Isolasi Pigmen dari Daun Bayam Tujuan Percobaan : Mengisolasi pigmen dari daun bayam dengan cara kromatografi

kolom Latar belakang Fotosintesis dalam tumbuhan terjadi dalam organel yang disebut kloroplas. Kloroplas mengandung pigmen berwarna yang dapat dibagi menjadi dua kategori klorofil dan karotenoid. Klorofil adalah pigmen berwarna hijau yang berperan sebagai fotoreseptor utama dalam tumbuhan. Klorofil mampu menyerap cahaya tampak pada panjang gelombang tertentu, yang kemudian diubah tumbuhan menjadi energi kimia. Ada dua bentuk pigmen ini yang ditemukan dalam tumbuhan, yaitu klorofil a dan klorofil b. Kedua molekul pigmen ini identik kecuali gugus metil pada klorofil a yang diganti dengan CHO pada klorofil b. Karotenoid adalah pigmen berwarna kuning yang juga terlibat dalam proses fotosintesis. Rumus struktur dan -karoten terlihat pada gambar dibawah. Selain itu, senyawa turunan karoten yang mengandung banyak oksigen juga terdapat dalam kloroplas. Senyawa yang dimaksud adalah xantofil. Bahan dan alat : Alumina, aseton, heksana, metanol Pipet Pasteur, mortar, kapas, clamp & stand, tabung reaksi

Prosedur kerja : A. Ekstraksi pigmen 1. dan pestel. 2. Masukanlah hasil gilingan daun bayam dalam 5 mL campuran heksana : toluena: erlenmeyer 25-mL yang berisi ruang. Sebanyak 1 g daun bayam dicuci dengan air, lalu dikering anginkan. Selanjutnya digiling sampai halus dengan mortar

metanol (9:1:3). Campuran diaduk selama 2 menit pada temperatur

3.

Saring

campuran,

dan

masukan

filtratnya

kedalam tabung reaksi. Tambahkan 3 mL air dan aduk dengan baik menggunakan metode pipet Pasteur. 4. Biarkan campuran memisah sempurna menjadi dua lapisan. Buanglah lapisan berair (bagian bawah) menggunakan metode pipet Pasteur. 5. Cairan (lapisan) organik dalam tabung reaksi dicuci kembali dengan menambahkan 3 mL air, kemudian diaduk dengan metode pipet Pasteur. Setelah didiamkan dan terbentuk dua lapisan, lapisan (bagian) berair dibuang dengan metode pipet Pasteur. Tambahkan sedikit Na2SO4 anhidrat. Larutan diaduk lalu didiamkan sampai buihnya hilang. 6. Saringlah larutan dengan Pasteur filter-tip pipette method. (ujung pipet dibalut dengan kapas. Pipet dimasukan kedalam larutan dengan karet dipencet. Setelah ujung pipet berada dalam larutan, lepas karetnya sehingga cairan akan diserap masuk kedalam pipet. Lepas balutan kapas dan cairan ditaruh dalam wadah yang telah disediakan) B. Kromatografi kolom Dimasukkan sumbat kapas kedalam pipet Pasteur dengan kawat. Ditambahkan 1,25 g alumina (permukaan alumina diratakan dengan cara digetarkan). Kolom dipasangkan dengan posisi vertikal menggunakan clamp dan stand. Posisi (tinggi) kolom diatur sedemikian rupa sehingga dibawahnya cukup untuk tinggi tabung reaksi (penampung). Taruhlah satu tabung reaksi (penampung 1) dibawahnya. Ditambahkan heksana secara perlahan-lahan kedalam kolom menggunakan pipet Pasteur. Pastikan semua alumina dalam kolom basah dengan pelarut. Bila perlu tambahkan lagi heksana. Jangan biarkan kolomnya kering ! Jika ketinggian heksana dalam kolom tepat sampai batas atas alumina, tambahkan sekitar 0,25 mL pigmen hasil ekstraksi. Segeralah tambahkan heksana ketika pigmen dimasukan. Tambahkan heksana sedikit saja dan tunggu seluruh pigmen meresap kedalam alumina. Selanjutnya tambahkan heksana sampai terjadi pemisahan (pita warna

kuning terpisah dengan pita warna hijau pada pigmen hasil ekstraksi). Jika tidak terjadi pemisahan, tingkatkan kepolaran pelarut (gantilah heksana dengan campuran heksana-aseton 7 : 3). Ketika mengganti pelarut, tambahkan pelarut pengganti ketika pelarut yang akan diganti tepat sampai batas atas alumina. Jika pelarut yang digunakan telah sesuai, tunggulah sampai pita kuning tepat akan keluar dari kolom dan gantilah tabung reaksi penampung 1 sesegera mungkin dengan tabung reaksi penampung 2. Jika eluen yang keluar dari kolom tidak berwarna lagi, gantilah dengan tabung reaksi penampung 3. Selanjutnya lakukan penggantian tabung reaksi penampung eluen sesuai dengan warna pita yang keluar dari kolom. Pastikan masing-masing pita tertampung sesuai dengan urutan elusinya dari kolom. Berilah label yang jelas ! N.B. Eluen yang digunakan : heksana, heksana-aseton (7:3), aseton, aseton-metanol (8:2) C. Kromatografi Kertas 1. Potong kertas saring dengan ukuran 10 x 8 cm. Buat garis start (tempat menotolkan sampel) pada bagian bawah (2 cm dari tepi kertas) dengan pencil. garis finis (batas akhir elusi) 1 cm dari tepi atas

garis start (tempat totolan sampel) 2 cm dari tepi bawah 2. kanan/kiri). 3. 4. Biarkan totolan ekstrak pigmen mengering (kering angin). Ujung kiri dan kanan kertas digulung dan disteples sehingga Totolkan ekstrak pigmen daun bayam memanjang pada garis

start sampel. Totolan jangan sampai terlalu dipinggir (kira-kira 1,5 cm dari pinggir

kertas berbentuk silinder dengan totolan ekstrak pigmen berada pada bagian luar.

5. 6.

Lakukan elusi dalam cember yang telah disiapkan dengan Hentikan elusi dan angkat kertas saring saat eluen mencapai

eluen campuran aseton:heksana (3 : 7). garis batas akhir elusi. Selanjutnya kertas saring dikeringanginkan. Tandailah spot/pita berwarna yang tampak pada kertas saring. Catatlah warna masing-masing pita !

Lembar Kerja Nama NIM Kelas/Kelompok 1. : : :

Tuliskan rumus struktur Klorofil A, Klorofil B, likopen, dan -karoten !

2.

Apa yang dimaksud dengan retardation factor (Rf)

3.

Sebutkan dan jelaskan faktor-faktor yang berpengaruh dalam proses

kromatografi agar komponen dalam sampel dapat terpisah dengan baik !

4.

Tuliskan urutan warna pigmen hasil pemisahan dengan kromatografi kolom

dari yang pertama keluar kolom. Tuliskan pula urutan warna pigmen hasil pemisahan dengan kromatografi kertas mulai dari yang Rfnya paling besar !

5.

Bila dibandingkan antara kromatografi kertas dan kromatografi kolom,

kromatografi manakah yang lebih baik digunakan ntuk memisahkan sampel dalam jumlah yang banyak ? Berikan penjelasan pilihan Anda !