COLORAES CITOQUMICAS

INTRODUO E IMPORTNCIA
Citoqumica a aplicao de corantes bioqumicos clulas do sangue e medula ssea, de maneira a refletir sua composio sem modificar apreciavelmente sua morfologia. Coloraes citoqumicas so auxiliares diagnsticos importantes em leucemias e em outras doenas hematolgicas. importante compreender que o estudo das clulas do sangue e da medula, atravs tcnicas especiais, complementar ao estudo clssico de suas morfologias ( evidenciadas aps coloraes panticas). Sem dvida, a riqueza de detalhes observveis em extenses assim coradas (Leishmann, May-Grunwald, Giemsa...), o ponto de partida indispensvel para estudos subseqentes. Como qualquer reao colorida ou tcnica de colorao por adsoro ou partio, a sensibilidade o calcanhar de Aquiles dos mtodos citoqumicos, Assim, embora saibamos que existam lipdeos e protenas em todas as clulas, no possvel corar, com tcnicas especficas para estas classes de substncias, todas as estruturas que as contm. Por outro lado, interessam-nos apenas as coloraes que possam esclarecer aspectos da fisiopatologia das clulas do sangue e seus precursores, mais precisamente, aquelas que tenham valor diagnstico e/ou prognstico. As coloraes citoqumicas incluem: - Sudan Black B; - cido peridico de Schiff (PAS); - Perls (reao do azul da prssia); - Coloraes para vrias enzimas etc; Note que, embora existam mtodos histoqumicos (i.., coloraes bioqumicas em tecidos, preservando a morfologia) para protenas, peptdeos e cidos nuclicos, estas coloraes so quase ausentes da rotina laboratorial, porque seu interesse diagnstico menor. H um grande nmero de estudos feitos com granulcitos de humanos e de animais, que procura estabelecer o mecanismo de ao destas clulas, desde sua migrao (da medula ssea para o sangue), at os fenmenos responsveis pela morte de microorganismos ou a fagocitose de substncias estranhas presentes na circulao e nos tecidos. Os dados presentes na literatura nem sempre so coincidentes, devido as variaes de material e procedimentos utilizados. Entretanto, o reconhecimento dos tipos de granulaes presentes nestas clulas, a dinmica de seu aparecimento durante a maturao da linhagem, as enzimas nelas contidas e seu papel nos diversos processos fisio e patolgicos, de que participam os granulcitos, devem muito a este tipo de estudo.

TCNICAS MAIS USADAS: PRINCPIO

COLORAO PELO PAS
A reao do cido peridico de Schiff importante na histo e na citoqumica de carbohidratos. Reaes positivas indicam a presena de glicognio, um polmero de glicose e de outros 1,2-glicis. uma reao efetuada em duas etapas: na primeira, grupos vicinais hidroxil so oxidados a aldedos; na segunda etapa, os dialdedos formados so demonstrados usando-se o reagente de Schiff, que o corante fucsina bsica. A cor produzida varia entre o prpura e o magenta, nos stios onde se localizam carboidratos oxidveis (mono-, oligo- e polissacardeos, glico- e mucoprotenas). Os granulcitos neutrfilos maduros contm altos nveis de glicognio, necessrio clula, para fagocitose. As clulas blsticas granulocticas quase no possuem glicognio. Na verdade, a partir do promielcito, que o teor de glicognio torna-se evidente, demonstrvel pelo PAS. A positividade aumenta com a maturao. Este glicognio bastante lbil e rapidamente consumido em situaes de baixa glicemia, sendo tambm rapidamente reposto. Os granulcitos eosinfilos e basfilos possuem polissacrides como os neutrfilos. Nos basfilos, a heparina e o cido hialurnico so responsveis pela basofilia, Nos eosinfilos, os polissacrides no parecem se localizar nas granulaes, que por conterem grande quantidade de protenas bsicas ricas em arginina (responsveis pela afinidade aos corantes cidos), no se coram pelo PAS.

SUDAN BLACK B
Os corantes de SUDAN, como o sudan black B so substncias provenientes de uma srie de pigmentos lipossolveis, que detectam lpides celulares. As clulas hematopoiticas contm lpedes finamente dispersos em seu citoplasma, lpides complexos ( lipoprotenas) na membrana celular e nas membranas de mitocndrias e de outras organelas. Estes lpides no so identificveis em extenses coradas por corantes panticos. Entretanto, quando o sudan black b cora estas clulas, particiona-se entre os lpedes celulares e a soluo corante, concentrando-se nas estruturas lipdicas, emprestando-lhes uma colorao escura, negra. Reaes positivas so associadas aos granulcitos. A srie monocitria apresenta reaes variveis e a linfocitria negativa. Comparando-se com o contedo lipdico dos eritrcitos, os leuccitos so muito mais ricos em glicolipdios (400:1). Alm disso, os leuccitos leucmicos, tm um teor de fosfolipdios mais elevado do que o dos linfcitos normais. A partir dos promielcitos a colorao fortemente positiva, aumentando com a maturao; porm nos mieloblastos, podem ser vistas coloraes sudanfilas pequenas e escassas, na linhagem neutroflica. A colorao em outras linhagens granulocticas varivel: nos eosinfilos, uma sudanofilia fraca, delimita as granulaes especficas. Os basfilos podem ter a positividade aumentada em leucemias (acompanha a positividade para o PAS). Devido a uma srie de dificuldades inerentes ao mtodo, ele considerado, por alguns autores, menos esclarecedor. Muitos lipdios, associados a outras substncias, no apresentam positividade,

