UNIVERSIDAD CATLICA DEL NORTE FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA

Evacuacin de gametos de lapa frutilla (Fissurella cumingi Reeve, 1849) y lapa negra (Fissurella latimarginata Sowerby, 1835,) mediante inductores qumicos y fsicos

Luis Gallardo Barraza.

Profesor Gua: Luis Pereira Chvez.

Evacuacin de gametos de lapa frutilla (Fissurella cumingi Reeve, 1849) y lapa negra (Fissurella latimarginata Sowerby, 1835,) mediante inductores qumicos y fsicos

Por Luis Gallardo Barraza.

DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA

Aprobado Comisin de Calificacin

__________________________________ Ernesto Corts Pizarro Decano

__________________________________ Luis Pereira Chvez.

__________________________________ Enrique Dupr Moraga

__________________________________ Juan Enrique Illanes Bcher

Informe entregado como un requisito para obtener el ttulo de Ingeniero en Acuicultura, en la Facultad de Ciencias del Mar. Universidad Catlica del Norte. Sede Coquimbo.

UNIVERSIDAD CATLICA DEL NORTE FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA

Evacuacin de gametos de lapa frutilla (Fissurella cumingi Reeve, 1849) y lapa negra (Fissurella latimarginata Sowerby, 1835,) mediante inductores qumicos y fsicos

Actividad de Titulacin Especial presentada para optar al ttulo de Ingeniero en Acuicultura.

Luis Gallardo Barraza.

Coquimbo

Dedicado a Dina

RESUMEN

En este trabajo se indujeron a la evacuacin de gametos dos especies del gnero Fisurella, lapa negra y lapa rosada, con inductores fsicos y qumicos que anteriormente haban sido utilizados con xito en otros moluscos. Se monitore la gravidez de las gnadas de tres sectores diferentes a travs del ndice gonadosomtico en las localidades: El Totoral, Totoralillo centro y Maitencillos. Entre diciembre del 2001 y enero del 2002 se indujeron al desove 55 lapas frutillas, mediante 3 mtodos de aplicacin de perxido de hidrgeno (H2O2), el primero de ellos consisti en una inyeccin intragonadal de H2O2, el segundo fue con H2O2 en forma externa con la metodologa usada por Morse en 1977 y en el tercero se utiliz agua de mar irradiada con luz UV. Adems 95 ejemplares de F.latimarginata fueron inducidos al desove con Cloruro de potasio, H2O2 en forma interna al 3%, Serotonina, shock trmico y luz UV. La duracin total del ciclo gonadal para lapas es de aproximadamente un ao, periodo que puede variar de acuerdo a la subespecies, condiciones climticas y alimentacin. En las localidades analizadas, se pudo apreciar que se encuentran animales maduros todo el ao, pero los porcentajes mensuales son variables, donde existen dos perodos de mayor intensidad de maduracin y evacuacin de gametos, durante la poca invernal y durante los meses de verano, observndose una mayor actividad durante este ltimo perodo. Al comparar la eficiencia de los distintos tipos de inductores se concluye que los mejores fueron los qumicos KCl 0.5M y H2O2 (3%) inyectados directo a la gnada, por la calidad y cantidad de los gametos evacuados, su respuesta fue de 1 24 horas despus de inyectado el inductor. 5

