J.C. Menezes, T.P. Alves, J.P. Cardoso, Biotecnologia Microbiana: A Produo de Penicilina, cap. 12, 15 pp.

in Biotecnologia: Fundamentos e Aplicaes, N. Lima e M. Mota (eds.), DIFEL, 2000.

12 - Biotecnologia Microbiana: A Produo de Penicilina

Jos C. Menezes1,3, Teresa P. Alves4 , Joaquim P. Cardoso2,3,4
1 2

Professor Auxiliar, IST Professor Catedrtico, IST 3 Departamento de Engenharia Qumica Centro de Engenharia Biolgica e Qumica, Instituto Superior Tcnico, Av. Rovisco Pais, P-1049-001 Lisboa, Portugal; telefone: 218 417 347; fax: 218 419 062; e-mail: cardoso.menezes@ist.utl.pt 4 Administrador, PhD Companhia Industrial Produtora de Antibiticos, CIPAN, S.A., Vala-do-Carregado, P-2601-906 Castanheira do Ribatejo, Portugal. telefone: 263 856 800; fax: 263 855 086; e-mail: ta.cipan@mail.telepac.pt

SUMRIO
A descoberta e produo em massa de medicamentos capazes de combater doenas infecciosas constitui uma das maiores realizaes da humanidade. A introduo dos antibiticos em medicina marcou o incio de uma era em que doenas mortais passaram a ter cura, originando um aumento de longevidade estimado em 10 anos nos pases industrializados. Neste captulo rev-se a descoberta da penicilina e a forma como hoje em dia produzida industrialmente. Discute-se a sua produo por fermentao, a extraco dos caldos fermentados e a obteno de produtos de maior eficcia teraputica por modificao qumica da penicilina. Passados mais de meio sculo do incio da produo industrial de penicilina, subsistem ainda problemas fundamentais por resolver neste processo. Pe-se ainda em evidncia o facto dos mtodos utilizados na soluo dos problemas de engenharia bioqumica encontrados na produo industrial de penicilina se terem constitudo em paradigma na investigao e desenvolvimento da generalidade dos processos de produo dos antibiticos actualmente comercializados.

12.1 INTRODUO
A indstria farmacutica de produo de antibiticos por fermentao nasceu h ca. de 60 anos com a produo de penicilina, sendo frequentemente utilizada como exemplo de uma biotecnologia estabelecida [1]. No entanto, apesar da escala a que se produz penicilina, da sua importncia comercial e de ser o antibitico produzido h mais tempo por fermentao, o conhecimento existente sobre o microrganismo e o processo de fermentao insuficiente para que seja possvel i) por modificao gentica dos mecanismos de controlo metablico a acentuao de determinadas caractersticas de uma estirpe (e.g., produtividade) ou ii) a formulao a priori de meios e condies de cultura mais adequadas a dada estirpe. A produo de penicilina realizada por fermentao com um fungo, o Penicillium chrysogenum, no existindo processos qumicos alternativos economicamente viveis. A partir da penicilina isolada dos caldos fermentados podem ser sintetizados diversos antibiticos com um valor teraputico e comercial significativamente superior. Neste captulo revm-se sumariamente estes processos e utilizaes.

12.2 A DESCOBERTA E A PRODUO INDUSTRIAL DE PENICILINA

Muitas descobertas cientficas importantes so acidentais. A ocorrncia de factores experimentais desconhecidos ou no-controlados, com um resultado que notado mas s depois entendido, responsvel por descobertas que mudaram a histria. A descoberta da penicilina pelo escocs SIR ALEXANDER FLEMING em 1928 um bom exemplo [2]. As razes que explicam que os antibiticos no tenham sido descobertos no sculo XIX persistiam no tempo de FLEMING - pex. a inexistncia de mtodos cromatogrficos e espectrofotomtricos adequados caracterizao e isolamento de um composto com a instabilidade qumica e trmica da penicilina em soluo - a tal ponto que o feito extraordinrio da descoberta da penicilina no teve nos anos seguintes grande evoluo [3]. A importncia estratgica da penicilina na Segunda Guerra Mundial fez com que CHAIN e FLOREY, a trabalharem na aplicao clnica da penicilina desde 1938, constassem de mandatos de captura alemes em 1940. A precariedade do Reino Unido no incio da guerra obrigou FLOREY a interromper o trabalho em LONDRES sobre a penicilina e a procurar em 1941 nos EUA o apoio necessrio para a produo em larga escala. Apesar da guerra, o trabalho do grupo de CHAIN e FLOREY tornou-se conhecido em todo o mundo, originando investigao independente sobre a penicilina em vrios pases. A Holanda, onde a investigao se fez clandestinamente devido ocupao, e a Espanha, devastada pela guerra civil, tornaram-se mais tarde em grandes produtores mundiais de penicilina [2]. Pelo seu trabalho sobre a penicilina FLEMING, CHAIN e FLOREY receberam em 1945 o prmio Nobel da medicina.

12.3 O PARADIGMA DA PRODUO INDUSTRIAL DE PENICILINA

A quantidade de penicilina fabricada nos EUA na primeira metade da dcada de 40, praticamente o nico produtor neste perodo, aumentou mais de 5 ordens de grandeza com o programa concertado de investigao e desenvolvimento lanado pelo governo americano durante a guerra, atingindo-se na altura do desembarque na Normandia uma produo anual suficiente para as necessidades militares dos aliados (Fig. 12.1).

