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Artigo

Identificao de Atividade cida Prosttica em Manchas Contendo Materiais Biolgicos e Alimentos Simuladas para a Anlise Forense
Jos Ricardo dos Santos Vieira1, Alaine Albuquerque da Silva2, Bianca Tatiana Fonte Rodrigues2, Crcia da Silva Alvarez2, Elissandra da Silva Rodrigues Alves2, Georgete Maria Moura Vieira3 1 - Professor do Centro de Cincias Biolgicas da Universidade Federal do Par UFPA 2 - Concluintes do Curso de Farmcia do Centro Universitrio do Par CESUPA 3 - Professora do Curso de Farmcia do Centro Universitrio do Par CESUPA

Resumo
A determinao qualitativa de atividade de fosfatase cida prosttica (FAP) tem sido utilizada h vrios anos na identificao de esperma em material biolgico ou manchas provenientes do local do crime de vtimas de provvel agresso sexual. Para avaliar a sensibilidade do mtodo de Roy modificado na determinao de atividade de FAP em anlise forense, foram analisadas manchas feitas em papel de filtro a partir de material biolgico e alimentos (esperma, sangue total, soro, saliva, secreo vaginal, fezes, urina, feijo, leite e caf) para simular material proveniente de local de crime. Todas as manchas contendo material biolgico mostraram resultados positivos com as manchas de esperma com os mais altos valores (~20.000x em relao s manchas com saliva com 0,92 0,78UI/mL). Manchas de alimentos apresentaram resultados positivos (0,31 0,13UI/mL), o que indica que a atividade de FAP no exclusiva de material biolgico. A metodologia utilizada para simular manchas provenientes de local de crime em casos de estupro, utilizando o mtodo modificado de Roy para determinar a atividade de FAP, mostrou-se adequada para anlises forenses. Entretanto, resultados positivos no podem ser considerados definitivos, mas sugestivos da presena de esperma quando os resultados apresentarem-se milhares de vezes acima de um valor de corte de 1,7UI/mL. Palavras-chaves: Fosfatase cida prosttica, anlise forense

Summary
Detection of phosphatase prostate acid in stains in with human biological material and food products to simulate forensic material Qualitative detection of phosphatase prostate acid (PPA) activity has been used for many years to identify seminal fluid in biological material or stains from clothes of alleged victims of sexual assaults. In order to investigate the sensibility of the modified Roy test for PPA activity determining, stains on filter paper made from human biological material and food products were used to simulate forensic material from crime scene investigation (sperm, whole blood, serum, saliva, vaginal secretion, feces, urine, food products beans, milk, and coffee). All biological material stains have shown PPA activity and stains of sperm have shown the highest PPA activity (~20,000 fold to stains with saliva which have shown 0.92 0.78UI/mL PPA activity). Food stains have shown positive results (0.31 0.13UI/mL) that indicate the PPA activity is not exclusive of biological material. The methodology used to simulate stains from crime scene investigation in rape cases, using the Roy adapted method to detect PPA activity, was adequate to forensic analysis of sperm detection in stains. However, positive results cannot be judged as conclusive but only suggestive of seminal fluid presence when there are results thousands times higher than a cut off of 1.7UI/mL. Key words: Phosphatase prostate acid, forensic investigation

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Introduo

materiais biolgicos e, at mesmo, em alimentos e outros componentes orgnicos (4, 5). O mtodo de Roy tem sido utilizado com sucesso para a quantificao de FAP srica e na anlise qualitativa em casos de violncia sexual como alternativa do clssico teste de Berg desenvolvido na dcada de 1950 (1). Entretanto, seu uso ainda carece de padronizao para a quantificao em anlise forense, uma vez que o esperma possui mais de 1.000 vezes a concentrao de FAP srica e sua quantificao pode contribuir na caracterizao de casos de violncia sexual (4, 6, 7, 8). Desta forma, este trabalho visa testar uma tcnica de dosagem da FAP, por meio do mtodo colorimtrico de Roy, em manchas simuladas com fluidos orgnicos e alimentos avaliando a possibilidade de resultados falsos-positivos ou falsos-negativos na dosagem de FAP em anlises forenses.

