Cumin These

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE EL-HADJ LAKHDAR-BATNAFACULTE DE SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
MEMOIRE
Prsent pour lobtention du diplme de
MAGISTER
En Biologie Option : Biochimie Applique Par : ATHAMENA Souad
THEME
ETUDE QUANTITATIVE DES FLAVONOIDES DES GRAINES DE Cuminum cyminum ET LES FEUILLES DE Rosmarinus officinalis ET LEVALUATION DE LACTIVITE BIOLOGIQUE
Devant le jury : Prsident : Mr YAHIA Mouloud M.C luniversit de Batna M.C luniversit de Batna M.C luniversit de Batna M.C luniversit dOum El Bouaghi
Rapporteur : Mr LAROUI Salah Examinatrice : Mme HAMBABA Leila Examinateur : Mr ZALLAGUI Amar
Anne universitaire : 2008-2009
REMERCIEMENTS
Je tiens tout dabord remercier mon directeur de mmoire, Monsieur Laroui Salah. Recevez ici mes sincres remerciements pour la confiance, les conseils que vous
m'avez accords tout le long de ce travail. Merci galement pour votre encadrement, votre disponibilit et votre gentillesse. Je vous adresse ma profonde reconnaissance pour vos remarques et conseils en vue damliorer ce manuscrit.
Mes remerciements vont aussi aux membres de jury : Monsieur Zallagui Amar
de lUniversit dOum El Bouaghi , Monsieur Yahia Mouloud, Madame Hambaba Leila tous deux de lUniversit de Batna. Recevez mes plus vifs remerciements pour avoir accept de juger ce travail.
Ma profonde reconnaissance va Madame Hambaba Leila, je n'oublie pas votre

soutien moral qui m'a souvent aid remonter la pente dans les moments difficiles.
Je remercie galement Messieurs Kasseh Laouar Ahmed et Chalghem Ikbal C.H.U Batna- Veuillez trouver ici lexpression de ma gratitude pour mavoir accueilli au sein de vos laboratoires. Soyez assur de mon profond respect et de ma vive reconnaissance pour mavoir fait bnficier de vos expriences et de vos rigueurs scientifiques et professionnelles.
A vrai dire, je ne sais pas comment vous remercier Messieurs Akkal Salah et
Benkiniwar Rachid -Universit Constantine- pour tout ce que vous m'avez apport, transmis et appris lors de ce travail. Merci pour lnorme contribution que mavez apporte afin de mener bien ce travail.
Je tenais te remercier chaleureusement Monsieur Abddaim Mohamed pour ton

soutien moral, pour ton aide technique et scientifique.
Une pense particulire pour Louaer Souhila, Segni Nariman, Harkat Hassina,
Boudiaf Kawthar, Meziti Asma, Khebri Souad, vous tiez toujours mes cts et vous m'avais toujours apport le soutien. Pour cela, je vous remercie chaleureusement.
Je remercie tous les membres des laboratoires de bactriologie et de parasitologie pour

leur aide prcieuse.
A tous ceux qui de prs ou de loin ont contribu la ralisation et au bon droulement
de ce travail.
Enfin, pour leur soutien sans faille et permanent, je tiens remercier de tout c mon ur
pre, mes frres et mes s urs.
LISTE DES ABREVIATIONS

ADN : AlCl3 : ATCC : AZA : BHA : BHT : BLSE : CAT : CCM : CHN : DPPH : DMH : DMSO : EAcOEt : EBr : En-BuOH : ERO : GSH : HCl : IgAs : HPLC : SOD : sp : UV-Vis : UFC : VIH : Acide dsoxyribonuclique Trichlorure dAluminum American type culture collection Azathioprine Butyle hydroxytolune Butyle hydroxytolune Btalactamase spectre largi Catalase Chromatographie sur couche mince Cphalosporinase haut niveau 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,2-dimethyl hydrazine Dimethyl sulfoxyde La fraction de lactate dthyle Lextrait brut (hydro-mthanolique) La fraction du n-butanol Espces ractives de loxygne Glutathion Acide chlorhydrique Immunoglobuline A scrtoire Chromatographie liquide haute performance Superoxyde dismutase Species (Espce) Ultraviolet/Visible Units formant des colonies Virus de lImmunodficience Humaine
GLOSSAIRE
Aflatoxine : est une mycotoxine produite par des champignons prolifrant sur des graines en atmosphre chaude et humide. Alcalodes : Substances azotes basiques trs actives, mais souvent trop toxiques pour tre utilises en phytothrapie. Aleurone : une protine prsente sous de grains dans lalbumen de nombreuses graines. Analgsique : apaise ou supprime la douleur. Anthocyane : compos htrocyclique oxygn li deux noyaux benzniques. Antispasmodique : cesse les spasmes, contractions involontaires des muscles et des organes, dorigine nerveuse. Apritif : provoque l'apptit en agissant sur les organes digestifs et les glandes. Arbrisseau : plante ligneuse haute de 3 5 mtres. Arbuste : plante ligneuse haute de 1 3 mtres. Asthnie : dpression de ltat gnral. Astringent : qui diminue les secrtions et favorise les cicatrisations. Carminatif : qui provoque lexpulsion des gaz intestinaux. Cataplasme : ancienne forme pharmaceutique pteuse, applique sur la peau pour combattre une inflammation. Cholagogue : facilite l'vacuation des voies biliaires, action bnfique pour le foie et le tube digestif. Cholrtique : augmente la scrtion biliaire. Choline : base quaternaire de structure amino-alcool. Coumarine : compos htrocyclique oxygn insatur comportant une fonction ctone et un noyau benznique. Diterpne : compos form de vingt atomes de carbone. Diurtique : qui augmente le volume urinaire et llimination des chlorures, du sodium, du potassium, de lure et de lacide urique dans les urines. Dyspepsie : un ensemble de symptmes de douleur ou de malaise pigastrique. Emmnagogue : qui provoque, facilite ou augmente les rgles. Fbrifuge : prvient les accs de fivre et permet de combattre celle-ci. Lactones : ester interne (perte dune molcule deau intramolculaire) dun acide-alcool ou dun acide phnol. Msophylle : la plus grande partie de lintrieur dune feuille.
Monoterpnes : se sont une classe de terpnes constitus de deux molcules disoprne C5H8 Mucilage : substance glucidique qui se gonfle au contact de leau en donnant une solution visqueuse. Ombelle : type dinflorescence dans laquelle les pdoncules sont attachs au mme point et sarrtent la mme hauteur. Phnols : carbure aromatique (cycle benznique) portant un ou plusieurs groupements Hydroxyles Phytase : enzyme naturelle qui, en hydrolysant les phytates, joue un rle essentiel dans le mtabolisme du phosphore. Saponine : substance htrosidique moussante agissant sur la permabilit des membranes. Sdatif : qui calme une activit exagre (cardiosdatif, neurosdatif). Sesquiterpne : constituant quinze atomes de carbones. Sous-arbrisseau : plante ligneuse ne dpassant pas 1 mtre. Spasmolytique : qui empche les contractions musculaires involontaires. Strol : alcool secondaire de structure ttracyclique caractristique form partir du cyclopentane et du phnanthrne hydrogn. Stomachique : facilite le travail de l'estomac et le fortifie. Tanins : substance polyphnolique non azote. Triterpnes : constituant vgtal compos de trente atomes de carbone et dont la structure chimique possde quatre ou cinq cycles. Vermifuge : expulse les vers de l'intestin. Vulnraire : en application externe, elle contribue la gurison des plaies, mais elle peut aussi tre administre oralement pour ranimer les personnes ayant subi une chute ou une blessure.
SOMMAIRE
INTODUCTION GENERALE ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre I. LES PLANTES MEDICINALES SELECTIONNEES I.1. La plante Cuminum cyminum . I.1.1. Caractristiques botaniques . I.1.2. Habitat et culture ...... I.1.3. Composition biochimique du cumin I.1.4.Utilisation du cumin . I.1.5 Proprits du cumin .. I.2. La plante Rosmarinus officinalis I.2.1. Etymologie I.2.2.Caractristiques botaniques .. I.2.3. Habitat et culture .. I.2.4. Composition biochimique du romarin . I.2.5. Utilisation . I.2.6. Proprits du romarin Chapitre II. LES FLAVONOIDES II.1.Les polyphnols . II.1.11 Classification .. II.1.2. Biosynthse . II.1.3. Effets biologiques des polyphnols II.2.Les Flavonodes .. II.2.1. Etymologie ......................................................................................................... II.2.2. Dcouverte des flavonodes II.2.3. Structure chimique ...... II.2.4. Classification ...... II.2.5. La substitution du squelette flavonique.. II.2.5.1.O- substitution II.2.5.2.C- substitution II.2.6. Origine biosynthtique II.2.7. Proprits Physico-Chimiques ....... II.2.7.1.Solubilit et lextraction . 17 17 17 18 19 19 19 19 20 21 21 22 23 25 25 1 1 2 2 3 3 7 7 7 8 8 10 10
II.2.7.2. Dosage II.2.8. Biodisponibilit des flavonodes . II.2.9. Consommation des flavonodes . II.2.10. Distribution dans les plantes II.2.11. Proprits biologiques .. II.2.12. Rles des flavonodes chez les plantes II.2.13. Emplois thrapeutiques Chapitre III. LE STRESS OXYDANT III.1. Historique III.2. Dfinition dun radical libre III.2.3. Principaux radicaux libres et leurs origines .. III.4.Rles des radicaux libres III.5. Dfinition du stress oxydant III.6. Origine du stress oxydant . III.7. Les consquences du stress oxydant III.8. Les maladies lies au stress oxydant III.9. Dfinition dun antioxydant III.10. Principaux antioxydants III.10.1 Les antioxydants endognes . III.10.2. Les antioxydants exognes ............................................................................ III.11. Mcanismes dactions des antioxydants Chapitre VI. LES SOUCHES MICROBIENNES UTILISEES VI.1. Effet antibactrien . VI.2. Mcanisme deffet antimicrobien des polyphnols VI.3 .Caractristiques des souches bactriennes utilises VI.4.Caractristiques des souches fongiques utilises ..... VI.5Antibiotiques lactamines VI.6.Mcanismes de rsistances aux -lactamines .. ETUDE EXPERIMENTALE Chapitre I. MATERIEL ET METHODES I.1. Matriel vgtal I.2. Etude chimique ....... I.2.1. Dtermination de la teneur en eau ..
25 25 26 26 26 29 30
31 31 32 33 34 34 35 35 36 36 36 36 37
38 38 39 40 42 42
43 43 43
I.2.2. Dtermination des taux de cendres .. I.2.3. Extraction . I.2.3.1 Prparation de lextrait brut I.2.3.2. Fractionnement de lextrait brut.. I.2.4. Dosage des polyphnols. I.2.5. Dosage des flavonodes I.2.5.1. Test prliminaire ... I.2.5.2. Dosage colorimtrique.. I.2.6 Analyse qualitative par HPLC. I.3.Activit biologique. I.3.1. Activit anti-oxydante . I.3.1.1.Test de blanchissement du Carotne I.3.1.2. Test au DPPH ... I.3.2. Activit antimicrobienne ... I.3.2.1. Activit antibactrienne . I.3.2.1.2. Milieux de culture . I.3.2.1.3. Prparation des solutions .. I.3.2.1.4. Mthode de diffusion en milieu glos.. I.3.2.2 Activit antifongique .. I.3.2.2.1 Souches fongiques .. I.3.2.2.2. Milieux de culture . I.3.2.2.3. Prparation des solutions .. I.3.2.2.4. Mthode de diffusion en milieu glos.. I.4. Etude statistique ......................................................................................................... Chapitre II. RESULTATS ET DISCUSSION II.1.Teneur en eau et taux de cendres.. II.2. Teneur en polyphnols II.3. Teneur en flavonodes II.3.1. Test prliminaire II.3.2. Dosage colorimtrique .. II.4. Analyse qualitative par HPLC II.5. Activit anti-oydante . II.5.1. Test de blanchissement du -Carotne
43 44 44 44 47 47 47 48 48 49 49 49 50 51 51 52 53 53 54 54 54 54 54 55
56 57 60 60 60 63 68 68
II.5.2. Test au DPPH.. II.6 . Activit antimicrobienne II.6.1. Activit antibactrienne II.6.2. Activit antifongique ........ CONCLUSION ET PERSPECTIVES REFERENCES BIBLOGRAPHIQUES
73 77 77 88
LISTE DES TABLEAUX

Tableau.1. Caractristiques des bactries utilises Tableau.2. Teneur en eau et taux de cendres . ...... Tableau.3. Teneur en polyphnols des extraits de cumin.. Tableau.4. Teneur en polyphnols des extraits de romarin .. Tableau.5. Virement de la couleur des extraits de cumin. Tableau.6. Virement de la couleur des extraits de romarin.. Tableau.7. Teneur en flavonodes des extraits de cumin.. Tableau.8. Teneur en flavonodes des extraits de romarin Tableau.9. Temps de rtention des flavonodes standards Tableau.10. Temps de rtention des flavonodes prsents dans les extraits de cumin. Tableau.11.Temps de rtention des flavonodes prsents dans les extraits de romarin Tableau.12. Diamtre de la zone dinhibition de lEBr de cumin..... Tableau.13. Diamtre de la zone dinhibition de lEBr de romarin.. Tableau.14.Diamtre de la zone dinhibition de lEAcOEt de romarin Tableau.15. Diamtre de la zone dinhibition de lEn-BuOH de romarin.... Tableau.16. La sensibilit des souches bactriennes vis--vis les extraits de cumin Tableau.17. La sensibilit des souches bactriennes vis--vis les extraits de romarin. Tableau.18. Diamtre de la zone dinhibition de LEBr du cumin + lEBr de 87 67 78 78 79 79 82 82 52 56 58 58 60 60 61 62 66 66
romarin
LISTE DES TABLEAUX Tableau.1. Caractristiques des bactries utilises Tableau.2. Teneur en eau et taux de cendres . ...... Tableau.3. Teneur en polyphnols des extraits de cumin.. Tableau.4. Teneur en polyphnols des extraits de romarin .. Tableau.5. Virement de la couleur des extraits de cumin. Tableau.6. Virement de la couleur des extraits de romarin.. Tableau.7. Teneur en flavonodes des extraits de cumin.. Tableau.8. Teneur en flavonodes des extraits de romarin Tableau.9. Temps de rtention des flavonodes standards Tableau.10. Temps de rtention des flavonodes prsents dans les extraits de cumin. Tableau.11.Temps de rtention des flavonodes prsents dans les extraits de romarin Tableau.12. Diamtre de la zone dinhibition de lEBr de cumin..... Tableau.13. Diamtre de la zone dinhibition de lEBr de romarin.. Tableau.14.Diamtre de la zone dinhibition de lEAcOEt de romarin Tableau.15. Diamtre de la zone dinhibition de lEn-BuOH de romarin.... Tableau.16. La sensibilit des souches bactriennes vis--vis les extraits de cumin Tableau.17. La sensibilit des souches bactriennes vis--vis les extraits de romarin. Tableau.18. Diamtre de la zone dinhibition de LEBr du cumin + lEBr de 87 67 78 78 79 79 82 82 52 56 58 58 60 60 61 62 66 66
romarin
INTRODUCTION GENERALE
Depuis des milliers d'annes, l'humanit a utilis diverses ressources trouves dans son environnement afin de traiter et soigner toutes sortes de maladies. Actuellement, l'organisation mondiale de la sant (OMS) estime qu'environ 80% des habitants de la terre ont recours aux prparations traditionnelles base de plantes en tant que soins de sant primaire (Lhuillier, 2007). Plus de 120 composs provenant de plantes sont aujourd'hui utiliss en mdecine moderne et prs de 75% d'entre eux sont utiliss selon leur usage traditionnel. Parmi, les 25 composs pharmaceutiques les plus vendus au monde, 12 d'entre eux sont issus de produits naturels. Cela signifie que le nombre de mdicaments issus de produits naturels est suprieur celui issus de la chimie combinatoire o plus de 10 000 molcules doivent tre synthtises puis testes afin de mener au dveloppement d'un seul mdicament. Par consquent, les quelques 250 300 000 espces inventories de plantes que l'on trouve sur terre, dont seulement 5 15% ont fait l'objet de recherches de molcules bioactives, reprsentent un rservoir immense de nouveaux composs mdicinaux potentiels. Selon certains auteurs, les composs d'origine naturelle prsentent l'avantage d'une trs grande diversit de structures chimiques et ils possdent aussi un trs large ventail d'activits biologiques (Brub-Gagnon, 2006). Les proprits antimicrobiennes des plantes aromatiques et mdicinales sont connues depuis lantiquit. Toutefois, il aura fallu attendre le dbut du 20me sicle pour que les scientifiques commencent sy intresser (Yano et al., 2006). Rcemment, lattention sest porte sur les herbes et les pices comme source dantioxydants, qui peuvent tre employs pour se protger contre les effets du stress oxydant (Mata et al., 2007). Ltude de la chimie des plantes est toujours dune brlante actualit malgr son anciennet. Cela tient principalement au fait que le rgne vgtal reprsente une source importante dune immense varit de molcules bioactives (Ferrari, 2002). Cette matire vgtale contient un grand nombre de molcules qui ont des intrts multiples mis profit dans lindustrie, en alimentation, en cosmtologie et en dermopharmacie, Parmi ces composs on retrouve, les coumarines, les alcalodes, les acides phnoliques, les tannins, les lignanes, les terpnes et les flavonodes (Bahorun, 1997). Les flavonodes constituent un groupe de produits naturels appartenant la famille des polyphnols, largement reprsents dans la quasi-totalit des plantes, faisant partie intgrante
de notre nourriture quotidienne. Ils possdent potentiellement des activits biologiques, antiinflammatoires, anti-cancrignes, antimicrobiennes et anti-oxydantes. Les pices et les herbes aromatiques sont considrs comme des sources importantes de flavonodes (Marfak, 2003). Le cumin (Cuminum Cyminum L.) occupe un endroit prominent, cest une plante annuelle appartenant la famille Ombellifres, utilise gnralement comme additif (Saiedirad et al., 2008), mais galement il a une varit de proprits mdicinales connue depuis lantiquit telles quanti-oxydantes, diurtiques, astringentes, hypoglycmiantes, cholagogues et stomachiques (Dhandapani et al., 2002). Le romarin (Rosmarinus Officinalis L.) fait lobjet de rcentes recherches dans les domaines pharmaceutiques, cosmtiques et agro-alimentaires. Cest une herbe aromatique de la famille des Labies, apprcie pour ses proprits aromatiques, anti-oxydantes, antimicrobiennes, antispasmodiques, emmnagogues et anti-tumorales, largement utilise dans les produits pharmaceutiques et en mdicine traditionnelle (Atik bekkara et al., 2007). Une grande partie des recherches actuelles porte sur ltude de molcules antioxydantes et antimicrobiennes comme les vitamines, les carotnodes et les polyphnols. Il nous a sembl donc, intressant dinscrire notre travail dans ce contexte de recherche. Le but de cette tude est d'value lactivit anti-oxydante par le test de blanchissement du -Carotne, anti-radicalaire par le test au DPPH et antimicrobienne par la mthode de diffusion en milieu glos des extraits bruts et leurs fractions de deux plantes mdicinales le cumin et le romarin. Cette valuation est reli au contenu phnolique des ces extraits. Dans la premire partie, nous aborderons les diffrentes connaissances
bibliographiques sur les deux plantes, les flavonodes, le stress oxydant ainsi que sur les souches microbiennes testes. Dans la partie exprimentale, nous dvelopperons dans le premier chapitre le matriel et les mthodes analytiques utilises pour lextraction, le dosage colorimtrique des polyphnols et des flavonodes, lanalyse par HPLC des flavonodes, lactivit anti-oxydante et finalement lactivit antimicrobienne. obtenus dans notre tude. A la lumire des rsultats obtenus, diffrentes perspectives de recherche seront voques. Le deuxime chapitre sera consacr aux rsultats
Etude bibliographique
I. LES PLANTES MEDICINALES SELECTIONNEES : I.1. La plante Cuminum cyminum : Le cumin est une petite plante annuelle, originaire du Turkestan, do elle fut rapidement propage dans lensemble des pays mditerranens puis jusquen Amrique latine (Boullard, 2001). Epice et plante mdicinale trs populaire dans lEgypte ancienne, le cumin tait prescrit contre les affections digestives et respiratoires, ainsi que pour soigner les caries dentaires. Le cumin est largement employ au moyen ge (Vican, 2001). Le fruit du cumin est un ingrdient essentiel dans de nombreux mlanges dpices : baharat arabe, poudre de curry Indienne, pte de curry Thalandaise et condiment cajun (Bremness, 2002). I.1.1. Caractristiques botaniques : Le cumin est une petite plante herbace de la famille Ombellifres (Bzangerbeauquesne et al., 1986), dune hauteur de 30 cm (Vican, 2001), feuilles parfumes, finement divises, ombelles de petites fleurs blanches ou roses en t (Bremness, 2002). Le fruit est fusiforme, dune couleur jaune clair, qui devient plus fonc au contact de l'air (Singh et Goswami, 1996), velu (Bzanger-beauquesne et al., 1986), stri variant du vert au gris-brun (Bremness, 2002), dune odeur aromatique et un got pic et amer (Behera et al., 2004).
Rgne : Plantes Embranchement : Spermaphytes Classe : Dicotyledones Ordre : Apiales Famille : Apiaceae Genre : Cuminum Espce : Cuminum cyminum L. (Quezel et Santa, 1963)
Figure.1. Aspects morphologiques du cumin (Site web : www.Wikipedia).