FROM ORDINARY MOLD the Greatest Healing Agent of this War

anncio na revista LIFE de 14 de Agosto de 1944

Figura 12.1 - Propaganda penicilina durante a Segunda Guerra Mundial. Desde ento a produo mundial tem aumentado, embora a uma taxa inferior, sendo actualmente superior a 20.000 ton/ano. Se se considerar a dosagem tpica por tratamento (ca. 1 a 10 g/paciente), a capacidade teraputica possvel com a quantidade de penicilina produzida em todo o mundo de de 2 a 20 mil milhes de pacientes tratados/ano, ou seja, da ordem do nmero de habitantes da Terra, nmeros impensveis h 50 anos.

Depois da penicilina, descobriram-se mais de 8.000 antibiticos, sendo hoje em dia produzidos industrialmente cerca de 170 antibiticos por fermentao e posterior modificao qumica [4]. O desenvolvimento dos processos de fabrico de todos estes antibiticos seguiu as mesmas etapas da produo de penicilina, estabelecendo-se como paradigma da investigao e desenvolvimento de processos industriais de fermentao e da prpria engenharia bioqumica:

seleco de estirpes optimizao escala laboratorial das condies de fermentao teste em instalaes piloto soluo emprica de problemas de aumento de escala caracterizao qumica e estrutural do composto activo modificao qumica do composto activo teste de formulaes em animais e seres humanos produo industrial do antibitico

A adopo no desenvolvimento e aumento de escala da maioria dos processos farmacuticos de fermentao de mtodos empricos de tentativa e erro, justificada pela sua complexidade bioqumica e a persistncia de problemas fundamentais nestes processos, como se ver adiante [5].

12.4 AS PRINCIPAIS PENICILINAS E DERIVADOS

A composio de todas as penicilinas apresenta um ncleo comum de acordo com a frmula
R CO HN N O COOH S CH3 CH3

O ncleo comum a todas as penicilinas o cido 6-amino penicilnico (6-APA) que embora seja biolgicamente inactivo o responsvel pela actividade de todas as penicilinas. A sua estrutura
H2N S
(1) (2)

CH3 CH3

N O COOH

contm 1 anel de 4 membros (1) chamado beta-lactmico e um anel de 5 membros (2) denominado anel tiazolidinico. A existncia do anel beta-lactmico em todas as penicilinas naturais ou semisintticas responsvel pela designao geral destes antibiticos de antibiticos beta-lactmicos. O Radical R d o nome penicilina respectiva de acordo com a Tabela 12.1. A estirpe original usada para a produo de penicilina na ausncia de precursor produzia m isturas das 6 primeiras penicilinas listadas na Tabela 2.1 [6]. Os estudos sobre a elucidao da estrutura da penicilina, contudo, levaram ao estabelecimento que a produo de uma dada penicilina requeria o fornecimento, normalmente em fed-batch, da cadeia lateral respectiva. Das penicilinas atrs apresentadas as nicas com interesse industrial e econmico, actualmente, so a penicilina G (benzilpenicilina) e a penicilina V (fenoximetilpenicilina), com uma produo e valor de mercado de cerca de 20.000 ton/ano e 600 milhes USD (preos correntes a granel). A obteno de uma dada penicilina est como se disse relacionada com o fornecimento da cadeia lateral durante a fermentao. Assim o fornecimento de sais de cido fenil actico (AFA) leva formao exclusiva de penicilina G enquanto que o fornecimento de sais de cido fenoxi actico (AFNA) leva formao exclusiva de penicilina V. As principais propriedades e usos destas duas penicilinas so descritas a seguir [7].

Radical R
CH2

Penicilina Correspondente (nome usual) Benzilpenicilina (Penicilina G) 2 Pentenilpenicilina (Penicilina F) 3 Pentenilpenicilina n-Amilpenicilina (Dihidropenicilina F) n-Heptilpenicilina (Penicilina K)
CH2

CH3 CH2 CH = CHCH2 CH3 CH = CHCH2 CH2 CH3 (CH2 )4 CH3 (CH2 )6

HO

p-Hidroximetilpenicilina (Penicilina X) Fenoximetilpenicilina (Penicilina V)

OCH2

Tabela 12.1 As penicilinas mais comuns.

12.4.1 - Penicilina G (Benzil Penicilina)

Frmula Bruta (cido) C16 H18 N2 O4 S (PM 344,4) CAS 61-33-6 Frmula Bruta (Sal de Potssio) C16 H17 N2 O4 SK (PM 372,5) CAS 113-98-4

12.4.1.1 - PROPRIEDADES FSICAS (SAL DE POTSSIO)

Slido cristalino branco, sem cheiro quando puro, solvel em gua, higroscpico, instvel a cidos e alcalis. Ponto de fuso 215C com decomposio. Uma miligrama de penicilina G potssica equivalente a 1.595 unidades (Oxford units).