TABLA DE CONTENIDOS.
RESUMEN ...................................................................................................................................... 4 TABLA DE CONTENIDOS. ......................................................................................................... 6 1.- INTRODUCCIN ..................................................................................................................... 7 2.-OBJETIVOS ............................................................................................................................. 20 2.1.- OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................... 20 2.2.- OBJETIVOS ESPECIFICOS.............................................................................................. 20 3.- MATERIALES Y MTODOS. .............................................................................................. 21 3.1.- OBTENCIN DEL NDICE GONADOSOMTICO (IGS).............................................................. 21 3.2.-TRASLADO Y MANTENCIN DE REPRODUCTORES ................................................................. 23 3.3.- INDUCCIN AL DESOVE ........................................................................................................ 23 MTODOS DE INDUCCIN AL DESOVE EN F. CUMINNGI ................................................................ 23 3.3.1.- Perxido de hidrgeno (H2O2) interno......................................................................... 24 3.3.2.- Perxido de hidrgeno (H2O2) externo ........................................................................ 24 3.3.3 .- Luz ultravioleta........................................................................................................... 24 MTODOS PARA LA INDUCCIN A LA LIBERACIN DE GAMETOS DE F. LATIMARGINATA ............... 26 3.3.4.- Cloruro de potasio (KCl) ............................................................................................. 26 3.3.5.- Serotonina (C14H19N502.H2 SO4) ............................................................................ 26 3.3.6.- Perxido de hidrgeno al 3% (H2O2 3%) ................................................................ 27 3.3.7.- Temperatura:.............................................................................................................. 27 3.3.8.- Agua irradiada con luz ultravioleta (UV) .................................................................... 27 3.4. RESPUESTA A LOS INDUCTORES ............................................................................................ 28 3.5.- FECUNDACIN ..................................................................................................................... 28 4.- RESULTADOS ........................................................................................................................ 30 4.1.- OBTENCIN DEL NDICE GONADOSOMTICO (IGS).............................................................. 30 Caleta Maitencillos ................................................................................................................. 31 Caleta Totoral.......................................................................................................................... 32 Caleta Totoralillo centro ......................................................................................................... 33 4.2. HISTOLOGA DEL CICLO REPRODUCTIVO DE AMBAS ESPECIES. .............................................. 34 4.2.1.-Histologa de gnada femenina.................................................................................... 39 4.2.2.-Histologa de gnada masculina. ................................................................................. 40 4.3.-RESPUESTA A LOS MTODOS DE INDUCCIN ......................................................................... 41 FISSURELLA CUMINGI.................................................................................................................... 41 4.3.1.- Perxido de hidrgeno externo .................................................................................... 41 4.3.2.-Perxido de hidrgeno (H2O2) interno.......................................................................... 41 4.3.2.1:Perxido de hidrgeno (H2O2) interno al 1%.............................................................. 42 4.3.2.2:Perxido de hidrgeno (H2O2) interno al 2%............................................................. 42 4.3.2.3:Perxido de hidrgeno (H2O2) interno al 3%............................................................. 42 4.3.2.4.- Perxido de hidrgeno (H2O2) interno al 4%.......................................................... 42 4.3.3.- Agua de mar irradiada con luz ultravioleta ................................................................. 43 FISSURELLA LATIMARGINATA: ........................................................................................................ 44 4.3.4.- Cloruro de potasio (KCl) ............................................................................................. 44 4.3.5.- Serotonina (C14H19N502.H2 SO4) ........................................................................... 44 4.3.6.- Perxido de hidrgeno 3% (H2O2 3%) ....................................................................... 44 4.3.7.- Temperatura............................................................................................................... 44 4.3.8.- Agua irradiada con luz ultravioleta (UV) .................................................................... 44 4.4.-FECUNDACIN ...................................................................................................................... 45 5.- DISCUSIONES Y CONCLUSIONES.................................................................................... 49 6.- REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS................................................................................... 55