1
I.1.2. Habitat et culture : Le cumin est cultiv en Afrique du Nord et au Sud-ouest de lAsie ; dans des sols lgers, bien drains, au soleil (Bremness, 2002). On cueille ses graines la fin de lt, lorsquelles sont mres (Vican, 2001). I.1.3. Composition biochimique du cumin : Les graines de cumin contiennent environ 15% dhuile fixe (Saiedirad et al., 2008), constitues essentiellement de triglycrides (55%), desters de strol (25%) et dacides gras libres (10%) (Shahnaz et al., 2004). Elles contiennent aussi 2,5 10 % dhuile essentielle, constitue de 25 35% daldhyde cuminique (ou cuminal), de laldhyde hydrocuminique, de lalcool cuminique, de terpinol, du -cymne, du dipentne et du pinne. En outre, elles renferment 13% de rsine, 7% de pentosanes, des tanins, de laleurone (Bellakhdar, 1997), 59% de fibres dittiques (dont 48.5% sont des fibres dittiques insolubles et 10.5% sont des fibres dittiques solubles), 8,3% damidon (Sowbhagya et al., 2007), des protines, de la cellulose, des sucres (Behera et al., 2004), des flavonodes (Vican, 2001), des coumarines, des acides phnoliques (Surveswaran et al., 2007), et des carotnodes (Kandlakunta et al., 2008). Ltude de la fraction protique a rvl que le cumin contient 18.25% de protines, qui incluent 18 acides amins avec les pourcentages suivants : 2.99% dacide glutamique, 1.41% dacide aspartique, 0.74% darginine, 0.58% de lysine, 0.67% de leucine, 0.46% disoleucine, 0.38% de thronine, 0.52% de valine, 0.05% de cystine, 0.04% de mthionine, 0.50% de srine, 0.91% de glycine, 0.53% dalanine, 0.26% de tyrosine, 0.54% de phnylalanine, 0.28% dhistidine, 0.01% de tryptophane, et 0.65% de proline (Komy, 2004). Lanalyse par la Chromatographie en phase gazeuse (CPG) a montr que les graines de cumin contiennent 56.54% de monoterpnes, 0.10% de sesquiterpnes, 43.2% daldhydes, et 0.3% dalcools (Behera et al., 2004). Selon (Harrorne et Williams, 1972) le cumin contient : de lapignine et de la lutoline 7- glucoside, de lapignine et de la lutoline-glucuronosylglucoside, ainsi que les glycosides de la querctine et du kaempferol (Hinneburg et al., 2006). En utilisant la spectromtrie de fluorescence des rayons X (XRF), le cumin sest avr contenir les 12 lments suivants : Al : 105 mg/kg, Si : 396 mg/kg, P : 384 mg/kg, S : 700 mg/kg, Mn : 15 mg/kg, Fe : 210 mg/kg, Cu : 56 mg/kg, Zn : 34 mg/kg, Sr : 7mg/kg, Cl : 0.14%, K : 0.66%, et Ca : 0.37% (Al-Bataina et al., 2003).
2
I.1.4. Utilisation du cumin : Partout au Maroc, les graines de cumin en poudre ou en dcoction, sont trs utilises dans le traitement des troubles gastro-intestinaux. Il est en effet recommand comme stomachique, carminatif, antispasmodique et vermifuge. On emploie aussi sa dcoction comme emmnagogue. En usage externe, le cumin est utilis en cataplasmes sur la nuque contre les oreillons (Bellakhdar, 1997). Les phytothrapeutes Indiens prescrivent le cumin contre les insomnies, les coups de froid et pour abaisser la fivre. Mlang au jus doignon, il forme une pte que lon applique sur les piqres de scorpion (Vican, 2001). Dans la mdecine Iranienne ancienne, les fruits de la plante ont t utiliss pour le traitement du mal de dents et l'pilepsie (Janahmadi et al., 2006). Le cumin est utilis largement dans la mdecine Ayurvdique (lancienne mdecine Indienne), pour le traitement de la dyspepsie, la diarrhe et de l'ictre. En outre, il est connu pour avoir des proprits anti-oxydantes, diurtiques, astringentes et hypoglycmiantes (Dhandapani et al., 2002). Les fruits toniques et stimulants, facilitent la digestion et soulagent la flatulence colique ou diarrhes (Bremness, 2002). Il est suppos augmenter la lactation et rduire les nauses pendant la grossesse. Utilis dans une compresse pour soulager le gonflement du sein et des testicules (Jalali-Heravi et al., 2007). Lhuile essentielle du cumin est meilleure que les antioxydants synthtiques conventionnels, montre une activit fongitoxique, ovicide (Behera et al., 2004) et antimicrobienne (El-Sawi et Mohamed, 2002). De plus elle utilise dans la prparation des parfums et les compositions vtrinaires (Bremness, 2002). I.1.5. Proprits du cumin : Les pices sont intensivement employes en mdecine, pharmacie, parfumerie, et les produits de beaut. Le cumin est lune des pices populaires largement rpondue qui a incit les chercheurs a mettre en vidence certaines de ses proprits. I.1.5.1. Activit antibactrienne : En 1994 Shetty, Singhal et Kulkarni ont rapport que lhuile des graines de cumin a des proprits antimicrobiennes (El-Sawi et Mohamed, 2002).
Sagdic et Ozcan, (2003) ont test in vitro, sur quinze bactries lactivit antibactrienne des hydrosols de seize pices. Les hydrosols du cumin ont t actifs, seulement sur Bacillus brevis, Entrobacter aerogenes et Escherichia coli O157 :H7. Lhuile essentielle du cumin a montr un effet antibactrien, plus fort que celui du romarin contre Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Listeria monocytogenes (Gachkar et al., 2007). I.1.5.2. Activit antifongique : Ltude in vitro, a montr une activit antifongique des hydrosols du cumin contre quelques myctes de microbes pathognes de plantes (Boyraz et Ozcan, 2005). ORiordan et Wilkinson (2008) ont constat labsence de la contamination par laflatoxine, dans les chantillons commerciaux du cumin. I.1.5.3. Activit ovicide : Les vapeurs d'huiles essentielles de 5 plantes, ont t examines contre les de ufs deux insectes de produits stocks (Tribolium confusum, Ephestia kuehniella). Les vapeurs ont montr une toxicit variable vis--vis les Celles du cumin taient plus actives contre les ufs. dEphestia kuehniella dont le taux de mortalit a atteint 100%. ufs Cependant, celles du romarin ont t moins actives et ont provoqu une mortalit allant jusqua 65% pour le Tribolium confusum et 24% pour lEphestia kuehniella (Tunc et al., 2000). I.1.5.4. Activit anti-oxydante : Les huiles essentielles du romarin et du cumin ont montr des activits antiradicalaires et anti-oxydantes. Les rsultats de lessai de blanchissement du -carotne ont t meilleurs que ceux de lessai du balayage du radical libre 2-2diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) (Gachkar et al., 2007). En prsence des extraits du cumin obtenus par de leau chaude et par le chlorure de sodium (NaCl), Muthamma Milan et al., (2008) ont constat des augmentations maximales dans les activits enzymatiques de lamylase, la lipase et la phytase. Dautre part ces deux extraits ont montr une activit anti-radicalaire trs leve par rapport lhuile essentielle.
I.1.5.5. Effet hypolipimiant : Ladministration orale de lextrait aqueux du cumin pendant 6 semaines aux rats diabtiques dalloxane, a eu comme consquence une rduction considrable du glucose, de lhmoglobine glycosyle et lempchement de la diminution du poids corporel. Le
traitement a provoqu aussi une rduction du cholestrol, des phospholipides, des acides gras libres et des triglycrides dans le plasma et les tissus (Dhandapani et al., 2002). I.1.5.6. Effet anti-carcinogne : En prsence d'un carcinogne du colon le 1,2-dimethyl hydrazine (DMH), l'activit des mucinases et des -glucuronidases est sensiblement augmente. Cette augmentation a comme consquence une hydrolyse des mucines protectrices du colon et des glucuronides conjugus. Lhydrolyse des glucoronides libre des toxines, ce qui peut engendrer le risque dun cancer du colon. Des travaux sur des rats, ont montr que le cumin peut protger le colon en diminuant l'activit des mucinases et des -glucuronidases en prsence ou en absence du DMH (Nalini et al., 1998). I.1.5.7. Effet anti -hyperglycmiant : L'effet anti-hyperglycmiant a t tudi sur 27 lapins sains aprs administration gastrique de l'eau, de tolbutamide et des prparations traditionnelle de 12 plantes comestibles. Pour ce but une solution de dextrose a t infuse en sous-cutane. le cumin a montr des diminutions significatives pour chaque point de tolrance du glucose (Roman-Ramos et al., 1995). Une autre tude labore par willatgamuwa et ses collaborateurs (1998), sur des rats diabtiques induits par la streptozotocine a montr une diminution de lhyperglycmie et de la glucosurie, aprs un rgime dittique contenant 1.25% de la poudre de cumin. Cette influence tait vidente autour de la troisime semaine de l'alimentation et l'effet tait de plus en plus prononc vers la fin de la 8me semaine. Ceci a t galement accompagn par une amlioration des poids corporels, des changements mtaboliques comme la diminution de lure sanguine ainsi que les excrtions de l'ure et de la cratinine chez les animaux diabtiques.
I.1.5.8. Autres effets : Les extraits mthanoliques du cumin et du romarin ont exerc un certain degr de protection, contre les formes de dommage biomolculaire qui touchent les protines, les lipides et l'ADN causs la peroxynitrite (Ho et al., 2008). Platel et Srinivasan ont tudi linfluence du cumin et dautres pices sur le taux de la scrtion de la bile, ainsi que sa teneur en acides biliaires. Les pices sont administres soit par le biais dune ingestion dittique soit sous forme dune dose orale simple. Lingestion dittique a influenc significativement la scrtion de la bile et sa teneur en acides biliaires, tandis que lingestion par dose simple a influenc seulement la teneur en acides biliaires (Platel et Srinivasan 2000). Les rsultats de Janahmadi et ses collaborateurs, (2006) ont dmontr que l'application extracellulaire d'huile essentielle du cumin (1% et 3%) chez les mollusques, a nettement diminu la frquence de l'activit spontane induite par le Pentylenetetrazol, d'une faon dpendante de la concentration et du temps. Selon ces auteurs ceci est probablement due un effet sur les canaux calciques (Ca +2) et potassiques (K + ). Selon Frage et Abozeid (1997) cit par Al-Bataina et al., (2003) le cumin contient le safrole, un compos mutagnique qui s'est avr dgrad par cuisson et/ou irradiation. Les tudes mutagniques sur diffrentes souches de Salmonella typhimurum (TA97a, TA98, TA100, et TA102) ont montr une action mutagnique oxydante trs faible provoque par le cumin (Al-Bataina et al., 2003).
I.2. La plante Rosmarinus officinalis : Le romarin est une plante des coteaux arides, garrigues et lieux rocheux de la rgion mditerranenne et mme un peu plus au sud jusquaux confins sahariens (Boullard, 2001). Depuis lantiquit, il est employ pour amliorer et stimuler la mmoire. Encore aujourdhui en Grce, les tudiants en font brler dans leurs chambres en priode dexamens. Les anthropologues et les archologues ont dcouvert que le romarin a t employ comme vertus mdicinales, culinaires et cosmtiques en Egypte, Mesopotamia, Chine et en Inde antiques (Stefanovits-Banyai et al., 2003). I.2.1. Etymologie : Le nom latin rosmarinus est habituellement interprt, comme driv "ros" de la rose et "marinus" d'appartenir la mer, bien quelle se dveloppe habituellement loin de la mer. On a affirm que cette interprtation est un produit d'tymologie traditionnelle, mais probablement le nom original est driv du grec (Heinrich et al., 2006). I.2.2. Caractristiques botaniques : Cette plante appartient la famille des Labies. Elle se prsente sous forme darbuste, sous arbrisseau ou herbace (Atik bekkara et al., 2007), mesurant environ de 0.8 2m de hauteur (Gonzalez-Trujano et al., 2007). Les feuilles sont troitement lancoles linaires, friables et coriaces, les fleurs dun bleu ple, macules intrieurement de violet sont disposes en courtes grappes denses spanouissent presque tout au long de lanne (Atik bekkara et al., 2007). '"rhops" arbuste et "myron" baume.
Rgne : Plantes Embranchement : Spermaphytes Classe : Dicotyledones Ordre : Lamiales (Labiales) Famille : Lamiaceae Genre : Rosmarinus Espce : Rosmarinus officinalis L. (Quezel et Santa, 1963)
Figure.2. Aspects morphologiques du romarin (Site web : www.Wikipedia). I.2.3. Habitat et culture : Le romarin est cultiv en mditerrane ; dans des sols drains, au soleil (Bremness, 2002).On le cultive du dbut du printemps, jusqu' lt (Poletti, 1988). I.2.4. Composition biochimique du romarin : Lhuile essentielle du romarin (1 2% dans la plante) contient : de l -pinne (7 80%), de la verbnone (1 37%), du camphre (1 38%), de leucalyptol (1 35%), du bornol (4 19%), de lactate de bornyle (jusqu 10%) et du camphne. En plus de lhuile essentielle on trouve dans le romarin : 2 4% de drivs
triterpniques tels que : lacide ursolique, lacide olanolique, lactate de germanicol ; des lactones diterpniques : picrosalvine, drivs de lacide carnosolique, rosmanol, rosmadial , des acides phnoliques , des acides gras hydroxyls surtout des drivs de lacide dcanoque , des acides gras organiques : lacide citrique, glycolique et glycrique , des strols, de la choline, du mucilage (Bellakhdar, 1997) et de la rsine (Beloued, 1998). Le criblage phytochimique de l'extrait ethanolique des parties ariennes du romarin a indiqu la prsence des flavonodes, des tannins et des saponines, et labsence des alcalodes dtect dans lextrait aqueux. Les flavonodes dtects par la chromatographie sur couche mince (CCM) sont la querctine et le kaemphrol (Gonzalez-Trujano et al., 2007).
Okamura et al., (1994) ont pu isoler de l'extrait hydro-mthanolique des feuilles du romarin trois flavonodes glycosyls (lutoline 3'-O- -D-glucuronide, lutoline 3'-O-(4 -Oactyl)- -D-glucuronide, l'hespridine. La premire application du systme dlectrophorse capillaire dtection lectrochimique a permis la dtection de : lhesprtine, lacactine, la diosmtine, et lutoline 3'-O-(3 -O-actyl)- -D-glucuronide), ainsi que
lapignine, la lutoline, lacide frulique, lacide rosmarinique et lacide cafique dans les extraits ethanoliques du romarin (Peng et al., 2005). En 2006 Almela et ses collaborateurs ont identifi par chromatographie liquide haute performance (HPLC), dans les extraits mthanoliques du romarin issus de diffrentes matires (romarin sauvage et distill) des composs classs en trois groupes : les diterpnes, les flavonodes et les acides phnoliques. Les structures des diterpnes ont t relies l'acide carnosique. Les flavonodes drivent de deux flavones apignine et la lutoline : genkwanine ; mthoxytectochrysine ; homoplantaginine ; scutellareine ; cirsimaritine et 6-hydroxylutoline7-glucoside. L'acide rosmarinique tait le seul acide phnolique identifi. Les rsultats de lanalyse dHPLC labore par (Kosar et al., 2005) et (Luis et al., 2007) ont montr respectivement la composition suivante : lutoline-glucoside : 2 .90 mg/g ; naringine-glucoside : 7.16 mg/g ; lutoline : 2.45 mg/g ; apignine : 1.80 mg/ g. Lacide vanillique 0.004 mg/g ; lacide cafique 0.012 mg/g ; naringine 0.570 mg/g ; lacide rosmarinique 2.080 mg/g ; hispiduline 0.020 mg/g ; cirsimaritine 0.080 mg/g ; carnosol 0.580 mg/g ; acide carnosique 12.180 mg/g. La Chromatographie liquide dtection par spectromtrie de masse (LCLC - MS) a montre la composition suivante en acides phnoliques de lextrait ethanolique du romarin : lacide gallique < 50 g/g, lacide chlorognique 120 g/g, lacide syringique < 50 g/g, l acide coumarique < 50 lacide frulique < 50 (Kivilompolo et Hyotylainen, g/g, g/g, 2007). 18 lments minraux ont t identifis par la spectromtrie dmission atomique, les plus abondants sont : Al : 146.48 mg/kg ; Ca : 7791.80 mg/kg ; Fe : 330.16 mg/kg ; K : 14916.23 mg/kg ; Mg : 1634.55 mg/kg ; Na : 2711.87 mg/kg ; P : 1474.60 mg/kg ; Cr : 97.36 mg/kg ; Sr : 74 .65 mg/kg (Arslan et al., 2007).
I.2.5. Utilisation : Le romarin est souvent cultiv pour son huile aromatique et considre utile pour contrler l'rosion du sol. Dans la mdecine traditionnelle ses parties ariennes sont utilises par voie orale pour soulager la colique rnale, les dysmnorrhes et comme antispasmodique (Gonzalez-Trujano et al., 2007). Dans le Mexique et le Guatemala, il est employ principalement comme remde de post-partum et traite galement les problmes respiratoires et les infections de la peau. En Espagne, lhuile du romarin est trs populaire pour beaucoup de genres de douleur, y compris les douleurs musculaires rhumatismales et traumatiques (Heinrich et al., 2006). Au Maroc, linfusion des feuilles est utilise comme apritif, cholagogue, stomachique et emmnagogue. En usage externe, les cataplasmes faits avec les compresses de la dcoction concentre sont appliqus comme vulnraires. La poudre des feuilles est saupoudre comme cicatrisant et antiseptique. La fumigation du romarin est indique pour calmer les maux de dents. Depuis quelques dcennies, lhuile essentielle du romarin est utilise en massage sdatif dans les rhumatismes et la sciatique. Les feuilles sches servent conserver la laine de lattaque des mites (Bellakhdar, 1997). En Turquie, la dcoction de feuilles du romarin a t traditionnellement employe pour traiter les diabtiques (Bakirel et al., 2008). L'infusion des feuilles est tonique, antitussive, carminative, antiasthmatique, fbrifuge, et anti-paralytique (Arnold et al., 1997). On le recommande dans les asthnies, les troubles du foie, contre les dyspepsies atoniques ainsi que contre les cphales et les migraines dorigine nerveuse, les vertiges et les troubles de mmoire (Poletti, 1988). Il a t galement employ en tant quanalgsique, antipileptique, diurtique, (Soyal et al., 2007), ainsi que pour traiter l'ictre et sa fume a t employe contre la peste (Heinrich et al., 2006). Lhuile du romarin a t largement rpandue pendant des sicles, comme un des ingrdients en produits de beaut, savons, parfums, dsodorisants, aussi bien pour l'assaisonnement et la conservation des produits alimentaires (Arnold et al., 1997 I.2.6. Proprits du romarin : Le romarin est une herbe mdicinale bien connue et considrablement value, largement rpandue dans les produits pharmaceutiques et la mdecine traditionnelle. Elle est trs apprcie pour ses proprits aromatiques, anti-oxydantes,
antimicrobiennes et anti-tumorales.
10
I.2.6.1. Activit antibactrienne : Plusieurs auteurs ont rapport que certains composs prsents dans les extraits du romarin possdent des proprits antibactriennes (Georgantelis et al., 2007). Les effets des extraits aqueux et mthanoliques du romarin, sur la croissance du Streptococcus sobrinus et sur lactivit extracellulaire de lenzyme glucosyltransfrase ont t tudis par Tsai et al., (2007). Les rsultats ont suggr que les extraits du romarin peuvent empcher les lsions de la carie en inhibant la croissance du Streptococcus sobrinus et peuvent aussi
liminer la plaque dentaire par la suppression de l'activit de la glucosyltransfrase. Afin de chercher des nouveaux antiseptiques et des agents antimicrobiens, une autre tude a t labore pour examiner les effets antimicrobiens des extraits et des composs isols de certaines plantes, sur lensemble de 29 bactries et levures avec pertinence dermatologique. Lextrait obtenu par le dioxyde de carbone (CO2) supercritique du romarin, a prsent un large spectre antimicrobien. La croissance de 28 sur 29 germes a t empche par cet extrait. press). Celiktas et al., (2007a) ont test lactivit antimicrobienne des huiles essentielles et des extraits mthanoliques du romarin, rassembl de trois diffrentes rgions et pendant quatre intervalles de l'anne. Leurs rsultats ont indiqu que les bactries testes taient sensibles aux huiles essentielles, partiellement aux extraits mthanoliques et que lactivit antimicrobienne des huiles essentielles diffrent selon les variations rgionales et saisonnires. Les 2 souches de la levure Saccharomyces et la bactrie Escherichia coli se sont montres sensibles vis--vis lhuile essentielle du romarin, tandis que la bactrie Staphylococcus epidermis est rsistante. Lhuile a empch galement la rplication du plasmide mtabolique (F'lac) dEscherichia coli (Schelz et al., 2006). Une autre tude a rvle que les quatre souches d Escherichia coli O157:H7 sont sensibles la totalit des huiles essentielles testes. Lactivit dhuile essentielle du romarin tait apprciable (Moreira et al., 2005). Les 3 extraits commerciaux du romarin taient actifs contre onze bactries portes par les aliments (Fernandez-Lopez et al., 2005). Le vibrio parahaemolyticus port par les fruits de mer infects est inhib par la suspension du romarin 30 C (Yano et al., 2006). Lexamination du Carnosol, acide carnosique, acide ursolique, a montr que seule lacide carnosique a une activit antibactrienne (Weckesser et al., in
11
La germination et la multiplication des cellules vgtatives des spores bactriennes de Clostridium botulinum 62A et Bacillus cereus T est empche par lensemble des huiles essentielles testes, y compris celle du romarin (Chaibi et al., 1997). Les rsultats dAbutbul viennent suggrer lutilisation du romarin comme traitement contre les maladies causes par le al., 2004). I.2.6.2. Activit antifongique : La biosynthse de laflatoxine a t inhibe totalement par lhuile essentielle du romarin, une concentration de 450 ppm. Selon les auteurs les rsultats parasiticus (Rasooli et al., 2008). En utilisant la technique standard de diffusion sur glose Sacchetti, et ses collaborateurs (2005) ont valu l'activit biologique de 11 huiles essentielles y compris plupart de ces huiles ont une activit indiquent le potentiel de cette huile essentielle en tant que prservatif naturel contre lAspergillus Streptocoque iniae, la bactrie qui cause des pertes conomiques significatives dans l'industrie d'aquaculture dans le monde entier (Abutbul et
celle du romarin, les rsultats ont montr que la
inhibitrice modre contre les cinq levures (Candida albicans, Rhodotorula glutinis, , Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lypolitica) examines. I.2.6.3. Activit antivirale : Lvaluation de lactivit antivirale de lextrait commercial du romarin, a indiqu quil ya une inhibition de linfection par le virus de limmunodficience humaine (HIV) aux concentrations trs basses, qui ont taient galement cytotoxiques. Cependant, le carnosol a montr une activit anti-HIV une concentration de 8 qui n'tait pas cytotoxique M (Aruoma et al., 1996). I.2.6.4. Activit ovicide : Lhuile essentielle du romarin sest avre un agent ovicide contre trois espces de moustique (Anopheles stephensi, Aedes aegypti et Culex quinquefasciatus) (Prajapati et al., 2005). De mme Gillij et al., ont trouv que cette huile prsente une activit rpulsive contre le moustique Aedes aegypti (Gillij et al., 2007). Dans le cadre de la protection des produits stocks Papachristos et Stamopoulos (2002), (2004) ont trouv que les les larves et les pupes dAcanthoscelides obtectus ufs,
sont sensibles aux vapeurs des huiles essentielles du romarin.