12.4.1.2 FRMULA
CH2 CONH N O S CH3 CH3 CO 2X

X=H X=K

benzylpenicilina sal de potssio

12.4.1.3 - UTILIDADE
Matria prima para as snteses de 6-APA, 7-ADCA penicilamina e outros derivados. Substncia teraputica em medicina humana e veterinria. Altamente activa contra bactrias Gram positivas sensveis penicilina por exemplo Streptococcus pyogenes e cocci Gram negativos, tambm activa contra Bacillus anthracis, Treponema pallidum e outras bactrias. geralmente administrada por injeco. utilizada como promotor de crescimento em feed aditivos para porcos e galinhas.

12.4.1.4 FORMAS COMERCIAIS MAIS IMPORTANTES E SUA QUALIDADE

Sal de potssio; crude, Pharm. Eur., USP, estril. Sal de sdio; Pharm. Eur., USP, estril. Sal de Procana; feed grade, Pharm. Eur., USP, estril. Sal de Benzatina; Pharm. Eur., USP, estril e no estril. Misturas e formulao de todos os sais acima.

12.4.2 - Penicilina V (Fenoximetil Penicilina)

Frmula Bruta (cido) C16 H18 N2 O5 S (PM 350,4) CAS 87-08-1 Frmula Bruta (Sal de Potssio) C16 H17 N2 O5 SK (PM 388,5) CAS 132-98-9

12.4.2.1 - PROPRIEDADES FSICAS (SAL DE POTSSIO)

Slido cristalino branco, sem cheiro quando puro, solvel em gua, higroscpico, instvel a alcalis, moderadamente estvel ao cido do estomago. Ponto de Fuso 200 - 210C com decomposio. Uma miligrama de penicilina V potssica equivalente a 1.670 unidades.

12.4.2.2 FRMULA
S OCH2CONH N O CH3 CH3 CO 2X

forma cida X = H; sal de potssio X = K

12.4.2.3 - UTILIDADE
Matria prima para as snteses de 6 -APA, 7 -ADCA, cefaclor e outros derivados. Substncia teraputica oralmente activa contra bactrias Gram positivas sensveis penicilina por exemplo Streptococcus pyogenes e cocci Gram negativos. menos activa em geral que a penicilina G mas uma terapia efectiva quando os microrganismos lhe so sensveis.

12.4.2.4 FORMAS COMERCIAIS MAIS IMPORTANTES E SUA QUALIDADE

Sal de Potssio; crude, Pharm. Eur., USP.

12.4.3 Penicilinas Semi-Sintticas e Derivados

Como se viu o ncleo activo de todas as penicilinas o cido 6-aminopenicilnico ou abreviadamente 6 -APA. Este composto biologicamente inactivo foi primeiramente detectado em fermentaes de penicilina onde era inexistente a presena de cadeias laterais (precursor) para formar a molcula de penicilina. Na produo de penicilinas semi-sintticas o ncleo activo da penicilina, 6-APA, acilado por condensao com vrios compostos cada contendo um radical que d origem penicilina semi-sinttica particular.

12.4.3.1 - PRODUO DE PENICILINAS SEMI-SINTTICAS

Aps as experincias falhadas de obter o 6-APA por mtodos biolgicos foi desenvolvido pela Gist Brocades um mtodo qumico de alto rendimento que posteriormente foi adoptado pelos vrios produtores de 6 -APA. Este mtodo qumico recorria ao uso de compostos muito txicos e corrosivos e utilizava temperaturas extremamente baixas da ordem dos - 30 a - 40C [8]. Posteriormente foi desenvolvido o mtodo enzimtico com enzimas imobilizadas de produo de 6-APA quer a partir da penicilina G quer a partir da penicilina V devido s vantagens do mtodo enzimtico sobre o mtodo qumico mais econmico e muito menos poluente [8]. Actualmente praticamente todos os produtores de 6-APA usam o mtodo enzimtico usando enzimas imobilizadas. A penicilina G hidrolisada a 6-APA pela enzima penicilina G acilase enquanto que a penicilina V hidrolisada a 6-APA pela enzima penicilina V acilase. A produo de penicilinas semisintticas pode ser visualizada no seguinte esquema reaccional simplificado [9]:
NH 2 R Cl
+

S N

CH 3 CH 3

HN N O

CH 3 CH 3

CO 2H

CO 2H

Agente Acilante

6 - APA

Penicilina semi-sinttica

Cada radical R usado d origem a uma dada penicilina semi-sinttica: Radical R Penicilina Semi-Sinttica
CH C O OH CH C O

NH2

NH2

Ampicilina

Amoxicilina

As penicilinas semi-sintticas so antibiticos de largo espectro e resistentes a pH baixo podendo ser tomadas oralmente. Contudo, no so resistentes a beta-lactamases.