Uma amostra de 1cm2 de papel de filtro contendo a amostra foi cortada aps 15 minutos de secagem ao ar e colocado para eluir em 1,0mL de gua destilada estabilizada com 10L de cido actico 10% (v/v) durante 15 minutos em temperatura ambiente. Amostras slidas (p.ex.: fezes, alimentos) foram previamente diludas ( 1g em 1mL de gua) antes de serem adicionadas ao papel de filtro. As amostras de secreo vaginal foram coletadas com swab de algodo esterilizado e distendidas diretamente sobre o papel de filtro, mas tambm foram diludas em 1,0mL de soluo salina fisiolgica (NaCl 0,85%) e depois adicionadas ao papel de filtro. A Figura 1 sumariza o processo metodolgico para a simulao das manchas. Os materiais biolgicos foram provenientes do Laboratrio de Anlises Clnicas do Centro de Ensino Superior do Par (CESUPA) e os alimentos foram provenientes de preparo caseiro.

pecfico de fosfatases que exibem pH timo entre 4,5 e 7,0 e catalizam a hidrlise de monoster ortofosfrico produzindo um lcool e um grupo fosfato, e amplamente distribuda nos tecidos humanos, alm de animais, vegetais e alimentos em geral (1). No homem adulto, a prstata contribui com quase cerca de 50% da fosfatase cida total, sendo o restante proveniente dos demais tecidos (ossos, fgado, bao, rins, eritrcitos e plaquetas) (2). A fosfatase cida prosttica (FAP) (EC 3.1.3.2), por ser substncia especfica do homem e presente no smen, tem sido utilizada com muita freqncia em anlises forenses, pois com o crescente aumento da violncia sexual imprescindvel adotar recursos cientficos sensveis, especficos e pouco dispendiosos para caracterizao de violncia sexual, tornando-se rotina sua pesquisa na secreo vaginal e anal, j que, havendo ejaculao, mesmo em indivduos azoosprmicos (patolgicos ou vasectomizados) certamente haver FAP, o que caracterizar, sem dvida, a conjuno carnal ou o ato libidinoso (3). Entretanto, a especificidade e sensibilidade da FAP so questionveis pela possibilidade de resultados falsos-positivos devido a interferentes presentes em outros

fosfatase cida designa um grupo heterogneo no es-

Metodologia
Foram utilizadas manchas de diversos materiais biolgicos (esperma, sangue total, soro, saliva, fezes, urina e secreo vaginal) e alimentos (caf, leite e feijo) para simular possveis manchas encontradas no local de crimes relacionados com suposto atentado sexual. As manchas foram obtidas pela adio de 50L de cada material em papel de filtro qualitativo nmero 1.

Para evitar a contaminao entre as amostras, foi realizada rigorosa limpeza do material envolvido na obteno dos fragmentos de papel de filtro (pina e tesoura) para evitar resultados falsamente positivos decorrentes da contaminao do material, principalmente por esperma. A FAP foi dosada na soluo eluda atravs do Mtodo de Roy (9), conforme sugerido pelo fabricante do kit de dosagem (Labtest

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dosagem do padro, uma vez que a reao linear segundo a Lei de Lambert-Beer. Uma anlise estatstica dos valores foi realizada utilizando o programa Bioestat verso 4.0 (10). O clculo das mdias e desvios padres dos valores de FAP nas amostras foi executado e um teste T paramtrico de aderncia foi aplicado para avaliar a significncia entre os valores observados e as mdias esperadas. Um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significante. Figura 1. Processo de simulao de manchas para dosagem de FAP pelo mtodo de Roy adaptado - Brasil) com modificaes (Tabela 1). Para as manchas de esperma, alm do esperma ntegro, diluiuse a eluio a 1:10, 1:100 e 1:1000 em gua destilada, com a finalidade de avaliar qual o volume ideal para a dosagem. As absorbncias do controle, teste e padro foram determinadas em espectrofotmetro semi-automtico Bioplus 2000 em comprimento de onda 578 nm, utilizando gua destilada para calibrar o zero de absorbncia. Uma correo de interferentes colorimtricos externos foi feita atravs da subtrao do valor da absorbncia do teste pela absorbncia do controle, multiplicando-se esse valor pelo fator de correo determinado atravs da A pesquisa qualitativa de FAP em manchas presentes em local de crime ou provenientes de peas ntimas de vtimas de ataque sexual questionvel na rotina de investigao forense, haja vista a possibilidade de resultados falsos-positivos observados em vrios trabalhos da literatura (1, 3, 4, 5, 7, 8).

Resultados e discusso

Tabela 1. Protocolo utilizado para a dosagem de fosfatase cida pelo mtodo de Roy modificado para a dosagem em manchas simuladas em papel de filtro Reagentes Substrato de timolftalena monofosfato gua destilada ou deionizada Padro de timolftalena Controle 0,25mL Teste 0,25mL Padro 0,25mL 0,05mL

Incubar em banho-maria a 37C durante 2 min. Amostra (eluio) 0,05mL

Misturar e incubar em banho-maria a 37C exatamente por 30 minutos Reagente de cor Amostra (eluio) 1,0mL 0,05mL 1,0mL 1,0mL