12
I.2.6. 5. Activit anti-oxydante : L'activit anti-oxydante du romarin est connue depuis environ 30 annes (Nassu et al., 2003). En raison de ses proprits anti-oxydantes, le romarin est largement accept en tant qu'une des pices qui a lactivit anti-oxydante la plus leve (Wang et al., 2008). 22 volontaires ont inhal larome des huiles essentielles de la lavande et du romarin pendant 5 minutes, par la suite les salives ont t rassembles pour mesurer lactivit antiradicalaire salivaire en utilisant le test au DPPH, ainsi que les variations dans les taux des substances actifs salivaires (cortisol, immunoglobuline A scrtoire (IgAs), et -amylase). Les valeurs de lactivit anti-radicalaire salivaire ont t augmentes, tandis que les taux du cortisol se sont diminus et aucun changement crucial n'a t not pour les IgAs et l - amylase. Les rsultats ont montr une corrlation inverse significative entre les valeurs de lactivit anti-radicalaire et les taux de cortisol pour chaque concentration de stimulation du romarin (Atsumi et al., 2007). Dans une autre tude les proprits anti-oxydantes et anti-radicalaires de 11 huiles essentielles, ont t examines au moyen du test de blanchissement du carotne, le test au DPPH et lanalyse photochimioluminescence (PCL). Les rsultats ont montr que lhuile essentielle du romarin tait parmi les huiles qui ont une activit importante (Sacchetti et al., 2005). La comparaison in vitro de lactivit anti-oxydante dhuile essentielle du romarin avec celles de ses principaux composants (1,8-cinole, pinne et pinne) au moyen de lessai au DPPH et lessai de blanchissement du carotne, a montr que lhuile essentielle tait plus active que ses composants dans les deux modles dessai (Wang et al., 2008). Sur la base des observations Gladine et ses collaborateurs ont conclue que les extraits des plantes riches en polyphnols choisis pour lexprience, en particulier le romarin pourraient tre des nouvelles sources d'antioxydants chez les animaux rendus extrmement sensibles la lipoperoxydation, par le biais dun rgime alimentaire riche en acides gras n-3 polyinsaturs et qu'aucune corrlation entre la capacit anti-oxydante in vitro et in vivo de ces extraits (Gladine et al., 2007). Divers modles dessai exprimentaux ont t employ pour la caractrisation des proprits anti-oxydantes des extraits aqueux, de quatre herbes appartenant la famille de Lamiace : Origanum vulgaris, Rosmarinus officinalis, Salvia officinalis et Thymus vulgaris. Les extraits ont montr des degrs variables d'activit dans tous les essais utiliss (Dorman et al., 2003).
13
Plusieurs auteurs ont tudi l'utilisation des extraits du romarin comme antioxydants pour conserver les produits base de viande : (Nassu et al., 2003) ; (Balentine et al., 2006) ; (Fernandez-Lopez et al., 2005) ; (Sebranek et al., 2005) et les huiles vgtales : (NogalaKalucka et al., 2005) ; (Samotyja et al., 2007). Les rsultats obtenus font toujours lobjet de lintressante activit anti-oxydante de cette plante. I.2.6. 6. Effet anti-carcinogne : Grce certains composants (carnosol, rosmaridiphnol, rosmanol et lacide rosmarinique), le romarin est considr comme une thrapie contre le cancer (Atik bekkara et al., 2007). Ltude labore par (Singletary, 1996 a) a dmontr que lextrait commercial du romarin et le carnosol sont des inhibiteurs des tumeurs mammaires, provoques par le dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) chez les rats. Slamenova et al., (2002) ont mentionn que lexposition des cellules traites par deux types doxydants (le bleu de Mthylne excit par la lumire visible, et le peroxyde dhydrogne (H2O2)), aux diffrentes concentrations de l'extrait ethanolique du romarin dilu dans le milieu de culture, a comme rsultat une rduction de l'activit gnotoxique de ces oxydants. De mme leffet anti-carcinogne t tudi par Visanji et ses collaborateurs (2006). Ces auteurs ont constat que le traitement des cellules de Caco-2 (des cellules issues dun cancer du colon), par le carnosol et l'acide carnosique a empch lincorporation de la thymidine-H3 dune manire dpendante de la dose. Cet effet a t associ par laccumulation des cellules traites dans la phase G2 / M du cycle cellulaire. Le carnosol s'est avr exercer son effet aprs pro-mtaphase, tandis que l'acide carnosique a arrt la multiplication des cellules avant la pro-mtaphase. I.2.6.7. Effet anti-actylcholinestrase : Des extraits aqueux et mthanoliques de 11 plantes utiliss dans la mdecine traditionnelle Danoise pour l'amlioration de la mmoire, ont t examins pour valuer leur activit inhibitrice d'actylcholinestrase en utilisant la mthode colorimtrique d'Ellman. Lextrait mthanolique du romarin a montr une inhibition modre (17 %) de l'enzyme une concentration de 0.1 mg/ml (Adsersen et al., 2006). Lactivit anti-radicalaire, anti-oxydante et anti-actylcholinestrase des huiles essentielles, des extraits d'thanol et de leau bouillante de cinq plantes aromatiques sont
14
values. Toutes les plantes ont montr une activit anti-actylcholinestrase modre el la meilleure activit inhibitrice a t montre par l'huile essentielle du romarin (Mata et al., 2007). Lhuile essentielle, les extraits de : l'ther de ptrole ; actate dthyle ; chloroforme ; mthanol du romarin et lacide rosmarinique ont t examins in vitro des concentrations de 0.2, 0.5, et 1 mg/ml pour valuer leurs activits inhibitrices de l'actylcholinestrase et la butyrylcholinestrase. Linhibition des deux enzymes tait non significative aux concentrations 0.2 et 0.5 mg/ml. A la concentration 1 mg/ml la butyrylcholinestrase a t
inhibe respectivement par lacide rosmarinique, lextrait mthanolique, lhuile essentielle et lextrait dther de ptrole, tandis que l'actylcholinestrase a t inhibe seulement par l'huile essentielle du romarin (Orhan et al., 2007). I.2.6.8. Effet anti -hyperglycmiant : Les observations aprs ladministration orale de diffrentes doses de l'extrait ethanolique du romarin, 3 groupes de lapins (lapins ayant une glycmie normale, lapins
ayant une hyperglycmie provoque par ladministration orale du glucose, lapins diabtiques dalloxane) ont clairement montr que cet extrait exerce une activit hypoglycmiante et anti-hyperglycmiante remarquable une dose de 200 mg /kg (Bakirel et al., 2008). I.2.6.9. Effet anti-hpatotoxique : De nombreuses tudes ont t ralises pour tudier leffet anti-hpatotoxique du romarin. Le travail de Sotelo-Felix et al., (2002) a t concentr pour lvaluation de lefficacit de lextrait mthanolique du romarin pour normaliser certains paramtres histologiques et biochimiques du foie, aprs lingestion dun hpatotoxine le ttrachlorure de carbone (CCl4). Les rsultats ont indiqu que cet extrait a empch la peroxydation lipidique, linflammation, la ncrose, normalis les taux de la bilirubine, le glycogne et lactivit de lalanine aminotransfrase et enfin il a augment lactivit du glutathion S-transfrase (GST). De mme, lhpatotoxicit induite par l'Azathioprine (AZA) chez les rats, a t
value en surveillant la fonction du foie aprs ladministration orale des extraits aqueux de 3 plantes (Hibiscus sabdariffa, Rosmarinus officinalis et Salvia officinalis). Les rsultats ont montr une rduction des taux de lalanine aminotransfrase, de laspartate aminotransfrase, du malonialdehyde et la disparition de leffet inhibiteur d'AZA sur les activits de la catalase (CAT), du glutathion (GSH) et du superoxyde dismutase (SOD) (Amin et Hamza, 2005).
15
Des souris sont soumises des rayonnements (pour tudier l'effet radioprotectecteur ) de l'extrait aqueux du romarin. Chez le groupe exprimental ils ont constat une
diminution de la peroxydation des lipides, accompagn d'une augmentation de la concentration de lGSH et que les variations des paramtres biochimiques (taux du glycogne, des protines, de la phosphatase acide et alcaline, du Cholestrol) ont taient peu significatives. Certaines valeurs ont regagnes presque la normale vers le 30 me jour, tandis que chez le groupe tmoin les valeurs normales nont t jamais atteintes (Soyal et al., 2007). Les rsultats de ltude labore par (Singletary, 1996b), a montr le potentiel de l'extrait dittique du romarin et du carnosol de stimuler in vivo les activits des enzymes du foie, la quinone rductase(QR) et le GST. I.2.6.10. Autres effets : Les effets anti-nociceptifs de l'extrait ethanolique des pices ariennes du romarin, ont t tudis par Gonzalez-Trujano et al., (2007) en employant diffrents modles exprimentaux de la douleur. La comparaison des rsultats obtenus avec ceux du tramadol et de lacide actylsalicylique a montr que, les extraits possdent une activit anti-nociceptive et anti-inflammatoire trs importante, ce qui renforce lutilisation mdicinale traditionnelle de cette plante. L'extrait hydro-ethanolique du romarin a diminu les lsions ulcratives produit par, l'indomthacine, l'thanol et la rserpine chez les rats (Correa Dias et al., 2000). Haloui et al., (2000) ont indiqu que les extraits aqueux du romarin ont une activit diurtique et un effet considrable sur l'excrtion urinaire deau et des lectrolytes (Na+ , K + et Cl une dose de 8%. ),
16
II. LES FLAVONOIDES : II.1. Les polyphnols : Les composs phnoliques ou les polyphnols sont des produits du mtabolisme secondaire des plantes, largement distribus possdant plusieurs groupements phnoliques, avec ou non dautres fonctions et comportant au moins 8000 structures connues diffrentes (Bahorun, 1997), allant de molcules phnoliques simples de bas poids molculaire tels que, les acides phnoliques des composs hautement polymriss comme les tannins. Ils font partie intgrante de lalimentation humaine et animale (Martin et Andriantsitohaina, 2002). II.1.1.Classification : Les polyphnols sont rpartit en plusieurs classes : Les flavonodes Les tanins Les stilbnes Les lignanes et les coumestanes Autres phytoestrognes Les saponines (triterpenodes) Les phytostrols et les phytostanols Bien qu'ils ne soient pas des polyphnols, on ajoute ordinairement cette liste les isothiocyanates, qui drivent de l'hydrolyse des glucosinolates (Dacosta, 2003). II.1.2. Biosynthse : Les polyphnols sont synthtiss par de deux voies biosynthtiques : celle de lacide shikimique celle issue de lactate De plus la diversit structurale des composs polyphnoliques due cette double origine biosynthtique, est encore accrue par la possibilit dune participation simultane des deux voies dans llaboration de composs dorigine mixte, les flavonodes (Martin et Andriantsitohaina, 2002).
17
II.1.3. Effets biologiques des polyphnols : Les polyphnols sont associs de nombreux processus physiologiques interviennent dans la qualit alimentaire, impliqus lorsque la plante est soumise des blessures mcaniques. La capacit dune espce vgtale rsister lattaque des insectes et des microorganismes est souvent corrle avec la teneur en composs phnoliques (Bahorun, 1997). Ces composs montrent des activits anti-carcinognes, anti-inflammatoires, antiathrognes, anti-thrombotiques, analgsiques, antibactriens, antiviraux, anticancreux (Babar Ali et al., 2007), anti-allergnes, vasodilatateurs (Falleh et al., 2008) et antioxydants (Gomez-Caravaca et al., 2006). Les composs polyphnoliques sont dailleurs de plus en plus utiliss en thrapeutique. Ils sont regroups dans la catgorie des veinotoniques et des vasculoprotecteurs. Parmi les veinotoniques, nous citerons le Relvenet ou le Cirkant renfermant du rutnoside, le Daflont ou le Diosmilt renfermant de la diosmine. Un certain nombre de molcules polyphnoliques sont galement en tude clinique comme des anti-agrgant plaquettaire, ou hypotenseur sans rsultats probants (Martin et Andriantsitohaina, 2002).
Figure.3. Effets biologiques des polyphnols (Martin et Andriantsitohaina, 2002).
18
II.2. Les flavonodes : Occupant une place prpondrante dans le groupe des phnols, les flavonodes sont des mtabolites secondaires ubiquistes des plantes. On estime que 2 % environ du carbone organique photo-synthtis par les plantes, soit quelques 109 tonnes par an, est converti en flavonodes (Lhuillier, 2007). II.2.1. Etymologie: L'expression flavonode a t introduite en 1952 par Geissman et Hinreiner pour designer les pigments ayant un squelette (C6-C3-C6), provenant du mot latin flavus qui signifie jaune (Bouakaz, 2006). II.2.2. Dcouverte des flavonodes : L'intrt nutritionnel pour les flavonodes date de la dcouverte de la vitamine C, la suite des travaux de Szent Gyorgyi en 1938. Le scorbut exprimental cde l'ingestion de jus dagrumes mais rsiste la seule administration d'acide ascorbique. Plus pratiquement, les symptmes hmorragiques du scorbut lis la fragilit des vaisseaux sont guris par des extraits de Paprika et du jus de citron alors que l'acide ascorbique seul est inefficace. Les analyses chimiques ont montr que la fraction active tait de nature flavonoque. Cette action des flavonodes sur la permabilit vasculaire a t appele proprit vitaminique P (P tant la premire lettre du mot permabilit). Cette notion de vitamine P nexiste plus lheure actuelle puisqu'elle ne correspond pas la dfinition classique des vitamines. Les flavonodes sont considrs comme des micronutriments importants puisquils peuvent jouer des rles antioxydants ou possder des proprits biologiques diverses (Milane ,2004). II.2.3. Structure chimique : Les flavonodes sont des drivs du noyau flavone ou 2-phnyl chromone (Milane, 2004) 15 atomes de carbone (C6-C3-C6), constitu de deux noyaux aromatiques, que dsignent les lettres A et B, relis par un htrocycle oxygn, que dsigne la lettre C (Dacosta, 2003), portant des fonctions phnols libres, thers ou glycosides (Milane, 2004). On signale que le noyau flavone est lui mme un driv du noyau flavane de base (Milane, 2004).
19
Figure.4. Structure de base des flavonodes
Figure.5. Schma simplifie des flavonodes
(Dacosta, 2003). II.2.4. Classification : Tous les flavonodes ont une origine biosynthtique commune et de ce fait possdent le mme lment structural de base. Ils peuvent tre regroups en diffrentes classes selon le degr doxydation du noyau pyranique central, le noyau B reli lhtrocycle C dans les positions 2, 3 (Figure.6). Dans la position 2 : le flavonode est appel Flavane. Si la position 4 de la flavane porte un groupement carbonyl la flavane est appel Flavanone. Si la liaison C 2-C3 dans le squelette de la flavanone est insature le compos est nomm Flavone. Si le squelette est substitu en position 3 par un groupement hydroxyle il est dsign par le nom de Flavonol. Dans la position 3 : le flavonode est dsign par le terme Isoflavane (Bouakaz, 2006).
20
Figure.6. Structures des diffrentes classes de flavonodes (Gamet-Payrastre et al., 1999). II.2.5. La substitution du squelette flavonique : IL existe diffrents processus de substitution du squelette flavonique et qui sont l origine de lextraordinaire diversit des structures flavoniques. II.2.5.1. O-substitution : II.2.5.1.1. Hydroxylation : Les hydroxyles 5 et 7 viennent s'introduire avant la formation du noyau A. Pour ce fait, ils sont considrs comme hydroxyles originels. II est de mme pour lhydroxyle en 4' du noyau B, tous les autres seront des extra-hydroxyles (Benakacha, 2001). Lhydroxylation du noyau B dans la position 3' se fera aprs la fermeture de lhtrocycle C. La position 2' et 6' du cycle B sont rarement hydroxyles (Bouakaz, 2006).
21
II.2.5.1.2. Mthoxylation : Cest la mtylation des hydroxyles aussi bien originels que les extra-hydroxyles (Bouakaz, 2006). II.2.5.1.3. O-glycosylation : Les flavonodes sont souvent prsents comme O- ou C glycosides ; La liaison O dans les flavonodes se produit frquemment plus que la liaison C. Le D-glucose est de loin le monosaccharide le plus courant, dautres hexoses, ainsi que des pentoses, et le D-apiose sont frquents avec le L-rhamnose (seul dsoxyhexose) et des acides uroniques. On trouve galement des disaccharides, des trisaccharides et quelques rares ttrasaccharides. Les sucres peuvent leur tour tre substitus par des groupements acyles tels que le malonate ou lactate (Lhuillier, 2007). Pas moins de 90% de flavonodes isols des plantes sont glycosyls (Le et al., 2007), La plupart des flavonodes sont glycosyls excepte la catchine (Rice-Evans, 2001). La liaison stablit entre un hydroxyle phnolique et un autre hydroxyle alcoolique dun sucre. Un deuxime sucre peut se rattacher la structure flavonique soit avec un autre OH phnolique soit avec un OH alcoolique du sucre dj fix. LO-glycosylation se fait prfrentiellement avec lhydroxyle de la position 7 qui constitue le site prfrentiel de la glycosylation dans le cas des flavones et les flavanones et en position 3 chez les flavonols (Bouakaz, 2006). II.2.5.2. C-substitution : II.2.5.2.1. C-mthylation : Le mthyle est directement li au cycle benznique par une liaison carbone-carbone, cette liaison est rencontre en position 6 ou en position 8, ou encore en position 6 et 8 (Bouakaz, 2006). II.2.5.2.2. C- glycosylation : Le sucre est li directement au cycle benznique par une liaison carbone-carbone. Dans cette glycosylation la liaison stablit entre le carbone du sucre et celui en position 6 ou 8 de la gnine. (Benakacha, 2001).
22
La rupture de la liaison gnine-ose est plus difficile dans le cas des C-htrosides que dans celui des O-htrosides (Milane, 2004). Dans certains composs les deux modes de glycosylation coexistent (Benakacha, 2001). II.2.6. Origine biosynthtique : Les flavonodes possdent tous le mme lment structural de base, car ils drivent dune origine biosynthtique commune. Le cycle A est form partir de trois molcules de malonyl-coenzyme A (malonyl-CoA), issues du mtabolisme du glucose. Les cycles B et C proviennent eux aussi du mtabolisme du glucose, mais par la voie du shikimate via la phnylalanine qui est convertie en -coumarate puis en -coumaroyl-CoA. Le -coumaroyl-CoA et les 3 malonyl-CoA se condensent en une seule tape enzymatique pour former une chalcone, la 4, 2,4, 6-ttrahydroxychalcone (raction catalyse par la chalcone synthtase). Le cycle C se forme par cyclisation de la chalcone, raction catalyse par la chalcone-isomrase qui induit une fermeture strospcifique du cycle conduisant une seule 2(S)-flavanone : la naringnine. Ce cycle shydrate ensuite pour former les diffrentes classes de flavonodes (Lhuillier ,2007). Des tapes ultrieures surtout de glycosylation et acylation amnent les flavonodes la forme dfinitive dans laquelle elles se trouvent in vivo (Bouakaz, 2006).
23
Figure.7. Voie de biosynthse des flavonodes (Milane, 2004).
24
II.2.7. Proprits Physico-Chimiques des flavonodes : II.2.7.1. Solubilit et lextraction : Les gnines sont pour la plupart, solubles dans les solvants organiques apolaires. Les htrosides peuvent tre extraits, le plus souvent chaud, par de l'actone ou par des alcools additionns d'eau. Il est possible de procder ensuite une vaporation sous vide et lorsque le milieu ne contient plus que de l'eau, de mettre en uvre une srie d'extractions liquide-liquide par des solvants non miscibles l'eau (Bruneton, 1999). Si les aglycones sont les cibles, une hydrolyse chimique est habituellement effectue avec de l'acide chlorhydrique ou lacide formique des tempratures leves, l'hydrolyse enzymatique est galement employe. Si l'intrt des flavonodes-glycosyls intacts, l'hydrolyse devrait naturellement tre empche (De Rijke et al., 2006). II.2.7.2. Dosage : Les mthodes de dosage classiques sont le plus souvent, colorimtriques ou spectrophotomtriques. L HPLC offre maintenant la possibilit d'une estimation rapide et prcise de tous les flavonodes (Bruneton, 1999). II.2.8. Biodisponibilit des flavonodes : Les flavonodes prsentent ainsi des proprits bnfiques biologiques et antioxydantes. Cependant la qualit nutritionnelle et les effets systmiques des flavonodes dpendent de leur absorption au niveau du tractus digestif. Peu dtudes systmatiques ont t menes sur la pharmacocintique des flavonodes chez lhomme. Toutefois, daprs des expriences menes sur des flavonodes provenant de lalimentation, il apparat que leur absorption est faible et implique des mcanismes encore mal connus. Seuls les aglycones sont supposes tre absorbables, alors que les glycosides, doivent subir lhydrolyse de leur liaison osidique par laction de la microflore intestinale pour leur permettre dtre absorbs au niveau du clon. Les principaux sites de mtabolisme sont la flore intestinale et le foie. Les mtabolites glucuro- et sulfoconjugus des flavonodes absorbs sont limins principalement par la bile, lexcrtion urinaire ne reprsentant que 3 6 % de llimination totale (Milane, 2004).
25
II.2.9. Consommation des flavonodes : La prise moyenne quotidienne des flavonodes est 14.4 mg dont (35.2%) viennent des fruits, (19.1%) des lgumes, (16.9%) du vin et (16.0%) du th (Ramassamy, 2006). La querctine est rgulirement consomme par lhomme car c'est le flavonode principal trouv dans le rgime alimentaire (Tieppo et al., 2007). Leur ingestion dittique est tout fait haute, compar d'autres antioxydants dittiques comme les vitamines C et E (Fiorentino et al., 2007). II.2.10. Distribution des flavonodes dans les plantes : A de rares exceptions prs, seules les plantes ont la capacit de biosynthtiser des flavonodes. Les flavonodes peuvent tre prsents dans toutes les parties des plantes. Dans la majorit des cas, les flavonodes sont prsents sous forme glycosyle dans les plantes car la glycosylation a pour effet de les rendre moins ractifs et plus hydrosolubles permettant alors leur stockage dans les vacuoles des cellules pidermiques des fleurs, de lpiderme et du msophylle des feuilles, des parenchymes des tiges et racines. Les gnines seules sont prsentes dans les exsudats farineux de certaines plantes, dans les cuticules des feuilles, corces et bourgeons ou sous forme de cristaux dans les cellules de certaines Cactaceae et plantes de rgions arides (Lhuillier ,2007). On les trouve en abondance dans les familles suivantes : Polygonaces; Apiaces; Rutaces; Astraces; Lgumineuses (Milane, 2004). Le monde animal est lui aussi concern par les flavonodes. On trouve par exemple de la chrysine, la querctine, et de la galangine dans la propolis des abeilles (Marfak, 2003). Il est noter que les flavanones et les flavones ont t isols dun corail marin et dun petit nombre de champignons (Lhuillier, 2007). II.2.11. Proprits biologiques : La principale proprit initialement reconnue aux flavonodes est d'tre "veino-actifs", c'est--dire capables de diminuer la permabilit des capillaires sanguins et de renforcer leur rsistance (Bruneton, 1999). II.2.11.1. Activit anti-oxydante : Les flavonodes ont t dcouverts dans les annes 30 par Albert Szent-Gyorgyi, laurat prix Nobel, en tant que des composs avec l'activit anti-oxydante prononce (Hodek et al., 2002). Les flavonodes expriment les proprits anti-oxydantes par : Le pigeage direct des espces ractives de loxygne (ERO), La suppression de la formation des ERO par
26
linhibition de quelques enzymes ou par chlation des ions mtalliques, impliqus dans leur production, La protection des systmes de dfense antioxydants de lorganisme (Boudiaf, 2006). II.2.11.2. Proprits pro-oxydantes : Nous avons dcrit prcdemment les proprits anti-oxydantes des flavonodes mais il ne faut pas ngliger leurs proprits pro-oxydantes. Parfois les flavonodes jouent un rle de pro-oxydants. En effet, plusieurs d'entre eux ont t dcrits comme responsables d'autooxydation et de la gnration de radicaux oxygns actifs, comme le peroxyde d'hydrogne. En dfinitive, certains flavonodes pourraient acclrer la survenue de l'atteinte oxydative de l'ADN, des protines et des glucides in vitro. Alors, le potentiel pro-oxydant de ces composs ne doit pas tre nglig dans le mcanisme d'action des flavonodes (Milane, 2004). II.2.11.3. Inhibition enzymatique : En rgle gnrale, les flavonodes sont in vitro, des inhibiteurs enzymatiques de l'histidine-dcarboxylase par le querctol ou la naringnine; llastase; lhyaluronidase, par les flavones et surtout par les proantho-cyanidols; la phosphodisterase de l'AMPc; l'aldoserductase par le querctiroside, ainsi que par des mthoxyflavones; la protine-kinase,
notamment par le lutolol; plusieurs flavonodes (cirsiliol, hypolaetine, etc.) sont de puissants inhibiteurs de la 5-lipoxygnase. Quant (lutolol, apignol, chrysine, etc.) inhibent la cyclooxygnase (Bruneton, 1999). Quelques flavonodes sont des inhibiteurs efficaces de la biosynthse des prostaglandines. Cet effet est d l'inhibition de certains enzymes (lipoxygnase,
phospholipase, cyclo-oxygnase) impliques dans leur biosynthse. Lactivit anti-tumorale de plusieurs flavonodes (pinostrobine, querctine, morine myrictine,) est attribue leurs efficacit dinhiber la topoisomrase I et II (Hodek et al., 2002). Beaucoup defforts ont t fait pour la recherche des inhibiteurs efficaces de la tyrosinase, lenzyme clef dans la biosynthse de la mlanine. Les flavonodes prsentent le groupe le plus tudi des polyphnols. Les rsultats des travaux de Gao, et ses collaborateurs (2007) ont montr que les 5, 6,7-trihydroxy-flavones sont utiles en tant quagents de dpigmentation.
27
Plus rarement, les flavonodes peuvent stimuler une activit enzymatique : c'est le cas de la proline-hydroxylase (Bruneton, 1999). II.2.11.4. Activit anti-tumorale : La plupart des flavonodes sont in vitro, antimutagnes ; a contrario, quelques flavonols sont sur les mmes modles mutagnes et un petit nombre d'entre eux sont anticancrognes et inhibiteurs de la croissance des cellules tumorales in vitro (Bruneton, 1999). Les effets anti-carcinognes de la querctine et d'autres flavonodes deviennent de plus en plus vidents (Hollman et al., 1996). Tieppo et al., (2007) ont dmontr que la querctine ntait pas gnotoxique et en
revanche, elle a augment la stabilit gnomique chez les rats ayant une cirrhose biliaire induit par la ligature cholagogue. En plus de l'activit anti-oxydante (Li et Jiang, 2007) ont observ une activit anticancreuse, pour l'picatchine, procyanidine B2, procyanidine B4 de la fraction d'actate dthyle des extraits du litchi. II.2.11.5. Effets cardiovasculaires : Rcemment, beaucoup d'tudes se sont concentres sur les effets cardiovasculaires des flavonodes. Les rapports pidmiologiques ont dmontr que les gens peuvent avoir une incidence plus limite en maladies du c s'ils ont une ingestion dittique leve en ur, flavonodes (Xu et al., 2007). Parmi les 17 flavonodes examins par Xu et ses collaborateurs (2007), les agents de relaxation vasculaires les plus efficaces sont lapignine, lutoline, kaempferol et la gnisteine. Cette relaxation est attribue l'action directe des flavonodes sur le muscle lisse vasculaire. II.2.11.6. Autres proprits : Des flavonodes ayant une activit antivirale ont t identifis depuis 1940, mais des tentatives ont t faites rcemment, pour faire des modifications synthtiques pour amliorer leur activit antivirale. Daprs Middleton et al., (2000) la querctine, morine, rutine, dihydroquerctine, dihydrofisetine, leucocyanidine, apignine, catchine, hespridine et la naringine possdent une activit antivirale contre 11 types de virus. L'activit antivirale semble tre associe aux
28
composs non glycosyls et lhydroxylation en position 3 est apparemment ncessaire cette activit. La myrictine empche la croissance de Burkholderia cepacia multi-rsistante, enterococci vancomycine-resistante, Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus epidermidis (Hodek et al., 2002). Les Flavanones et quelques dihydroflavonols empchent la croissance du Streptococcus mutans et Streptococcus sobrinus. Lahouel et ses collaborateurs, (2004) ont valu leffet des flavonodes donns par voie orale pendant 14 jours, vis--vis la toxicit hmatologique et hpatique du cyclophosphamide et de la vinblastine, ainsi que la toxicit hpatique du paractamol. Chez les rats prtraits par les flavonodes il apparat une nette amlioration dans les effets toxiques. La querctine et la rutine une fois administr oralement aux souris hyper-uricmique induits par loxonate de potassium, rduisent les niveaux d'acide urique dans le srum, mais avec un profil pharmacologique partiellement diffrent de celui de l'allopurinol. Ces effets hypo-uricmiques sont partiellement dus l'inhibition des activits de la xanthine dshydrognase et la xanthine oxydase XDH/XO (Zhu et al., 2004). Selon (Tieppo et al., 2007) la querctine et les flavonodes protgent contre les
cataractes diabtiques, empchent l'agrgation plaquettaire et l'oxydation des lipoprotines de faible densit (LDL). Les Flavonodes peuvent tre des : antispasmodiques, hypocholestrolmiants, diurtiques, (Bruneton, 1999), analgsiques (Gonzalez-Trujano et al., 2007). Leurs effets bnfiques ont t dcrits pour le diabte mellitus, le mal de tte et lulcre de l'estomac et du duodnum (Van Ackher et al., 1998). Quelques flavonodes montrent galement une varit d'effets biologiques tels qu'antiinflammatoire, antiallergique, ainsi que la capacit de stimuler le systme immunitaire (Merken et Beecher, 2000). Cependant, tous les flavonodes nont pas des activits ncessairement intressantes. Quelques flavonodes ont des effets mutagnes et / ou pro-oxydant (Hodek et al., 2002). II.2.12. Rles des flavonodes chez les plantes : Les flavonodes sont des pigments quasiment universels des vgtaux. Ils sont responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois feuilles. Quand ils ne sont pas directement visibles, ils contribuent la coloration par leur rle de co-pigments.
29
Dans certains cas, la zone d'absorption de la molcule est situe dans le proche ultraviolet : la coloration n'est alors perue que par les insectes qui sont ainsi efficacement attirs et guids vers le nectar et donc contraints assurer le transport du pollen (Bruneton, 1994). On peut galement noter que les flavonodes, en repoussant certains insectes par leur got dsagrable, peuvent jouer un rle dans la protection des plantes. Les flavonodes montrent dautres proprits intressantes dans le contrle de la croissance et du dveloppement des plantes en interagissant dune manire complexe avec diverses hormones vgtales de croissance. Certains d entre eux jouent galement un rle de phytoalexines, cest--dire des mtabolites que la plante synthtise en grande quantit pour lutter contre une infection cause par des champignons ou par des bactries (Marfak, 2003). De plus ils sont impliqus dans la photosensibilisation, la morphogense, la dtermination sexuelle, la photosynthse et la rgulation des hormones de croissance des plantes (Lhuillier, 2007). II.2.13. Emplois thrapeutiques des flavonodes : L'utilit thrapeutique de ces composs a t dmontre dans les hmorragie gastrointestinale, avortement habituel, mnorragie, cystite saignante, tuberculose hmoptysie, la maladie de Meniere, pistaxis, rtinopathie, hmorrodes et syndrome de Raynaud. Ils ont t frquemment combins avec la vitamine K et lacide ascorbique. Rcemment, Les rutosides hydroxythyls s'ont avrs efficaces dans l'allgement des symptmes provoqus par l'insuffisance veineuse chronique des membres infrieurs, varicosis de grossesse et d'autres maladies veineuses. Le (+)-cyanidanol-3 a t de plus en plus employ dans le traitement de l'hpatite virale aigu et diverses autres maladies du foie (Parmar et Ghosh, 1980). Une tude clinique a permis de montrer une activit anticancreuse de la querctine, administre par voie intraveineuse chez des patients atteints du cancer. Le resveratrol est actuellement en phase I, dtude clinique pour son utilisation dans le traitement du sida. Il est galement en phase dtudes prclinique et clinique pour son utilisation dans le traitement de divers cancers (Martin et Andriantsitohaina, 2002).
30
III. LE STRESS OXYDANT : III.1. Historique : Radicaux libres, les espces ractives doxygne (ERO), le stress oxydant et antioxydants deviennent des termes de plus en plus familiers pour les professionnels de la sant et mme pour le grand public. Ces notions ne sont toutefois pas nouvelles puisquil faut rappeler que dans le milieu des annes 50, R. Gerschman puis D. Hartman voquaient dj la toxicit de loxygne et la free radical theory pour expliquer le processus du vieillissement. En 1969, les Amricains McCord et Fridovich isolent partir de globules rouges humains un systme enzymatique antioxydant la SOD, dmontrant ainsi pour la premire fois que notre organisme produit bel et bien des ERO dont il doit se protger. Cette dcouverte sera le point de dpart dune intense recherche scientifique dans le monde entier sur le stress oxydant et les antioxydants (Favier, 2003). III.2. Dfinition dun radical libre : La majeure partie de la toxicit de loxygne provient de la formation de radicaux libres, c'est--dire, selon la dfinition propose par Halliwell et Gutteridge, despces capables dexistence indpendante, contenant un ou plusieurs lectrons non apparies dits lectrons clibataires, ces radicaux peuvent se former par transferts mono-lectroniques ou par scission homolytique de liaison covalente selon le schma suivant : (Bonnefont-rousselot et al., 2003). A. + B. A:B A+ + B rupture htrolytique ions rupture homolytique radicaux libres
Aprs une rupture homolytique, chacun des deux lectrons intervenant dans la liaison entre les atomes A et B gagne lorbitale externe de ces atomes, qui deviennent alors des radicaux libres (Bonnefont-rousselot et al., 2003). Du fait de leur instabilit nergtique, les radicaux libres ont tendance revenir immdiatement un tat stable en donnant un lectron ou en prenant un une autre molcule : ils peuvent donc tre rducteurs ou oxydants. En jouant le rle daccepteur ou donneur dlectrons, les radicaux libres ont donc la proprit dtre extrmement ractifs vis--vis des autres molcules, possdant un temps de demi-vie extrmement court (de la nano- la milliseconde) (Koechlin-Ramonatxo, 2006). Bien que le terme de radical libre ait souvent
31
t assimil une espce ractive ou un oxydant, il est important de signaler que tous les radicaux libres ne sont pas forcement des oxydants. De mme que, tous les oxydants ne sont pas des radicaux libres (Diallo, 2005). III.3. Principaux radicaux libres et leurs origines : Parmi toutes les espces radicalaires susceptibles de se former dans les cellules, il convient de distinguer un ensemble restreint de composs radicalaires qui jouent un rle particulier en physiologie et que nous appellerons radicaux primaires. Les autres radicaux libres, dits radicaux secondaires, se forment par raction de ces radicaux primaires sur les composs biochimiques de la cellule (Favier, 2003). Du point de vue de la terminologie, il est souvent fait mention despces ractives de loxygne. Ces espces incluent non seulement des radicaux libres drivs de loxygne : anion superoxyde (O2 . radical hydroxyle (.OH) , radical hydroperoxyle (HO2. ), radical ), peroxyle (RO2.) , radical alcoxyle (RO.) , mais dautres espces non radicalaires drives de loxygne : peroxyde dhydrogne (H 2O2), acide hypochloreux (HOCl), Ozone (O3), Oxygne singulet ( 1O2), peroxynitrite (ONOO(Bonnefont-rousselot et al., 2003) , qui ne ) sont pas ractives mais peuvent tre des prcurseurs de radicaux (Favier, 2003). Par ailleurs, tous les radicaux libres ne sont pas des drivs de loxygne, par exemple le monoxyde dazote (.NO) est un radical libre driv de lazote (Bonnefont-rousselot et al., 2003).
32
Figure.8. Formation en cascade des diffrentes espces oxygnes ractives partir du radical superoxyde (Koechlin-Ramonatxo, 2006).
Il ne faut pas penser que tous les radicaux d'oxygne sont extrmement ractifs, cette ractivit tant trs variable selon la nature du radical. Ainsi parmi les radicaux forms chez les tres vivants, l'anion radicalaire superoxyde comme le monoxyde d'azote ne sont pas trs ractifs, mais constituent des prcurseurs d'autres espces plus ractives (Favier,2003). III.4. Rles des radicaux libres : Le paradoxe des radicaux libres en biologie est quils constituent des espces extrmement dangereuses, susceptibles d'engendrer un nombre considrable de maladies, tout en tant des espces indispensables la vie. Ils remplissent en effet de trs nombreuses fonctions utiles qui part la phagocytose, ont t dcouvertes rcemment. Les radicaux libres participent au fonctionnement de certaines enzymes, la transduction de signaux cellulaires, la dfense immunitaire contre les agents pathognes, la destruction par apoptose des cellules tumorales, la rgulation de la dilatation capillaire, au fonctionnement de certains neurones et notamment ceux de la mmoire, la fcondation de l'ovule, la rgulation des gnes (Favier, 2003), la production nergtique, au rglement de la croissance des cellules et la signalisation intracellulaire (Ardestani et Yazdanparast 2007).
33
III.5. Dfinition du stress oxydant : Dans les circonstances quotidiennes normales, des radicaux libres sont produits en permanence et en faible quantit et cette production physiologique est parfaitement matrise par des systmes de dfense, d'ailleurs adaptatifs par rapport au niveau de radicaux prsents. Dans ces circonstances normales, on dit que la balance antioxydants/pro-oxydants est en quilibre. Si tel n'est pas le cas, que ce soit par dficit en antioxydants ou par suite d'une surproduction norme de radicaux, l'excs de ces radicaux est appel stress oxydant (Favier, 2003). Chaque individu ne possde pas le mme potentiel antioxydant selon ses habitudes alimentaires, son mode de vie, ses caractristiques gntiques ou lenvironnement dans lequel il vit (Diallo, 2005). L'importance des dommages du stress oxydant dpend de la cible molculaire, de la svrit de l'effort et du mcanisme par lequel l'effort oxydant est impos (Aruoma, 1999). III.6. Origine du stress oxydant: Cette rupture d'quilibre, lourde de consquence, peut avoir de multiples origines. L'organisme peut avoir faire face une production beaucoup trop forte pour tre matrise, qui sera observe dans les intoxications aux mtaux lourds, les ischmies/reperfusions suivant des thromboses (Favier, 2003), le dysfonctionnement de la chane mitochondriale ; lactivation de systmes enzymatiques ; la libration de fer libre partir des protines chlatrices ou dune oxydation de certaines molcules (Pincemail, 2002). Les radicaux libres sont produits pendant l'irradiation, par la lumire UV, par rayons X et par les rayons sont des produits des ractions mtal-catalyses ; sont prsent comme des , polluants dans l'atmosphre ; sont produits par des neutrophiles et des macrophages pendant l'inflammation ; sont des sous-produits des ractions mitochondrie-catalyses de transport d'lectron et d'autres mcanismes (Valko et al., 2006). L'ingestion d'alcool est suivie par la formation de radicaux libres, galement des antibiotiques, des anticancreux. Linfection au VIH a pour effet daccrotre la production de radicaux libres dans lorganisme (Mohammedi, 2006). Enfin, une mauvaise alimentation pauvre en antioxydants contribuera galement lapparition dun stress oxydant (Pincemail, 2002). Gnralement, le stress oxydant sera la rsultante de plusieurs de ces facteurs et se produira dans un tissu et un type cellulaire bien prcis, objet de la dfaillance et non pas dans tout lorganisme (Favier, 2003).
34
