Determinacin de glucosa Uno de los mtodos para determinar glucosa, usado frecuentemente, consiste en dos reacciones enzimticas acopladas

(Trinder). En este caso, la primera reaccin es la especfica y la reaccin indicadora es inespecfica. En la primera se emplea glucosa oxidasa (-D-glucosa-oxgeno oxidorreductasa o GOD) para oxidar la glucosa a cido glucurnico y perxido de hidrgeno. Dado que la GOD es muy especfica para la -D-glucosa, la mayora de las preparaciones de GOD contienen la enzima mutarrotasa para catalizar la conversin de la -D-glucosa a la forma beta. El perxido de hidrgeno de la reaccin GOD es consumido por una reaccin redox, en la cual el producto oxidado es coloreado, permitiendo que la reaccin sea seguida por fotocolorimetra. El sustrato coloreado presenta un mximo de absorbancia a =505 nm. Aplicando la ley de Lambert y Beer y teniendo en cuenta que la concentracin de sustrato oxidado es directamente proporcional a la concentracin de glucosa, es posible determinar la concentracin de glucosa en la muestra. Para ello es necesario determinar la absorbancia de una solucin de glucosa de concentracin conocida (patrn de glucosa), o bien realizar una recta patrn con diferentes concentraciones de glucosa.

Muchos compuestos, como la bilirrubina, el cido ascrbico y el cido rico pueden ser oxidados por el perxido de hidrgeno producido, dando una desviacin negativa. Adems, existen muchos compuestos que pueden oxidar al colorante indicador, dando tendencias positivas. Se ha aumentado la especificidad y exactitud de los procedimientos con reacciones acopladas de glucosa oxidasa, eligiendo condiciones de reaccin que reducen estas tendencias al mnimo. El enfoque mas comn es el uso del anlisis cintico de la reaccin. Seleccionando en forma adecuada los tiempos inicial y siguiente para las lecturas puede obtenerse una reduccin de las interferencias qumicas y espectrofotomtricas. Muestra: la muestra de eleccin es suero o plasma. Tambin pueden emplearse otros lquidos orgnicos como LCR y orina. Los anticoagulantes comunes como oxalato, fluoruro, EDTA, citrato o heparina no causan interferencia. Dado que la glucosa en sangre entera a temperatura ambiente puede sufrir una gluclisis con una velocidad de 5% por hora, es necesario separar el cogulo o las clulas tan pronto como sea posible ( los responsables de la destruccin enzimtica son los leucocitos y los hemates). La glucosa en el plasma o suero ya separado es estable durante 24 horas, entre los 2 y los 8 grados. El fluoruro se usa como inhibidor de la gluclisis para conservar la sangre que no puede ser separada inmediatamente.

En cuanto a los intervalos de referencia, no se observan diferencias significativas por sexo o raza, sindo en los adultos de entre 70 y 110 mg/dl, pero si existen algunas relacionadas con la edad. En los nios menores de 5 aos los niveles normales de glucosa pueden ser 10 a 15 % inferiores a los correspondientes para los adultos. Los recin nacidos pueden presentar concentraciones de glucosa sangunea que oscilan entre 20 y 80 mg/dl, y los prematuros, niveles an mas bajos. Cada laboratorio debe realizar sus propios intervalos de referencia. Los niveles de glucosa en LCR son aproximadamente 40% a 80% de los de suero o plasma. Normalmente no existe glucosa detectable en orina. Reactivo de trabajo: se mezclan en orden, la solucin de 4-aminofenazona, la solucin de fenol y la solucin de enzimas.

Material requerido: fotocolormetro, tubos de ensayo, bao a 37 grados, pipetas, pipetas automticas. El material de vidrio debe estar perfectamente limpio y enjuagado, ya que si no es asi, se pueden producir interferencias. Podemos tener un aumento en la reaccin de color por la presencia de agentes oxidantes como el hipoclorito de sodio,(en este caso la absorbancia del blanco aumenta). Mientras que si por ejemplo quedan restos de sustancias reductoras disminuir la respuesta de color. En caso de que haya restos de detergente o metales pesados, habr inhibicin enzimtica. Procedimiento: en tres tubos, marcados como blanco (B), standard (S) y desconocido (D), colocar:

Incubar 10 minutos en bao de 37 grados. Luego leer en espectrofotmetro a 505 nm, o en fotocolormetro con filtro verde (490-530 nm), llevando el aparato a cero con agua destilada, y luego descontando a las lecturas, la lectura del blanco. El color de reaccin final es estable 1 hora, por lo que la absorbancia debe ser leda en ese lapso. Clculo de los resultados: si utilizamos una solucin standard de 1 g/l, entonces Glucosa (g/l)= ADxf, donde f=1 g/l / AS Linealidad: la reaccin es lineal hasta 4,5 g/l. Para valores superiores, diluir al la solucin coloreada final con el reactivo de trabajo, y repetir la lectura, multiplicando el resultado por dos. Podemos determinar la precisin del mtodo en el trabajo prctico, procesando la misma muestra desconocida por duplicado, y teniendo en cuenta los valores que hall cada comisin. Con la serie de datos obtenida obtendremos la media y luego el DS, que se calcula como

Donde xi-x son las diferencias entre cada medicin y la media, y N es el nmero total de mediciones. Para luego calcular el coeficiente de variacin del mtodo en el trabajo prctico (CV%) de esta forma:

Donde sigma es el desvo standard. Significado clnico: la patologa ms comn relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono es la diabetes mellitus. El diagnstico precoz y el control de los pacientes diabticos, tienen por objeto evitar la cetoacidosis y las complicaciones de los sntomas resultantes de la hiperglicemia, mediante el tratamiento adecuado. Para ello se dispone, como prueba de laboratorio, de la determinacin basal de glucosa, en la cual, un resultado mayor a 126 mg/dl, obliga a la realizacin de una PTOG, determinando la glucosa basal y a los 120 minutos luego de la

ingesta de 75 g de glucosa en 375ml de agua, pudiendo en este caso diagnosticar una resistencia a la insulina (140-160 mg/dl a los 120 minutos), o diabetes (>160 mg/dl a los 120 minutos). Dado que existen mltiples factores causales de hiper o hipoglucemia, debe considerarse en cada caso la condicin fisiolgica y/o la patologa presente en el paciente en cuestin.