ENZIMAS
Desempenham papel muito importante na fisiologia leucocitria e, por esse motivo, sua demonstrao tem crescido em importncia. As enzimas esto associadas, nos granulcitos s estruturas granulares e intervm nos processos de ataque e morte de microrgranismos. Cumprem, em geral, funes de hidrlise e de oxidao. Nem todas podem ser demonstradas citoquimicamente. De um modo geral, o mecanismo de colorao citoqumica-enzimtica segue o seguinte esquema : Substrato ----------------enzima corante precursor ---------------captador colorao final

fcil perceber que alteraes de localizao e de atividade da enzima podem ocorrer, gerando falsos resultados, O principal problema a difuso dos produtos formados durante a reao. Uma outra interferncia importante a diferena de atividade entre as diversas isoenzimas. Dentre as principais enzimas demonstrveis citoquimicamente nos granulcitos, temos: - Alfa-1,4-glicosidase; - Aril sulfatases; - Beta-glicuronidase; - Esterases; - Fosfatase cida; - Fosfatase alcalina; - Lipase cida; - Mieloperoxidase; - Proteases. Nossa experincia limita-se s fosfatases, algumas esterases e mieloperoxidase.

FOSFATASES
As fosfatases so enzimas largamente distribudas nos tecidos de mamferos. Como um grupo, elas liberam ortofosfato de um fosfato orgnico. A classificao em cida e alcalina deve-se ao pH de sua atividade tima. Sua determinao baseia-se na formao de precipitados de fosfatos orgnicos por elas hidrolizados.

FOSFATASE ALCALINA
Hidrolisa steres naturais ou sintticos, liberando o cido ortofosfrico em meio alcalino (pH 9,2 9,6), inibida pelo cianeto, fosfato e arsenato. Est presente nas granulaes especficas dos neutrfilos e encontrada em maior quantidade nas clulas maduras. Nas clulas precursoras de metamielcitos, bem como nos outros granulcitos (eosinfilos e basfilos) a atividade enzimtica detectvel por esta tcnica mnima. Nem todos os neutrfilos segmentados tm reao fortemente positiva da fosfatase alcalina. Ao contrrio, predominam as clulas negativas e fracamente positivas em extenses sangneas

de indivduos normais. A atividade maior nos neutrfilos circulantes do que nas clulas medulares, indicando que o teor enzimtico mximo deve ser obtido aps a emisso da medula. As clulas recm formadas possuem maior atividade enzimtica. O mtodo de avaliao semi-quantitativo, atravs escores. A atividade enzimtica aumenta em certas condies fisiolgicas, como estresses, gestao e em certas patologias como infeces, infarto do miocrdio, hemopatias malignas do tipo policitemia vera e mielofibrose primria. Entretanto, o maior interesse dessa reao a baixa atividade caracterstica da Leucemia Mielide Crnica. relevante no diagnstico diferencial desta condio. Nas Leucemias Agudas, ao contrrio, a fosfatase alcalina pode estar normal ou mesmo aumentada, nos escassos segmentos neutrfilos comumente encontrados. Em reaes do tipo leucemide, o usual encontrar um escore elevado. Embora muitas dvidas existissem sobre a localizao celular da fosfatase alcalina, concluiu-se que os ncleos so desprovidos de atividade. A enzima granular (granulaes especficas) e, dependendo de fatores tcnicos como fixador, temperatura, tempo de incubao e anticoagulante, pode difundir na clula. FOSFATASE CIDA Hidrolisa steres naturais ou sintticos de fosfato, liberando em meio cido (pH 4,5 a 6,0), o cido ortofosfrico. inibida por ons fluoreto em baixas concentraes. Constitui uma hidrolase importante no processo de ataque e morte de microorganismos fagocitados e atua, juntamente com a fosfatase alcalina, no processo de defesa primria. A fosfatase cida situa-se nas granulaes primrias: uma enzima lisossomal. A intensidade da reao da fosfatase cida menor nos neutrfilos do que a da fosfatase alcalina. Nas clulas linfocitrias, ao contrrio, o teor de fosfatase cida maior do que o da alcalina, e sua determinao citoqumica pode ser importante na caracterizao da linhagem, quando envolvida em um processo leucmico. Nos agranulcitos, a fosfatase cida aparece intensamente positiva em moncitos e com pequena atividade em linfcitos. Porm, as clulas T exibem intensa positividade na regio do Golgi, enquanto as clulas B podem ser positivas ou negativas. Um estudo adicional de inibio pelo cido tartrico pode ser feito. A maioria das isoenzimas da fosfatase cida inibida pelo cido L-tartrico. So resistentes enzimas das clulas de reticuloendoteliose leucmica (leucemia de clulas cabeludas), sndrome de Szary e algumas leucemias linfoblsticas agudas de clulas T.