III.7. Les consquences du stress oxydant : Lattaque des radicaux libres au sein des doubles liaisons lipidiques membranaires, induit des processus de peroxydations en cascade aboutissant la dsorganisation complte de la membrane, altrant de ce fait ses fonctions dchange, de barrire et dinformation . (Koechlin-Ramonatxo, 2006) La toxicit des EOR sexerce galement sur les protines. Les EOR sont en effet capables de ragir avec diffrents acides amins des chanes de protines, altrant galement leur fonction. Les plus sensibles leur action sont le tryptophane, la tyrosine, lhistidine, la cystine et la mthionine. Les EOR sont aussi capables de couper des liaisons peptidiques et de former ainsi des fragments protiques. LADN, quil soit nuclaire ou mitochondrial, est galement une cible majeure des EOR. Ceux-ci peuvent en effet interagir avec les dsoxyriboses de lADN, mais aussi avec ses bases puriques et pyrimidiques. Ces altrations structurales lorsquelles ne sont rpares entranent long terme des altrations gniques (Koechlin-Ramonatxo, 2006). Si la chimie de l'attaque radicalaire des polysaccharides a t beaucoup moins tudie que celle des autres macromolcules, il n'en demeure pas moins que les EOR attaquent les mucopolysaccharides et notamment les protoglycanes du cartilage. Les consquences biologiques du stress oxydant seront extrmement variables selon la dose et le type cellulaire. De lgers stress augmenteront la prolifration cellulaire et l'expression de protines d'adhsion, des stress moyens faciliteront l'apoptose, alors que de forts stress provoqueront une ncrose et des stress violents dsorganiseront la membrane cellulaire, entranant des lyses immdiates. De nombreuses autres anomalies biologiques sont induites par le stress oxydant : mutation, carcinogense, malformation des f dpt de tus, protines anormales, fibrose, formation d'auto-anticorps, dpt de lipides oxyds, immunosupression (Favier, 2003). III.8. Les maladies lies au stress oxydant : La plupart des maladies induites par le stress oxydant apparaissent avec l'ge, car le vieillissement diminue les dfenses anti-oxydantes et augmente la production mitochondriale de radicaux. En faisant apparatre des molcules biologiques anormales et en sur-exprimant certains gnes, le stress oxydant sera la principale cause initiale de plusieurs maladies : cancer, cataracte, sclrose latrale amyotrophique, syndrome de dtresse respiratoire aigu, oedme pulmonaire, vieillissement acclr.
35
Le stress oxydant est aussi un des facteurs potentialisant l'apparition de maladies plurifactorielles tel que le diabte, la maladie d'Alzheimer, les rhumatismes et les maladies cardiovasculaires (Favier, 2003). III.9. Dfinition dun antioxydant : On dsigne par antioxydant toute substance qui, lorsquelle est prsente en faible concentration compare celle du substrat oxydable, retarde ou prvient de manire significative loxydation de ce substrat (Diallo, 2005). III.10. Principaux antioxydants : III.10.1. Les antioxydants endognes : La production physiologique dERO, est rgule par des systmes de dfense composs denzymes (SOD, CAT, hme oxygnase, peroxyrdoxine...), de molcules antioxydantes de petite taille (glutathion, acide urique, bilirubine, ubiquinone, ...) et de protines (transferrine, ferritine, ). Enfin, un systme secondaire de dfense compos de phospholipases, dADN endonuclases, de ligases et de macroxyprotinases empche laccumulation dans la cellule de lipides, dADN et de protines oxyds et participe llimination de leurs fragments toxiques (Pincemail, 2002). III.10.2 Les antioxydants exognes : Toutes ces dfenses peuvent tre renforces par des apports exognes en : Mdicaments : Ils constituent une source importante dantioxydants. Actuellement, les classes thrapeutiques comme les anti-inflammatoires non strodiens, les anti-
hyperlipoprotinmiques, les bta-bloquants et autres antihypertenseurs ont t valus pour leurs proprits anti-oxydantes. Antioxydants naturels : La vitamine C ou acide ascorbique : Cest un puissant rducteur. Il joue un rle important dans la rgnration de la vitamine E. La vitamine E ou tocophrol : Prvient la peroxydation des lipides membranaires in vivo en capturant les radicaux peroxyles.
36
Le slnium : Les effets bnfiques de cet oligo-lment sur lorganisme ne sont connus que depuis un quart de sicle. Il neutralise les mtaux toxiques (plomb, mercure). Il aurait aussi une action prventive sur certains cancers. Le -carotne : Outre lactivit pro vitaminique A, possde la capacit de capter loxygne singulet. Les flavonodes : Les relations structure-activits anti-oxydantes des flavonodes et des composs phnoliques ont montr que lactivit anti-oxydante tait dtermine par la position et le degr dhydroxylation. Les tanins : Ces tanins sont des donneurs de protons aux radicaux libres lipidiques produits au cours de la peroxydation. Les coumarines : Ils sont capables de prvenir la peroxydation des lipides membranaires et de capter les radicaux hydroxyles, superoxydes et peroxyles. Les phnols : Les acides phnoliques, comme lacide rosmarinique, sont fortement antioxydants et anti-inflammatoires et peuvent avoir des proprits antivirales (Diallo, 2005). III.11. Mcanismes dactions des antioxydants : Les mcanismes daction des antioxydants sont divers, incluant le captage de loxygne singulet, la dsactivation des radicaux par raction daddition covalente, la rduction de radicaux ou de peroxydes, la chlation des mtaux de transition (Diallo, 2005).
37
VI. LES SOUCHES MICROBIENNES UTILISEES : VI.1.Effet antimicrobien : Ces dernires annes, il y a eu un grand intrt pour la dcouverte de nouveaux agents antimicrobiens, due une augmentation alarmante du taux des infections avec les microorganismes rsistant aux antibiotiques. Une des approches courantes pour la recherche des substances biologiquement actives est le criblage systmatique des micro-organismes ou les plantes, qui sont des sources de beaucoup d'agents thrapeutiques utiles. En particulier, l'activit antimicrobienne d'huiles et des extraits de plantes ont form la base de beaucoup d'applications, y compris, pharmaceutiques, mdecine, thrapie naturelle et la conservation des aliments (Sagdic et al., 2002). Le premier rapport des proprits antimicrobiennes des pices est apparu en 1880 dont lequel les activits de la moutarde, clou de girofle et de la cannelle et leurs huiles ont t dcrites (Prasad et Seenayya, 2000). VI.2. Mcanisme deffet antimicrobien des polyphnols : Il est sans doute trs complexe, peut impliquer multiples modes d'actions tels que : l'inhibition des enzymes extracellulaires microbiennes, la squestration de substrat ncessaire la croissance microbienne ou la chlation de mtaux tels que le fer, linhibition du mtabolisme microbien (Milane, 2004), dgradation de la paroi cellulaire, perturbation de la membrane cytoplasmique, se qui cause une fuite des composants cellulaires, linfluence de la synthse de l'ADN et l'ARN (Zhang et al., 2009), des protines des lipides, et la fonction mitochondriale (Balentine et al.,2006), ainsi que la formation des complexes avec la paroi (Gangou piboji, 2007). Ces mcanismes ne sont pas des cibles spares, certains peuvent tre comme consquence d'un autre mcanisme. Le mode d'action des agents antimicrobiens dpend galement du type de micro-organismes et l'arrangement de la membrane externe (Shan et al., 2007).
38
VI.3 .Caractristiques des souches bactriennes utilises : Staphylococcus aureus : Les staphylocoques sont des cocci gram positif qui tendent se grouper en amas (Nauciel, 2000) irrgulier la faon dune grappe de raisin (Avril, 2000). Staphylococcus aureus est un germe arobie - anarobie facultatif (Avril, 2000), doit son non despce laspect pigment de ses colonies. Il tient une place trs importante dans les infections communautaires et nosocomiales, possde une coagulase, ce qui le distingue de la plupart des autres espces de staphylocoques. La bactrie est trs rpandue chez lhomme et dans de nombreuses espces animales. Chez lhomme, environ un tiers des sujets sont des porteurs sains qui hbergent la bactrie au niveau des muqueuses et des zones cutanes humides. Il dveloppe rapidement des rsistances aux antibiotiques et les souches hospitalires ne sont souvent sensibles quaux glycopeptides (Nauciel, 2000). Pseudomona aeruginosa : Le genre pseudomonas est fait de bacilles mobiles arobies stricts, se cultive facilement sur les milieux usuels. Pseudomona aeruginosa (ou bacille pyocyanique) se caractrise par la pigmentation bleu-vert de ses colonies. (Nauciel, 2000). Cest une bactrie ubiquiste qui vit normalement ltat de saprophyte dans leau et le sol humide ou sur les vgtaux. Cette bactrie peut vivre en commensale dans le tube digestif de lhomme et des divers animaux. Considr comme une bactrie pathogne opportuniste cest le germe-type des infections hospitalires ou nosocomiales (Avril, 2000). Entrobactries : Constituent une famille de bactries trs importante comportant de nombreux genres subdiviss eux-mmes en espces. Ce sont des bacilles gram ngatif dont la plupart sont mobiles, grce des flagelles. Ils cultivent facilement sur les milieux usuels et sont aroanarobies facultatifs. Comme leur nom lindique, les entrobactries sont pour la plupart des bactries qui colonisent lintestin. En dehors du tube digestif, elles peuvent tre transitoirement prsents sur diffrentes parties du revtement cutano-muqueux.
39
Les espces les plus frquemment rencontres en pathologie humaine, Escherichia coli, Salmonella, Shigella et Yersinia. Les autres bactries de la famille des entrobactries se comportent gnralement comme des bactries opportunistes souvent impliques dans les infections nosocomiales, en particulier urinaires. Parmi elles, on peut mentionner les genres Proteus, Klebsiella, Entrobacter, Serratia, Providencida, Marganella , Citrobacter. La plupart de ces bactries produisent des lactamases et sont rsistantes de nombreux antibiotiques. Escherichia coli : Cest lespce dominante de la flore arobie du tube digestif. Escherichia coli est habituellement une bactrie commensale. Elle peut devenir pathogne si les dfenses de lhte se trouvent affaiblies ou si elle acquiert des facteurs de virulence particuliers (Nauciel, 2000). Le groupe Klebsiella, Enterobacter, Serratia, dit K.E.S, sont rassembls des enterobacteriaceae qui ont en commun les caractres suivants : La raction de Voges-Proskauer (VP) est gnralement positive Ce sont des bactries pathognes Ces espces sont souvent multi-rsistantes aux antibiotiques (Avril, 2000). Streptococcus : Les bactries appartenant au genre Streptococcus sont des cocci gram positif se disposant en chainettes plus ou moins longues, elles ont un mtabolisme anarobie, mais peuvent se cultiver en prsence de lair. Leur culture ncessite habituellement des milieux riches (Nauciel, 2000). Les Streptocoques vivent ltat commensal au niveau des tguments ou des muqueuses de lhomme ou des animaux (Avril, 2000). Le genre Streptococcus comprend de nombreuses espces dont lhabitat et le pouvoir pathogne peuvent diffrer considrablement. Plusieurs espces tiennent une place trs importante dans la pathologie infectieuse communautaire (Nauciel, 2000). VI.4. Caractristiques des souches fongiques utilises : Les champignons ou myctes ou fongiques sont des organismes eucaryotes qui nont pas dorganisation tissulaire et la masse cytoplasmique est enferme dans une structure paritale rigide qui constitue le thalle ou myclium.
40
Le thalle se prsente plus souvent sous forme dun systme tubulaire, de filaments ramifis et parfois anastomotiques, appels hyphes on parle alors de champignons filamenteux. Le thalle est parfois rduit une structure simplifie, unicellulaire, sphrique ou subshrique, uninuclue. Il nya pas formation dun vritable myclium, mais parfois dun pseudomyclium par tirement des lments cellulaires. Il sagit dans ce cas dun thalle dissoci on parle alors de champignons levuriformes ou levures. Les champignons voluent le plus souvent : A lhumidit, en arobiose, une temprature optimale de 20 28 C, certains sont dit thermophiles. Certains champignons peuvent tre : Des agents de fermentations (ex : Saccharomyces cervisiae), des producteurs de substances bnfiques (ex : antibiotiques), de substances cancrignes (ex : aflatoxine daspergillus flavus), de substances toxiques (ex : champignons macroscopiques vnneux), utiliss en gnie gntique pour la fabrication (vaccins Hpatite B) ou la synthse (Insuline) de produits biologiques. Candidose : Les plus frquentes des levuroses provoquent des affections cosmopolites atteignant la peau, les ongles, les cavits naturelles et les divers viscres par hmo-dissmination (Moulinier, 2003). Selon la littrature, la recherche des produits naturels actifs contre les espces de Candida a accrue sensiblement en 10 dernires annes, approximativement la recherche tait sur 258 espces de plantes, appartenant 94 familles (Duarte et al., 2005). Candida albicans : Levure non pigmente, non capsule, bourgeonnement multiple et formant un pseudo-myclium et du myclium vrai. Saprophyte endogne de la lumire intestinale humaine et des cavits gnitales par contigut (femme). Aspergilus sp : Ils sont saprophytes de matires organiques en dcomposition. Ce sont des contaminateurs frquents. En effet, les spores sont vhicules dans lespace arien avec les poussires. Certains dentre eux sont thermotolrants (Moulinier, 2003).
41
VI.5. Antibiotiques lactamines : Les -lactamines reprsentent la principale famille des antibiotiques la plus dveloppe et la plus utilise dans le monde entier. Cette large utilisation est due leur large spectre daction, leur faible toxicit, leur efficacit et leur faible cot (Gangou piboji, 2007). Il existe de nombreux variete de lactamines qui se distiguent par leur spectre dactivit et leur propreits pharmacologiques Penicillines Cphalosporines Autres lactamines (monobactames,carbapneme) Les cphalosporines de la 1re gnration ont un niveau dactivit assez limit vis--vis les bacilles gram ngatif, en raison de leur sensibilit aux cphalosporinases. Les cphalosporines de 2me et 3 me gnration sont beaucoup plus actives. Les cphalosporines les plus rcentes dites parfois de 4me gnration se montrent plus actives vis-vis des souches productrices de cphalosporinases (Avril, 2000). VI.6.Mcanismes de rsistances aux -lactamines : Les bactries ont dvelopp diffrents mcanismes pour contrecarrer laction des lactamines : entre autre la modification de la cibles (protines liants les pnicillines) qui les rend moins sensibles au -lactamines ; la synthse des enzymes qui inactivent les lactamines ; lacquisition ou la surproduction des pompes efflux qui peuvent expulser lantibiotique hors de la cellule mme contre le gradient de concentration ; La modification des porines chez les bacteries gram ngatif, ayant pour rsultat diffusion lente des lactamines travers la membrane externe (Gangou piboji, 2007).
42
Matriel et mthodes
I.1. Matriel vgtal : Le matriel vgtal est constitu de feuilles sches de romarin et des graines de cumin, obtenus partir des phytothrapeutes de la wilaya de Batna. I.2. Etude chimique : I.2.1. Dtermination de la teneur en eau : La mthode utilise est la mthode de dessiccation par vaporation (Audigie et al., 1978). Principe : Selon (Audigie et al., 1978) on procde une dessiccation du produit une temprature de 103C 2C dans une tuve jusqu' masse constante. La teneur en eau est dfinie comme la perte de masse subie dans les conditions de la mesure. Expression des rsultats : La dtermination de la teneur en eau se fait par le calcul de la diffrence de poids selon la formule suivante : Teneur en eau (H%) = ((Mi -Mf)/ P)*100 O : H% : Teneur en eau ou humidit ; Mi : Masse initiale (avant dessiccation) ; Mf : Masse finale (aprs dessiccation) ; P : Masse de la prise dessai ; La teneur en matire sche est calcule selon la relation suivante : Matire sche (MS%) = 100 - H% I.2.2. Dtermination des taux de cendres : La mthode utilise est la mthode de minralisation par calcination (Laurent, 1991). Principe : Cest la mthode la plus simple, elle consiste un passage au four une temprature de 400 600 C jusqua destruction totale de toute particule charbonneuse (Laurent, 1991).
43
Matriel et mthodes
Expression des rsultats : La dtermination de la teneur en matire organique se fait par le calcul de la diffrence de poids selon la formule suivante : Teneur en matire organique (MO%) = ((Mi-Mf)/ P)*100 O : MO% : Teneur en matire organique ; Mi : Masse initiale (avant calcination) ; Mf : Masse finale (aprs calcination) ; P : Masse de la prise dessai ; Le taux des cendres est calcul selon la relation suivante : Taux de cendres (C%) = 100 - MO% I.2.3. Extraction : Lextraction a t ralise au niveau des laboratoires de chimie de luniversit Mentouri Constantine . Lextraction des flavonodes est ralise selon le schma prsent par Lebreton (1967) modifi par Boutard (1972), Gonnet (1973) et Jay (1975) cit par (Elgoun, 2003). I.2.3.1 Prparation de lextrait brut : Les feuilles du romarin ainsi que les graines de cumin sont mises macrer pendant une nuit temprature ambiante, dans un mlange mthanol-eau (7:3 V/V) qui est port bullition, le tout par la suite est filtr sur papier Whatman, lextraction est refaite plusieurs fois avec renouvellement du solvant. Le solvant est limin du filtrat par vaporation rotative dans un rotavapor (BCHI). I.2.3.2. Fractionnement de lextrait brut : Lextrait brut est mlang avec de leau distille bouillante et laiss temprature ambiante pendant 24 heures. Aprs filtration, lextrait brut est puis successivement par 2 solvants (lactate dthyle et le n- butanol). Lextrait brut est initialement mlang avec lactate dthyle, le mlange est laiss dcanter et la phase organique suprieure est rcupre. Lextraction est refaite plusieurs fois jusqu ce que le solvant devient transparent. Lactate dthyle est par la suite vapor et lextrait rsultant est considr comme tant la fraction dactate dthyle.
44
Matriel et mthodes
La phase aqueuse rsiduelle est soumise une autre extraction liquide-liquide par le nbutanol, en suivant les mmes tapes que la premire extraction. La Figure 9, rsume les tapes de fractionnement de lextrait brut. La srie dextraction permet dobtenir quatre fractions ; lextrait brut hydro-mthanolique (EBr), la fraction dactate dthyle (EAcOEt), la fraction du n-butanol (En-BuOH), et la fraction aqueuse (EAq) rsiduelle. Les extraits sont conservs jusqu utilisation.
45
Matriel et mthodes
(Feuilles du romarin / Graines du cumin)
Extraction avec mthanol - eau (7 :3) V/V
Lextrait brut concentr
Traitement avec de leau distille bouillante
Extraction liquide-liquide avec lactate dthyle
Phase dactate dthyle
Phase aqueuse
Extraction liquide-liquide avec le n- Butanol
Phase n-butanolique
Phase aqueuse
Figure.9. Les tapes dextraction (Elgoun, 2003).
46
Matriel et mthodes
I.2.4. Dosage des polyphnols :
Le dosage des polyphnols totaux a t effectu avec le ractif colorimtrique FolinCiocalteu selon la mthode cit par (Wong et al., 2006). Principe : La teneur phnolique totale est habituellement dtermine colorimtriquement avec le spectrophotomtre UV-Vis en utilisant lessai de Folin-Denis ou gnralement FolinCiocalteu. Ces essais sont bass principalement sur la rduction du ractif acide phosphotungstique phosphomolybdique (ractif de Folin) dans une solution alcaline (Vuorela, 2005). Brivement 200 de chaque extrait (dissous dans le mthanol) ont t ajouts 1ml l de ractif de Folin-Ciocalteu 10 fois dilu. Les solutions ont t mlanges et incubes pendant 4 minutes. Aprs lincubation 800 de la solution de carbonate de sodium Na2CO3 (75g /l) a t l ajoute. Le mlange final a t secou et puis incub pendant 2 heures dans l'obscurit temprature ambiante. L'absorbance de tous les extraits a t mesure par un spectrophotomtre (VIS BECKMAN Modle 34) 765 nm. Expression des rsultats : La concentration des polyphnols totaux est calcule partir de lquation de rgression de la gamme dtalonnage, tablie avec le standard talon lacide gallique (5-200 g/ml) et exprime en microgrammes dquivalents dacide gallique par milligramme dextrait (g EAG/mg). I.2.5. Dosage des flavonodes : I.2.5.1. Test prliminaire :( La raction de Shibata) Principe : La prsence ou labsence des flavonodes dans un extrait peut tre mis en vidence par un test simple et rapide au magnsium. Ce test consiste mettre 2 ml de chaque extrait dans un tube, dadditionn quelques fragments de magnsium et quelques gouttes dHCl.
47
Matriel et mthodes
Expression des rsultats : La prsence des flavonodes aglycones dans les extraits est indique par le virement de la couleur vers lorange ou le rouge brique(Ciulei, 1982). I.2.5.2. Dosage colorimtrique : La mthode de trichlorure daluminium (AlCl 3) cit par (Djeridane et al., 2006) et (Boudiaf, 2006) est utilise pour quantifier les flavonodes dans nos extraits. Principe : 1 ml de chaque extrait et du standard (dissous dans le mthanol) avec les dilutions convenables a t ajout un volume gal dune solution dAlCl3 (2% dans le mthanol). Le mlange a t vigoureusement agit et l'absorbance 430 nm a t lue aprs 10 minutes dincubation. Expression des rsultats : La quantification des flavonodes t faite en fonction d'une courbe d'talonnage linaire (y = a x + b) ralis par un standard talon "la querctine" diffrentes concentrations (1.75-40 g/ml) dans les mmes conditions que lchantillon. Les rsultats sont exprims en microgrammes dquivalent de querctine par milligramme dextrait (g EQ/mg). I.2.6. Analyse qualitative par HPLC : Lanalyse est ralise par un HPLC (VP SHIMADZU LIQUID
CHROMATOGRAPH) au niveau du laboratoire de la facult de sciences - Universit El Hadj lakhdar - Batna . Le besoin de savoir les profils et d'identifier les composs individuels dans les chantillons exige le remplacement des mthodes traditionnelles par des techniques sparatives. LHPLC est sans doute la technique analytique la plus utile pour caractriser les composs polyphnoliques (Gomez-Caravaca et al., 2006). Principe : 20 l de chaque extrait ont t injects sur une colonne de type phase inverse C18, de dimensions gales 125 x 4.6 mm. La phase mobile est constitue de trois luants : leau distille, mthanol, acide actique (50 : 47 : 2.5) (V /V /V). Le gradient dlution appliqu est de type isocratique tal sur 10 min. Le dbit est de 1 ml / min (Amarowicz et al., 2005).
48
Matriel et mthodes
La dtection a t effectue par un dtecteur UV-Vis une longueur donde gale 254 nm. Expression des rsultats : Les flavonodes contenus dans chaque extrait analys ont t identifis par la comparaison des temps de rtention obtenus par ceux des tmoins. I.3. Activit biologique : I.3.1. Activit anti-oxydante : I.3.1.1.Test de blanchissement du Carotne : Dans cette analyse la capacit anti-oxydante est dtermine par la mesure de l'inhibition des composs organiques volatils et les hydroperoxydes conjugus dine rsultant de loxydation de lacide linolique (Tepe et al., 2006), qui attaquent simultanment le carotne et ayant comme rsultat le blanchissement du -carotne et la disparition de sa couleur jaune (Deba, 2008). Principe : Premirement 2 mg de - carotne ont t dissous dans 1 ml de chloroforme. La solution du -carotne-chloroforme a t introduite dans un ballon contenant 2 mg dacide linolique et 200 mg de Tween 40. Le chloroforme a t limin en utilisant un bain marie. Ensuite 100 ml de leau distille sature en oxygne ont t ajoutes lentement avec agitation vigoureuse. 2.5 ml de cette nouvelle solution sont transfres dans des tubes et 350 de chaque extrait (2g/l dans le mthanol) et du tmoin BHT sont ajoutes. l Labsorbance a t immdiatement mesur seulement pour le BHT 490 nm. Autres lectures sont mesures diffrents intervalles de temps (2h, 4h, 6h, 12h, et 48h) (Kartal et al., 2007), (Tepe et al., 2006). Expressions des rsultats : Lactivit anti-oxydante des extraits est compare avec celles du tmoin et du control ngatif. Lactivit anti-oxydante relative aprs 48 heures est calcule selon la relation suivante :
49
Matriel et mthodes
AAR = (Abs Echantillon / Abs BHT) x 100 O : AAR : Activit anti-oxydante relative ; Abs Abs
Echantillon BHT
: Absorbance de lchantillon aprs 48 heures ;
: Absorbance du BHT aprs 48 heures ;
I.3.1.2. Test au DPPH : L'activit du balayage des radicaux libres a t mesure en employant le radical libre stable DPPH (C 18H12N506) qui est l'un des essais principaux employs pour explorer l'utilisation des extraits d'herbes comme antioxydants (Markowicz Bastos et al., 2007). Principe : En prsence des pigeurs de radicaux libres, le DPPH. (2.2 diphenyl 1 picryl hydrazyl) (Fig.10) de couleur violette se rduit en 2.2 diphnyl 1 picryl hydrazine de couleur jaune. (Maataoui et al., 2006).
Forme libre
Forme rduite
Figure.10. Forme libre et rduite du DPPH (Mohammedi, 2006)
Ce radical est un oxydant qui peut tre rduit par l'antioxydant (AH) selon la raction suivante : DPPH. + AH (Lopes-Lutz et al., 2008).
50
DPPH-H + A. (Celiktas et al., 2007b)
LActivit du balayage du radical DPPH a t mesure selon le protocole dcrit par
Matriel et mthodes
Le DPPH est solubilis dans le mthanol pour avoir une solution de 0,3 mM.
Dans
des tubes on introduit 2,5 ml de chaque extrait (0.1mg/ml dans le mthanol) et on ajoute 1ml de la solution mthanolique au DPPH. Aprs agitation par un vortex, les tubes sont placs lobscurit temprature ambiante pendant 30 minutes. La lecture est effectue par la mesure de labsorbance 517 nm. Le contrle ngatif est compos de 1 ml de la solution mthanolique au DPPH et de 2.5 ml de mthanol. Le contrle positif est reprsent par une solution dun antioxydant standard le BHT. Lexpression des rsultats : En prsence dun antioxydant la force d'absorption est diminue et la dcoloration rsultante est st chiomtrique en ce qui concerne le nombre d'lectrons capts (Markowicz Bastos et al., 2007). Les rsultats peuvent tre exprims en tant que lactivit anti-radicalaire o linhibition des radicaux libres en pourcentages (I %) en utilisant la formule suivante : % = [1 (Abs Echantillon Abs O % : Pourcentage de lactivit anti-radicalaire ; Abs Echantillon : Absorbance de l'chantillon ; Abs Control ngatif : Absorbance du control ngatif ; I.3.2. Activit antimicrobienne : I.3.2.1. Activit antibactrienne : Ce test est ralis au niveau du laboratoire de microbiologie C.H.U Batna . Lactivit antibactrienne des extraits a t dtermine par la mthode de diffusion en milieu glos standardise par (NCLLS) cit par (Celiktas et al., 2007a). NCCLS :(National committe for clinical laboratory standards) I.3.2.1.1. Souches bactriennes : 8 souches bactriennes ont t testes : 3 souches de rfrences : Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923. 5 souches issues partir des prlvements (pus) de malades :
51
Control ngatif)]
X 100
Matriel et mthodes
2 souches dEnterobacter sp, Serratia sp, Klebsiella pneumoniae et Streptocoque sp. Le tableau.1 rsume les caractristiques les plus importantes des bactries utilises et leur profil de sensibilit (Rahal, 2005) Tableau .1. Caractristiques des bactries utilises Caractristiques des bactries Les bactries utilises Escherichia coli ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Staphylococcus aureus ATCC Entrobacter sp Klebseila pneumoniae Entrobacter sp Serratia sp Streptocoque sp Bactries non exigeantes Gram Gram Gram Souches BLSE+CHN Souches BLSE Souche dune rsistance sensible vis--vis la Cefotaxime Gram Souche dune rsistance intermdiaire vis--vis la Cefotaxime Bactries exigeantes ATCC : American type culture collection ; BLSE : Bta lactamases spectre largi ; CHN : Cphalosporinases haut niveau ; I.3.2.1.2. Milieux de culture : Selon les souches, nous avons utilis comme milieux de culture les milieux suivants : Glose Nutritive et Glose Mueller Hinton pour les bactries non exigeantes ; Glose Mueller Hinton qui contient 5% sang du cheval pour les bactries exigeantes ; Gram + Souche dune rsistance intermdiaire vis--vis la Vancomycine Gram + Selon lexigence Selon Gram Gram Gram Souches de rfrences Selon le profil de sensibilit vis-vis les antibiotiques
52
Matriel et mthodes
I.3.2.1.3. Prparation des solutions : Les extraits ont t repris avec le Dimethyl sulfoxyde (DMSO). Des dilutions en srie de 1/2 1/16 ont t ensuite ralises pour obtenir des concentrations de 500 62.5mg/ ml. I.3.2.1.4. Mthode de diffusion en milieu glos : Principe : Prparation de linoculum bactrien : Chaque souche a t ensemence en stries sur une glose non inhibitrice (glose nutritive et glose Mueller Hinton au sang) pour obtenir des colonies isoles. Aprs incubation de 24 heures 37 C, on a choisi 4 5 colonies bien isoles avec une anse de platine et les transfrer dans un tube de solution deau distille strile afin davoir une densit cellulaire initiale ou une turbidit voisine celle de McFarland 0,5 (106 UFC/ml). Cette comparaison est mesure laide dun densitomtre. Ensemencement : Dans les 15minutes suivant lajustement de la turbidit de la suspension servant dinoculum, on a tremp un couvillon dans la suspension et on a tal la surface entire de la glose (Glose Mueller Hinton et glose Mueller Hinton au sang ) trois reprises , en tournant la boite environ 60 aprs chaque application dont le but davoir une distribution gale de linoculum . Enfin, on a couvillonn partout autour du bord de la surface de la glose. Incubation : Les disques striles imprgns des concentrations croissantes dextraits raison de 10 par disque (Ngameni et al., 2009), ont t dposs strilement laide dune pince sur la l surface de la glose. Des tmoins imbibs seulement par le DMSO ont t raliss. Les boites ont t incubes 24 h 37 C en atmosphre normale pour les bactries non exigeantes et dans une atmosphre contenant 5% de CO 2 pour les bactries exigeantes pour le dveloppement du germe en question. Expression des rsultats : Lactivit antibactrienne a t dtermine en mesurant laide dune rgle le diamtre de la zone dinhibition, dtermin par les diffrentes concentrations des diffrents extraits autour des disques.
53
Matriel et mthodes
I.3.2.2. Activit antifongique : Ce test est ralis au niveau du laboratoire de parasitologie et de mycologie C.H.U Batna . Lactivit antifongique des extraits a t dtermine par la mthode de diffusion en milieu glos cit par (Sacchetti et al., 2005) et (Rasooli et al., 2008). I.3.2.2.1. Souches fongiques : Les souches fongiques sont issues partir des prlvements de malades (selles, langue, oreille). Levures : 2 souches : Candida albicans et Candida Kefyr. Champignon : Aspergilus niger. I.3.2.2.2. Milieux de culture : Selon les souches, nous avons utilis les milieux de culture suivants : Glose Sabouraud avec Chloramphnicol + Actidione. Glose Sabouraud. I.3.2.2.3. Prparation des solutions : Les extraits ont t repris avec le DMSO. Des dilutions en srie de 1/2 1/16 ont t ensuite ralises pour obtenir des concentrations de 500 62.5 mg/ml. I.3.2.2.4. Mthode de diffusion en milieu glos : Principe : Les cultures-mre ont t dveloppes sur une glose appropri (Sabouraud avec chloramphnicol et lactidione), afin dinhiber la croissance des lments de la flore bactrienne contaminante et d'atteindre la phase stationnaire de la croissance. Les disques striles imprgns de diffrentes concentrations dextraits raison de 10 par disque, ont t dposs strilement sur la glose Sabouraud, ensemenc au pralable l par la suspension microbienne (10 6 spores/ml). Pour le champignon la glose sabouraud est inocule par cette suspension. Les levures ont t incubes 48 h 37 C, tandis que le champignon a t incub 10 jours 27 C en atmosphre normale. Des tmoins imbibs par le DMSO ont t raliss :
54
Matriel et mthodes
Expression des rsultats : Lactivit antifongique a t dtermine en mesurant le diamtre de la zone dinhibition, dtermin par les diffrentes concentrations des diffrents extraits. I.4. Etude statistique: Ltude statistique a t ralise par le logiciel statistique GraphPad Prism. Toutes les expriences ont t ralises en triple, Les rsultats sont exprims en moyenne SD. Les rsultats sont analyss par le test Anova univarie suivie du test Dunnet /Tukey pour les comparaisons multiples et la dtermination des taux de signification. Les valeurs de p 0.05 sont considres statistiquement significatives.
55
Rsultats et discussion
II.1. Teneur en eau et taux de cendres : Les rsultats obtenus suite une dessiccation et une calcination sont reprsents dans le tableau ci-dessous : Tableau.2. Teneur en eau et taux de cendres. Plantes Les graines du cumin Les feuilles fraiches du romarin Teneur en eau (%) Taux de cendres (%) 10.83 0.40 67.00 0.89 3.67 0.26 4.00 0.00
Les valeurs sont les moyennes SD de six mesures.
La teneur en eau de nos chantillons est de lordre de : 10.83% pour le cumin et 67.00 % pour le romarin. La teneur en eau du cumin est rapproche de celle obtenu par Banerjee et Sarkar en 2003 (9.46 0.96%) et Kandlakunta et al., en 2008 (11.6%). Une diffrence est constate avec les rsultats de (Shahnaz et al., 2004) qui ont trouv 4.87%. Albu et ses collaborateurs, (2004) ont trouv une teneur en eau de 40% dans les feuilles fraiches du romarin, cette teneur diffre de faon remarquable avec nos resultats. Nous remarquerons, toute fois que les deux plantes ont prsent relativement le mme taux de cendres. Le taux de cendres des graines du cumin est similaire celui trouv par (Shahnaz et al., 2004) (3.98%) et reprsente presque la moiti par rapport celui trouv par (Sowbhagya et al., 2007) 6 %. Selon (Laurant, 1991) cette diffrence pourrait sexpliquer par la prsence de la silice, ce qui gne la calcination engendrant un taux de cendres lev. Les travaux labors par (Arslan et al., 2007) et (Al-Bataina et al., 2003) indiquent que ces deux plantes sont un potentiel dlments minraux. Les variations rencontres dans la teneur en eau et le taux de cendres de nos chantillons compars certains travaux antrieurs, peuvent tre dues certains facteurs cologiques, lge de la plante, la priode du cycle vgtatif, ou mme des facteurs gntiques.
56
II.2. Teneur en polyphnols : La mthode d'extraction doit permettre l'extraction complte des composs d'intrt et doit viter leur modification chimique. L'eau, les mlanges aqueux de l'thanol, du mthanol et de l'actone sont gnralement utiliss pour lextraction (Turkmen et al., 2007). La solubilit des composs phnoliques est en fonction de leur degr de polymrisation, linteraction avec les autres constituants et le type de solvant utilis. Le mthanol a t recommand et frquemment employ pour l'extraction des composs phnoliques (Falleh et al., 2008). Le mthanol aqueux 70% est deux fois plus efficace que le mthanol pur, pour lextraction des composs phnoliques de graine de colza (Vuorela, 2005). La teneur en polyphnols a t estime par la mthode colorimtrique de FolinCiocalteu. Cest lune des mthodes les plus anciennes conue pour dterminer la teneur en polyphnols, des plantes mdicinales et les nourritures (Abdel-Hameed, 2009). Lacide gallique est le standard (Figure.11) le plus souvent employ dans la mthode de Folin-Ciocalteu (Maisuthisakul et al., 2008).
2.5
y = 0.0113x + 0.0686 R = 0.9984
2 Absorbance 765 nm
1.5
0.5
0 0 50 100 150 200 250 Concentration (g/ml)
Figure.11. Courbe d'talonnage de l'acide gallique (moyenne SD de trois mesures).
57
Gnralement, toutes les plantes de la famille des Lamiace sont connues pour leurs composs phnoliques (Gortzi et al., 2007, Fecka et al., 2008) Toutes les plantes de la famille Ombellifres tudies par (Wojdylo et al., 2007) prsentent une teneur trs basse en polyphnols. Ceci est en accordance avec nos rsultats prsents dans le tableau.3 et 4. Tableau.3. Teneur en polyphnols des extraits du cumin. Extrait EBr EAcOEt En-BuOH Teneur en polyphnols (a) 28.99 1.67 19.39 1.89 595.45 4.54
(a) mg dquivalent dacide gallique par gramme dextrait. Les valeurs reprsentent la moyenne de 3 mesures SD. Tableau.4. Teneur en polyphnols des extraits du romarin. Extrait EBr EAcOEt En-BuOH Teneur en polyphnols (a) 195.45 4.16 541.82 3.15 539.39 5.25
(a) mg dquivalent dacide gallique par gramme dextrait. Les valeurs reprsentent la moyenne de 3 mesures SD.
Les teneurs en polyphnols montrent que lextrait brut du romarin (EBr) contient 195.45 4.16 mg EAG/g et que les deux autres fractions prsentent presque la mme quantit, une teneur de 541.82 3.15 mg EAG/g pour la fraction AcOEt et une teneur de 539.39 5.25 mg EAG/g pour la fraction n-BuOH. Concernant le cumin les rsultats rvlent que lextrait brut contient 28.99 1.67 mg EAG/g et que la fraction n-BuOH tait plus riche en polyphnols avec une teneur de 595.45 4.54 mg EAG/g par rapport la fraction AcOEt qui contient 19.39 1.89 mg EAG/g. La teneur dEBr du romarin est si proche celle de Erkan et al., (2008) : 162 mg GAE/g et Ho et al., (2008) : 127 3 mg GAE /g, mais assez loin celle de Tsai et al., (2007) : 58.1 0.9 mg GAE/g et Tawaha et al., (2007) : 39.1 3.6 mg GAE/g. Pour le cumin la teneur dEBr ne prsente pas une similitude avec celle de Ho et al., (2008) : 75 1 mg GAE /g.
58
Les rsultats dcals rsultent vraisemblablement de: La faible spcificit du ractif de Folin-Ciocalteu est l'inconvnient principal du dosage colorimtrique. Le ractif est extrmement sensible la rduction de tout les groupes dhydroxyles non seulement celles des composs phnoliques, mais galement de certains sucres et de protines etc. (Vuorela, 2005 ; Gomez-Caravaca et al., 2006). Le solvant d'extraction emporte des substances non phnoliques comme les sucres, les protines et les colorants qui peuvent interfrer pendant toute valuation phnolique (Djeridane et al., 2006). Le dosage par ce ractif donne donc une valuation brute de tous les composs phnoliques dun extrait. Il n'est pas spcifique aux polyphnols, mais beaucoup de composs peuvent ragir avec le ractif, donnant un taux phnolique apparent lev (Tawaha et al., 2007). La distribution des mtabolites secondaires peut changer pendant le dveloppement de la plante. Ceci peut tre li aux conditions climatiques dures (la temprature leve, exposition solaire, scheresse, salinit), qui stimulent la biosynthse des mtabolites secondaires tels que les polyphnols (Falleh et al., 2008). En effet, la teneur phnolique d'une plante dpend d'un certain nombre de facteurs intrinsques (gntique) et extrinsques (conditions climatiques, les pratiques culturelles, la maturit la rcolte et les conditions de stockage) (Falleh et al., 2008 ; Podsedek, 2007). Perez et ses collaborateurs, (2007) ont montr leffet du traitement de pr-extraction (irradiation ionisante) et du solvant dextraction, sur la concentration des composs phnoliques totaux dans les extraits du romarin Les rsultats de (Celiktas et al., 2007a) stend de 34.1 119 mg GAE/g confirment que cette teneur montre des diffrences considrables, au cours des diffrents intervalles de lanne et mme avec les conditions gographiques.
59
II.3. Teneur en flavonodes : II.3.1. Test prliminaire : On trouvera dans les tableaux ci-aprs les rsultats du dosage prliminaire des flavonodes : Tableau.5. Virement de la couleur des extraits du cumin. Extrait EBr EAcOEt En-BuOH Couleur Rouge brique clair Rouge brique trs fonc Rouge brique fonc
Tableau.6. Virement de la couleur des extraits du romarin. Extrait EBr EAcOEt En-BuOH Couleur Rouge brique trs clair Rouge brique clair Rouge brique trs clair
