Relatrio referente aula prtica de Bioqumica I

Caracterizao de lipdeos

Presidente Prudente 2012 1

SUMRIO

1. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 3 2. INTRODUO .................................................................................................................... 3 2.1. Lipdios ........................................................................................................................... 3 3. REAGENTES E PROCEDIMENTOS ............................................................................... 4 3.1. Esterides: Caracterizao e dosagem do colesterol ...................................................... 4 3.2. Reaes para Lipdios saponificveis ............................................................................. 5 4. RESULTADOS E DISCUSSO ......................................................................................... 7 4.1 Esteris: Caracterizao e dosagem de colesterol ........................................................... 7 4.2. Reaes para lipdios saponificveis .............................................................................. 8 4.3. Separao dos cidos graxos......................................................................................... 10 4.4. Propriedades dos sabes e cidos graxos ...................................................................... 10 5. CONCLUSO..................................................................................................................... 12

6. REFERNCIAS ................................................................................................................. 13

1. Objetivos
Caracterizar um esterol atravs de suas reaes de colorao; Caracterizar triacilglicerois atravs de hidrlise alcalina (saponificao); Evidenciar a formao dos produtos de hidrlise (sabes) pelas suas propriedades.

2. Introduo
Os lipdios constituem uma classe de compostos com estrutura bastante variada, caracterizados por sua alta solubilidade em solventes orgnicos e por serem praticamente insolveis em gua. Exercem diversas funes biolgicas, como componentes de membranas, isolantes trmicos e reservas de energia; eles prprios ou seus derivados tambm participam em algumas funces de vitaminas e hormnios. Muitos lipdios so compostos anfipticos. ou seia. apresentam na molcula uma poro polar, hidrofflica, e uma poro apoiar, hidrofbica [1]. Os cidos graxos so cidos monocarboxlicos anfipticos. Geralmente com uma cadela carbnlca longa, com nmero par de tomos de carbono e sem ramificaes, podendo ser saturada ou conter uma insaturao ou duas ou mais insaturaces. O grupo carboxila constitui a regio polar, e a cadeia carbnica, a parte apoiar. cidos graxos livres so poucos encontrados nos organismos, estes sendo mais frequentemente esto ligados a um lcool, que pode ser o glicerol ou esfingosina. Os lipdios resultantes no primeiro caso so os triacilglicerois e os glicerofosfolipidios; no segundo caso so os esfingolipideos (Hgura 1). Os triacilgliceris so uma forma de armazenamento de cidos graxos: os glicerofosfolipdios e os esfingolipldeos, juntamente com o colesterol, fazem parte das membranas celulares [1].

Os triacilgliceris constituem a maneira mais eficiente de armazenar energia nos seres vivos. O seu carter fortemente hidrofbico permite o armazenamento sob forma praticamente 3

anidra, ou seja, sem molculas de gua adsorvida, as quais aumentam muito o peso da reserva de energia. Alm disso, como so compostos altamente reduzidos, sua oxidao libera muito mais energia que a oxidao de quantidades equivalentes de carboidratos ou protenas. Nos vertebrados, os triacilgliceris so depositados no tecido adiposo, de localizao visceral e subcutnea. que atua tambm como isolante trmico e como proteo contra traumas mecnicos [1]. Ao contrrio dos triacilglioeris, todos os outros lipdios mencionados anteriormente so molculas anfipaticas. Nos fostolipdios (glicerotosfolipdios e esiingomieiinas) a poro hidrofilica constituida pelo grupo iosfato, que apresenta carga negativa em pH fisiolgico. ligado a uma outra molcula. tambm polar. Que pode ter carga positiva (colina e etanolamina). carga negativa (serina) ou no apresentar carga (inositol). Os glicolipidios (oerebrosldios e gangliosidios) contem acares hidroflicos. que podem no apresentar carga (glicose e galactose) ou apresentar carga positiva devido presena de grupos amino. A poro hidroflica do colesterol representada por uma hdroxila, e o restante da molcula apoiar. A regio hidrotbica do colesterol representada por uma hidroxila, e o restante da molcula apolar. A regio hidroibica dos demais lipdios anfilicos mencionados representada pelas cadeias de hidrocarboneto da esfingosina e/ou dos cidos graxos. Os lipdios antipticos so elementos estruturais importantes das membranas biolgicas [1,2].