12.4.3.2 - PRODUO DE DESACETOXICEFALOSPORINAS

Actualmente existem no mercado trs desacetoxicefalosporinas semi-sintticas tambm chamadas cefalosporinas orais nomeadamente cefalexina, cefradina e cefadroxil. So antibiticos de largo espectro resistentes a pH baixo e com alguma resistncia a beta-lactamases. Estas cefalosporinas obtm-se pela condensao de compostos adequados com um derivado da penicilina (G ou V) o cido 7 aminodesacetoxicefalospornico ou 7-ADCA. Existem duas possibilidades para a produo do 7 -ADCA: a) mtodo exclusivamente de sntese qumica e b) mtodo misto onde a hidrlise da chamada Cefalosporina G (cido 7 fenil acetamido desacetoxicefalospornico) feita enzimaticamente usando a mesma enzima que hidrolisa a penicilina G a 6 -APA [10]. A produo de cefalosporinas orais pode ser visualizada no seguinte esquema reaccional simplificado [11]:

Agente Acilante

7-ADCA

Cefalosporina Oral

Cada radical R usado d origem a uma dada desacetoxicefalosporina semi-sinttica ou cefalosporina oral:
CH NH 2 C O CH NH2 C O HO CH NH 2 C O

Radical R

Cefalosporina Oral

Cefalexina

Cefradina

Cefadroxil

12.4.3.3 - PRODUO DE CEFACLOR E CEFROXADINA

O cefaclor e a cefroxadina so importantes frmacos produzido por complexos processos de sntese qumica a partir da penicilina V. So antibiticos de largo espectro resistentes a pH baixo e com alguma resistncia a beta-lactamases. Estruturalmente o Cefaclor muito semelhante cefalexina com a diferena que no cefaclor na posio 3 existe um tomo de cloro em vez de um grupo CH3 . A cefroxadina semelhante Cefradina com a diferena que na posio 3 existe um grupo OCH3 em vez de um grupo CH3 . Simplificadamente pode representar-se a sntese do cefaclor e da cefroxadina pelos esquemas [11] abaixo:

vrios passos de sntese orgnica

Penicilina V
vrios passos de sntese orgnica

Cefaclor

Penicilina V

Cefroxadina

12.5 A FERMENTAO DE PENICILINAS

Quer a penicilina G quer a penicilina V so produzidas industrialmente do mesmo modo em reactores agitados, com arejamento, operados em fed-batch (i.e., alimentao contnua de vrias substncias a uma fermentao descontnua). Este modo de operao permite um melhor controlo das condies de fermentao do que os modos contnuo ou descontnuo, conseguindo-se com a adio controlada de um acar facilmente metabolizvel manter na fase de produo uma actividade catablica adequada fermentao da penicilina. A operao fed-batch permite manter ao mesmo tempo as condies de fermentao em estado quase-estacionrio e a cultura em estado transiente (i.e., vivel), sendo indispensvel a uma boa produo de antibitico, dado que permite: 1. operar o fermentador entre os limites superior e inferior de actividade catablica (e.g., evitando a represso catablica) 2. operar abaixo dos nveis de inibio/toxicidade por substncias essenciais biossntese (e.g., fonte-N e precursor) 3. reduzir a durao da fase de crescimento (acelerando o crescimento) 4. prolongar a durao da fermentao (manter a biomassa vivel mais tempo) 5. operar a concentraes de biomassa elevadas e constantes (i.e., utilizar eficientemente a biomassa produzida) 6. repr a gua evaporada com o arejamento da cultura (contrariando o aumento de viscosidade do caldo e a consequente co-limitao pelo O2 ) A preparao do inculo para a fermentao comea com a inoculao de bales de 500 ml, contendo 100 ml de meio de cultura, com espros de P. chrysogenum. Os bales so em seguida colocados num agitador orbital, numa cmara a 25C e aps 4 dias o caldo de cultura resultante utilizado para inocular bales contendo 2 l de meio. O caldo desta segunda etapa em bales utilizado como inculo para nova fermentao vegetativa, com a durao de apenas 2 dias, num tanque de 100 l com agitao, arejamento, arrefecimento e controlo de pH e T . Por fim, num tanque com 500 l de meio, produz-se, aps 3 dias, um volume de cultura suficiente para inocular at 120 3 3 m de meio em tanques com 200 m de capacidade [12]. Os meios de cultura industriais so formulados com matrias primas fontes de C & N a maioria das quais so complexas em termos de composio qumica (e.g., gua da macerao de milho, melaos, leos vegetais ou gorduras animais). Aps a inoculao do meio segue-se um curto perodo de operao descontnua (ca. 12 h). Em seguida e at ao fim da fermentao so adicionadas diversas substncias (viz., acar, AFA ou AFNA, sais, leos, gorduras, correctores de p H). A regulao das adies ao longo da fermentao (ca. 180 a 220 h) depende da estirpe utilizada. Por exemplo, a adio de acar faz-se normalmente com um xarope de glucose ou sacarose (303 50%) com um caudal decrescente durante a fermentao (de 2,0 a 1,0 kg/m /h). Os perfis de alimentao utilizados industrialmente tm, segundo alguns dos maiores produtores mundiais (e.g., GIST -BROCADES e NOVO -NORDISK ), como principal objectivo reduzir ao mnimo a lise da cultura, mantendo constante a concentrao de biomassa na fase de produo. Assim, a taxa de adio mantida dentro de bandas nominais de operao que correspondem a partir do terceiro dia de fermentao a caudais aproximadamente constantes.