Le test prliminaire a indiqu la prsence des flavonodes aglycones dans les extraits des deux plantes. Au Pralable, lintensit de la couleur observe indique la richesse du cumin en flavonodes. II.3.2. Dosage colorimtrique : La raison principale pour la quelle on a choisi cette classe de polyphnols, rside dans le fait que les flavonodes constituent la classe polyphnolique la plus importante, avec plus de 5000 composs dj dcrits (Gomez-Caravaca et al., 2006). Selon (Elgoun, 2003) lactate dthyle est utilis pour lextraction des flavonodes aglycones ou flavonodes mono O- glycosides et partiellement di-O-glycosides, tandis que le n-butanol est utilis pour lextraction des flavonodes di-O-glycosides et tri-glycosides et Cglycosides. Le dosage des flavonodes a t ralis selon la mthode dAlCl3 en utilisant comme standard la querctine (Figure.12), les teneurs en flavonodes sont exprimes en g EQ/mg dextrait.
60
Figure.12. Courbe dtalonnage de la querctine (moyenne SD de trois mesures). Les rsultats du dosage quantitatif des flavonodes (Tableau.7 et 8) rvlent que : LEBr du romarin contient 2.06 1.14 mg EQ/g, ses deux fractions reprsentent presque la mme quantit avec une teneur de 21.39 0.72 mg EQ/g p our la fraction AcOEt et 19.58 2.75 mg EQ/g pour la fraction n -BuOH. Par consquent lEBr du cumin contient 17.39 2.71 mg EQ/g et la fraction AcOEt est plus riche avec une teneur de 54.21 2.82 mg EQ/g par rapport la fraction n -BuOH qui ne contient que 20.11 5.80 mg EQ/g. ent Tableau.7. Teneur en flavonodes des extraits du cumin. Extrait EBr EAcOEt En-BuOH BuOH Teneur en flavonodes (b) 17.39 2.71 54.21 2.82 20.11 5.80
(b) mg dquivalent de la querctine par gramme dextrait. Les valeurs reprsentent la moyenne de 3 mesures SD.
61
Tableau.8. Teneur en flavonodes des extraits du romarin. Extrait EBr EAcOEt En-BuOH Teneur en flavonodes (b) 2.06 1.14 21.39 0.72 19.58 2.75
(b) mg dquivalent de la querctine par gramme dextrait. Les valeurs reprsentent la moyenne de 3 mesures SD. En tenant compte, de la slectivit de chaque solvant utilis pour le fractionnement on admet que le cumin est riche en aglycones et que le romarin contient la mme quantit des flavonodes glycosyls et les aglycones. Daprs les rsultats de Ho et ses collaborateurs, (2008) lextrait mthanolique du cumin est riche en flavonodes (243.1 0.00 mg EC/g (quivalent de la catchine par gramme dextrait)) et pauvre en polyphnols (75 1 mg EAG/g), tandis que lextrait du romarin est riche en polyphnols (127 3 mg EAG/g) et pauvre en flavonodes (20.1 1.30 mg EC/g). Nous pouvons dire que nos rsultats viennent corroborer ceux de Ho. En outre, Tsai et al., (2007) ont galement trouv que lextrait mthanolique du romarin contient 60.7 1.1 mg EC/g. Les teneurs rapportes par Ho et Tsai sont trs leves par rapport nos rsultats, cette diffrence trouve probablement son explication dans la diffrence du standard utilis pour le dosage des flavonodes. Maisuthisakul et al., (2008) ont constat que la teneur totale des flavonodes des extraits ethanoliques de 28 plantes, est lie la teneur des composs phnoliques totaux. De mme nous avons trouv que la teneur des flavonodes des extraits du romarin s'est corrl significativement avec la teneur des polyphnols (R 2 = 0.969). Dun autre cot, Bilusic Vundac et ses collaboratteurs, 2007 ont dmontr une corrlation ngative (R = -0.26) entre la teneur des polyphnols totaux de 7 espces de Stachys taxa et celle des flavonodes. Un coefficient de corrlation (R2 = 0.197) exprime labsence dune corrlation entre la teneur des polyphnols et des flavonodes des extraits du cumin.
62
II.4. Analyse qualitative par HPLC : Le mthanol utilis pour lextraction a un rle protecteur. Il peut empcher les composs phnoliques d'tre oxyde par des enzymes, telles que des phnoloxydases. La colonne utilise pour sparer les composs phnoliques est exclusivement phase inverse. Ce systme est une haute technique de rsolution chromatographique largement rpandue, pour la sparation et la quantification simultan des substances phnoliques (Proestos et al., 2006). Les chromatogrammes dHPLC des standards et des diffrents extraits sont reprsents ci-dessous.
Figure.13. Chromatogramme dHPLC de la querctine enregistr 254 nm.
Figure.14. Chromatogramme dHPLC de la rutine enregistr 254 nm.
63
Figure.15. Chromatogramme dHPLC de la catchine enregistr 254 nm.
Figure.16. Chromatogramme dHPLC dEBr du cumin enregistr 254 nm.
Figure.17. Chromatogramme dHPLC dEAcOEt du cumin enregistr 254 nm.
64
Figure.18. Chromatogramme dHPLC dEn-BuOH du cumin enregistr 254 nm.
Figure.19. Chromatogramme dHPLC dEBr du romarin enregistr 254 nm.
Figure.20.Chromatogramme dHPLC dEAcOEt du romarin enregistr 254 nm.
Figure.21. Chromatogramme dHPLC dEn-BuOH du romarin enregistr 254 nm.
65
La comparaison des temps de rtention (Tableau.9) des standards avec ceux enregistrs dans les diffrents chromatogrammes (Tableau.10 et 11), permet l'identification probable de certains flavonodes dans nos extraits (Merken et al., 2000). Tableau.9. Temps de rtention des flavonodes standards. Temps de rtention (min) Le flavonode Standard 1.8 3.4 2.0 Querctine Rutine Catchine
Tableau.10. Temps de rtention des flavonodes prsents dans les extraits du cumin. Temps de rtention (min) Le flavonode probable EBr 1,7 2,2 2,5 2,7 3,1 3,4 4,0 5,4 6,9 8,5 9,5 9,8 EAcOEt 0,8 1,7 2,2 2,7 3,1 3,4 4,0 5,3 8,0 En-BuOH 0,9 1,3 1,7 2,1 3,0 3,4 3,9 5,3 7,9 9,4 Prsence de la rutine dans les trois extraits -
66
Tableau.11. Temps de rtention des flavonodes prsents dans les extraits du romarin. Temps de rtention (min) Le flavonode probable EBr 1,7 2,0 2,6 3,4 3,8 4,7 5,2 6,3 7,6 8,9 9,6 EAcOEt 0,5 0,8 1,2 1,7 2,0 2,6 3,4 3,7 4,6 5,5 6,1 7,5 8,0 8,8 En-BuOH 0,8 1,7 2,0 3,4 3,7 4,7 5,3 7,5 9,4 Prsence de la catchine dans lEBr Prsence de la catchine En-BuOH Prsence de la rutine dans lEBr et En-BuOH Prsence de la catchine dans lEAcOEt Prsence de la rutine dans lEAcOEt -
Les rsultats montrent la prsence de la catchine dans les extraits du romarin et la prsence de la rutine dans les extraits des deux plantes. On constate labsence de la querctine dans lensemble des extraits. De mme (Justesen et al., 2001) et (Wojdylo et al., 2007) qui ont utilis comme phase mobile un systme gradient ont rvl labsence de la querctine dans les extraits mthanoliques du romarin.
67
II.5. Activit anti-oxydante : Les extraits sont des mlanges de plusieurs composs, avec diffrents groupements fonctionnels, polarits et comportements chimiques. Cette complexit chimique des extraits pourrait mener des rsultats disperss selon l'essai utilis. Par consquent, une approche avec des analyses multiples pour valuer le potentiel antioxydant des extraits serait plus instructif et mme ncessaire (Ozturk et al., 2007). Dans ce travail, deux mthodes sont utilises : mthode de blanchissement de carotne et le balayage du radical libre DPPH. II.5.1. Test de blanchissement du -Carotne : La dcomposition des acides gras est une des causes principales de la dtrioration de la nourriture. Linhibition de l'oxydation des acides gras par lutilisation des conservateurs naturels, est une question importante dans l'industrie alimentaire (Kartal et al., 2007). Dans ce test l'inhibition de loxydation de lacide linolique est mesure en prsence du -carotne, qui est employ comme marqueur. Le changement d'absorbance diffrents intervalles de temps (Figure.22 et 23) du -
carotne a montr que lEAcOEt du romarin semble a tre le meilleur inhibiteur doxydation de l'acide linolique.
0.8
Absorbance 490 nm
E Br E AcOEt E n-BuOH Control ngatif BHT
0.6
0.4
0.2
0.0 0 20 Temps (h) 40 60
Figure.22. Changement d'absorbance du - carotne 490 nm en prsence des extraits du cumin, BHT et le control ngatif (moyenne SD de trois mesures).
68
0.8 E Br
Absorb ance 490 nm
E AcOEt 0.6 E n-BuOH Control ngatif 0.4 BHT
0.2
0.0 0 20 Temps (h) 40 60
Figure.23. Changement d'absorbance du - carotne 490 nm en prsence des extraits du romarin, BHT et le control ngatif (moyenne SD de trois mesures).
Les rsultats (Figure.24 et 25) ont indiqu que les extraits du cumin et du romarin ainsi que le BHT inhibe dune manire significative (P<0.001) loxydation coupl de lacide linolique -carotne par rapport au control ngatif. Pour les extraits du cumin linhibition la plus leve a t fournie par lEn-BuOH (36.56%) suivie par lEAcOEt (25.41%) et en dernier lEBr (21.97%). Ces deux derniers ne prsentent pas une diffrence significative dans leur activit (P<0.05). Malgr cette inhibition lactivit des trois extraits du cumin reste inferieure significativement (P<0.001), par rapport au control positif BHT. Linhibition de loxydation tait plus importante pour le romarin 79.34% pour lE
AcOEt suivie respectivement par lEn-BuOH (48.03%) et lEBr (45.41%), qui nont pas aussi prsent une diffrence significative (P<0.05). Nous constatons que les extraits du romarin ont montr une inhibition plus importante que celle des extraits du cumin, mais reste significativement inferieure par rapport au BHT (P<0.001).
69
150
Activit anti-oxydante relative
100
50
c d c
0
Br Et g at if cO uO H E Co nt ro ln nB A B
a c
Les barres avec des lettres diffrentes indiquent des activits significativement diffrentes (P<0.05). Figure.24. Activit anti-oxydante relative des extraits du cumin, BHT et le control ngatif.
150
Activit anti-oxydante relative
100
d c
50
e
0
A cO Et nB uO H E ln g B H T at if B r
on t ro
Les barres avec des lettres diffrentes indiquent des activits significativement diffrentes (P<0.05). Figure.25. Activit anti-oxydante relative des extraits du romarin, BHT et le control ngatif.
70
H T
Nous remarquons que lactivit la plus leve est celle de lune des fractions, ce qui a t aussi constat par (Abdel-Hameed, 2009). Les fractions dactate dthyle et le n-butanol de 11 espces de Ficus ont montr une activit anti-radicalaire plus importante que celles des fractions dEther de ptrole, du Chloroforme et de lextrait mthanolique (Abdel-Hameed, 2009). Les deux fractions AcOEt et n-BuOH sont riche en flavonodes, ceci suggre un lien entre lactivit anti-oxydante des deux fractions et ces composants. Ce lien reste conditionn par la structure des flavonodes, particulirement la substitution hydroxy pour les anneaux aromatiques A et B et le modle de substitution de lanneau C, les flavonodes les plus actifs possdent de 3 6 groupes dhydroxyle (Tsimogiannis et al., 2007 ; Le et al., 2007), tandis que l'hydroxylation en position C3 semble tre nuisible pour leur pouvoir antioxydant et pour l'activit de chlation du fer. En revanche la glycosylation des flavonodes rduit leurs capacits de piger les radicaux libres (Ramassamy, 2006). A titre dexemple, le pouvoir antioxydant augmente du kaempferol, querctine la myrictine, qui concide avec laugmentation du modle dhydroxylation (Le et al., 2007). Nous constatons aussi que les extraits de deux plantes se sont avrs des antioxydants modestes, par rapport aux donnes de la littrature, ce rsultat est probablement due la haute spcificit de lessai du blanchissement du - carotne pour les composs lipophiles (Gachkar et al., 2007). Le coefficient de corrlation entre la teneur des extraits du cumin en polyphnols et lactivit anti-oxydante tait fortement significatif (R
2
= 0.816), indiquant que 81% de la
capacit anti-oxydante d'extraits, soit d la contribution des composs phnoliques et quils sont les antioxydants dominants dans ces extraits. Ces rsultats sont conformes aux rsultats de beaucoup de groupes de recherche, qui ont rapport une telle corrlation positive entre le contenu phnolique total et l'activit antioxydante (Wong et al., 2006 ; Tawaha et al., 2007 ; Perez et al., 2007 ; Hayouni et al., 2007 ;Turkmen et al., 2007 ;Wojdylo et al., 2007 ; Surveswaran et al., 2007 ; Djeridane et al., 2006 ). Cependant, il nya pas une corrlation significative (R2 = 0.313) entre la teneur des polyphnols et lactivit anti-oxydante des extraits du romarin. Ceci peut sexpliquer par se qui t constat par (Dorman et al., 2003). Ces derniers ont montr que la capacit antioxydante des extraits des plantes examins (origan, romarin, sauge et le thym) n'est pas
71
ncessairement lie un contenu lev de composs phnoliques, mais vraisemblablement dpend fortement de lacide rosmarinique, le composant phnolique principal actuel dans ce type d'extrait de Lamiaceae. Le niveau de corrlation entre le contenu phnolique et l'activit anti-oxydante est un aspect intressant, mais il faut prendre en considration que les composs phnoliques rpondent diffremment dans l'analyse, selon le nombre de groupes phnoliques et que les composs phnoliques totaux nincorporent pas ncessairement tous les antioxydants qui peuvent tre prsents dans un extrait (Tawaha et al., 2007). L'attribution exacte de la capacit anti-oxydante un compos, ou un petit groupe de composants dans un extrait de plante est une tche difficile, puisque l'activit efficace dpend de plusieurs facteurs, tels que la concentration, les formes isomriques et l'interaction synergique avec d'autres composants (Almela et al., 2006). De mme les rsultats de Celiktas et ses collaborateurs (2007a) confirment aussi, que lactivit anti-oxydante de divers extraits du romarin de diffrentes priodes de rcolte change galement sensiblement. Dautre part (Kosar et al., 2005) ont montr que le traitement acide (1.2 N HCl dans lethanol 50%) des extraits dune slection de Lamiaceae, a augment dune manire
gnrale lactivit anti-oxydante et que la prolongation du temps dextraction (2-18 h) a eu comme consquence laugmentation de la teneur en polyphnols, ainsi que lactivit antioxydante des diffrents extraits de Camellia sinensis et Ilex paraguariensis al., 2007). Aprs irradiation, (Perez et al., 2007) ont constat une augmentation de 22% dans l'activit anti-radicalaire des extraits ethanoliques et aqueux du romarin. Les extraits obtenus en utilisant des solvants de haute polarit taient considrablement plus efficace que ceux obtenus en utilisant des solvants de basse polarit. La polarit des solvants change la capacit de dissoudre un groupe choisi de composs antioxydants, ce qui influe lvaluation de lactivit anti-oxydante (Hayouni et al., 2007 ; Turkmen et al., 2007). (Turkmen et
72
II.5.2. Test au DPPH : Le radical DPPH est un radical libre organique stable, avec une bande maximum d'absorption entre 515-528 nm. Dans cet essai les antioxydants rduit et dcolore le radical DPPH, un compos jaune le diphenyl picryl hydrazine, l'ampleur de la raction dpendra de la capacit des antioxydants de donner lhydrognes (Ardestani et Yazdanparast, 2007). Les rsultats peuvent tre exprims en tant que : pourcentage de lactivit antiradicalaire ou en pourcentage de DPPH restant ou peuvent galement tre exprims en utilisant le paramtre IC50, qui est dfini comme la concentration du substrat qui cause une perte de 50% de l'activit de DPPH (Markowicz Bastos et al., 2007). Nos rsultats exprims en tant que pourcentage de lactivit anti-radicalaire (Figure.26 et 27), rvlent que tous les extraits tests ainsi que le BHT pris comme rfrence sont des anti-radicalaires. LEn-BuOH du cumin a prsent lactivit anti-radicalaire la plus leve (94.55%), suivie par lEAcOEt (58.11%) et en dernier lEBr (54.16%). Ces deux derniers ne prsentent pas une diffrence significative dans leur activit (P<0.05). Lactivit anti-radicalaire de lEAcOEt et lEBr du cumin reste inferieure significativement (P<0.001), par rapport au control positif BHT (92.91%). Lactivit anti-radicalaire des extraits du romarin tait plus importante (96.18%) pour lEn-BuOH suivie respectivement par lE AcOEt (95.81%) et lEBr (80.50%). Nous constatons quil nya pas de diffrence significative (P<0.05) entre lactivit de lEn-BuOH et lE AcOEt du romarin.
73
100
Activit ant-radicalaire
80 60 40 20 0
Et B r H nBu O A BH
a a a
cO
Les barres avec des lettres diffrentes indiquent des activits significativement diffrentes (P<0.05). Figure.26. Activit anti-radicalaire des extraits du cumin et le BHT.
150
Activit ant-radicalaire
100
50
0
r Et B H nBu O A cO BH E T
Les barres avec des lettres diffrentes indiquent des activits significativement diffrentes (P<0.05). Figure.27. Activit anti-radicalaire des extraits du romarin et le BHT.
74
Les rsultats de lactivit anti-radicalaire des extraits du romarin sont en accord avec ceux obtenus par (Almela et al., 2006). Ces derniers ont constat que les extraits
mthanoliques du romarin issus de diffrentes matires (plantes sauvages, plantes gouttement-irrigues, sous-produit rsultant de la distillation d'huile essentielle) ont montr une activit anti-radicalaire, dont celle des extraits issus des plantes sauvages est presque identique celle du tocophrol et plus haute que celle du BHT. Nous constatons aussi que LEn-BuOH du cumin et lEn-BuOH, lE AcOEt du romarin ont prsent une activit plus leve que celle du control positif (BHT). Cette activit pourrait tre lie leur richesse en polyphnols. La teneur des polyphnols totaux des extraits du cumin sest corrle significativement (R = 0.977) avec leurs activit anti-radicalaire. De mme pour les extraits du romarin avec un coefficient de corrlation gale 0.997. Ces rsultats se corroborent aux rsultats dj mentionns auparavant (Wong et al., 2006 ; Tawaha et al., 2007 ; Perez et al., 2007 ; Hayouni et al., 2007 ;Turkmen et al., 2007 ;Wojdylo et al., 2007 ; Surveswaran et al., 2007 ; Djeridane et al., 2006 ). Selon (Turkmen et al., 2007) les polyphnols semble tre des donateurs efficaces d'hydrogne au radical DPPH, en raison de leur chimie structurale idale. (Turkmen et al., 2007) ont constat que les extraits du th noir ayant une activit anti-oxydante trs leve, ont galement un contenu plus lev en polyphnols. Les autres composs phnoliques mineurs ne devraient pas tre ngligs, par ce que la synergie entre les diffrents produits chimiques l'un avec l'autre devrait tre pris en considration dans l'activit biologique (Bourgou et al., 2008). Dun autre cot, la fraction phnolique n'incorpore pas tous les antioxydants et les interactions synergiques entre les antioxydants dans un mlange fait que lactivit antioxydante dpend non seulement de la concentration, mais galement de la structure et la nature des antioxydants (Falleh et al., 2008). Les rsultats de Fellah et ses collaborateurs, (2008) ont montr que lactivit antiradicalaire des extraits mthanolique de Cynara cardunculus tait organo-dpendante, les extraits de graines ont montr la meilleure activit inhibitrice du DPPH, suivi des feuilles et des fleurs. Hinneburg et al., (2006) ont constat que l hydrodistillat du cumin a une activit anti-oxydante, qui varie selon le type dessai utilis. De mme (Gachkar et al., 2007) ont
75
2
constat aussi que lactivit anti-oxydante diffre selon le test utilis, lhuile essentielle du romarin tait meilleure que celle du cumin dans le balayage du radical libre DPPH, tandis que celle du cumin tait meilleure dans lessai de blanchissement du carotne et que lactivit tait meilleure pour les deux types dhuiles dans le test de blanchissement du carotne. Cette hirarchie observe dans l'activit anti-oxydante a t galement constate dans nos rsultats, qui rvlent une meilleure activit anti-oxydante de tous les extraits dans le test au DPPH que le test de blanchissement du - carotne. Le test au DPPH est simple, trs rapide et indpendant de la polarit des chantillons (Kartal et al., 2007) ce qui peut expliquer cette hirarchie. En conclusion, les rsultats des deux tests sont en accord avec ceux dcrits dans la littrature. En effet le romarin est une plante qui appartient la famille des Lamiaceae, qui inclut un grand nombre de plantes qui sont bien connu pour leurs proprits anti-oxydantes et que la plupart de leurs composants antioxydants ont t identifis (Tepe et al., 2006 ; Kivilompolo et al., 2007). Le romarin fait partie des antioxydants naturels accept en tant qu'une des pices avec l'activit anti-oxydante la plus leve (Peng et al., 2005), cette dernire est due principalement aux composs phnoliques, appartenant trois groupes : les diterpnes phnoliques, les acides phnoliques et les flavonodes (Almela et al., 2006). Pendant les 10 dernires annes, le romarin et ses constituants (le carnosol, l'acide carnosique, l'acide ursolique, l'acide rosmarinique, l'acide cafique) sont intensivement tudis (Slamenova et al., 2002). Lacide carnosique et le carnosol, sont responsables de 90% de lactivit anti-oxydante du romarin et reprsentent ensemble environ 5% du poids sec de ses feuilles (Wei et Ho, 2006) (Visanji et al., 2006). D'autres composs, tels que la genkwanine, la cirsimaritine (Ramirez et al., 2007), lacide chlorognique, lacide cafique (Peng et al., 2005), les carotnodes et - tocophrol sont galement associs lactivit anti-oxydante du romarin (Amin et Hamza, 2005). Des tudes ont montr que certains composs, comme le rosmanol, rosmariquinone, rosmaridiphnol et le carnosol, sont jusqu quatre fois effective que le BHA et gale au BHT (Fernandez-Lopez et al., 2005). Quelques chercheurs ont prcdemment rapport que les pices de la famille ombellifres ont exhib un effet antioxydant fort (Wojdylo et al., 2007) et que le cumin est connu pour avoir des proprits anti-oxydantes, en rduisant la susceptibilit de l'oxydation des lipides (Dhandapani et al., 2002).
76
II.6. Activit antimicrobienne : II.6.1. Activit antibactrienne : Pour lvaluation du potentiel antibactrien de nos extraits, nous avons prfr de les tester contre plusieurs cibles, car chacune delles possde des structures cellulaires et un mtabolisme particulier. Les rsultats prsents dans les tableaux et les figures ci-dessous montrent que : LEAcOEt et lEn-BuOH du cumin se sont avrs inactif contre lensemble des souches testes, lEBr est actif seulement contre Staphylococcus aureus ATCC. Les extraits du romarin prsentent des activits importantes, qui stendent sur la totalit des souches de la collection, dont LEAcOEt est le plus actif. Les souches Escherichia coli ATCC et Klebseila pneumoniae possdent un potentiel de rsistance trs lev contre laction antibactrienne des 3 extraits du romarin. Quelques zones dinhibition modres avec lEAcOEt ont t enregistres avec Pseudomonas aeruginosa ATCC (11.33 1.15mm), les deux souches dEntrobacter sp (13.00 0 .00 ; 15.67 0.58) et Serratia sp (12.33 1.53mm). La bactrie Entrobacter sp (BLSE+CHN) est une bactrie hautement rsistante aux antibiotiques, mais sest rvle trs sensible lEAcOEt du romarin que la bactrie Entrobacter sp sensible la Cefotaxime. Une activit la plus leve avec les 3 extraits du romarin, a t remarque chez Staphylococcus aureus ATCC, qui est sensibilise aux faibles concentrations dextraits. Sterptocoque sp une bactrie Gram (+), sest rvle rsistante aux extraits tests. Les effets inhibiteurs augmentent considrablement avec la concentration des extraits. La majorit des extraits peuvent conserver une activit dcelable, aprs des dilutions faibles. LEAcOEt du romarin a persist actif aussi aprs la dilution 1/16 pour les souches Pseudomona aeruginosa ATCC, Staphylococcus aureus ATCC et les 2 souches dEntrobacter sp.
77
Tableau.12. Diamtre de la zone dinhibition de lEBr du cumin. Diamtre de la zone dinhibition *(mm) Les souches bactriennes 1/4 Escherichia coli ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Staphylococcus aureus ATCC Entrobacter sp Entrobacter sp BLSE+CHN Klebseila pneumoniae BLSE Serratia sp Sterptocoque sp les dilutions de lEBr du cumin 1/8 1/16 1/32 -
16.33 0.58 14.33 0.58 12.67 0.58 9.67 1.53 -
(*) Diamtre de la zone dinhibition produite autour des disques par lajout de 10 L dextrait. (Diamtre du disque est inclus) les valeurs reprsentent la moyenne de 3 mesures SD. Tableau.13. Diamtre de la zone dinhibition de lEBr du romarin. Diamtre de la zone dinhibition *(mm) Souches bactriennes 1/2 Escherichia coli ATCC Staphylococcus aureus ATCC Entrobacter sp Entrobacter sp BLSE+CHN Klebseila pneumoniae BLSE Serratia sp Sterptocoque sp Pseudomonas aeruginosa ATCC 10.00 1.73 les dilutions de lEBr du romarin 1/4 8.67 1.15 1/8 7.33 1.15 1/16 -
25.33 1.15 23.67 0.58 17.67 0.58 17.33 0.58 9.00 1.00 12.33 1.15 7.67 0.58 7.00 0.00 7.67 0.58 8.00 0.00 9.66 0.58 9.33 0 .58 -
(*) Diamtre de la zone dinhibition produite autour des disques par lajout de 10 L dextrait. (Diamtre du disque est inclus) les valeurs reprsentent la moyenne de 3 mesures SD.
78
Tableau.14. Diamtre de la zone dinhibition de lEAcOEt du romarin. Diamtre de la zone dinhibition *(mm) Souches bactriennes 1/2 Escherichia coli ATCC Staphylococcus aureus ATCC Entrobacter sp Entrobacter sp BLSE+CHN Klebseila pneumoniae BLSE Serratia sp Sterptocoque sp 8.00 0 .00 Pseudomonas aeruginosa ATCC 11.33 1.15 28.33 0.58 les dilutions de lEAcOEt du romarin 1/4 11.33 1.15 1/8 9.33 0.58 1/16 8.67 0.58
27.67 0.58 24.67 1.53 23.33 0.58 9.33 2.31 9.33 0.58
13.00 0 .00 12.33 0.58 15.67 0.58 12.33 1.53 8.67 1.15 16 2.00 12.33 0.58 8.00 0 .00
13.67 0.58 11.00 2.64 9.67 1.53 7.33 1.15 -
(*) Diamtre de la zone dinhibition produite autour des disques par lajout de 10 L dextrait. (Diamtre du disque est inclus) les valeurs reprsentent la moyenne de 3 mesures SD. Tableau.15. Diamtre de la zone dinhibition de lEn-BuOH du romarin. Diamtre de la zone dinhibition *(mm) Souches bactriennes Escherichia coli ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Staphylococcus aureus ATCC Entrobacter sp Entrobacter sp BLSE+CHN Klebseila pneumoniae BLSE Serratia sp les dilutions de lEn-BuOH du romarin 1/2 1/4 1/8 1/16 -
24.00 1.00 24.00 1.00 19.67 0.58 18.33 0.58 8.33 0.58 -
79
Sterptocoque sp
9.67 0.58
Figure.28. Leffet de lEAcOEt du romarin sur Staphylococcus aureus ATCC.
Figure.29. Leffet de lEAcOEt du romarin sur Sterptocoque sp.
Figure.30. Leffet de lEAcOEt du romarin sur lEntrobacter sp BLSE+CHN.
80
Figure.31. Leffet de lEBr du romarin sur Pseudomonas aeruginosa ATCC.
Figure.32. Leffet de lEn-BuOH du romarin Staphylococcus aureus ATCC.
Figure.33. Leffet de lEBr du cumin sur Staphylococcus aureus ATCC.
81
La sensibilit aux diffrentes huiles est classifie selon le diamtre des zones dinhibition comme suit : non sensible (-) pour le diamtre moins de 8 mm ; sensible (+) pour un diamtre entre 9-14 mm ; trs sensible (+ +) pour un diamtre entre 15-19 mm et extrmement sensible (+++) pour le diamtre plus que 20 mm (Moreira et al., 2005). Les tableaux.16 et17 montrent la sensibilit des souches testes vis--vis les six extraits. Tableau.16. La sensibilit des souches bactriennes vis--vis les extraits du cumin. Souches bactriennes Escherichia coli ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Staphylococcus aureus ATCC Entrobacter sp Entrobacter sp BLSE+CHN Klebseila pneumoniae BLSE Serratia sp Sterptocoque sp Sensibilit EBr
_ _
EAcOEt
_ _ _ _ _ _ _ _
En-BuOH
_ _
++
_ _ _ _ _
_
_ _ _ _ _
Non sensible (_), Sensible (+), Trs sensible (+ +), Extrmement sensible (+++) Tableau.17. La sensibilit des souches bactriennes vis--vis les extraits du romarin. Souches bactriennes Escherichia coli ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Staphylococcus aureus ATCC Entrobacter sp Entrobacter sp BLSE+CHN Klebseila pneumoniae BLSE Serratia sp Sensibilit EBr
_
EAcOEt
_
En-BuOH
_ _
+ +++ + +
_ _
+ +++ + ++
_
+++
_ _ _ _
82
_ _
Sterptocoque sp
Non sensible (_), Sensible (+), Trs sensible (+ +), Extrmement sensible (+++)
Les rsultats rvlent des rponses variables en fonction des souches, de la concentration, type de lextrait test et que la sensibilit ou la rsistance aux antibiotiques na aucun rapport avec celle des extraits. Plusieurs travaux ont mis en vidence la grande sensibilit des bactries Gram (+) par rapport aux Gram (-) (Falleh et al., 2008 ; Hayouni et al., 2007 ; Turkmen et al., 2007 ; Shan et al., 2007 ; Kon et al., 2004), Ceci peut sattribuer la diffrence dans les couches externes des bactries Gram (-) et Gram (+). Les bactries Gram (-), indpendamment de la membrane des cellules, possdent une couche additionnelle la membrane externe, qui se compose des phospholipides, des protines et des lipopolysaccharides, cette membrane est impermable la plupart des molcules. Nanmoins, la prsence des porines dans cette couche permettra la diffusion libre des molcules avec une masse molculaire en-dessous de 600 Da. Cependant, l'inhibition de la croissance des bactries Gram (-) a t rapporte, particulirement en combinaison avec les facteurs qui peuvent dranger lintgrit de la cellule et/ou la permabilit de la membrane, telle que les basses valeurs du pH et concentrations accrues en NaCl (Georgantelis et al., 2007). Lhypersensibilit de la souche Staphylococcus aureus ATCC peut sexpliquer par la probabilit de sensibilit des bactries Gram (+) aux changements environnementaux externes, tels que la temprature, le pH et les extraits naturels dus l'absence de la membrane externe (Balentine et al., 2006). Certaines tudes ne rvlent aucune activit antimicrobienne slective vis--vis les bactries Gram (+) ou Gram () (Guesmi Et Boudabous, 2006). La rsistance de la souche Sterptocoque sp peut tre attribue la capacit de lagent antibactrien de diffus uniformment dans l'agar (Hayouni et al., 2007). La zone dinhibition augmente considrablement avec la concentration des extraits, ce qui a t constat aussi par Dordevic et ses collaborateurs, (2007). Les auteurs ont rvl des zones dinhibition de lordre de (20.5 1.8 mm), (12.8 0.5 mm), (16.3 0.5 mm) respectivement pour les souches Staphylococcus aureus ATCC, Escherichia coli ATCC, Pseudomonas aeruginosa ATCC pour une dilution au 2% dhuile essentielle de Carlina acanthifolia, ces zones sont augmentes de lordre de : (21.8 0.9 mm), (13.5 0.5 mm), (19.3 0.5 mm) pour une dilution au 4%.
83
La charge du disque influe lactivit antimicrobienne, Rasooli et ses collaborateurs, (2008) ont remarqu que linhibition de la croissance dAspergillus parasiticus est forte lorsque le disque est plus charg en huiles essentielles de Rosmarinus officinalis et Trachyspermum Copticum. Nous avons employ une quantit moyenne de 10l dextrait par disque, par rapport Gachkar et al., (2007) qui ont employ des fractions minimales de 5l dhuile, tandis que (Dimitrijevic et al., 2007), (Abutbul et al., 2004) ont employ des fractions plus riches : 20 l et 15 l par disque. La mthode utilise pour lvaluation de lactivit antibactrienne influe aussi les rsultats (Natarajan et al., 2005) et (Fazeli et al., 2007) ont constat que la mthode de diffusion partir des puits sur glose est plus adapte pour tudier lactivit des extraits aqueux et organiques de lEuphorbia fusiformis et Hydro-ethanoliques de Rhus coriaria et Zataria multifora, que la mthode de diffusion en milieu glos . Plusieurs classes de polyphnols telles que les acides phnoliques, flavonodes et les tannins servent de mcanisme de dfense des plantes contre les micro-organismes, les insectes, et les herbivores pathognes ( Falleh et al., 2008). Les Polyphnols, tels que les tannins et les flavonodes comme lepigallocatchine, la catchine, la myrictine, la querctine, (Shan et al., 2007) et lutoline (Askun et al., 2009) sont des substances antibactriennes importantes. LHPLC a rvl la prsence de la catchine dans tous les extraits du romarin, ce qui peut expliquer lactivit antibactrienne des extraits de cette plante. Nous avons constat quil nya pas une corrlation entre le contenu phnolique des extraits du romarin et lactivit antibactrienne. Les valeurs du coefficient de corrlation R2 calcules taient entre R2 = 0.442 et R2 = 0.001 et diminuent dans l'ordre suivant : Sterptocoque sp ; Escherichia coli ATCC ; Pseudomonas aeruginosa ATCC ; Staphylococcus aureus ATCC, Entrobacter sp et Entrobacter sp BLSE+CHN. De mme pour lEBr du cumin na pas prsent cette corrlation (R2 = 0.323). Des rsultats similaires (R2 = 0.00) ont t obtenus par (Turkmen et al., 2007) lors de lvaluation de lactivit antibactrienne des extraits de th. Seule linhibition de la souche Klebseila pneumoniae qui a prsent une corrlation trs significative, entre le taux des polyphnols de lEBr du romarin et lactivit antibactrienne avec un coefficient R 2 = 0.992. Ce rsultat est conforme avec la premire tude systmatique labore par (Shan et al., 2007), en effet cette tude montre un rapport fortement positif entre l'activit
84
antibactrienne et le taux des polyphnols dun grand nombre d'extraits (46) d'pices et d'herbes, les valeurs des coefficients de corrlation R2 taient compris entre 0.93 et 0.73. lactivit antimicrobienne ne dpend pas seulement de la prsence des composs phnoliques, mais galement de la prsence de divers mtabolites secondaires (Kil et al., 2009), de lemplacement et le nombre des groupes d'hydroxyles (Falleh et al., 2008). La richesse du cumin en flavonodes na pas amlior son effet antibactrien, ces derniers thoriquement pourraient exercer des effets antibactriens puisqu'ils sont des puissants inhibiteurs in vitro de lADN gyrase (Milane, 2004). Labsence des flavonodes dous de lactivit antibactrienne dans les extraits du cumin, comme les flavanones qui ont montr un effet bactricide sur un Staphylococcus aureus pourrait expliquer les rsultats obtenus (Milane, 2004). Gnralement, toutes les plantes de la famille Lamiaceae connues pour ses composs phnoliques, ont t prouv actif contre une varit de micro-organismes (Gortzi et al., 2007). L'activit antimicrobienne du romarin a t galement attribue lacide rosmarinique, lacide chlorognique et lacide cafique (Tsai et al., 2007), l'acide carnosique et quelques composs de lhuile essentielle, principalement le bornol et le camphre (Ramirez et al., 2007). Bien que, lthanol et le mthanol fussent les meilleurs solvants que d'autres en extrayant les composs phnoliques, en raison de leur polarit et de leur bonne solubilit pour ces composs, les rsultats ont prouv que l'thanol tait le meilleur solvant pour extraire les composs phnoliques, suivi du mthanol et finalement par de leau (Mohsen et Ammar, 2009) ce qui pourrait expliquer la diffrence mentionne ci-aprs. Nous avons constat une diffrence on comparant la zone dinhibition dEscherichia Coli ATCC (0.00 mm) obtenue par lEBr du romarin avec celle (16.62 mm) obtenue par lextrait ethanolique test par (Zhang et al., 2009). Les rsultats de (Ertrk, 2006) rvlent que lextrait ethanolique du cumin est actif contre Escherichia coli ATCC, Pseudomonas aeruginosa ATCC, par rapport lEBr du cumin. Les diffrences trouves peuvent tre attribues aux plusieurs facteurs tels que les facteurs inhrents (varit, conditions ambiantes, facteurs cologiques, variations saisonnires), les mthodes d'extraction (Moreira et al., 2005 ; Sagdic et Ozcan 2003 ; Celiktas et al., 2007a, Turkmen et al., 2007), prparation de lextrait, solvant utilis, la sensibilit des bactries (Loziene et al., 2007), et finalement lorgane de la plante utilis (Natarajan et al., 2005).
85
Nos rsultats nindiquent pas que le cumin est une plante qui ne ncessite pas une importance dans ce domaine, parce que lhuile essentielle de cette plante a montr une activit forte contre Escherichia coli ATCC (13.00 mm), Staphylococcus aureus ATCC (10.00 mm), Lesteria monocytogenes PTCC (17.67mm), par rapport celle du romarin : 16.67 mm ; 8.33 mm ; 16 mm (Gachkar et al., 2007). En contre partie, nos rsultats viennent conforts ceux de (Shan et al., 2003) qui ont trouv que lextrait mthanolique du cumin na aucune activit contre Escherichia coli, Staphylococcus aureus, tandis que celui du romarin sest rvl actif contre le Staphylococcus aureus avec une zone dinhibition gale 8.9 mm (y compris 4.6 mm diamtre du puits) et inactif contre Escherichia coli. Dun autre cot, elles sont en accord avec ceux de (Celiktas et al., 2007a) qui ont indiqu que les bactries testes taient sensibles aux huiles essentielles et partiellement aux extraits mthanoliques du romarin. Il est important, de prciser quun rsultat observ lors de lvaluation dun extrait brut ou dune fraction enrichie est la composante de deux paramtres : lactivit intrinsque des produits actifs et leur quantit relative dans lextrait. Par exemple, une activit avre dun extrait peut aussi bien tre le reflet dune faible quantit de constituants trs actifs que dune grande quantit de constituants peu actifs (Ferrari, 2002), ou certains constituants tels que les hydrocarbures et les alcools qui dmontrent un synergisme (Chaibi et al., 1997). Il ne faut pas oublier que le produit actif qui se prsente dans la plante peut tre : soit actif sans tre mtabolis et aura ainsi une activit in vitro et in vivo ; soit actif aprs mtabolisation et dans ce cas il sera inactif in vitro et actif in vivo. Pour de nombreuses plantes, en fonction de la date de la rcolte il aura des variations trs importantes dans la composition chimique et de lactivit. Lexemple du latex obtenu par incision du tronc d'Alafia multiflora utilis pour le traitement des plaies en Afrique tropicale. Selon la priode de rcolte le taux d'acide vanillique varie de 5 % 16 % et l'activit paralllement d'un facteur 3 (Balansard, 2007). Il a t rapport que les composs responsables de l'action antibactrienne semblent vraisemblablement tre les diterpnodes phnoliques, qui sont les composs principaux de la fraction apolaire des extraits des plantes (Fernandez-Lopez et al., 2005), Ceci pourrait expliquer la modeste activit de nos extraits polaires. Nanmoins, il est toujours possible que l'ajout de DMSO un extrait vgtal diminue son activit intrinsque de telle manire que dans ce cas le rsultat n'a qu'une valeur relative (Balansard, 2007).
86
Finalement, il sagit dextraits, contenant un grand nombre de composs diffrents. Il est donc probable quils contiennent des composs qui, une fois purifi, aient une activit comparable celle dun agent chimique. Les rsultats du test de synergie sont indiqus dans le tableau.18 Tableau.18. Diamtre de la zone dinhibition de LEBr du cumin + lEBr du romarin. Diamtre de la zone dinhibition *(mm) Souches bactriennes Escherichia coli ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Staphylococcus aureus ATCC Entrobacter sp Entrobacter sp Klebseila pneumoniae Serratia sp Sterptocoque sp LEBr du cumin + lEBr du romarin la dilution 9.67 0 .58 18.50 2 .12 9.00 0 .00 11.67 0 .58 -
Les prsents rsultats nont pas rvl une synergie daction, entre les extraits mthanoliques des deux plantes, par contre (Zhang et al., 2009) ont observ un effet antimicrobien fort dun mlange d'extrait ethanolique du romarin et celui de la rglisse qui peut tre un rsultat des effets synergiques des composs spcifiques dans ce mlange dextraits. En conclusion, la diffrence de lactivit anti-oxydante et antimicrobienne des extraits des deux plantes semble tre directement li la diversit quantitative et/ou qualitative des composs qui prsents dans ces extraits.
87
II.6.2. Activit antifongique : Aucune zone dinhibition na t constate autour des disques imprgns des diffrents extraits. Les rsultats de (Ertrk, 2006), ont dmontr des zones dinhibition de 15 14 mm de lextrait ethanolique du cumin respectivement vis--vis dAspergilus niger et Candida albicans. Ce qui indique que lactivit antifongique dpend aussi de plusieurs facteurs tels que le type du solvant utilis pour lextraction. A la lumire de ces rsultats ont dit que les extraits des deux plantes ne contiennent pas dagent antifongique.
88