ESTERASES
um grupo de enzimas muito diversificado. A propriedade mais significativa destas enzimas o fato de que seus substratos naturais so steres de cidos carboxlicos. As esterases so enzimas capazes de hidrolisar ligaes ster de lcoois, fenis e naftis. Muitas esterases tm uma baixa especificidade pelo substrato e so referidas como esterases no especficas. Aquelas com alta especificidade pelo substrato so denominadas conforme esta propriedade, por exemplo, a cloroacetato esterase.

Vrios tipos de reaes de esterase pedem ser usadas em leuccitos na diferenciao das linhagens neutroflica e monocitria. Se um substrato naftol AS-D cloroacetato enzimaticamente hidrolisado por uma esterase cloroacetato especfica, um naftol livre liberado. Esse composto acoplado a um sal diaznico para formar um depsito bastante colorido nos stios de atividade enzimtica. Reaes positivas so observveis em clulas da linhagem granuloctica. Esta enzima foi ocasionalmente observada em promoncitos e moncitos maduros. Monoblastos so negativos. As reaes com estes substratos so similares tanto colorao com o Sudan Black B quanto reao para a mieloperoxidase, no que diz respeito s clulas positivas. As esterases aparecem um pouco mais tardiamente na diferenciao celular, usualmente entre os estadios de mieloblasto e promielcito. As esterases no especficas (por exemplo, alfa- naftil acetato e butirato esterase) so usadas clinicamente para reconhecer clulas de origem monocitria. Nesta linhagem, e no nas linhagens granuloctica e linfocitria, a enzima inibida pelo fluoreto de sdio. Esta reao tambm libera um naftol livre do substrato. Este naftol captado por um sal de diaznio, como na reao anterior, para formar um depsito negro, nos stios de atividade enzimtica. A reao fortemente positiva nos moncitos, fracamente positiva ou negativa nos granulcitos e positiva em outros tipos celulares.

MIELOPEROXIDASE
Peroxidases so enzimas relativamente raras em tecidos animais. So bastante comuns em tecidos vegetais. Em humanos, peroxidases so encontradas nos microssomas das clulas hepticas e renais, e nos grnulos das clulas mielides e monocitides. A mieloperoxidase localiza-se nos grnulos azurfilos primrios. Os blastos primitivos, comprometidos com a linhagem mielide, demonstram atividade de peroxidase em reas como o retculo endoplasmtico e a regio do Golgi. A reao catalizada pela peroxidase a decomposio dos perxidos, liberando oxignio (que vai oxidar um determinado receptor). Na identificao, o perxido usado o de hidrognio, e o receptor , em geral, a benzidina. O mecanismo a oxidao da benzidina, incolor, ao azul de benzidina, que instvel, e finalmente ao composto estvel de cor castanho-esverdeada, ou quase negra, dependendo da tcnica usada. A colorao positiva nos granulcitos num padro granular. O padro de reao positiva em clulas jovens pode aparecer como estruturas em basto ou manchas, denominadas corpsculo Phi. As clulas granulocticas exibem positividade crescente com a maturao, enquanto que nas clulas monocitrias a reao menos intensa, caracterizada por depsitos granulares finos, dispersos por toda a clula. Outras linhagens so negativas. A reao da mieloperoxidase freqentemente acompanha o Sudan, mas no obrigatoriamente. Esta reao til na diferenciao de leucemias agudas. Casos em que a mieloperoxidase no acompanha a colorao pelo Sudan, incluem estados pr-leucmicos ou infecciosos graves (negativa) e reaes positivas em linfcitos em pessoas com reticuloendoteliose leucmica (leucemia de clulas cabeludas). Existe tambm uma condio de diminuio hereditria da mieloperoxidase.

REDUO DO NBT
O NBT um corante oxidado, amarelo, que tem um potencial de oxi-reduo baixo o suficiente para competir com o O2 como receptor de eltrons e pode aceitar eltrons de oxidases e desidrogenases. Isto fez com que ele fosse proposto em Histologia, com outros corantes da mesma famlia, como detector de atividade redox. Seu produto de reduo total, a diformazana, uma substncia insolvel em gua e com uma cor azul intensa. O sucesso e seu uso para este fim originou um teste clnico que, baseado no aumento de atividade oxidativa nos neutrfilos em infeces, buscava distinguir entre infeces bacterianas e virais. Foi, por razes da prpria filosofia celular, um fracasso. Mesmo assim, alguns clnicos ainda solicitam o teste do NBT. O resultado expresso como no escore das enzimas, s que na forma de ndice (escore/100).

COLORAES CITOQUMICAS DE INTERESSE NO ESTUDO DA SRIE ERITROCITRIA

Diversos tipos de incluses podem ser vistas em eritrcitos corados pelos corantes panticos. Alm de parasitas como o plasmdio, as substncias observveis em extenses de sangue perifrico incluem cidos nuclicos residuais (DNA e RNA), agregados de mitocndrias, ribossomos e partculas e ferro. A maioria das incluses visvel na colorao pantica usual. Algumas, entretanto, requerem coloraes especiais. o caso do RNA residual, que pode ser corado (demonstrado) por corantes supravitais (novo azul de metileno ou o azul de cresil brilhante), ou ento dos precipitados de hemoglobinas anormais, que so demonstrveis como precipitados de cristal violeta.