Durante a fermentao, o pH e a T so mantidos constantes (6,5 e 25-27C, respectivamente) e a conduo do processo quase exclusivamente manual com procedimentos estabelecidos empiricamente para a estirpe utilizada. A velocidade de arejamento est normalmente entre 0,5 e 3 3 1,0 m de ar / m de meio/min (vvm), dependendo da estirpe, fermentador e velocidade de agitao (viz., 120-150 rpm). Tratando-se de um microorganismio filamentoso, para evitar problemas de disperso de oxignio no meio, procura-se com uma formulao adequada do meio de cultura e das condies operatrias, obter escala de produo uma morfologia de pellets pequenos e pouco compactos, com menores viscosidades e maiores produtividades do que a morfologia filamentosa. Na produo industrial de penicilina (G ou V) so utilizadas duas estratgias de conduo da fermentao no que respeita evoluo do volume de meio dentro do fermentador. Devido adio de nutrientes durante a fermentao o volume dentro do fermentador vai aumentar desde o incio at ao fim da fermentao. Uma das estratgias consiste em fazer periodicamente descargas parciais do meio fermentado que iro ser processadas juntamente com a descarga final do fermentador. A outra estratgia consiste em iniciar a fermentao com um volume tal que no fim da mesma atingido o volume mximo do fermentador, no havendo assim descargas parciais. A primeira estratgia implica ,menos investimento de capital para a mesma capacidade de produo. Na Figura 12.2 apresentam-se os perfis de concentrao tpicos das espcies mais importantes numa fermentao semi-descontnua de penicilina G, com meios complexos [12;13].
100 80 N-amoniacal 60 pH

concentraes (u.a.)
penicilina oxignio dissolvido

40

biomassa

20 acares redutores 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160

t (h)

Figura 12.2 - Perfis de concentrao principais das espcies numa fermentao semi-descontnua
de penicilina G (adaptado de [13]). Os valores para as concentraes no caldo durante a fermentao so tipicamente: X=1-40 g-DMW/l, PENG=0-50 g-PENG/l, O2=100-50%sat., acares redutores=200,5 g-glucose/l, N=0,80-0,25 g-NH3/l, pH 6,5. As taxas especficas de consumo dos substratos determinadas por [13] em cultura contnua (=0,015 h -1) podem ser usadas para calcular os caudais alimentados fermentao fed-batch (mg/g-DMW /h): C (glucose)=60, O2=40-50, N (amnia)=2,0, P (fosfato)=0,6, S (sulfato)=2,8, precursor (AFA)=1,8.

12.5.1 - Metabolismo Primrio

As estirpes industriais consomem simultnea ou consecutivamente as diversas fontes de C & N presentes nos meios industriais, os quais contm acares, lpidos, cidos orgnicos e aminocidos, de acordo as vias metablicas conhecidas, mas evidenciando mecanismos de regulao complexos e muito pouco estudados nestas estirpes (Quadro 12.1) [14].

12.5.2 - Metabolismo Secundrio

A quantidade de penicilina G (ou V) produzida por estirpes de productividade elevada da mesma ordem da concentrao de biomassa (como peso seco) no fim de uma fermentao - i.e., 50 g-PENG/l-caldo. Podem imaginar-se as quantidades de nutrientes e precursores (e.g., AA)

processadas atravs das vias metablicas do P. chrysogenum para que se atinjam ttulos de penicilina desta ordem. A biosntese da penicilina-G semelhantemente da penicilina V envolve a condensao do cido -aminoadpico (-AAA), da cistena (CYS) e da valina (VAL), num tripptido, o -(-aminoadipil) cisteinilvalina (ACV). Em seguida, o tripptido ciclizado formando-se a isopenicilina-N (IPN) - o primeiro composto com actividade antibitica do metabolismo. No passo seguinte, a cadeia aminoadipato permutada por fenilacetato, produzindo-se a penicilina G (Quadro 12.2).

polissacridos pentoses hexoses glicerol triose fosfato lpidos piruvato

gluconato histidina fenilalanina lactato valina cistena/cistina alanina treonina isoleucina

CO 2

H2O

acetil~S-CoA leucina oxaloacetato aspartato metionina malato fumarato citrato isocitrato

-aminoadipato
lisina arginina glutamato

2H
CO2

-cetoglutarato
succinato

O catabolismo de hexoses (converso de compostos C6 em C3) realizado no P. chrysogenum por duas vias concorrentes, mas com algumas semelhanas nomeadamente porque terminam ambas em piruvato. O catabolismo destes cidos carboxlicos prossegue com a converso em acetato e oxidao completa deste a CO2 no ciclo do cido tricarboxlico (TCA). Devido oxidao incompleta de hexoses podem acumular-se no microrganismo vrios intermedirios do catabolismo como cidos orgnicos de C2 (e.g., acetato) a C6 (e.g., gluconato). O catabolismo de lpidos (cidos gordos) necessita de ATP e acetil~S-CoA, convertendo-se por passos o cido de cadeia longa em diversas molculas de acetil~S-CoA. A acetil~S-CoA pode depois, via ciclo do TCA, ser convertida em ATP gerando uma quantidade significativa de energia. A desregulao do ciclo do TCA por uma actividade catablica demasiado intensa, conduz como anteriormente, acumulao de intermedirios cidos do ciclo (C2 a C4). O catabolismo de aminocidos envolve primeiro a desaminao em cidos carboxlicos e depois oxidao destes nas vias utilizadas no catabolismo dos cidos do ciclo do TCA. Finalmente, ao esgotar as fontes de carbono disponveis num meio de fermentao complexo, o microrganismo inicia o catabolismo dos reservatrios intracelulares de cidos carboxlicos C2 a C6 acumulados anteriormente. Durante a fase catablica realiza-se o anabolismo de aminocidos necessrios sntese de protenas no P. chrysogenum. A sntese de aminocidos utiliza, como precursores os aminocidos assimilados do meio de fermentao, ies amnio intra e extracelulares, e os intermedirios cidos do catabolismo de acares, lpidos, cidos carboxlicos e aminocidos.