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Ces dernires annes, il y a eu un intrt croissant pour l'utilisation des antioxydants et des antimicrobiens naturels. De nombreux chercheurs ont t intresss par les composs biologiquement actifs isols des extraits de plantes. Ce travail avait pour objectifs dvaluer lactivit anti-oxydante et antimicrobienne des extraits (EBr, EAcOEt et En-BuOH) polyphnolique. Le dosage quantitatif des polyphnols totaux, par le ractif de Folin-Ciocalteu a rvl que le romarin est plus riche en polyphnols que le cumin. Le dosage quantitatif des flavonodes par la mthode dAlCl3 a rvl que le cumin est plus riche en flavonodes que le romarin. Le coefficient de corrlation (R2 = 0.197) indique labsence dune corrlation significative entre la teneur des flavonodes et des polyphnols des extraits du cumin. Une corrlation trs significative est trouve entre la teneur des flavonodes et des polyphnols des extraits du romarin (R2 =0.969). Lanalyse qualitative par HPLC a montr la prsence de la rutine dans tous les extraits, la catchine dans les extraits du romarin et labsence de la querctine dans lensemble des extraits. Les rsultats du test de dcoloration du -carotne ont montr une activit inhibitrice doxydation de lacide linolique pour lensemble des extraits, cette dernire reste significativement inferieure celle du control positif BHT (P<0.001). LEAcOEt du du cumin et du romarin, relativement leur teneur
romarin a montr lactivit la plus importante avec un taux dinhibition gale 79.34%. Le coefficient de corrlation (R 2 = 0.816) entre la teneur en polyphnols des extraits du cumin et lactivit anti-oxydante a indiqu que les composs phnoliques interviennent
dans lactivit anti-oxydante des ces extraits, tandis quil nya pas une corrlation significative (R2 = 0.313) entre la teneur en polyphnols et lactivit anti-oxydante des extraits du romarin. Les rsultats du test au DPPH ont montr que les extraits : En-BuOH du cumin, EnBuOH et EAcOEt du romarin ont prsent des activits anti-radicalaires gales 94.55%, 96.18%, 95.81% respectivement. On peut noter que ces activits taient mme plus leves que celle du BHT (92.91%) La teneur en polyphnols totaux des extraits du cumin et du romarin sest corrle significativement (R 2 = 0.977, R2 = 0.997) avec leurs activits anti-radicalaires.
Lactivit antimicrobienne a t value sur 8 souches bactriennes et 4 souches fongiques, par la mthode de diffusion sur milieu glos. Les rsultats biologiques obtenus tout au long de ce test ont montr que : les extraits du romarin ont prsent une activit antibactrienne contre un certain nombre de bactries et lEAcOEt sest rvl le plus actif, alors que seul lEBr du cumin qui tait actif contre Staphylococcus aureus ATCC. Les extraits du romarin ont tmoign dune activit antibactrienne intressante surtout contre la bactrie multi-rsistante Entrobacter sp (BLSE+CHN). Seule linhibition de la souche Klebseila pneumoniae a prsent une corrlation trs significative entre le taux des polyphnols de lEBr du romarin et lactivit antibactrienne avec un coefficient R 2 =0.992. Les extraits des deux plantes se sont rvls inactifs vis--vis les souches fongiques et aucune synergie na t rvle pendant levaluation de lactivit antimicrobienne. Les rsultats prsents ici peuvent contribuer la connaissance des potentiels antioxydants et antimicrobiens de ces espces. Une prolongation de ce travail l'avenir est souhaitable pour tudier les composants prsents dans lEAcOEt du romarin et pour valuer leur activit antibactrienne et antioxydante. Ces rsultats prliminaires montrent que lEAcOEt du romarin tmoigne dune activit antibactrienne et anti-oxydante in vitro, Il serait galement intressant de raliser dautres tudes pour valuer le potentiel in vivo sur des modles animales. Une recherche de lagent antibactrien responsable de linhibition de lEntrobacter sp (BLSE+CHN) est aussi ncessaire et semble dune grande importance. Les mcanismes de l'action de chaque compos phnolique contre diverses bactries sont trs compliqus, il serait donc ncessaire dtudier plus loin et de comprendre le rapport entre lactivit antibactrienne et anti-oxydante et la structure chimique du compos phnolique dans les extraits examins. Nous pensons montrer travers ce travail que les plantes constituent un rservoir trs intressent pour la recherche dans le futur.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
A
Adsersen, A., Gauguin, B., Gudiksen, L., Jager, A K. (2006) Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for acetylcholinesterase inhibitory activity. J Ethnopharmacol. 104: 418-422. Abdel-Hameed, E.S., (2009) Total phenolic contents and free radical scavenging activity of certain Egyptian Ficus species leaf samples. Food Chem. 114:1271-1277. Abutbul, S., Golan-Goldhirsh, A., Barazani, O., Zilberg, D. (2004) Use of Rosmarinus officinalis as a treatment against Streptococcus iniae in tilapia (Oreochromis sp.). Aquaculture. 238: 97-105. Al-Bataina, B.A., Maslat, A.O., AL-Kofahi, M.M. (2003) Element analysis and biological studies on ten oriental spices using XRF and Ames test. J Trace Elem. Med. Biol. 17: 85-90. Albu, S., Joyce, E., Paniwnyk, L., Lorimer, J.P., Mason, T.J. (2004) Potential for the use of ultrasound in the extraction of antioxidants from Rosmarinus officinalis for the food and pharmaceutical industry. Ultrasonics Sonochemistry. 11: 261-265. Almela, L., Sanchez-Munoz, B., Fernandez-Lopez, J A., Roca, M.J, Rabe, V. (2006) Liquid chromatograpic- mass spectrometric analysis of phenolics and free radical scavenging activity of rosemary extract from different raw material. J Chromatography A. 1120: 221229. Amarowicz, R., Troszynska, A., Shahidi, F. (2005) Antioxidant activity of almond seed extract and its fractions. J food lipids. 12: 344-358. Amin, A., Hamza, A.A. (2005) Hepatoprotective effects of Hibiscus, Rosmarinus and Salvia on azathioprine-induced toxicity in rats. Life Sciences.77: 266-278. Ardestani, A., Yazdanparast, R. (2007) Antioxidant and free radical scavenging potential of Achillea santolina extracts. Food Chem. 104: 21-29. Arnold, N., Valentini, G., Bellomaria, B., Laouer, H. (1997) Comparative study of the essential oils from Rosmarinus eriocalyx Jordan & Fourr. from Algeria and R. officinallis L. from other countries. J.essent.Oil Res. 9: 167-175. Arslan, D, Musa ozcan, M. (2007) Evaluation of drying methods with respect to drying kinetics, mineral content and colour characteristics of rosemary leaves. Energy Conversion and Management. (in press)
Aruoma, O. I., Spencer, J. P. E., Rossi, R., Aeschbach, R., Khan, A., Mahmood, N., Munoz, A., Murcia, A., Butler, J., Halliwell, B. (1996). An Evaluation of the Antioxidant and Antiviral Action of Extracts of Rosemary and Provencal Herbs. Food and Chemical Toxicology. 34: 449-456. Aruoma, O I. (1999) Free radicals, antioxidants and international nutrition. Asia Pacific J Clin Nutr. 8: 53-63. Askun, T., Tumen, G., Satil, F., Ates, M. (2009) In vitro activity of methanol extracts of plants used as spices against Mycobacterium tuberculosis and other bacteria. Food Chem. 116: 289-294. Atik bekkara, F., Bousmaha, L., Taleb bendiab, S.A., Boti, J.B., Casanova J. (2007) Composition chimique de lhuile essentielle de Rosmarinus officinalis L poussant ltat spontan et cultiv de la rgion de Tlemcen. Biologie & Sant. 7: 6-11. Atsumi, T., Tonosaki, K. (2007) Smelling lavender and rosemary increases free radical scavenging activity and decreases cortisol level in saliva. Psychiatry Research. 150: 89-96. Audigie, Cl., Figurearella, J., Zonszain, F. (1978) Manipulations danalyses biochimiques.
Doin (Ed). Paris, 274 p. Avril, J.L., Dabernat, H., Denis, F., Monteil, H. (2000) Bactriologie clinique. 3 me dition Ellipses (Ed) Paris, 602 p.
B
Babar Ali, M., Hahn, E.J., Paek, K.Y. (2007) Methyl Jasmonate and Salicylic Acid Induced Oxidative Stress and Accumulation of Phenolics in Panax ginseng Bioreactor Root Suspension Cultures. Molecules. 12: 607-621. Bahorun, T. (1997) Substances naturelles actives : la flore mauricienne, une source dapprovisionnement potentielle. Food and agricultural resarch council, Rduit, Mauritus. 83-94. Bakirel, T., Bakirel, U., Ustuner Keles, O., Gunes Ulgen, S., Yardibi, H. (2008) In vivo assessment of antidiabetic and antioxidant activities of rosemary (Rosmarinus officinalis) in alloxan-diabetic rabbits. J Ethnopharmacol. 116: 64-73. Balansard G., (2007) Analyse critique des protocoles pharmacologiques utiliss pour la recherche d'extraits et de substances pures d'origine vgtale proprits Antibactrienne ou antiparasitaire. Revue ethnopharmacologie.42
Balentine, C.W., Crandall, P.G., OBryan, C.A., Duong, D.Q., Pohlman, F.W. (2006) The pre- and post-grinding application of rosemary and its effects on lipid oxidation and color during storage of ground beef. Meat Science. 73: 413-421. Banerjee, M ., Sarkar, P K. (2004) Growth and enterotoxin production by sporeforming bacterial pathogens from spices. Food Control. 15: 49-496. Behera, S., Nagarajan, S., Rao, L.J.M. (2004) Microwave heating and conventional roasting of cumin seeds (Cuminum cyminum L.) and effect on chemical composition of volatiles. Food Chem. 87: 25-29. Bellakhdar, J. (1997) La pharmacope marocaine traditionnelle. Ibis Press (Ed). Paris,764 p. Beloued, A. (1998) Plantes mdicinales dAlgrie. 2me Edition. Office des publications universitaires (Ed). Alger, 274p. Benakcha, R. (2001) Etude phytochimique de deux plantes algriennes : Centaurea pungens et Salsola vermiculata, activit biologique. Mmoire de magister. Batna. Brub-Gagnon, J. (2006) Isolation et identification de composs antibiotiques des corces de Picea mariana. Mmoire comme exigence partielle de la matrise en ressources renouvelables. Quebec. Bzanger-Beauquesne, L., Pinkas, M., Torck, M. (1986) Les plantes dans la thrapeutique moderne ; 2 me Edition. Maloine (Ed). Paris, 469 p. Bilusic Vundac, V., Brantner, A.H., Plazibat, M. (2007) Content of polyphenolic constituents and antioxidant activity of some Stachys taxa. Food Chem. (in press). Bonnefont-Rousselot, D., Thrond, P., Delattre, J. (2003) Radicaux libres et anti-oxydants. In : Biochimie pathologique : aspects molculaires et cellulaires. Mdecine-sciences. Flammarion (Ed). Paris, pp 59-81. Bouakaz, I., 2006. Etude phytochimique de la plante Genista Microcephala. Mmoire de magister. Batna. Boudiaf, K., (2006) Etude des effets anti-xanthine oxydoreductase et anti-radicalaires des extraits des graines de Nigella sativa. Mmoire de magister .Setif. Boullard, B. (2001) Plantes mdicinales du monde ralits et croyances. ESTEM (Ed) Paris .660 p. Boyraz, N., Ozcan, M. (2005) Antifungal effect of some spice hydrosols. Fitoterapia. 76: 661- 665. Bremness, L. (2002) Plantes aromatiques et mdicinales. Bordas (Ed). Paris, 303 p. Bruneton, J. (1999) Pharmacognosie, phytochimie, plantes mdicinales. 3me Edition. Tec & Doc (Ed). Paris, 575p.
C
Celiktas, O.Y., Hames Kocabas, E.E., Bedir, E., Vardar Sukan, F., Ozek, T., Baser, K.H.C. (2007a) Antimicrobial activities of methanol extracts and essential oils of Rosmarinus officinalis, depending on location and seasonal variations. Food Chem. 100: 553-559. Celiktas, O.Y, Bedir, E., Vardar Sukan, F. (2007b) In vitro antioxidant ctivities of Rosmarinus officinalis extracts treated with supercritical carbon dioxide. Food Chem. 101: 1457-1464 Chaibi, A., Ababouch, L.H., Belasri, K., Boucetta, S., Busta, F.F. (1997) Inhibition of germination and vegetative growth of Bacillus cereusT and Clostridium botulinum 62A spores by essential oils. Food Microbiology. 14:161-174. Ciulei, I. (1982) Methodology for analysis of vegetable drugs. 67p. Correa Dias, P.C., Foglio, M.A., Possenti, A., De Carvalho, J.E. (2000) Antiulcerogenic activity of crude hydroalcoholic extract of Rosmarinus officinalis L. J Ethnopharmacol. 69: 57-62.
D
Dacosta, E. (2003) Les phytonutriments bioactifs. Yves Dacosta (Ed). Paris, 317p. Deba, F., Dang Xuan, T., Yasuda, M., Tawata, S. (2008) Chemical composition and antioxidant, antibacterial and antifungal activities of the essential oils from Bidens pilosa Linn. var. Radiata. Food Control. 19: 346-352 . De Rijke, E., Out P., Niessen, W. M.A., Ariese, F., Gooijer, C., Brinkman, U.A.T. (2006) Analytical separation and detection methods for flavonoids. J Chromatography A.1112: 31-63. Dhandapani, S., Subramanian, V. R., Rajagopal, S., Namasivayam, N. (2002) hypolipidemic effect of cuminum cyminum L. on alloxan-induced diabetic rats. research. 46: 251-255. Diallo A., 2005. Etude de la phytochimie et des activites biologiques de Syzygium guineense willd. (MYRTACEAE). Thse de Doctorat. Mali. Dimitrijevic, S.I., Mihajlovski, K.R., Antonovic, D.G., Milanovic-Stevanovic, M.R., Mijin, D.Z. (2007) A study of the synergistic antilisterial effects of a sub-lethal dose of lactic acid and essential oils from Thymus vulgaris L., Rosmarinus officinalis L. and Origanum vulgare L. Food Chem. 104: 774-782. Djeridane, A., Yous, M., Nadjemi, B., Boutassouna, D., Stocker, P., Vidal, N. (2006) Antioxidant activity of some Algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds. Food Chem. 97: 654-660. Pharmacological
Dordevic, S., Petrovic, S., Dobric, S., Milenkovic, M., Vucicevic, D., Zizic, S., Kukic, J. (2007) Antimicrobial, anti-inflammatory, anti-ulcer and antioxidant activities of Carlina acanthifolia root essential oil .J Ethnopharmacol. 109: 458 -463 . Dorman, H.J.D., Peltoketo, A., Hiltunen, R., Tikkanen, M.J. (2003) Characterisation of the antioxidant properties of de-odourised aqueous extracts from selected Lamiaceae herbs. Food Chem. 83: 255-262. Duarte, M. C.T., Figureueira, G.M., Sartoratto, A., Rehder, V.L.G, Delarmelina, C. (2005) Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants. J Ethnopharmacology. 97 : 305311.
E
Elgoun, S. (2003) (LAMIACEAE)
. . . El-Sawi, S.A., Mohamed, M.A. (2002) Cumin herb as a new source of essential oils and its response to foliar spray with some micro-elements. Food Chem. 77: 75-80. Erkan, N., Ayranci, G., Ayranci, E. (2008) Antioxidant activities of rosemary (Rosmarinus Officinalis L.) extract, blackseed (Nigella sativa L.) essential oil, carnosic acid, rosmarinic acid and sesamol. Food Chem. 110: 76-82. Ertrk, . (2006) Antibacterial and antifungal activity of ethanolic extracts from eleven spice plants. Biologia, Bratislava. 61: 275-278.
F
Falleh, H., Ksouri, R., Chaieb, K., Karray-Bouraoui, N., Trabelsi, N., Boulaaba, M., Abdelly, C. (2008) Phenolic composition of Cynara cardunculus L. organs, and their biological activities .C. R. Biologies. 331: 372-379. Favier, A. (2003) Le stress oxydant Intrt conceptuel et exprimental dans la comprhension des mcanismes des maladies et potentiel thrapeutique . Lactualit chimique. 108-115. Fazeli, M. R., Amin, G., Ahmadian-Attari, M. M., Ashtiani, H., Jamalifar, H., Samadi, N. (2007) Antimicrobial activities of Iranian sumac and avishan-e shirazi (Zataria multiflora) against some food-borne bacteria. Food Control 18: 646-649. Fecka, I., Turek, S. (2008) Determination of polyphenolic compounds in commercial herbal drugs and spices from Lamiaceae: thyme, wild thyme and sweet marjoram by chromatographic techniques. Food Chem. 108: 1039-1053. Ferrari, J. (2002) Contribution la connaissance du mtabolisme secondaire des Thymelaeaceae et investigation phytochimique de lune delles: Gnidia involucrata Steud. ex A. Rich. Thse de doctorat. Lausanne.
Fernandez-Lopez, J., Zhi, N., Aleson-Carbonell, L., Perez-Alvarez, J.A., Kuri, V. (2005) Antioxidant and antibacterial activities of natural extracts: application in beef meatballs. Meat Science. 69: 371-380. Fiorentino, A., DAbrosca, B., Pacifico, S., Golino, A., Mastellone, C., Oriano, P., Monaco, P. (2007) Reactive Oxygen Species Scavenging Activity of Flavone Glycosides from Melilotus neapolitana. Molecules. 12: 263-270.
G
Gachkar, L., Yadegari, D., Rezaei, M.B., Taghizadeh, M., Astaneh S.A., Rasooli, I. (2007) Chemical and biological characteristics of Cuminum cyminum and Rosmarinus officinalis essential oils. Food Chem. 102: 898-904. Gamet-Payrastre, L., Manenti, S., Gratacap, M.P.,Tulliez, J., Chap, H., Payrastre, B. (1999) Flavonoids and the inhibition of PKC and PI 3-kinase. General Pharmacology. 32: 279286. Gangou piboji, J. (2007) caractrisation des beta-lactamases et leur inhibition par les extraits de plantes mdicinales. Thse de doctorat. Lige. Gao, H., Nishida, J., Saito, S., Kawabata, J. (2007) Inhibitory Effects of 5, 6, 7Trihydroxyflavones on Tyrosinase. Molecules. 12: 86-97. Georgantelis, D., Ambrosiadis, I., Katikou, P., Blekas, G., Georgakis, S A. (2007) Effect of rosemary extract, chitosan and -tocopherol on microbiological parameters and lipid oxidation of fresh pork sausages stored at 4 C. Meat Science. 76: 172-181. Gillij, Y.G., Gleiser, R.M., Zygadlo, J.A. (2007) Mosquito repellent activity of essential oils of aromatic plants growing in Argentina. Bioresource Technology. (in press). Gladine, C., Morand, C., Rock, E., Bauchart, D., Durand, D. (2007) Plant extracts rich in polyphenols (PERP) are efficient antioxidants to prevent lipoperoxidation in plasma lipids from animals fed n-3 PUFA supplemented diets. Animal Feed Science and Technology. 136: 281-296. Gomez-Caravaca, A.M., Gomez-Romero, M., Arraez-Roman, D., Segura-Carretero, A., Fernandez-Gutierrez, A. (2006) Advances in the analysis of phenolic compounds in products derived from bees. J Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41: 1220-1234. Gonzalez-Trujano, M.E., Pena, E.I., Martinez, A.L., Moreno, J., Guevara-Fefer, P., DecigaCampos, M., Lopez-Munoz, Ethnopharmacol. 111: 476-482. F.J. (2007) Evaluation of the antinociceptive effect of Rosmarinus officinalis L. using three different experimental models in rodents. J
Gortzi, O., Lalas, S., Chinou, I., Tsaknis, J. (2007) Evaluation of the Antimicrobial and Antioxidant Activities of Origanum dictamnus Extracts before and after Encapsulation in Liposomes. Molecules. 12: 932-945. Guesmi, A., Boudabous, A. (2006) Activit antimicrobienne de cinq huiles essentielles associes dans les produits de thalassothrapie. Revue des Rgions Arides. Numro spcial : 224-230.
H
Haloui, M., Louedec, L., Michel, J.B, Lyoussi, B. (2000) Experimental diuretic effects of Rosmarinus officinalis and Centaurium erythraea. J Ethnopharmacology. 71: 465-472. Harrorne, J.B., Williams, C.A. (1972) Flavonoid patterns in the fruits of The Umbelliferae. Phytochemiatry. 11: 1741-1750 Hayouni, E.A, Abedrabba, M ., Bouix, M., Hamdi, M., (2007)The effects of solvents and extraction method on the phenolic contents and biological activities in vitro of Tunisian Quercus coccifera L. and Juniperus phoenicea L. fruit extracts. Food Chem. (in press). Heinrich, M., Kufer, J., Leonti, M., Pardo-de-Santayana, M. (2006) Ethnobotany and ethnopharmacology-Interdisciplinary links with the historical sciences. J Ethnopharmacol. 107: 157-160. Hinneburg, I., Dorman, H.J. D., Hiltunen, R. (2006) Antioxidant activities of extracts from selected culinary herbs and spices. Food Chem. 97: 122-129. Ho, S.C., Tsai, T.H., Tsai, P.J., Lin, C.C. (2008) Protective capacities of certain spices against peroxynitrite-mediated biomolecular damage. Food and Chemical Toxicology. 46: 920-928. Hodek, P., Trefil, P., Stiborova, M. (2002) Flavonoids-potent and versatile biologically active compounds interacting with cytochromes P450. Chemico-Biological Interactions. 139: 121. Hollman, P.C.H., Hertog, M.G.L., Katanc, M.B. (1996) Analysis and health effects of flavonoids. Food chem. 51: 43-46.
J
Jalali-Heravi, M.J., Zekavat, B., Sereshti, H. (2007) Use of gas chromatography- mass spectrometry combined with resolution methods to characterize the essential oil components of Iranian cumin and caraway. J Chromatography A. 1143: 215-226.
Janahmadi, M., Niazi, F., Danyali, S., Kamalinejad, M. (2006) Effects of the fruit essential oil of Cuminum cyminum Linn. (Apiaceae) on pentylenetetrazol-induced epileptiform activity in F1 neurones of Helix aspersa. J Ethnopharmacol. 104: 278-282. Justesen, U., Knuthsen, P. (2001) Composition of flavonoids in fresh herbs and calculation of flavonoid intake by use of herbs in traditional Danish dishes. Food Chemistry.73: 245-250.
K
Kandlakunta, B., Rajendran, A.,Thingnganing, L. (2008) Carotene content of some common (cereals, pulses, vegetables, spices and condiments) and unconventional sources of plant origin. Food Chem. 106: 85-89. Kartal, N., Sokmen, M., Tepe, B., Daferera, D., Polissiou, M., Sokmen, A. (2007) Investigation of the antioxidant properties of Ferula orientalis L.using a suitable extraction procedure. Food Chem. 100: 584-589. Kivilompolo, M., Hyotylainen, T. (2007) Comprehensive two-dimensional liquid
chromatography in analysis of Lamiaceae herbs: Characterisation and quantification of antioxidant phenolic acids. J Chromatography A. 1145: 155-164. Kil, H.Y., Seong, E.S., Ghimire, B.K., Chung, I.M., Kwon, S.S., Goh, E.J., Heo, K., Kim, M.J., Lim, J.D., Lee, D., Yu, C.Y. (2009) Antioxidant and antimicrobial activities of crude sorghum extract. Food Chem. 115:1234-1239. Komy, Z.R. (2004) Determination of acidic sites and binding toxic metal ions on cumin surface using nonideal competitive adsorption model. J Colloid and Interface Science. 270 : 281-287. Kon, W.M., Kamanzi Atindehou, K., Terreaux, C., Hostettmann, K., Traor, D., Dosso, M. (2004) Traditional medicine in North Cte-dIvoire: screening of 50 medicinal plants for antibacterial activity. J Ethnopharmacol. 93: 43-49. Kosar, M., Dorman, H.J.D., Hiltunen, R. (2005) Effect of an acid treatment on the phytochemical and antioxidant characteristics of extracts from selected Lamiaceae species. Food Chem. 91: 525-533. Koechlin-Ramonatxo, C. (2006) Oxygne, stress oxydant et supplmentations anti-oxydantes ou un aspect diffrent de la nutrition dans les maladies respiratoires. Nutrition clinique et mtabolisme. 20: 165-177.
L
Lahouel, M., Boulkour, S., Segueni, N., Fillastre, J.P. (2004) The flavonoids effect against vinblastine, cyclophosphamide and paracetamol toxicity by inhibition of lipid-
peroxydation and increasing liver glutathione concentration. Pathologie Biologie. 52 : 314-322. Laurent, L. (1991) Elments minraux. In : Techniques danalyses et de contrle dans les industries agroalimentaires. Volume 4. Lavoisier (Ed). Paris, pp78-98. Le, K., Chiu, F., Ng, K. (2007) Identification and quantification of antioxidants in Fructus lycii. Food Chem. (in press). Lhuillier, A. (2007) Contribution a ltude phytochimique de quatre plantes malgaches : Agauria salicifolia Hook.f ex Oliver, Agauria polyphylla Baker (Ericaceae), Tambourissa trichophylla Baker (Monimiaceae) et Embelia concinna Baker (Myrsinaceae). Thse de doctorat. Toulouse. Li, J., Jiang, Y. (2007) Litchi Flavonoids: Isolation, Identification and Biological Activity. Molecules. 12: 745-758. Lopes-Lutz, D., S. Alviano, D., S. Alviano, C., P. Kolodziejczyk, P. (2008) Screening of chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of Artemisia essential oils Phytochemistry. 69 :1732-1738. Loziene, K., Venskutonis, P. R., Sipailien, A., Labokas, J. (2007) Radical scavenging and antibacterial properties of the extracts from different Thymus pulegioides L. chemotypes. Food Chem. 103: 546-559. Luis, J.C., Martin Perez, R., Valdes Gonzalez, F. (2007) UV-B radiation e.ects on foliar concentrations of rosmarinic and carnosic acids in rosemary plants. Food Chem. 101: 1211-1215.
M
Maataoui, B. S., Hmyene, A., Hilali, S. (2006) Activites anti-radicalaires dextraits de jus de fruits du figuier de barbarie (opuntia ficus indica). Lebanese Science Journal. 7: 3-8. Maisuthisakul, P., Pasuk, S., Ritthiruangdej, P. (2008) Relationship between antioxidant properties and chemical composition of some Thai plants. J Food Composition and Analysis. 21: 229-240. Marfak, A. (2003) Radiolyse gamma des flavonodes. Etude de Leur reactivite avec les radicaux issus des Alcools: formation de depsides. Thse de doctorat. Limoges. Markowicz Bastos, D. H., Saldanha, L. A., Catharino, R. R., Sawaya, A.C.H. F., Cunha, I B. S., Carvalho, P. O. Eberlin, M. N. (2007) Phenolic Antioxidants Identified by ESI-MS from Yerba Mat (Ilex paraguariensis) and Green Tea (Camelia sinensis) Extracts. Molecules. 12: 423-432.
Martin S., Andriantsitohaina R. (2002) Mcanismes de la protection cardiaque et vasculaire des polyphnols au niveau de lendothlium. Annales de cardiologie et dangiologie. 51: 304-315. Mata, A.T., Proenc, C., Ferreira, A.R., Serralheiro, M.L.M., Nogueira, J.M.F., Araujo, M.E.M. (2007) Antioxidant and antiacetylcholinesterase activities of five plants used as Portuguese food spices. Food Chem. 103: 778-786. Merken, H.M., Beecher, G.R. (2000) Liquid chromatographic method for the separation and quantification of prominent flavonoid aglycones. J Chromatography A. 897: 177-184. Middleton, E., Kandaswami, C., Theoharides, T.C. (2000) The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer. Pharmacol Rev. 52: 673-751. Milane, H., (2004) La querctine et ses drivs: molcules caractre pro-oxydant ou capteurs de radicaux libres; tudes et applications thrapeutiques. Thse de doctorat. Strasbourg. Mohammedi, Z. (2006) Etude du pouvoir antimicrobien et antioxydant des huiles essentielles et flavonodes de quelques plantes de la rgion de Tlemcen. Mmoire de magister .Tlemcen. Mohsen, S. M., Ammar, A.S.M. (2009) Total phenolic contents and antioxidant activity of corn tassel extracts. Food Chem.112: 595-598. Moreira, M.R., Ponce, A.G., Del Valle, C.E., Roura, S.I. (2005) Inhibitory parameters of essential oils to reduce a foodborne pathogen. LWT. 38: 565-570. Moulinier, C., (2003) Parasitologie et mycologie mdicales Elments de morphologie et de biologie. E M inter (Ed), 796p. Muthamma Milan, K.S., Dholakia, H., Kaul Tiku, P., Vishveshwaraiah, P. (2008) Enhancement of digestive enzymatic activity by cumin (Cuminum cyminum L.) and role of spent cumin as a bionutrient. Food Chem.110: 678-683.
N
Nalini, N., Sabitha, K., Viswanathan, P., Menon, V.P. (1998) Influence of spices on the bacterial (enzyme) activity in experimental colon cancer. J Ethnopharmacol. 62: 15-24. Nassu, R.T., Guaraldo Goncalves, L.A., Azevedo Pereira da Silva, M.A., Beserra, F.J.(2003) Oxidative stability of fermented goat meat sausage with different levels of natural antioxidant. Meat Science. 63: 43-49.
Natarajan D., John Britto S., Srinivasan K., Nagamurugan N., Mohanasundari C., Perumal G. (2005) Anti-bacterial activity of Euphorbia fusiformis-A rare medicinal herb. J Ethnopharmacol. 102: 123-126. Nauciel, C. (2000) Bactriologie mdicale. Masson (Ed).Paris, 276p. Ngameni, B., Kuete, V., Simo I.K., Mbaveng, A.T., Awoussong, P.K., Patnam, R., Roy, R., Ngadjui, B.T. (2009) Antibacterial and antifungal activities of the crude extract and compounds from Dorstenia turbinata (Moraceae). South African J Botany. 75 : 256-261. Nogala-Kalucka, M., Korczak, J., Dratwia, M .,Lampart-Szczapa, E., Siger, A., Buchowski, M.(2005) Changes in antioxidant activity and free radical scavenging potential of rosemary extract and tocopherols in isolated rapeseed oil triacylglycerols during accelerated tests. Food Chem. 93: 227-235.
O
Okamura, N., Haraguchi, H., Hashimoto, K., Yagi, A. (1994) Flavonoids in Rosmarinus officinalis leaves. Phytochemistry. 37: 1463-1466. Orhan, I., Aslan, S., Kartal, M., Sener, B., Husnu Can Baser, K. (2008) Inhibitory effect of Turkish Rosmarinus officinalisL. on acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase enzymes. Food Chem.108: 663-668. ORiordan, M.J., Wilkinson, M.G. (2008) A survey of the incidence and level of aflatoxin
contamination in a range of imported spice preparations on the Irish retail market. Food Chem.107:1429-1435. Ozturk, M., Aydogmus-Ozturk, F., Duru, M-E., Topcu, G. (2007) Antioxidant activity of stem and root extracts of Rhubarb (Rheum ribes): An edible medicinal plant. Food Chem. 103: 623-630.
P
Papachristos, D.P., Stamopoulos, D.C. (2002) Toxicity of vapours of three essential oils to the immature stages of Acanthoscelides obtectus (Say) (Coleoptera: Bruchidae). J Stored Products Research. 38: 365-373. Papachristos, D.P., Stamopoulos, D.C. (2004) Fumigant toxicityof three essential oils on the eggs of Acanthoscelides obtectus (Say) (Coleoptera: Bruchidae). J Stored Products Research. 40: 517-525. Parmar, N.S., Ghosh, M. N. (1980) Current trends in flavonoid research. Ind. J. Pharmac.12: 213-228.
Peng, Y., Yuan, J., Liu, F., Ye, J. (2005) Determination of active components in rosemary by capillaryelectrophoresis with electrochemical detection. J Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 39: 431-437. Perez, M.B., Calderon, N.L., Croci C.A. (2007) Radiation-induced enhancement of antioxidant activity in extracts of rosemary (Rosmarinus officinalis L.).Food Chem. 104: 585-592. Pincemail, J., Bonjean, K., Cayeux, K., Defraigne, J.O. (2002) Mcanismes physiologiques de la dfense anti-oxydante Physiological action of antioxidant defences. Nutrition clinique et mtabolisme. 16: 233-239. Platel, K., Srinivasan, K. (2000) Stimulatory influence of select spices on bile secretion in rats. Nutrition Research. 20: 1493-1503. Podsedek, A. (2007) Natural antioxidants and antioxidant capacity of Brassica vegetables: A review. LWT. 40:1-11. Poletti, A. (1988) Fleurs et plantes mdicinales. 2me Edition. Delachaux & Niestl (Ed). Paris, 222p. Prajapati, V., Tripathi, A.K., Aggarwal, K.K., Khanuja, S.P.S. (2005) Insecticidal, repellent and oviposition-deterrent activity of selected essential oils against Anopheles stephensi, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus. Bioresource Technology. 96: 1749-1757. Prasad, M.M., Seenayya, G. (2000) Effect of spices on the growth of red halophilic cocci isolated from salt cured fish and solar salt. Food Research International. 33: 793-798. Proestos, C., Sereli, D., Komaitis, M. (2006) Determination of phenolic compounds in aromatic plants by RP-HPLC and GC-MS. Food Chem. 95: 44-52.
Q
Quezel, P., Santa, S. (1963) Nouvelle flore de lAlgrie et des rgions dsertiques mridionales. Tome II. C.N.R.S. (Ed). Paris, 565p.
R
Rahal, K. (2005) standardisation de lantibiogramme en mdecine humaine lechelle nationale.4me edition.116p Ramassamy, C., (2006) Emerging role of polyphenolic compounds in treatment of neurodegenerative diseases: A review of their intracellular targets. European J Pharmacology.545: 51-64. Ramirez, P., Santoyo, S., Garcia-Risco, M.R., Senorans, F.J., Ibanez, E., Reglero, G. (2007) Use of specially designed columns for antioxidants and antimicrobials enrichment by
preparative supercritical fluid chromatography (Prep-SFC). J Chromatography A.1143: 234-242. Rasooli, I., Fakoor, M.H., Yadegarinia, D., Gachkar, L., Allameh, A., Rezaei, M.B.( 2008) Antimycotoxigenic characteristics of Rosmarinus officinalis and Trachyspermum copticum L. essential oils. International J of Food Microbiology.122:135-139. Rice-Evans C. (2001) Flavonoid Antioxidants. Current Medicinal Chemistry. 8:797-807. Roman-Ramos, R., Flores-Saenz, J.L., Alarcon-Aguilar, F.J. (1995) Anti-hyperglycemic effect of some edible plants. J Ethnopharmacol.48: 25-32.
S
Sacchetti, G., Maietti, S., Muzzoli, M., Scaglianti, M., Manfredini, S., Radice, M., Bruni, R. (2005) Comparative evaluation of 11 essential oils of different origin as functional antioxidants, antiradicals and antimicrobials in foods. Food Chem. 91: 621-632. Sagdic, O., Ozcan, M. (2003) Antibacterial activity of Turkish spice hydrosols. Food Control.14: 141-143. Sagdic, O., Kuscu, A., zcan, M., zcelik, S. (2002) Effects of Turkish spice extracts at various concentrations on the growth of Escherichia coli O157:H7. Food Microbiology. 19: 473-480. Samotyja, U., Malecka M. (2007) Effects of blackcurrant seeds and rosemary extracts on oxidative stability of bulk and emulsified lipid substrates. Food Chem. 104: 317-323. Saiedirad, M.H., Tabatabaeefar, A., Borghei, A., Mirsalehi, M., Badii, F., Ghasemi Varnamkhasti, M. (2008) Effects of moisture content, seed size, loading rate and seed orientation on force and energy required for fracturing cumin seed (Cuminum cyminum Linn.) under quasi-static loading. J Food Engineering. 86: 565-572. Schelz Z., Molnar J, Hohmann J. (2006) Antimicrobial and antiplasmid activities of essential oils. Fitoterapia. 77: 279-285. Shahnaz, H., Hifza, A., Bushra, K., Khan, J.I. (2004) Lipid studies of cuminum cyminum fixed oil Pak. J Bot. 36: 395-401. Shan, B., Cai, Y.Z., Brooks, J.D., Corke, H. (2007) The in vitro antibacterial activity of dietary spice and medicinal herb extracts. International J Food Microbiology. 117: 112119. Sebranek, J.G., Sewalt, V.J.H., Robbins, K.L., Houser, T.A. (2005) Comparison of a natural rosemary extract and BHA/BHT for relative antioxidant effectiveness in pork sausage. Meat Science.69: 289-296.
Singh, K.K., Goswami, T.K. (1996) Physical Properties of Cumin Seed. J.agric.Engng Res. 64: 93-98. Singh, K.K., Goswami, T.K. (1998) Mechanical Properties of Cumin Seed (Cuminum cyminum Linn.) under Compressive Loading. J Food Engineering. 36: 311-321. Singletary, K., MacDonald, C., Wallig, M. (1996a) Inhibition by rosemary and carnosol of 7,12- dimethylbenz[a)anthracene (DMBA)-induced rat mammary tumorigenesis and in vivo DMBA-DNA adduct formation. Cancer Letters. 104: 43-48. Singletary, K.W. (1996b) Rosemary extract and carnosol stimulate rat liver glutathione-Stransferase and quinone reductase activities .Cancer Letters. 100: 139-144. Slamenova, D., Kuboskova, K., Horvathova, E., Robichova, S. (2002) Rosemary-stimulated reduction of DNA strand breaks and FPGsensitive sites in mammalian cells treated with H2O2 or visible light-excited Methylene Blue.Cancer Letters.177: 145-153. Sotelo-Felix, J.I., Martinez-Fong, D., Muriel, P., Santillan, R.L., Castillo, D., Yahuaca, P.(2002) Evaluation of the effectiveness of Rosmarinus officinalis (Lamiaceae) in the alleviation of carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in the rat .J Ethnopharmacology. 81: 145-154. Soyal, D., Jindal, A., Singh, I., Goyal, P.K. (2007) Modulation of radiation-induced biochemical alterations in mice by rosemary (Rosemarinus officinalis) extract. Phytomedicine.14: 701-705. Sowbhagya, H.B., Florence Suma, P., Mahadevamma, S., Tharanathan, R.N. (2007) Spent residue from cumin - a potential source of dietary fiber. Food Chem. 104: 12201225. Srinivasan, K. (2005) Spices as influencers of body metabolism: an overview of three decades of research . Food Research International. 38: 77-86. Stefanovits-Banyai, E., Tulok, M.H., Hegedus, A., Renner, C., Szollosi Varga, I. (2003) Antioxidant effect of various rosemary (Rosmarinus officinalis L.) clones+. Acta Biologica Szegediensis. 47:111-113. Surveswaran, S., Cai, Y.Z., Corke, H., Sun, M. (2007) Systematic evaluation of natural phenolic antioxidants from 133 Indian medicinal plants. Food Chem. 102: 938-953.
T
Tawaha, K., Alali, F.Q., Gharaibeh, M., Mohammad, M., El-Elimat, T. (2007) Antioxidant activity and total phenolic content of selected Jordanian plant species. Food Chem. (in press).
Tepe, B., Sokmen, M., Akpulat, H.A., Sokmen, A. (2006) Screening of the antioxidant potentials of six Salvia species from Turkey. Food Chem. 95: 200-204. Tieppo, J., Vercelino, R., Dias, A.S., Silva Vaz, M.F., Silveira, T.R., Marroni, C.A., Marroni, N.P., Henriques, J.A.P., Picada, J.N. (2007) Evaluation of the protective effects of quercetin in the hepatopulmonary syndrome. Food and Chemical Toxicology. 45: 11401146. Tsai, P., Tsai, T., Ho, S. (2007) In vitro inhibitory effects of rosemary extracts on growth and glucosyltransferase activity of Streptococcus sobrinus. Food Chem. (in press). Tsimogiannis, D., Samiotaki, M., Panayotou, G., Oreopoulou, V. (2007) Characterization of Flavonoid Subgroups and Hydroxy Substitution by HPLC-MS/MS. Molecules. 12: 593606. Tunc, I., Berger, B.M., Erler, F., Dagli, F. (2000) Ovicidal activity of essential oils from five plants against two stored-product insects. J Stored Products Research. 36: 161-168. Turkmen, N., Velioglu, Y. S, Sari, F., Polat, G. (2007) Effect of Extraction Conditions on Measured Total Polyphenol Contents and Antioxidant and Antibacterial Activities of Black Tea. Molecules. 12:484-496.
V
Valko, M., Rhodes, C.J.b, Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. (2006) Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160: 1-40. Van Acker, S.A.B. E., Van Balen, G.P ., Van den Berg, D.J ., Bast, A., Van der Vijgh, W.J. F.(1998) Influence of Iron Chelation on the Antioxidant Activity of Flavonoids. Biochemical Pharmacology. 56: 935-943. Vican, P., (2001) Encyclopdie des plantes mdicinales. Larousse (Ed). Paris, 355p. Visanji, J.M., Thompson, D.G., Padfield, P.J. (2006) Induction of G2/M phase cell cycle arrest by carnosol and carnosic acid is associated with alteration of cyclin A and cyclin B1 levels. Cancer Letters. 237: 130-136. Vuorela, S. (2005) Analysis, isolation, and bioactivities of rapeseed phenolics. Helsinki.
W
Wang, W., Wu, N., Zu, Y.G., Fu, Y.J. (2008) Antioxidative activity of Rosmarinus officinalis L. essential oil compared to its main components. Food Chem. 108: 1019-1022.
Wei, G.J, Ho, C.T. (2006) A stable quinone identified in the reaction of carnosol, a major antioxidant in rosemary, with 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical. Food Chem. 96: 471476 . Weckesser, S., Engel, K., Simon-Haarhaus, B., Wittmer, A., Pelz, K., Schempp C.M. Screening of plant extracts for antimicrobial activity against bacteria and yeasts with dermatological relevance. Phytomedicine. (in press). Willatgamuwa, S.A., Platel, K., Saraswathi, G., Srinivasan, K. (1998) Antidiabetic influence of dietary cumin seeds in streptozotocin induced diabetic rats. Research. 18: 131-142. Wojdylo, A., Oszmianski, J., Czemerys, R. (2007) Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chem. 105: 940-949. Wong, C.C., Li H.B., Cheng, K.W., Chen, F. (2006) A systematic survey of antioxidant activity of 30 Chinese medicinal plants using the ferric reducing antioxidant power assay. Food Chem. 97: 705-711. Nutrition
X
Xu, Y.C., Leung, S.W.S., Yeung, D.K.Y., Hu, L.H., Chen, G.H., Che, C.M., Man, R.Y.K., (2007) Structure- activity relationships of flavonoids for vascular relaxation in porcine coronary artery. Phytochemistry. 68: 1179-1188.
Y
Yano, Y., Satomi, M ., Oikawa, H.(2006) Antimicrobial effect of spices and herbs on Vibrio parahaemolyticus. International J Food Microbiology. 111: 6-11.
Z
Zhang, H., Kong, B., Xiong, Y .L., Sun, X. (2009) Antimicrobial activities of spice extracts against pathogenic and spoilage bacteria in modified atmosphere packaged fresh pork and vacuum packaged ham slices stored at 4 C. Meat Science. 81: 686-692. Zhu, J.X, Wang, Y., Kong, L.D., Yang, C., Zhang, X. (2004) Effects of Biota orientalis extract and its flavonoid constituents, quercetin and rutin on serum uric acid levels in oxonate-induced mice and xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase activities in mouse liver. J Ethnopharmacol. 93: 133-140.