COLORAO PARA FERRO

A reao do azul da prssia precipita o ferro livre dos eritrcitos, em pequenos grnulos azuis ou azul-esverdeados. Este ferro livre no visualizvel nas extenses coradas por corantes panticos. As formas celulares imaturas e maduras, contendo ferro livre, so denominadas sideroblastos e sidercitos, respectivamente. Um nmero aumentado de sidercitos visto em doenas como a Talassemia Major ou em pacientes ps-esplenectomizados. Se os grnulos de ferro circundam o ncleo do eritroblasto, ele denominado sideroblasto em anel ( ringer sideroblast ). Apesar da causa mais comum de sideroblastos em anel ser o alcoolismo, eles tambm podem ser vistos em anemias e em envenenamentos por chumbo.

COLORAES CITOQUMICAS
Aplicao de corantes bioqumicos a clulas do sangue e medula ssea de maneira a refletir sua composio sem modificar apreciavelmente a sua morfologia. As coloraes citoqumicas so auxiliares diagnsticos importantes em doenas hematolgicas, principalmente nas leucemias. Interessam-nos as coloraes que possam esclarecer aspecto da fisiopatologia das clulas do sangue e de seus precursores: mais precisamente aquelas que tenham valor diagnstico e/ou prognstico. As coloraes citoqumicas incluem:

Citoqumica

COLORAO PELO PAS (CIDO PERIDICO DE SCHIFF)

Importante na citoqumica de carboidratos. Reaes positivas incluem a presena de glicognio. Presente nos neutrfilos maduros em altos nveis. As clulas blsticas granulocticas quase no possuem glicognio. Passa a ser evidente a partir dos promielcitos e aumenta com a maturao.

Fundamento
O cido peridico oxida carboidratos aldedos, que reagem com o reativo de Schiff para liberar um produto corado.

Reao

Grupamento 1, 2 glicol (-CHOH -CHOH) ------------Dialdedo + Reativo de Schiff --------- Colorao rsea

oxidao

Dialdedo

Interpretao:
A cor produzida varia entre prpura e magenta brilhante, nos stios onde se encontram os carboidratos oxidveis.

Distribuio em clulas hematopoiticas normais:

Leuccitos polimorfonucleares: reao intensa, difusa, corando de rosa ou vermelho. Presente nos neutrfilos maduros em altos nveis.

- Moncitos: reao fraca, levemente rsea. - Plaquetas: cora intensamente. Precursores granulocticos: reao aumenta medida em que as clulas se diferenciam. As clulas blsticas granulocticas quase no possuem glicognio. Passa a ser evidente a partir dos promielcitos e aumenta com a maturao. - Precursores eritrides: no se coram. - Megacaricitos: reao difusa intensa. - Linfcitos: algumas vezes apresentam reao fraca sob a forma de finos grnulos.

Neoplasias Hematolgicas:
Leucemia Mielide Aguda (LMA): - M1 e M2: negativo. - M3: Leucemia Promieloctica Aguda, com uma leve colorao difusa com ou sem grnulos finos dispersos. - M4 e M5: em geral negativo e algumas vezes positiva em grnulos finos. - M6: eritroleucemia, apresenta PAS intenso. PAS em precursores eritrides. ocorrem na Eritroleucemia, LMA e Sndrome Mielodisplsica e, algumas vezes, em Talassemias. - M7: positividade difusa e granular, com grnulos grosseiros na periferia. Leucemia Linfoblstica Aguda (LLA) : variabilidade na atividade PAS. A maioria dos casos apresenta pelo menos alguns blastos com grnulos grosseiros ou blocos PAS positivos. As LLAs, classificao FAB L3, so negativas.

SUDAN BLACK B
Para deteco de lpides celulares. As clulas hematopoticas contm lpides finamente dispersos em seu citoplasma, lpides complexos como lipoprotenas na membrana celular e nas membranas das mitocndrias e na de outras organelas.

Fundamento:
O Sudan Black cora uma variedade de lipdios, incluindo gorduras neutras, fosfolpides e esteris. A reao baseia-se na habilidade do corante, solvel em gordura, se dissociar de seu solvente e penetrar no complexo lipoprotico.

Interpretao:
Uma colorao positiva indicada pela presena de grnulos citoplasmticos negros.

Distribuio em clulas hematopoiticas normais:

Leuccitos polimorfonucleares: reaes positivas.

Moncitos: reaes variveis. Plaquetas: cora intensamente. Precursores granulocticos: reao aumenta medida que as clulas se diferenciam. fortemente positiva a partir dos promielcitos e aumenta com a maturao. Nos mieloblastos podem ser vistas granulaes finas e escassas. Precursores eritrides: o contedo de lpides muito pequeno em relao aos neutrfilos (1:400). Linfcitos: Reao negativa. Eosinfilos: uma fraca colorao delimita as granulaes especficas. Basfilos: positividade aumentada nas leucemias.