3. Reagentes e Procedimentos 3.1 Esterides: Caracterizao e dosagem do colesterol

a) Reao de Salkowski (qualitativa) Reativos: Soluo clorofrmica de colesterol 1% cido sulfrico concentrado. Tcnica: Em um tubo de ensaio bem seco colocar 1 mL de soluo clorofrmica de colesterol e acrescentar 1 mL de cido sulfrico concentrado.

b) Reao de Liebermann-Burchard (quantitativa) Reativos: Soluo padro de colesterol a 0,2% em cido actico glacial. 4

Reagente cromognico: anidrido actico 220 mL + cido actico glacial 200 mL + cido sulfrico concentrado 30mL Soro humano

Tubos Padro de colesterol 0,2 % (mL) cido actico glacial (mL) Amostra de soro (mL) Reativo cromognico (mL)

1 0,5 6,0

2 0,1 0,4 6,0

3 0,2 0,3 6,0

4 0,4 0,1 6,0

5 0,5 6,0

6 0,4 0,1 6,0

Tcnica: Misturar e levar os tubos ao banho-maria a 37C por 20 minutos e ler as absorbncias em fotocolorimetro com ltro vermelho (660 nm).

3.2 Reaes para Lipdeos saponificveis

1. Solubilidade: Tcnica: Colocar em 3 tubos de ensaio numerados, respectivamente, 1mL de gua destilada, 1 mL de lcool etlico e 1 mL de ter. Juntar a cada tubo 5 gotas de leo vegetal de soja e notar a solubilidade do leo em cada um dos solventes. Em um 4 tubo de ensaio, coloque 5 mL de gua destilada e transfira cuidadosamente pelas paredes deste tubo, a soluo etrea contida no tubo 3, de maneira a formar uma camada de separao gua-ter. Agitar suavemente e observar o aparecimento de emulso (camada constituda por gordura cuja parte polar liga-se gua e a parte apolar ao leo) de leo em gua na interface. Em um 5 tubo de ensaio, prepare o tubo controle, colocando 5mL de gua destilada e 1 mL de ter, para servir de comparao com o quarto tubo.

2. Saponificao: Tcnica: Colocar em um tubo de ensaio grande 1 mL de leo vegetal de soja. Adicionar 2 mL de soluo alcolica de hidrxido de potssio a 10%. Aquecer cuidadosamente em banho de gua fervente durante aproximadamente 8 minutos. Adicionar 10 mL de gua destilada e agitar com basto de vidro, continuando o aquecimento em banho-fervente por 10 minutos.

3. Separao de cidos graxos: Tcnica: Transferir metade do contedo do tubo contendo sabes (obtido no ensaio 2, de saponificao) para outro tubo de ensaio. Verificar o pH desta soluo mergulhando um basto de vidro e testando com papel tornassol. Juntar a soluo contida no tubo, HCl 1:2 gota a gota at pH cido, observado pela mudana de cor no papel de tornassol. Verificar a separao da mistura em duas camadas, Deixar o tubo em banho-fervente at a fuso da camada superior. Conservar o tubo em banho fervente para ensaios posteriores e colocar tambm um outro tubo de ensaio contendo 5 mL de gua destilada para aquecer neste banho fervente. 4. Propriedades dos sabes e cidos graxos: Tcnica: a) Solubilidade dos sabes: Ao tubo contendo a soluo restante do sabo (obtido no ensaio 2 de saponificao), adicionar 5 mL da soluo saturada de cloreto de sdio. b) Formao de sabes por redissoluo dos cidos graxos: Com auxlio de uma pipeta de vidro transferir 3 gotas do leo obtido no ensaio 3 (separao de cidos graxos), para um tubo contendo cerca de 5 mL de gua destilada quente (conforme experimento 3). Adicionar gotas de soluo KOH 1M at a solubilidade da fase oleosa. Agitar suavemente o tubo e verificar a formao de espuma. Conservar esse tubo para ensaios posteriores. No o despreze.