: -carotne DPPH ( ) . ).(HPLC 3AlCl Folin-Ciocalteu ) (195.45 4.16 mg EAG/g dEBr (17.39 2.71 mg EQ/g .)dEBr HPLC rutine catchine . . -carotne )%43.97( DPPH )%55.49 )%81.69 )%18.59( ( ( .BHT ).Entrobacter sp (BLSE+CHN . ) Synergie . (
. :
RESUME Le prsent travail a pour objectif dvaluer lactivit anti-oxydante par le biais de deux mthodes : la mthode de blanchissement du -carotne et la mthode au DPPH et de tester lactivit antimicrobienne par la mthode de diffusion en milieu glos, des extraits (EBr, EAcOEt et En-BuOH) des graines du cumin et les feuilles du romarin. Nous avons tout dabord procd aux dosages quantitatifs colorimtriques par un spectrophotomtre UV-Vis des polyphnols totaux, ainsi que les flavonodes comme tant la classe la plus importante de la famille des polyphnols et une analyse qualitative des flavonodes par chromatographie liquide haute performance (HPLC). Les dosages quantitatifs des polyphnols totaux par la mthode de Folin-Ciocalteu et des flavonodes par la mthode dAlCl 3 ont rvl la richesse du romarin en polyphnols (195.45 4.16 mg EAG/g dEBr) et du cumin en flavonodes dEBr). Lanalyse qualitative par HPLC a rvl la prsence de la rutine dans tous les extraits et la catchine dans les extraits du romarin. Lexpression des rsultats de lactivit anti-oxydante et antibactrienne a montr que les extraits du romarin taient plus actifs, comme agents antioxydants et antibactriens. Dans le test de blanchissement du -carotne, lEAcOEt du romarin a montr lactivit anti-oxydante la plus leve (79.34%), tandis que dans le test au DPPH lEn-BuOH du cumin (94.55%) et les extraits En-BuOH (96.18%), EAcOEt (95.81%) du romarin ont prsent une activit anti-radicalaire plus leve que celle du BHT (92.91%). LEAcOEt du romarin tait lextrait le plus actif sur lensemble des bactries testes et a rvl une activit antibactrienne intressante contre la souche multi-rsistante Entrobacter sp (BLSE+CHN). Les rsultats de lactivit antifongique ont montr linefficacit de tous les extraits contre les souches fongiques. De mme les rsultats de lactivit antimicrobienne nont pas indiqu une synergie entre lEBr des deux plantes. (17.39 2.71 mg EQ/g
Mots cls : Cumin, Romarin, Polyphnols, Activit Anti-oxydante, Activit antimicrobienne.
ABSTRACT This work aims at evaluating the antioxidant activity by the means of two methods: the -carotene bleaching method and DPPH assay as well as testing the antimicrobial activity by the Agar-well diffusion method, of the extracts (EBr, EAcOEt and En-BuOH) of the seeds of cumin and the rosemary leaves. First, we carried out colorimetric quantification by a spectrophotometer UV-Vis of total polyphenols as well as the flavonoids being the most important class of the family of polyphenols. Afterwards, we have proceeded at analysis of the flavonoids by high performance liquid chromatography (HPLC). The quantification of total polyphenols using the Folin-Ciocalteu method and of the flavonoids using the AlCl 3 method revealed the richness of the rosemary in polyphenols (195.45 4.16 mg EAG/g of EBr) and the cumin in flavonoids (17.39 2.71 mg EQ/g of EBr). The analysis by HPLC revealed the presence of rutin in all the extracts and the catechin in the extracts of the rosemary. The expression of the results of the antioxidant and antibacterial activity showed that the extracts of the rosemary were more active as antioxidant and antibacterial agents. In the -carotene bleaching test , the EAcOEt of the rosemary displayed a very high antioxidant activity (79.34%), whereas in the DPPH assay the En-BuOH of the cumin (94,55%) and the extracts En-BuOH (96,81%), EAcOEt (59.81%) of the rosemary have shown an radical-scavenging activity overpassing that of the BHT (92,91%). The rosemary EAcOEt has been the most active extract against the whole tested Bacterial strains. It has revealed an interesting antibacterial activity against the multi-resistant strain Entrobacter sp (ESBL+HLC). The results of the antifungal activity showed the inefficiency of all the extracts against the fungal strains. Similarly, the results of the antimicrobial activity did not indicate a synergy between the EBr of the two plants. Key words: Cumin, Rosemary, Polyphenols, Antioxidant activity, Antimicrobial Activity.