Neoplasias Hematolgicas:
Leucemia Mielide Aguda (LMA) - M1 e M2: positivo. - M3 e M4: fortemente positivo. - M5 e M7: negativo. -

ENZIMAS:
Desempenham um papel muito importante na fisiologia leucocitria. As enzimas esto associadas, nos granulcitos, s estruturas granulares e intervm nos processos de fagocitose e morte dos microorganismos. Cumprem, em geral, funes de hidrlise e oxidao. Mecanismos de colorao: Substrato ---------------- corante precursor ------------------ colorao final Enzima Captador Dentre as principais enzimas demonstrveis citoquimicamente nos granulcitos, temos: Alfa-1, 4- glicosidase Aril sulfatases Esterases Fosfatase cida Fosfatase alcalina Lipase cida Mieloperoxidase Proteases

1) FOSFATASES:

So enzimas largamente distribudas nos tecidos dos mamferos. A classificao em cida e alcalina se deve ao pH de sua atividade tima. Sua determinao se baseia na formao de precipitados de fosfatos orgnicos por elas hidrolisados.

FOSFATASE ALCALINA Fundamento:

A enzima identificada por meio de sua ao hidroltica sobre um substrato que apresenta o grupo naftol-fosfato. O grupo naftol liberado e, em seguida, captado por um sal de diaznio (Fast Blue BB), resultando na formao de um precipitado corado, no stio da atividade enzimtica.

Reao:
fosfatase alcalina Substrato (naftol fosfato) --------------------------- naftol (aril naftolamida) + sal diaznico (Fast Blue BB) ------------------- corante insolvel.

Resultados:
Classifica-se a intensidade do corante precipitado em 100 neutrfilos segmentados e bastonetes, com um score variando de 0 a 4+, somando-os. 0- Negativo, sem grnulos; 1- Positivo, com poucos grnulos; 2- Positivo, com moderados grnulos; 3- Fortemente positivo, com numerosos grnulos; 4- Fortemente positivo, com grnulos densos em todo o citoplasma.

Interpretao:
< 15: LMC; > 120: Reao leucemide, metaplasia mielide, policitemia Vera; Reao fraca ou ausente: Hemoglobinria Paroxstica Noturna.

FOSFATASE CIDA Fundamento:

Hidrolisa steres naturais ou sintticos de fosfato, liberando o cido ortofosfrico em meio cido (pH 4,5 a 6,0). uma hidrolase importante no processo de ataque e morte de microorganismos fagocitados e atua, juntamente com a fosfatase alcalina, no processo de defesa primria.

Distribuio em clulas hematopoticas normais:

Neutrfilos: Reao menos intensa que a da fosfatase alcalina; Moncitos: Intensamente positiva;

Linfcitos: Pequena atividade porm, os linfcitos T exibem intensa positividade na regio do Golgi, enquanto as clulas B podem ser positivas ou negativas.

2) ESTERASES:
As esterases permitem a distino entre clulas da srie monoctica e srie neutroflica, utilizando-se diferentes substratos. As esterases inespecficas utilizando o substrato -naftil acetato fortemente positiva em moncitos e fraca em neutrfilos.

Fundamento:
A esterase leucocitria hidrolisa um substrato sinttico, um ster derivado do naftaleno (-naftil acetato). Um composto naftol liberado e se liga rapidamente a um sal diaznico (pararosanilina), resultando em um precipitado colorido, prximo atividade da enzima.

Reao:
esterase R-CO-R + H2O ----------------------- RCOOH + ster carbnico cido carbnico ROH lcool

steres de naftol tm sido usados predominantemente em citoqumica de esterase porque o naftol liberado se junta com uma amina diazotada apropriada para dar um azo corante:

Reao de captao:
esterase Naftol do ster de --------------------- Naftol + sal cido carbnico de diaznio +H2O --------Azo corante

ESTERASES ESPECFICAS (CAE): Fundamento:

A enzima esterase especfica, dentro dos granulcitos, hidrolisa o substrato naftol cloroacetato. O substrato hidrolisado captado pelo sal diaznico (pararosanalina), formando um precipitado corado fora do stio de atividade enzimtica.

Interpretao:
Colorao vermelha no citoplasma dos granulcitos e mastcitos teciduais.

ESTERASES INESPECFICAS:
ANAE- -naftil acetato esterase; ANBE- -naftil butirato esterase;

NASDA Esterase- naftol SA-D acetato esterase.

Distribuio das Esterases Inespecficas em Clulas Hematopoticas Normais:

Moncitos, macrfagos, megacaricitos e plaquetas: reao positiva intensa; Basfilos; Plasmcitos; Linfcitos T: reao focal (em bloco); Eritroblastos: reao fraca; Inibio pelo fluoreto: moncitos, megacaricitos, plaquetas e plasmcitos; Fluoreto resistente: linfcitos e granulcitos.

3) MIELOPEROXIDASE:
uma enzima lisossmica, localizada em grnulos azurfilos (primrios) de neutrfilos e em grnulos de eosinfilos e moncitos. til no diagnstico diferencial das LMA e LLA.

Fundamento:
As peroxidases so enzimas que catalizam a oxidao de substratos especficos (fenis, cidos aromticos e outros) na presena de perxido de hidrognio. Na citoqumica, utilizam-se corantes como substratos que, ao serem oxidados, originam um derivado colorido no local da atividade enzimtica. So utilizados como indicadores da atividade desta enzima, a benzidina e os derivados benzidnicos.

