Uji Millon Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat.

Jika pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein maka akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenolfenol karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Tetapi khusus untuk proteoso dan pepton secara langsung akan menghasilkan larutan yang berwarna merah. Endapan yang terbentuk berupa garam kompleks dari tirosin yang ternitrasi. Jika larutan protein yang akan dianalisis ada dalam suasana basa, maka terlebih dahulu harus dinetralisasi dengan asam (bukan HCl). Jika tidak, ion merkuri dari pereaksi akan mengendap sebagai Hg(OH)2. Ion Cl- dapat bereaksi dengan asam nitrat menghasilkan radikal klor yang dapat merusak kompleks berwarna.
COO +H 3N

NO2 H2 C conc. OH + Hg22+ + HNO 3 -H2O COOH H2 C C H Nitrated Tyrosine

C H

+H

OH

+ HgO

Tyrosine

Gambar 2. Reaksi pada uji millon Uji Hopkins-Cole Pereaksi Hopkins-Cole dapat digunakan untuk mengidentifikasi larutan protein yang mengandung triptofan. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin biru-ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut. Uji ini digunakan untuk identifikasi larutan asam amino triptofan dan protein yang mengandung asam amino triptofan karena triptofan merupakan satu-satunya senyawa yang mengandung cincin indol. Cincin ungu yang tampak pada bidang batas antara kedua cairan adalah hasil kondensasi triptofan dengan gugus aldehida dari asam glikoksilat dalam suasana asam sulfat.
C CH2 CH COOH + C NH2
CHO COOH
N H
asam glioksilat

H2SO4

H COOH NH

+ H2O

N H

Triptopan

N H

C CH2 CH COOH + C NH2

CHO

H H2SO4 H asam-2,3,4,5-tetrahidro--karbolin-4-karboksilat H COOH N H H NH

COOH

+ H2O

Gambar 3. Reaksi pada uji Hopkins-cole H

asam glioksilat asam-2,3,4,5-tetrahidro--karbolin-4-karboksilat Uji NinhidrinTriptopan Ninhidrin (triketohidrin hidrat) dipanaskan bersama asam amino, maka akan terbentuk kompleks berwarna. Asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan jalan mengamati intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi asam amino tersebut. Pada reaksi ini, dilepaskan CO2 dan NH3 sehingga asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan mengukur jumlah CO2 atau NH3 yang dilepaskan. Prolin dan hidroksi prolin menghasilkan kompleks yang berbeda warnanya dengan asam amino lainnya. Kompleks berwarna yang terbentuk mengandung dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan amonia yang dilepaskan pada oksidasi asam amino. Keseluruhan reaksi asam amino dengan ninhidrin adalah sebagai berikut.

a. Dekarboksilasi oksidatif dari asam amino dan produksi ninhidrin tereduksi, amoniak, dan karbon dioksida. b. Reaksi ninhidrin tereduksi dengan molekul ninhidrin yang lain dan dengan molekul amoniak yang dibebaskan. c. Pembentukan kompleks berwarna biru.
O C C O Ninhidrin O C C O H OH OH + H N H + H HO OH OH R + H2N C H COOH C O C H OH + NH3 + CO2 + RCHO

O Ninhidrin tereduksi O C C O O C N C C O O Kompleks berwarna biru O C

+ 3H2O

Gambar 4. Reaksi uji Ninhidrin (Redhana, 2010) Uji PbS Belerang yang terdapat dalam asam amino sistein dibebaskan sebagai ion sulfida dengan kehadiran NaOH. Ion sulfida selanjutnya bereaksi dengan ion Pb2+ membentuk endapan berwarna hitam dengan reaksi sebagai berikut S2-(aq) + Pb2+(aq) PbS(s)
endapan hitam

Uji nitroprusida Protein yang mengandung gugus SH bebas (sistein) memberikan warna kemerahmerahan jika direaksikan dengan natrium nitroprusida, Na2Fe(CN)5NO.2H2O dalam larutan amoniak. Beberapa protein yang memberikan hasil negatif terhadap reaksi ini ternyata menjadi positif setelah dipanaskan sampai mengalami koagulasi atau denaturasi. Hal ini menunjukkan proses tersebut menghasilkan gugus SH bebas. Jadi protein yang mengandung sistein dapat memberikan hasil positif. Hal ini disebabkan selain terdapat gugus COOH dan gugus NH2, gugus R pada asam amino bisa juga gugus tiol (gugus sulfidril) atau peptida. Pada asam amino lain dapat beraksi dengan natrium nitroprusida dalam amonia berlebih menghasilkan kompleks berwarna merah. Reaksinya adalah sebagai berikut.
[Fe3+(CN)5NC]2- + NH 3 + HS
CH2 CH NH2 COOH

NH4+ + Fe2+(CN) 5NOS

CH2

CH NH2

COOH

sistein

kompleks berwarna merah