c) Formao de sabes insolveis: Dividir o tubo contendo os sabes obtidos no ensaio 4-b em duas partes, numerando os tubos 1 e 2. Dobrar visualmente o volume de cada tubo com adio de gua destilada. Ao primeiro tubo adicionar 4 gotas de cloreto de clcio a 5% e ao segundo adicionar 4 gotas de acetato de chumbo a 1%. Agitar os tubos. d) Formao da acrolena: Colocar em um tubo de ensaio uma ponta de esptula de bissulfato de potssio slido e 5 gotas de leo de soja. Aquecer cuidadosamente em chama direta, segurando o tubo com uma garra de madeira, at desprendimento de acrolena, detectvel pelo odor caracterstico. e) Adio de iodo:

Colocar em 3 tubos de ensaio enumerados, respectivamente, 1 mL de leo de canola, 1 mL de leo de soja e 1 mL de leo de girassol. Diluir o contedo de cada tubo com 2 mL de clorofrmio. Preparar um controle representado pelo tubo nmero 4, com 2 mL de clorofrmio. Adicionar 3 gotas de soluo de iodo clorofrmica a 1% em cada tubo, agitar. Deixar em repouso na estante, SEM AGITAR OS TUBOS e acompanhar a descolorao das solues , anotando o tempo inicial de descolorao para cada tubo.

4. RESULTADOS E DISCUSSES
4.1 Esterides: Caracterizao e dosagem do colesterol a-Reao de Salkowski (qualitativa) Tabela 01- Dados experimentais Reao de Salkowski Reativos Observaes Soluo clorofrmica de colesterol 1% + Foi observado o desenvolvimento de uma cido sulfrico concentrado colorao vermelha devida ao colesterol

b-Reao de Liebermann-Burchard (quantitativa) Tabela 02- Dados experimentais Reao de Lieberman-Burchard Tubos 1 2 3 Padro de colesterol 0,2 % (mL) 0,1 0,2 cido actico glacial (mL) 0,5 0,4 0,3 Amostra de soro (mL) Reativo cromognico (mL) 6,0 6,0 6,0 Absorbncia 0,0 0.103 0,125

4 0,4 0,1 6,0 0,221

5 0,5 6,0 0.255

6 0,4 0,5 6,0 0.264

Grfico da curva padro de colesterol.

Clculo dos Resultados

Camostra = CP x Aamostra (mg/mL) Apadro Aamostra/P = (Aamostra/P - Abranco)

Fator de converso: C (mg/mL) x 0,022586 = C (mmol/mL) Obs: Nossa amostra apresentou um valor aproximado de 186,5mg% de colesterol sricos totais.

4.2 Reao para lipdeos saponificveis 1-Solubilidade Tabela 03- Solubilidade dos lipdios em gua e em solventes orgnicos Tubos Solubilidade insolvel 1 pouco solvel 2 solvel 3 Ordem de solubilidade: tubo 3 > tubo 2 > tubo 1 A solubilidade foi maior no tubo 3, que continha 1 mL de ter e cinco gotas de leo de soja, pois apesar do ter ser polar ele menos polar que agua devido aos grupos metila presentes nas extremidades de sua cadeia. Estes grupos permitem ao ter solvatar as molculas de lipdeos. A solubilidade do tubo 2, que continha 1 mL de lcool etlico e cinco gotas de leo, foi

menor, pois apesar do lcool ser polar sua solubilizao parcial, formando uma emulso que quando gotas de uma fase permanecem em suspenso na outra fase, devido as densidades das solues serem bastante prximas. No tubo 1, que continha 1 mL de gua destilada e cinco gotas de leo de soja, no houve solubilizao, pois a gua que bastante polar no interage com as molculas de lipdeo, formando duas fases, uma de gua e outra de leo.

Comparao tubo 4 com tubo 5 (controle):

Ao transferirmos a soluo etrea do tubo 3 a um outro tubo de ensaio (tubo 4) que continha 5 mL de gua destilada observarmos a formao de uma interface gua-ter. Por ser pouco polar o ter no se mistura com a gua que bastante polar, formando duas fases. Quando agitada, a mistura forma uma emulso, pois o leo contido na soluo etrea se deposita na forma de pequenas gotculas sobre a gua.