Reao
Peroxidase + H2O2 ----(citoplasma da clula) H2O + O2 ---Benzidina ------------- complexo (incolor) oxidao (corado)

Interpretao:
Uma reao positiva para MPO indicada pela presena de grnulos que variam de castanho-esverdeado quase negro.

Distribuio de Peroxidase em Clulas Hematopoticas Normais:

Positiva: - Srie granuloctica neutroflica e eosinoflica: a partir do estadio de promielcitos at as formas segmentadas. Presena de reao discreta em mieloblastos; - Srie granuloctica basoflica: reatividade at o estadio de metamielcito; - Srie monoctica: reao fraca com grnulos dispersos. Negativa: Eritrcitos; Linfcitos; Megacaricitos; Basfilos maduros: reao negativa ou quase negativa.

Neoplasias hematolgicas
Negativa: Positiva: Varivel: LLA; LMAM7. LMA-M1: Positiva em mais de 3% dos blastos; LMA-M2: Positiva em mais de 85% dos blastos; LMA-M3: Positiva em mais de 85% dos blastos, de elevada intensidade, recobrindo toda a clula. LMA-M4 e M5: os precursores monocticos so algumas vezes fracamente positivos e, freqentemente, negativos. Na LMA-M4, o componente mielide peroxidase negativa. LMA-M6: precursores eritrides negativos e precursores granulocticos positivos.

Deficincia Hereditria de mieloperoxidase:

Deficincia em todos os neutrfilos e moncitos, mas os eosinfilos no so afetados.

REAO DE PEARLS PARA FERRO

Fundamento:
O ferro da hemossiderina liberado pelo cido diludo. A combinao do ferro inorgnico com ferrocianeto de potssio, em soluo cida, forma ferricianeto frrico de colorao azul da prssia.

Reao:
4 FeCl3 + 3 K4Fe(CN)6 -------------Fe4[Fe(CN)6]3 + 12 KCl

Resultados:
A localizao da partcula de ferro corado em azul na medula ssea pode ser intra e extra-celular. O ferro intra-celular est localizado dentro de sidercitos, sideroblastos e macrfagos.

Interpretao:
a) b) c) Pela quantidade de ferro (ausente, normal e aumentada); Pelo tamanho da partcula (grande ou pequena); Pela distribuio dos grnulos (sideroblastos em anel ou normais).

TERMINAL DEOXINUCLEOTIDIL TRANSFERASE (TdT):

A terminal deoxinucleotidil tranferase um marcador para populaes linfides primitivas. A enzima derivada do ncleo e observada em clulas pr-B e linfoblastos T, mas ausente em linfcitos B maduros.

Fundamento:
Anti-corpo de cabra anti-coelho marcado com isotiocianatode fluorescena (FITC) incubado com a amostra. A atividade da TdT no ncleo indicada pela presena de fluorescncia na clula.

Interpretao:
Atividade TdT positiva: LLA de Clulas T e pr-B Linfomas 50% das leucemias indiferenciadas 30% das LMC em crise blstica 5% das LMA

PEROXIDASE (mtodo de GRAHAM mod.):

SOLUO I
Benzidina purificada --------------------------------------- 0,3 ml lcool etlico ------------------------------------------------ 99,0 ml Juntar 1 ml de soluo saturada de nitroprussiato de sdio (3,6%), que deve ser conservada em frasco escuro, a 4C.

SOLUO II
H2O2 (10 v) -------------------------------------------------- 0,1 ml (2 gotas padronizadas) H2O destilada ----------------------------------------------- 10,0 ml Preparar no momento do uso Colocar cerca de 1,0 ml da soluo I sobre extenses sangneas (obtidas logo aps a coleta e sem o uso de anticoagulante); deixar fixar por 3 minutos; adicionar igual volume de soluo II (sobre as lminas) e deixar durante 5 minutos; decantar, lavar delicadamente com gua corrente; secar ao ar e contracorar com corante panptico.

Interpretao:

Os grnulos apresentam uma colorao que varia do amareloesverdeado ao marrom.

FOSFATASE ALCALINA EM LEUCCITOS (tcnica de KAPLOW)

1) SOLUO FIXADORA
Formol -------------------------------------------- 10 ml lcool metlico ---------------------------------- 90 ml Acertar pH para 7,2 e guardar em geladeira.

2) TAMPO SOLUO ESTOQUE

Propanol em soluo 0,2 M 2-amino, 2-metil, 1, 3-propanodiol -------------------------- 1,8 g H2O dest. -------------------------------------------------------- 100 ml Guardar em geladeira

3) TAMPO SOLUO EM USO

Propanol em soluo 0,05 M, pH = 9,75 Tampo soluo estoque ------------------------------------------------- 50,0 ml HCl 0,1 N ----------------------------------------------------------- + ou - 2,5 ml H2O dest. q.s.p.----------------------------------------------------------- . 200 ml Guardar em geladeira

4) SUBSTRATO
(deve ser preparado imediatamente antes do uso pH= 9,5) Tampo soluo de uso -------------------------------------------------- 17,5 ml Alfa-naftil fosfato de sdio ---------------------------------------------- 17,5 mg Fast Blue (sal diaznico) ------------------------------------------------- 17,5 mg Filtrar o substrato diretamente sobre a lmina