Adaptado do protocolo original disponvel em <http://www.centerlabrs.com.br>

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A metodologia utilizada no presente trabalho para obter material para anlise aps eluio de mancha em gua destilada mostrou-se eficaz na deteco de atividade de FAP em todas as amostras analisadas (Tabela 2). Os valores de atividade de FAP obtidos em manchas de esperma integral, diludo 1:10 e 1:100 ultrapassaram a linearidade de leitura espectrofotomtrica sugerida pelo fabricante do kit de dosagem (>0,800). Desta forma, somente as amostras cuja eluio foi diluda a 1:100 forneceram leitura dentro dos limites de linearidade de 19,34 13,25 x103 UI/mL. Esses resultados corroboram o trabalho de Mendes et al(6), que demonstraram que a dosagem de FAP no esperma deve ser precedida de diluio na ordem mnima de 1:1000 para situar as absorbncias dentro da faixa de linearidade do mtodo. Como a presena de esperma a prova final de que houve ataque sexual, os resultados obtidos demonstram que a necessidade de diluio do eludo na ordem de 1.000 vezes para se obter absorbncia <0,800 sugere fortemente que a mancha analisada esteja contaminada com esperma e isso deve ser informado no laudo. As dosagens de FAP em manchas contendo esperma apresentam valores significativamente aumentados em relao s demais manchas analisadas no presente trabalho (mais de 20.000X, p<0,00001).

Tabela 2. Atividade de fosfatase cida prosttica em manchas simuladas contendo


amostras biolgicas e de alimentos identificada por meio do mtodo de Roy modificado

Manchas Manchas de material biolgico Esperma (integral) Esperma (1:10) Esperma (1:100) Esperma (1:1000) Sangue Total Soro Saliva Fezes Urina Secreo vaginal Manchas de alimentos Feijo Leite Caf

FAP (UI/mL)

Sem leitura* Sem leitura* Sem leitura* 19,34 (13,25) x 103 0,29 (0,47) 0,10 (0,11) 0,92 (0,78) 0,44 (0,59) 0,21 (0,29) 0,50 (0,50)

0,32 (0,27) 0,18 (0,30) 0,44 (0,61)

Mdia ( desvio padro) * Valores de absorbncia acima da linearidade do mtodo (>0,800)

Este resultado apia o uso do mtodo de Roy como de alta sensibilidade na dosagem de FAP em manchas em local de crime. A presena de atividade de FAP em quase todas as manchas contendo material biolgico e em manchas de alimento indica que a simples deteco qualitativa de FAP em manchas no fator conclusivo da presena de esperma, resultados que apiam os achados de Hooft & van der Voorde (4) que observaram a presena de atividade de FAP em at 3,3% dos alimentos investigados.

Esta observao particularmente importante na anlise de manchas de secreo vaginal que revelaram valores na ordem de 0,50 0,5UI/mL e que, apesar de estarem muito abaixo dos nveis observados nas manchas de esperma, podem ser fatores de falsa interpretao na anlise de material genital em casos de suspeita de estupro. Entretanto, uma atividade na ordem de milhares de vezes aumentada em relao aos demais materiais biolgicos um indicativo da presena de esperma, uma vez

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que somente este material biolgico apresentou tal nvel de atividade de FAP no presente estudo. Levando-se em considerao que as manchas encontradas em local de crime no possuem um padro especfico de formao, resultados positivos na pesquisa de atividade de FAP no podem ser conclusivos da presena de esperma. Contudo, a deteco de atividade de FAP aumentada em milhares vezes em relao a um valor de corte terico de 1,7UI/ mL (correspondente atividade mxima detectada em manchas de saliva) pode ser considerada como sugestiva da presena de esperma na mancha investigada em anlise forense. Em contrapartida, o achado de resultados negativos

conclusivo da ausncia de esperma na mancha investigada. A deteco de atividade de FAP nas amostras de alimentos (mdia 0,31 0,13UI/mL) que, teoricamente, no deveriam demonstrar essa atividade, indica que o mtodo possui limitao na presena de interferentes que possam gerar resultado falso positivos, uma vez as mdias de FAP nessas amostras variou significativamente (p<0,027) de um valor nulo esperado na anlise. Em uma anlise de manchas provenientes de atividade humana diria (Vieira GMM et al, 2006, dados no publicados), foi detectado que gua sanitria tambm apresenta atividade de FAP (0,11 0,17UI/l), indicando que outros produtos podem gerar resultados

falsos-positivos em manchas encontradas em local de crime relacionados a possvel ataque sexual. Certamente, a identificao de espermatozides continua sendo o padro-ouro na confirmao de ataque sexual, porm os resultados deste trabalho reforam a necessidade de expandir da anlise de manchas utilizando material proveniente de cena de crime, onde esta metodologia proposta poder ser avaliada e comparada com outros mtodos para ser validada como eficaz na identificao de esperma em manchas.

Correspondncia para:

Jos Ricardo dos Santos Vieira jrvieira@ufpa.br

Referncias Bibliogrficas
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