1.- INTRODUCCIN Las especies del gnero Fissurella de las costas de Per, Chile y sur de Argentina son numerosas y abundantes, comprendiendo el mayor elemento de la fauna malacolgica de la costa Oeste de Amrica del Sur. En Chile, son conocidas como lapas y tienen un hbitat o nicho nico, ocupando la zona submareal e intermareal. Fissurella maxima, F. cumingi y F. latimarginata habitan comnmente desde la zona intermareal baja hasta profundidades de 5 m. La aparicin de estas especies en la zona intermareal se da en reas no expuestas al oleaje. lo que facilit que las lapas fueran parte de la dieta de los pueblos costeros chilenos desde la prehistoria. (McLean, 1984). En la actualidad alrededor de 10 especies de lapas son extradas con fines comerciales (pesquera multiespecfica). La utilizacin en Chile de las lapas como fuente de alimentacin tiene una antigua data, encontrndose numerosos conchales arqueolgicos a lo largo de la costa. Sin embargo, las capturas comerciales comienzan a tener una importancia relativa slo a partir de la dcada de los ochenta, coincidiendo con la declinacin del recurso loco y la apertura de mercados externos para este recurso. Las lapas son extradas por 3 grupos humanos, los mariscadores de orilla que acceden desde la costa con las mareas bajas y extraen las lapas que se distribuyen en la zona intermareal, los buzos a resuello que extraen las lapas submareales de la zona de la rompiente y los buzos hooka que trabajan sobre las poblaciones submareales propiamente tales (Duran et al, 1987). En general, existe una escasa informacin de las caractersticas biolgicas del recurso lapa y especficamente los antecedentes reproductivos que son un aspecto 7

preponderante para el establecimiento y desarrollo de sistemas de cultivo productivos de estas especies. La clase Gastrpoda corresponde a la clase ms exitosa de los moluscos y se estima que emergieron en el Cmbrico hace 550 Ma. Tuvieron una rpida radiacin colonizando exitosamente todos los ambientes del planeta, para lo cual han desarrollado diversos cambios morfolgicos corporales y funcionales de sus sistemas que les ha permitido utilizar ptimamente el espacio abitico y los diferentes sistemas trficos, siendo actualmente la clase ms numerosa entre los moluscos (Haszprunar, 1988; Bieler, 1992). Otra caracterstica relevante de los gasterpodos es la torsin corporal que ocurre durante el desarrollo larval, desplazndose la masa visceral en 180

(sentido contrario al reloj) respecto de la cabeza, pasando de una simetra bilateral a una asimetra bilateral. Este desplazamiento promueve la atrofia de uno de los rganos pares, la torsin del aparato digestivo y cordones nerviosos. El ano, nefridioporo y gonoporo quedan en posicin anterior, prximos a la cabeza, y evacuan en la cavidad del manto. El proceso de atrofia de los rganos presenta algunas caractersticas propias para algunos grupos de gasterpodos. En Vetigastropodos (Fissurellidae, Haliotidae), durante el desarrollo embrionario del sistema renogenital, se produce en primera instancia la atrofia y prdida de la gnada izquierda con su respectivo gonoducto y posteriormente la prdida del nefridio izquierdo (Olivares, 2009). En general las especies de Fissurella son organismos dioicos, pero en la especie del Mediterrneo F. nubecula se observ un 17% de reversin sexual tipo

protndrica (Bacci, 1947). En cambio en F. barbadensis especie del Caribe no se detect hermafroditismo (Ward, 1966). La gnada es nica y est localizada en el extremo posterior de la cavidad visceral, adyacente a la glndula digestiva. El ovario y testculo tienen forma sacular y poseen un amplio lmen. En las observaciones realizadas en las gnadas de diferentes especies de fisurlidos de Chile, se ha detectado que la proporcin sexual es 1:1 a cualquier tamao del animal, lo cual permite aseverar que las especies son de sexo separado y que en ellas no ocurre la reversin sexual durante el crecimiento ni en la maduracin. El ovario es de color verde y el testculo vara en tonalidades de blanco, segn el estado de funcionamiento gonadal (Bretos, 1979; Bretos et al. 1983; 1988; Olivares et al. 1998; Bretos & Chihuailaf, 1990; 1993.)
En la escala de madurez gnadal se distinguen cuatro estados (previtelogenesis,

vitelogenesis, madurez y evacuacin), basndose la diferenciacin entre ellos en la predominancia de los elementos celulares durante la gametognesis. La fluctuacin de stos, revela una clara actividad reproductiva durante todo el ciclo anual, estableciendo la presencia de organismos maduros, a travs de todo el ao (Olgun et al, 1997), presentando dos desoves parciales al ao. En el gnero Fissurella, el sistema reproductivo se relaciona con el sistema excretor. La gnada, de organizacin en septos, se comunica con la porcin distal del rin derecho distal por medio del canal renopericrdico que funciona como conducto genital. Los gametos son evacuados a la cavidad del manto a travs de la apertura renal derecha. Adems de transportar los gametos, el conducto genital, que comunica con el pericardio a travs del nefrostoma (Fig. 1). La gnada es un 9