Tcnica:
abcdefixar extenses, secas ao ar, por 30 segundos, em temperatura + ou de 5C; lavar em gua destilada por 10 segundos; incubar com substrato por 10 minutos, em temperatura ambiente, no escuro; lavar em gua destilada por 10 segundos; secar; contracorar com verde de malaquita, por 20 segundos

VERDE DE MALAQUITA
Verde malaquita 2% -------------------------------------------------- 0,01 ml gua destilada --------------------------------------------------------- 10 ml Obs.: Tambm pode ser corado com Hematoxilina de Mayer ou Hematoxilina Carazzi (de 1 a 2 minutos). Grnulos marrons. Referncias: Kaplow, L. S.; Blood 10: 123, 1955; Amer J. Clin. Path. 39: 439, 1963.

SUDAN BLACK (mtodo de SHEEHAN)

1) FORMALDEDO 37% 2) SOLUO ESTOQUE DE SUDAN BLACK
Sudan Black ------------------------------------------------------- 0,3 g Etanol absoluto --------------------------------------------------- 100 ml Agitar, filtrar e envelhecer

3) SOLUO TAMPO
Cristais de fenol -------------------------------------------------- 16 g Etanol absoluto --------------------------------------------------- 30 ml Dissolver e acrescentar: Na2HPO4 x 12 H2O ----------------------------------------------- 0,3 g H2O dest. ----------------------------------------------------------- 100 ml

4) SOLUO CORANTE
Soluo estoque de Sudan --------------------------------------- 60 ml Soluo tampo --------------------------------------------------- 40 ml Filtrar aps suco - o corante estvel por 2 a 3 meses.

Tcnica:
abcdefixar as lminas em vapor de formol por 10 minutos; deixar em Jarra de Coplin por 60 minutos com a soluo corante; lavar em etanol a 70% por 2 a 3 minutos, para remover o excesso de corante; lavar em gua; contracorar com corante pantico. Grnulos verde-escuro ou negros.

P.A.S. (CIDO PERIDICO DE SCHIFF) Mtodo de HOTCHKISS

REAGENTES:

1) SOLUO DE CIDO PERIDICO

Cristais de cido peridico ---------------------------------------------- 5,0 g H2O dest. q.s.p. -----------------------------------------------------------.500 ml Estocar a 4C estvel por 3 meses

2) REATIVO DE SCHIFF
H2O dest. em ebulio ---------------------------------------------------- 200 ml Fucsina bsica (B.D.H.) -------------------------------------------------- 1,0 g Adicionar gua, a fucsina, tomando o cuidado para que no haja a formao de bolhas de ar que poderiam extravasar o lquido. Aps dissoluo, esfriar em gua corrente at que a temperatura atinja cerca de 50C. Adicionar 1,0 g de HCl concentrado, agitar e esperar esfriar temperatura ambiente. Transferir para frasco com rolha esmerilhada. Adicionar 2,0 g de metabissulfito de sdio e agitar. Deixar em repouso, ao abrigo da luz, durante 24 horas. Adicionar 1,0 g de carvo absorvente (Norita). Agitar fortemente, esperar 30 minutos, e filtrar ( papel de filtro Whatman). O filtrado dever ser incolor. Para isto, adicionar 1,0 g de carvo e 2,0 ml de HCl . Filtrar novamente e armazenar a 4C em frasco mbar. Obs.: Para se testar o reagente de Schiff, adicionar a ele algumas gotas de reagente de formaldedo (37%). Imediatamente deve-se desenvolver uma cor prpuraavermelhada. Descartar se a cor desenvolvida for prpura-azulada.

3) SOLUO SULFUROSA (remove excesso de reagente de Schiff)

H2O dest. ----------------------------------------------------------- 200 ml Metabissulfito de sdio e potssio (0,5%) --------------------- 10 ml HCl 1N -------------------------------------------------------------- 10 ml Preparado no momento do uso

4) FIXADOR
Formaldedo (37%) ----------------------------------------------------- 10 ml lcool etlico absoluto ------------------------------------------------- 90 ml

Tcnica:
abcdefghifixar por imerso em mistura etanol-formaldedo (9:1) por 10 minutos; lavar com lcool 70% por 30 segundos; cobrir as extenses com cido peridico por 15 minutos; decantar; imergir em lcool 70% por 10 minutos; lavar com HO dest. e secar bem; imergir em reativo de Schiff por 30 minutos manter ao abrigo da luz; lavar com soluo sulfurosa (se necessrio); lavar com H2O corrente (at a soluo ficar lmpida) contracorar com hematoxilina de Mayer ou de Carazzi por 5 minutos, ou Verde de Malaquita por 30 segundos. j- lavar com gua corrente e secar. Resultado: Grnulos Vermelhos

HEMATOXILINA DE CARAZZI OU MAYER 1) HEMATOXILINA DE CARAZZI

H2O dest. ------------------------------------------------------------ 400 ml Glicerina ------------------------------------------------------------- 100 ml Almen de K -------------------------------------------------------- 25,0 g Iodeto de sdio ------------------------------------------------------ 0,1 g Hematoxilina -------------------------------------------------------- 0,7 g Misturar todos os reagentes, dissolver sem aquecer, filtrar, deixar envelhecer durante dois meses em frasco escuro. 2) HEMATOXILINA DE MAYER Hematoxilina ----------------------------------------------------------- 1,0 g H2O dest. ---------------------------------------------------------------- 500 ml Aquecer at ebulio e adicionar mais 500 ml de H2O. Iodato de sdio --------------------------------------------------------- 0,2 g Sulfato de potssio e alumnio --------------------------------------- 50 g Estocar em frasco escuro temperatura ambiente e filtrar antes do uso.