Quadro 12.1 - O metabolismo primrio e intermdio do Penicillium chrysogenum.

12.5.3 - Caractersticas de Estirpes Industriais

A biossntese da penicilina envolve 3 enzimas e portanto 3 genes responsveis pela sua expresso. A simplicidade aparente da biossntese no sugere a existncia de quaisquer problemas na sua compreenso. Contudo, s h menos de 10 anos se conseguiram clonar estes genes e se verificou que constituem um cluster permitindo antever aumentos de produtividade com amplificao simultnea dos trs genes relacionados com a sntese das enzimas biossintticas [15]. A evidncia recente sobre os reservatrios intracelulares dos trs aminocidos precursores da penicilina, revela uma muito maior complexidade do que inicialmente se supunha. O microrganismo constitui reservas diferenciadas dos AA, segundo o tipo de utilizao - i.e., biossntese de protenas ou de penicilina - mas dispe de mecanismos de troca entre os diferentes compartimentos [16]. Em estirpes de produtividade elevada, a permuta entre reservatrios de

determinado AA muito rpida, ocorrendo a velocidades muito superiores de estirpes de baixa produtividade [16]. Os mecanismos genticos de regulao da expresso das enzimas da biossntese da penicilina so ainda muito pouco conhecidos, embora envolvam, semelhana de outros organismos com elevada homologia gentica com o P. chrysogenum, a represso catablica por fontes de C e N facilmente metabolizveis e a regulao pelo fosfato. Uma das explicaes sugeridas para a elevada produtividade das estirpes industriais a capacidade de produzirem e acumularem maiores quantidades de precursores e intermedirios do metabolismo secundrio (e.g., -AAA) e de maiores concentraes intracelulares das enzimas biossintticas, com maior actividade especfica, em relao a estirpes no-industriais [14;15;17]. tambm conhecido que estirpes de produtividade elevada excretam quantidades significativas de 6-APA e praticamente no oxidam o precursor [14;18;19].

L-cistena

cido L - - aminoadpico AAA ) ( -

L-valina

-(L- -aminoadipil)
cisteinil-D-valina (LLD - ACV )

ciclizao em 2 passos

isopenicilina-NIPN ) (

fenilacetato (activado)

benzil-penicilinaPENG ) (

Quadro 12.2 - A biossntese de penicilina-G pelo P. chrysogenum.

12.6 O ISOLAMENTO DA PENICILINA DOS CALDOS FERMENTADOS

Os processos de isolamento da penicilina G e da penicilina V so semelhantes pelo que se iro descrever em conjunto. Consistem basicamente de duas operaes: extraco seguida de cristalizao. No fim da fermentao o caldo fermentado, contendo ou no descargas parciais, arrefecido a temperaturas abaixo dos 10C e enviado para o sector de extraco onde por adio de uma

determinada percentagem de formol (0,5 1%, se procede inactivao do microorganismo). A adio deste composto tem tambm por objectivo a preveno da degradao da penicilina por aco das beta-lactamases.

12.6.1 - Extraco dos Caldos Fermentados

Quaisquer que sejam os processos de extraco de penicilina (G ou V) o objectivo obter um solvente rico neste antibitico, normalmente o acetato de butilo, a partir do qual se isola o antibitico [7]. Normalmente o rendimento global de extraco depende pouco do mtodo utilizado e ronda os 85 90%. Para se obter a soluo rica do antibitico no acetato de butilo podero pelo menos utilizar-se os trs processos alternativos descritos a seguir.

12.6.1.1 - EXTRACO USANDO FILTROS ROTATIVOS E EXTRACTORES CONTNUOS PODBIELNIAK

O caldo fermentado contendo ou no descargas parciais, ao pH de fermentao (cerca de 6.5) e a cerca de 10C, alimentado a filtros rotativos sob vcuo de tipo especial string discarge filters onde feita a separao slido/lquido. Durante a filtrao o bolo do filtro lavado com gua de modo a que o filtrado emerja do filtro com uma concentrao de penicilina da ordem das 20.000 U/ml. O rendimento desta operao ([penicilina no caldo filtrado/penicilina no caldo fermentado] x 100) situa-se normalmente nos 90 95%. A extraco da penicilina do caldo filtrado efectuada com solventes imiscveis com a gua sendo o mais comum o acetato de butilo. O pH ptimo de extraco situa-se na gama 2 10%. Esta extraco efectuada em contracorrente em extractores contnuos de vrios andares sendo o mais vulgar destes extractores o Podbielniak. Conforme as necessidades de caudal e o rendimento requerido podem ser usados grupos de mquinas em srie. O esquema de extraco mostrado na figura seguinte:
Agente antiemulsionante cido sulfrico diludo Agente molhante Caldo de Penicilina Caldo exausto de Penicilina

Podebielniak
Acetato de Butilo Rico Acetato de Butilo

Do acetato de butilo rico obtido pode-se isolar a penicilina G ou V sob a forma de sal de potssio por alguns processos diferentes.