saco multilobulado de morfologa y tamao variable, dependiendo del estado de madurez de los ejemplares, presenta dimorfismo sexual en coloracin. En ambos sexos se encuentra separado de otros rganos de la masa visceral. La gnada ocupa una posicin ventral en la cavidad corporal, por debajo de la glndula digestiva y el estmago (Collado, 2007).

10

C
Figura 1.-

Organizacin esquemtica comn del sistema reproductivo. A. Corte transversal. B. Corte dorsal. Abreviaturas: a, ano; c, conducto genital (conducto renopericardial); ct, ctenidium; g, glndula; go, gnada; la, aurcula izquierda; Ik, rin izquierdo; lko, abertura izquierda del rin; n, nephrostoma; p, pericardio; ra, aurcula derecha; rk, rin derecho; rko, abertura rin derecho; v, ventrculo. (Collado, 2007). C. Testculo, de coloracin blanquecina a amarillo plido, dividido superficialmente en lbulos irregulares. D. ovario de color verde, cuya superficie est recorrida por surcos superficiales poco profundos que lo dividen parcial e irregularmente (Olivares, 2009).

Las especies del gnero Fissurella presentan fecundacin externa, hecho que facilita el control de los procesos reproductivos (Huaquin, 1998). Investigaciones referentes a la biologa y tcnicas de manejo en especies del gnero Fissurella en Chile, para la obtencin de gametos maduros y posteriormente larvas viables, son escasos. De las ocho especies comerciales que se distribuyen en las regiones de Coquimbo y Valparaiso, existen tres especies de las que se han obtenido juveniles en laboratorio: F. latimarginata, F. cumingi, y F. costata (Vega et al., 1996). Vega et al. (1996) trabajaron con F. cumingi y obtuvieron juveniles de lapas en laboratorio a travs de la induccin mediante la inyeccin de H2O2 interno y H2O2 externo, con macerado de gnadas y temperatura, en machos y hembras; Perez et al.(2007) lograron inducir el desove de F. nigra con aumento de temperatura combinado con desecacin; Reynoso et al. (2007) obtuvieron un desove 11

espontaneo de F. volcano tras acondicionar reproductores durante 40 das; Huaquin et al (1998) obtuvo gametos de de F.crassa al inyectar las lapas con KCl siguiendo la metodologia de Horstadius (1973) obteniendo evacuacin de

gametos y posterior fecundacin al igual que Bustos et al. (1991) y Vega et al. (1996). Sin embargo, se han presentado dificultades en controlar el desove y la obtencin de gametos; conocimiento importante para planificar cultivos larvales. Los ovocitos del gnero Fissurella estn protegidos por una membrana rgida o corion que tiene una funcin en la fecundacin adems de proteccin, esta tiene un micrpilo, el cual ha sido descrito en varios grupos de invertebrados como gasterpoda, bivalvia, nemertea y echinodermata, siendo universal en insecta y cephalopoda (Austin 1965, Tumboh-Operi 1982, Longo 1987, Focarrelli 1988), el micrpilo es una apertura que permite la penetracin de los espermios entre la envoltura gelatinosa externa y el corin. Los ovocitos de F.cumingi y F.latimarginata son similares en la presencia de la cubierta gelatinosa a los descrito para Tegula funebralis por Moran (1997), F. crassa por Huaquin et al. (1998), Diadora aspera por Hadfield y Strathmann (1996) y F. nigra por Perez (2007). Los espermatozoides en gasterpodos tiene una cabeza cnica, un flagelo y su morfologa es del tipo primitivo, segn Franzen (1956). La induccin al desove en gasterpodos marinos del gnero Haliotis particularmente ha sido controlado satisfactoriamente, Uki y Kikuchi en 1974 lograron la evacuacin de gametos en Haliotis discus hannai con agua irradiada con luz ultravioleta (UV) y Morse en el ao 1977 control la evacuacin de 12