Cumin These

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Cumin These

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

Anne universitaire : 2008-2009

Ma profonde reconnaissance va Madame Hambaba Leila, je n'oublie pas votre

Je tenais te remercier chaleureusement Monsieur Abddaim Mohamed pour ton

Je remercie tous les membres des laboratoires de bactriologie et de parasitologie pour

LISTE DES ABREVIATIONS

LISTE DES TABLEAUX

Figure.1. Aspects morphologiques du cumin (Site web : www.Wikipedia).

celle du romarin, les rsultats ont montr que la

sont sensibles aux vapeurs des huiles essentielles du romarin.

Figure.3. Effets biologiques des polyphnols (Martin et Andriantsitohaina, 2002).

Figure.4. Structure de base des flavonodes

Figure.5. Schma simplifie des flavonodes

Figure.7. Voie de biosynthse des flavonodes (Milane, 2004).

(Feuilles du romarin / Graines du cumin)

Extraction avec mthanol - eau (7 :3) V/V

Lextrait brut concentr

Traitement avec de leau distille bouillante

Extraction liquide-liquide avec lactate dthyle

Phase dactate dthyle

Extraction liquide-liquide avec le n- Butanol

Figure.9. Les tapes dextraction (Elgoun, 2003).

I.2.4. Dosage des polyphnols :

: Absorbance de lchantillon aprs 48 heures ;

: Absorbance du BHT aprs 48 heures ;

Figure.10. Forme libre et rduite du DPPH (Mohammedi, 2006)

DPPH-H + A. (Celiktas et al., 2007b)

LActivit du balayage du radical DPPH a t mesure selon le protocole dcrit par

Les valeurs sont les moyennes SD de six mesures.

y = 0.0113x + 0.0686 R = 0.9984

0 0 50 100 150 200 250 Concentration (g/ml)

Figure.11. Courbe d'talonnage de l'acide gallique (moyenne SD de trois mesures).

Figure.13. Chromatogramme dHPLC de la querctine enregistr 254 nm.

Figure.14. Chromatogramme dHPLC de la rutine enregistr 254 nm.

Figure.15. Chromatogramme dHPLC de la catchine enregistr 254 nm.

Figure.16. Chromatogramme dHPLC dEBr du cumin enregistr 254 nm.

Figure.17. Chromatogramme dHPLC dEAcOEt du cumin enregistr 254 nm.

Figure.18. Chromatogramme dHPLC dEn-BuOH du cumin enregistr 254 nm.

Figure.19. Chromatogramme dHPLC dEBr du romarin enregistr 254 nm.

Figure.20.Chromatogramme dHPLC dEAcOEt du romarin enregistr 254 nm.

Figure.21. Chromatogramme dHPLC dEn-BuOH du romarin enregistr 254 nm.

E Br E AcOEt E n-BuOH Control ngatif BHT

0.0 0 20 Temps (h) 40 60

E AcOEt 0.6 E n-BuOH Control ngatif 0.4 BHT

0.0 0 20 Temps (h) 40 60

= 0.816), indiquant que 81% de la

16.33 0.58 14.33 0.58 12.67 0.58 9.67 1.53 -

13.67 0.58 11.00 2.64 9.67 1.53 7.33 1.15 -

Figure.28. Leffet de lEAcOEt du romarin sur Staphylococcus aureus ATCC.

Figure.29. Leffet de lEAcOEt du romarin sur Sterptocoque sp.

Figure.30. Leffet de lEAcOEt du romarin sur lEntrobacter sp BLSE+CHN.

Figure.31. Leffet de lEBr du romarin sur Pseudomonas aeruginosa ATCC.

Figure.32. Leffet de lEn-BuOH du romarin Staphylococcus aureus ATCC.

Figure.33. Leffet de lEBr du cumin sur Staphylococcus aureus ATCC.

Mots cls : Cumin, Romarin, Polyphnols, Activit Anti-oxydante, Activit antimicrobienne.

You might also like