12.6.1.2 - EXTRACTORES DECANTADORES (WHOLE BROTH EXTRACTORS)

Os extractores decantadores so mquinas desenvolvidas pela Westflia que permitem a extraco directa do caldo fermentado para o solvente (normalmente acetato de butilo). Existem vrios modelos de mquinas que s diferem no caudal que podem processar. Normalmente as mquinas so combinadas em srie e o rendimento obtido ([penicilina no solvente/penicilina no caldo fermentado] x 100) depende do nmero de mquinas em srie. Para duas mquinas em srie o rendimento da ordem de 96% enquanto que para 3 mquinas em srie o rendimento se aproxima de 98%. O investimento numa terceira mquina pode todavia no compensar o aumento de rendimento. Devido ao facto de a separao no Extractor Decantador dar origem a um solvente com algum grau de turvao necessrio existir a montante um clarificador do tipo separador lquido / lquido. O processo de extraco da penicilina para o acetato de butilo processa-se nas seguintes condies. O caldo fermentado com ou sem descargas parciais alimentado ao sistema de extractores a uma temperatura da ordem dos 10C. O pH ptimo para a extraco situa-se na gama 2 10%. A

quantidade de solvente a utilizar tendo em conta o rendimento de extraco calculada para ter um solvente rico contendo cerca de 70.000 U/ml de penicilina.

O esquema de extraco usando dois extractores decantadores em srie o seguinte:

caldo agentes molhantes fermentado solvente fresco H2 SO4 solvente semi rico

solvente rico

caldo semi exausto caldo exausto + +miclio

12.6.1.3 - COMBINAO DE SISTEMAS DE MEMBRANAS COM EXTRACTORES CONTNUOS TIPO PODBIELNIAK

Este sistema provavelmente o menos utilizado na indstria de produo de penicilina mas constitui uma opo vlida. Este sistema advogado para separao slido/lquido em antibiticos que necessitam de utilizar adjuvante de filtrao na filtrao convencional o que no normalmente o caso da fermentao de penicilina. Basicamente o sistema de filtrao por membranas para a separao slido/liquido da penicilina dever incluir uma microfiltrao com diafiltrao como uma primeira operao de filtrao. Nesta introduzido um factor de diluio aprecivel seguindo-se uma concentrao do caldo filtrado por nanofiltrao ou osmose inversa. A nanofiltrao tem vantagens sobre a osmose inversa j que a grande maioria dos sais inorgnicos sero eliminados atravs da membrana o que no acontece na operao de osmose inversa. Aps obteno do caldo filtrado rico em penicilina com um rendimento de 9095% a extraco efectuada para acetato de butilo em Podbielniaks como descrito na primeira alternativa.

12.6.2 - Cristalizao da Penicilina (G ou V)

Independentemente do processo utilizado para a obteno do acetato de butilo rico em penicilina os processos de cristalizao da penicilina so basicamente os mesmos. Iremos apenas descrever um dos processos de cristalizao mais utilizados industrialmente que permite obter uma penicilina G potssica de excelente qualidade. Neste processo o acetato de butilo rico em penicilina primeiro descolorado com carvo activado o qual removido por filtrao. O solvente purificado contactado com uma soluo de bicarbonato de potssio a cerca de 23% de modo a que o pH de extraco seja cerca de 6,2 6,5. A razo volumtrica de solvente/soluo de bicarbonato de potssio tal que a concentrao de penicilina na soluo de bicarbonato de potssio seja da ordem das 550 000 U/ml tendo em conta o rendimento de extraco que da ordem dos 98%. As duas fases, orgnica e aquosa, aps um perodo de contacto adequado so separadas num separador centrfugo lquido/lquido sendo o solvente exausto enviado para a instalao de recuperao de solventes. A fase aquosa que contm a penicilina extrada como se disse numa concentrao de cerca de 550.000 U/ml ento processada para cristalizao da penicilina do seguinte modo: cerca de 4 volumes de n-butanol so adicionados soluo aquosa rica em penicilina e procede-se de seguida destilao da mistura a baixa presso e a baixa temperatura para no degradar a penicilina. O butanol forma um azeotropo com a gua com uma composio aproximada de 63% de butanol e 37% de gua (peso/peso). medida que prossegue a destilao a gua vai sendo removida at que se atinge a situao em que o butanol existente no evaporador/cristalizador tem uma humidade inferior a 1%. A operao

de destilao ento terminada e a suspenso dos cristais de penicilina potssica enviada para filtros adequados. Aps filtrao os cristais so lavados com butanol e depois de secos com ar no filtro so descarregados para secadores. Aps secagem so peneirados, misturados, embalados e analisados.