2- Saponificao A reao de saponificao, realizada no experimento, consistiu da hidrlise alcalina das molculas lipdicas, isto , o processo de quebra das ligaes ster existentes nas molculas de triacilglicerol do leo de soja vegetal, na presena de soluo alcolica de hidrxido de potssio 10 %, e mediante aquecimento (banho-maria), tendo como produtos sais de cidos graxos e glicerol, conforme apresentado na equao qumica abaixo:

Triacilglicerol

Potassa alcolica

Glicerol

Sabo

Inicialmente o lquido apresentou duas fases distintas, representando o leo e o KOH. Com o passar do tempo, houve uma reduo do volume de leo, medida que gotas deste iam dispersando-se sobre o KOH. Aps o aquecimento, por 5 minutos, obteve-se por completa a

reao de hidrlise alcalina com a produo do sabo e do glicerol, que juntos formaram no tubo um sistema monofsico. Para conferir maior efetividade reao, procedeu-se agitao do tubo, uma vez que tal procedimento favorece o contato do triacilglicerol com a potassa alcolica, permitindo a coliso de um nmero maior de molculas de reagentes, e, portanto, uma maior concentrao de produtos finais.

4.3 Separao de cidos graxos A adio de HCl a uma soluo aquosa de sabo provoca a precipitao do cido graxo, que pouco solvel em gua e, em soluo aquosa, tende a formar dmeros atravs de fortes ligaes de hidrognio, e, portanto a diviso da mistura em duas fases, sendo a fase slida composta pelo cido graxo. A equao qumica abaixo representa a reao:

4.4 Propriedades dos sabes e cidos graxos a- Solubilidade dos sabes

O exemplo acima demonstra a formao de um sal de potssio. Os sabes constitudos por sais de potssio (K+) so solveis. Em contrapartida, os sais de clcio (Ca2+) e magnsio (Mg2+), formados a partir da reao do lipdeo com Ca(OH)2 e Mg(OH)2, respectivamente, so insolveis e precipitam. A precipitao muito til no processo de purificao dos sabes e tambm pode ser feita por adio de NaCl(aq). b- Formao de sabes por redissoluo dos cidos graxos Estamos redissolvendo o precipitado que obtemos no item (a), aps a adio da soluo concentrada de cloreto de sdio houve a precipitao visto anteriormente (deslocamento do 10

equilbrio qumico), ao acrescentar novamente a soluo de hiroxido de potssio reestabelecemos o equilbrio, e assim a dissoluo total do sabo. c- Formao de sabes insolveis

Reaes de sabes com cloreto de clcio e acetato de chumbo formando precipitados.

d- Formao de acrolena

Como a decomposio do leo de soja gera glicerol, este reage com o bissulfato de sdio formando a acrolena, que foi identificada pelo odor caracterstico.

e- Adio de Iodo Pelo fato dos cidos graxos insaturados nos triacilgliceris terem ligaes duplas, eles sofrem reaes de adio tpicas dos alquenos. A adio de iodo por exemplo, constitui-se em uma base para a determinao do grau de insaturao (quanto mais ligaes duplas no cido graxo, mais iodo pode ser adicionado), i.e., quanto maior o ndice de iodo, mais insaturados so os cidos graxos do lipdio. Portanto o leo que possui mais cidos graxos insaturados o de soja, seguido pelo do canola e por fim o que mais pobre em cidos graxos insaturados o leo de girassol

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5. Concluso Evidenciou-se que os lipdios so molculas que, apesar de quimicamente diferentes entre si, tem a insolubilidade em gua como caracterstica comum; apresentando solubilidade em solventes apolares como, por exemplo, o ter. Atravs das reaes foi possvel compreender as propriedades fsicas e qumicas dos cidos graxos e triacilgliceris, bem como a formao de sabes e sua separao por adio de sais, analisando o aumento da saturao da soluo e da tenso superficial do lquido. Portanto, sua compreenso de fundamental importncia para entender bioquimicamente os diversos processos que ocorrem na natureza.

6. Referncias Bibliogrficas 12

CAMPBELL, M. K. Bioqumica. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2001.

NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: Princpios de Bioqumica. 4. ed. So Paulo: Sarvier, 2006.

HIDRLISE- departamento de engenharia qumica. Disponvel em: <http://www.dequi.eel.usp.br/~barcza/Hidrolise.pdf>. Acesso em: 23 maio 2012. NELSON, L. N; COX, M. M. Lehninger princpios de bioqumica. 4.ed. So Paulo: SARVIER, 2006. POLISSACARDEOS: Reao com o iodo. Disponvel em <http://www.fcfar.unesp.br/alime ntos/bioquimica/praticas_ch/teste_amido.htm>. Acesso em: 23 maio 2012.

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