ESTERASE INESPECFICA
REATIVOS: 1) Na2HPO4 0,1M
Na2HPO4 ---------------------------------------------------------------- 7,09 g H2O dest. ---------------------------------------------------------------- q.s.p. 500 mL

2) KH2PO4 0,1 M

KH2PO4 ------------------------------------------------------------------ 6,8 g H2O dest. ----------------------------------------------------------------- q.s.p. 500 mL

3) MISTURA DE SUBSTRATO: a) 100 mL de tampo pH 6,9

Na2HPO4 0,1M --------------------------------------------------------- 60 mL KH2PO4 0,1 M ---------------------------------------------------------- 40 mL

b) 5 mL de sal de naftol - AS Acetato

Naftol - AS Acetato --------------------------------------------------- 16 mg Acetona ------------------------------------------------------------------- 3 mL Propilenoglicol ----------------------------------------------------------- 2 mL

c) 0,2 g do sal de Fast Blue BB

Misturar a, b e c em um agitador magntico por 3 a 4 minutos e filtrar 50 mL da mistura obtida, imediatamente antes do uso. outra parte, adicionar 0,075 g de NaF e filtrar.

Tcnica:
Fixar com vapor de formol por 10 minutos e secar ao ar; Incubar as extenses nas duas misturas (com e sem fluoreto) por 70 minutos, temperatura ambiente; Lavar delicadamente e secar ao ar; Contracorar com Hematoxilina de Harris.

Resultados:
Reao fortemente positiva nos moncitos, macrfagos, megacaricitos e plaquetas (+++). Neutrfilos: + a +++ Plasmcitos: ++ a +++ Linfcitos: a + Eritroblastos: a + Obs.: A presena do fluoreto inibe a reao positiva para a srie monoctica. Bibliografia: Daniel e cols., 1971. DANIEL, M.T.; FLANDRIN, G.; LEJEUNE, F.; LISO, P.; LORTHOLARY, P.F.: Les estrase spcifiques monocytaires: utilisation dans la classification des leucmies aigues. Noure. Rev. Fran. Hemato, 11: 233-40, 1971.

COLORAO DO AZUL DA PRSSIA

Princpio:
A reao do Azul da Prssia emprega uma soluo cida de ferrocianeto para demonstrar o ferro da parte no hemica que ocorre na forma de ferritina e hemossiderina que so compostos que armazenam ferro. A ferritina uma substncia relativamente homognea composta por uma cpsula protica (apoferritina) que rodeia um centro de hidrxido de ferro. A composio da hemossederina varivel devido incorporao de lipdio, clcio e cobre. Comparando-se com a ferritina, a hemossiderina contm o dobro da quantidade de ferro (40%). A ferritina uma forma mvel de armazenamento de ferro, enquanto que o ferro da hemossiderina lentamente mobilizado. O ferro nos dois compostos facilmente identificado por cidos diludos que fornece o ferro inico. Uma dessas reaes a

formao de um pigmento azul, o Azul da Prssia, que resulta da reao de ons frricos e ferrocianeto.

Reagentes:
1) Fixador:cool metlico ou formol 40% - etanol 95% - 1:10; 2) HCl 10% 3) Ferrocianeto de Potssio 5% (armazenado em frasco mbar e estvel por 3 minutos); 4) Safranina 0,05 % ou vermelho neutro1% ou nuclear fast RED Nuclear Fast RED ---------------------------------------------------------- 0,1 g Sulfato de alumnio 5% --------------------------------------------------- 100 mL Aquea, filtre e adicione 1 g de Timol. 5) Corante: imediatamente antes do uso, misture partes iguais (250 mL) das solues 2 e 3 e filtre a mistura em um jarro de Coplin.

Tcnica:
1) Fixar a lmina em formol etanol por 1 minuto; 2) Enxaguar com gua deionizada; 3) Corar com a mistura de ferrocianeto de potssio e HCl por 30 60 minutos, temperatura ambiente ou a 37C; 4) Enxaguar com gua deionizada; 5) Contracorar com safranina por 5 minutos; 6) Lavar com gua destilada,

Resultados:
O ferro da ferritina e da hemossiderina coram em azul, ncleos em vermelho e o citoplasma em rosa.

Nota:
1) Toda vidraria e reagentes utilizados devem ser isentos de ferro; 2) Safranina, quando muito envelhecida, forma precipitados cristalinos. Bibliografia: SONNENWIRTH, A. C. & JARETT, L. GRADWHOLS Clinical Laboratory Methods and Diagnosis 8th ed. V. I. p. 765, 1980.