12.7 PRODUO DE PENICILINA G POTSSICA EM PORTUGAL

A actual Brocades Portuguesa em Matosinhos tem uma instalao de produo de penicilina G potssica mas a sua capacidade no conhecida. A CIPAN S.A. embora no produza industrialmente penicilina detm know-how de fabrico quer ao nvel fermentativo quer extractivo para este antibitico. A deteno deste know-how permitiu j CIPAN S.A. a construo de uma fbrica para a produo de penicilina G potssica em Madras no sul da ndia com uma capacidade de cerca de 700 ton/ano.A fbrica entrou em funcionamento em 1994 tendo o investimento sido de cerca de 55 milhes de USD (1994). constituida por trs sectores distintos: fermentao semi-descontnua com um volume instalado de 1.000 m3 , extraco com capacidade para cerca de 2.200 Kg/dia de penicilina G potssica e unidade de recuperao de solventes. As Figuras 12.3A e 12.3B mostram aspectos desta fbrica. O desenvolvimento da tecnologia de produo da penicilina G foi levado a cabo na Instalaao Piloto de Fermentaoda CIPAN, S.A. constituida por vrios fermentadores e respectivos sistemas de controlo com capacidades desde 200 a 1.050 litros. As Figuras 12.4A e 12.4B do uma ideia desta instalao.

Figura 12.3 - Vista parcial da fbrica para a produo de penicilina G potssica em

Madras, ndia, construda pela CIPAN em 1994. A. Edifcio de extraco e a zona de utilidades em construco; B. Vista geral da fbrica acabada.

12.8 CONCLUSO
A indstria farmacutica d produo de antibiticos por fermentao nasceu h 50 anos com a e produo de penicilina. Neste artigo mostrou-se o empreendimento extraordinrio de engenharia que foi o desenvolvimento do processo de cultura submersa para a produo industrial de penicilina. O esforo conjunto de microbiologistas e engenheiros, ao longo de mais de 50 anos, permitiu aumentar quase 5 ordens de grandeza os ttulos finais de penicilina numa fermentao [1;3]. Mostrou-se a importncia que a penicilina tem actualmente quer pelo seu valor teraputico intrnseco, nomeadamente em formulaes veterinrias, quer como matria prima para a produo de diversos antibiticos derivados mais eficazes sob o ponto de vista de espectro bacteriano, de estabilidade a pHs baixos e de resistncia a beta-lactamases. Esta resistncia a beta-lactamases

pode ainda ser drasticamente aumentada por formulao com compostos inibidores de beta-lactamases, sendo os mais representativos o cido clavulnico o sulbactam e o tazobactam. Por esta razo, apesar do aparecimento de um nmero crescente de bactrias patognicas resistentes a antibiticos beta-lactmicos a penicilina tem mercado assegurado pelo menos durante a prxima dcada [7;9;11;20].

A a)

B b)

Figura 12.4 - Vista parcial da INSTALAO-PILOTO da CIPAN.

A. Perspectiva geral de um fermentador de 1.050 l; B. Topo do tanque com as entradas para adies e o mdulo de controlo.

12.9 PROBLEMAS DE REVISO

1. Qual a quantidade em gramas que corresponde a um BOU de Penicilina G Potssica e a um BOU de Penicilina V Potssica (BOU < > Billion Oxford Units) ? 2. As massas moleculares da Penicilina G Benzatnica e da Penicilina G Procana so respectivamente 909 e 588,7 g/mole, contendo a primeira duas molculas e a segunda uma molcula de Penicilina G sob a forma cida. Quais so as actividades tericas de cada uma destas penicilinas expressas em U/mg ? 3. A resistncia desenvolvida por microorganismos amoxicilina muito maior do que mistura de amoxicilina e clavulanato de potssio (inibidor de beta-lactamases). Justifique a razo deste fenmeno. 4. A Penicilina G e seus sais s podem ser administradas por via injectvel enquanto que a penicilina V pode ser administrada por via oral. Porqu ? 5. Na hidrlise enzimtica da Penicilina G a 6-APA pela Penicilina G Amidase qual o volume de hidrxido de sdio 4N necessrio para converter 50 kg de Penicilina G a 6-APA com 98% de converso ? 6. Qual a morfologia mais favorvel produo de penicilina e porqu ? 7. Em qual dos tipos limites de morfologia filamentosa ou em pellets de esperar, para as mesmas condies de cultura no seio do meio de fermentao, maior represso catablica por substratos facilmente metabolizveis ? 8. A partir dos dados na Fig. 12.2, calcule as quantidades aproximadas de substratos e precursor consumidas numa fermentao de Penicilina com durao tpica, conduzida num fermentador de 100 m3 com um volume til 70% do volume nominal. 9. Sabendo que a concentrao em g/l de pptidos solveis (C5,0 H9,8 O2,4 N1,4 S0,02) devidos formulao do meio de cultura com guas de macerao de milho, ca. de metade da de acares redutores no incio da fermentao, e assumindo a exausto do meio em pptidos

solveis na fase de crescimento, calcule a importncia desta fonte C em relao a outras fontes presentes na formao de biomassa at s 40 h de fermentao (despreze a existncia de lise). 10. Na extraco de Penicilina G de um caldo fermentado com um ttulo de 65.000 U/ml obteve-se 36 kg/m3 de Penicilina G Potssica com uma actividade de 1.585 U/mg. Qual foi o rendimento global da operao de extraco ?

Palavras-Chave
Pencillium chrysogenum, penicilina, produo de antibiticos, fermentao de antibiticos, extrao de antibiticos, beta-lactmicos, 6-APA, penicilinas semi-sintticas

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