gametos de Haliotis rufens adicionando perxido de hidrgeno al agua de mar donde estaban los reproductores. Ambos mtodos inducen al desove de forma artificial por mecanismos similares, esto es generando radicales libres de endoperxido, HOO - o perxidos radicales OO- en el agua de mar lo que activa la sntesis enzimtica de prostaglandinas en abalones (Morse, 1977). Dentro de los estmulos fsicos, el choque trmico es quiz, el mtodo que ms se emplea actualmente en invertebrados debido a que es fcil y econmico de realizar, adems ha sido estudiado desde principios del siglo pasado por investigadores como Nelson (1928) en Ostrea virginica, Prytherch (1929) en Ostrea gigas (actualmente del gnero Crassostrea) y Young (1945) en Mytilus californianus. Se ha observado que la serotonina (5-HT), siendo un neurotransmisor del sistema nervioso, es un excelente agente inductor de desove en muchos invertebrados, en 1982 Matsutani y Nomura indujeron con 5-HT al desove pectnidos de la especie Patinopecten yessoensis y en 1984 Gibbson y Castagna experimentaron con Argopecten irradians y otros bivalvos.

Fissurella cumingi (Reeve, 1849) presenta una concha ovalada pero no alta, (Fig. 2) presenta costillas radiales finas donde las primarias son ms prominentes que las secundarias. Las estras concntricas de crecimiento no son regulares. El orificio apical es central. Su margen interno es cortante y tiene un ancho variable, de color homogneo o similar al patrn de color dorsal de la concha, el que presenta franjas radiales de color rosa a pardo sobre un fondo de tonos grises a 13

pardos oscuros. Esta especie presenta rasgos que la hacen semejante a F. latimarginata y a F. maxima, de all la complicacin en determinarla cuando la concha se encuentra cubierta de algas. Esta especie tiene la forma general de F. latimarginata, con un patrn de coloracin externa similar al de F. maxima, aunque un poco ms oscura. Sus costillas radiales son ms gruesas que en la primera y un poco ms finas que en la segunda. El margen interno, a diferencia de F. latimarginata, proyecta los rayos de la coloracin externa y generalmente no es grueso como en F. maxima. La diferencia fundamental con stas y otras especies de Fissurella radica en el color del borde del pie, que es rosado a prpura oscuro. (Guzman, 1998). McLean (1984) en su revisin sistemtica de las especies de Fissurella, considera a F. stellata Reeve, 1850 como un sinnimo de F. cumingi, aunque la figura de F. stellata de Riveros-Zuiga (1951) parece ser F. peruviana. Esta especie es conocida con los nombres de "lapa frutilla" y lapa rosada por lo caracterstico del color del pie. Su distribucin segn McLean (1984) va desde Matarani (Per) hasta Mehun (Chile).
Figura 2.- Concha de F. cumingi, se observa el orificio apical central y franjas radiales no muy gruesas.

Fissurella

latimarginata

(Sowerby, 1835) presenta 14

el cuerpo protegido dorsalmente por una concha calcrea secretada por el manto (Olivares, 1995), la concha es cnica y ms aguzada en su parte anterior, con su orificio apical medianamente grande y ovalado (Fig. 3). La superficie externa es ornamentada con bajas, finas y poco espaciadas estras radiales, en un fondo de color prpura oscuro. El interior de la concha es blanco, con el borde grueso (que puede ser angosto en ejemplares de gran tamao), uniforme y de color prpura. Los costados del pie y manto son de un color negro intenso, con prolongaciones de color amarillo en el borde del manto. Sus tentculos tambin son de color amarillo intenso. Especie que habita normalmente la franja inframareal del litoral, sobre rocas y entre el cordn de Lessonia nigrescens, aunque es ms abundante en la zona infralitoral. Los juveniles de la mayora de las especies de Fissurella muestran en la concha dos rayos blancos, uno a cada lado del orificio apical. Esta caracterstica es bastante evidente en sta especie y de all, probablemente, algunos autores reconocen la variedad "biradiata" (Guzman, 1998). Estudios realizados por Acua (1977) en la localidad de Tocopilla concluyeron que esta especie puede alcanzar longitudes mximas de 65 mm., aunque segn McLean (1984) pueden alcanzar los 115 mm. Bretos (com. pers., 2002) seala la importancia de esta especie en el sur del pas, donde es el soporte de la pesquera local. Se distribuye desde Pimentel (Per) hasta el ro Bo Bo Chile (Mclean, 1984).

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Figura 3.- Fissurella latimarginata se observa las prolongaciones del manto y tentculos de color amarillo intenso.

En

la

ltima

dcada se ha extrado un promedio anual de 2.939 585 ton de Fissurella spp. y desde el ao 2000, menos del 10% del

desembarque pesquero se ha desglosado con las denominaciones vernaculares de lapa

negra, reina y rosada, las cuales corresponden a las especies F. latimarginata, F. maxima y F. pulcra o F. cumingi, respectivamente (Bretos, 1988; Osorio, 2002; Sernapesca, 2007). Parte de la comercializacin se realiza directamente al pblico como producto fresco entero y fresco desconchado eviscerado; pero

mayoritariamente se destina a la industria pesquera, la cual procesa el msculo del pie en la forma de fresco refrigerado, congelado y en conserva (Osorio, 2002). El procesamiento industrial implica la prdida total de los caracteres de las especies, resultando imposible su distincin. (Olivares et al, 2006).

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Figura 4.- Desembarque total anual de lapas durante los aos 1998-2009 (Sernapesca, 2009)

Las lneas de elaboracin con que se est exportando el recurso, son bsicamente conserva, congelado, fresco enfriado y deshidratado. Sin embargo, a la luz de las estadsticas oficiales la produccin parece ser monoespecfica, destacando por sobre todas las lneas de elaboracin, la conserva. En este sentido cabe destacar que el precio en el mercado internacional de la tonelada de conserva mantiene un valor promedio (US$ 8.500/t) que no difiere significativamente del congelado y fresco enfriado, no as de la lnea de elaboracin deshidratado, la que alcanza un valor por sobre los US$ 120.000/t. (FIP N 2005-39, 2007). El mercado, tanto nacional como internacional, no presenta mayor inters en el recurso, que justifique un desarrollo de la pesquera en trminos de aumento del esfuerzo. No obstante esto, durante el 2004, producto del incremento del precio del dlar, y consecuentemente el incremento del precio en playa. Se intensific la actividad extractiva en la zona norte, alcanzndose capturas por sobre el promedio histrico, situacin que vari notablemente durante el 2005, producto de la cada del dlar y la sobresaturacin del mercado, debiendo las empresas en algunos 17

casos sacrificar el margen con que manejan el precio del recurso a nivel nacional, situacin que se prolonga durante el 2006. (FIP N 2005-39, 2007).

Desembarques de F.latimarginata y F. cumingi

250 200 toneladas 150 100 50 0 1998

F. cumingi F.latmarginata

2000

2002

2004 aos

2006

2008

2010

Figura 5.- Desembarque de Lapas negras y rosadas (Sernapesca, 2009).

La nica medida de proteccin de la lapa es la restriccin en la talla de extraccin, la que es de 65 mm. Esta normativa sin embargo, no ha tenido mayor efecto en la conservacin de las Fisurellas debido a que se aplica al gnero, existiendo diferencias significativas en los tamaos promedios de las distintas especies. Lo anterior se ha visto reflejado en un aumento de las zonas de sobreexplotacin llevndolas a la extincin o reduccin de sus densidades a niveles de riesgo para la pesquera. Este riesgo ha aumentado debido a que desde 1986 la lapa se viene perfilando como un producto alternativo del loco (Concholepas concholepas) en el mercado nacional y en los mercado asiticos. Los desembarques chilenos de fissurlidos son en promedio de 2.200 toneladas anuales, alcanzando un mximo de 5.500 ton. en 1993 y 4.760 el ao 2004. Esta

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mayor demanda, ha generado una tendencia al alza en los precios de exportacin de los productos con mayor valor agregado (fresco enfriado y conserva).
Tabla I: Exportaciones de lapas (Fissurella spp.) congeladas Ao Cant (KN) Monto (US) 2005 22.709,50 569.709,37 2006 86.187,95 772.852,93 2007 225.663,35 1.925.564,67 2008 153.338,60 1.847.181,51 2009 215.299,08 2.749.703,13

Fuente: ProChile
Tabla II: Exportaciones de lapas (Fissurella spp.) preparadas

Ao Cant (KN) 2007 644.578,20 2008 573.303,14 2009 707.036,24 Fuente: ProChile

Monto (US) 5.040.268,46 4.724.394,99 5.689.327,71

La creciente demanda por fisurlidos hace oportuno y conveniente desarrollar tecnologas de produccin intensiva. La base para crear cultivos intensivos es dominar la liberacin de gametos, concentraciones y condiciones de fecundacin y produccin de juveniles para lo cual se debe experimentar en base a experiencias realizadas en individuos del mismo gnero, familia u especies. Basado en bibliografa, se decidi probar con distintos inductores al desove que haban dado xito en la liberacin de gametos de diferentes gastrpodos marinos, de la mano del seguimiento de la madurez gonadal de forma histolgica y con el clculo del ndice gonadosomtico de las diferentes poblaciones de Fissurellas sp.

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2.-OBJETIVOS 2.1.- OBJETIVO GENERAL Comparar y evaluar la induccin a la evacuacin de gametos de F. aplicado en

cumingi y F. latimarginata con inductores qumicos y fsicos distintas concentraciones.

2.2.- OBJETIVOS ESPECFICOS Determinar el perodo de madurez sexual de diferentes poblaciones de F. cumingi y F. latimarginata a travs del ndice gonadosomtico (IGS). Determinar el efecto de distintos tipos de inductores fsicos y qumicos para la liberacin de gametos de F. latimarginata y F. cumingi.

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3.- MATERIALES Y MTODOS. 3.1.- Obtencin del ndice gonadosomtico (IGS). Durante los meses de mayo del 2001 a julio del ao 2002, en el marco del proyecto Fondef Innovaciones tecnolgicas para repoblamiento y produccin de lapas chilenas de exportacin (Fisurella latimarginata y F. Cumingi) en reas de manejo y Centros de cultivo, se recolectaron mensualmente 30 individuos adultos de F. cumingi y 30 adultos de F.latimarginata de las siguientes localidades de reas de manejo:

Figura 6.- Mapa que muestra caletas donde se realiz el estudio del IGS.

Caleta Maitencillo, sindicato de trabajadores independientes de pescadores

artesanales, Regin de Valparaso. (Fig. 6) Caleta El Totoral, sindicato de trabajadores independientes de buzos y

pescadores artesanales, Regin de Coquimbo. Caleta Totoralillo centro, asociacin gremial de buzos, asistentes y

pescadores artesanales, Regin de Coquimbo. Las lapas fueron colectadas del submareal e intermareal. Se obtuvieron mediante buceo apnea, se midi la longitud de la concha con un vernier de precisin 0,05 mm., seleccionando aquellas de mejor textura y color del pie con 21

un rango de tamao de 6 a 10 cm. Los individuos recolectados se trasladaron al laboratorio hmedo de la Universidad Catlica del Norte (UCN) en heladeras o en bandejas de polipropileno cubiertas con esponjas hmedas y/o cubierta con macroalga fresca (Macrocystis sp).

Una vez en laboratorio, se limpiaron con un cuchillo comn, retirando los epibiontes y algas adheridas a la concha (Gelidium chilensis, Procamium spp. y cirripedios), y luego se depositaron en estanques con flujo de agua, aire abierto y continuo, como el de la Fig. 7.

Figura 7.- Estanque rectangular con flujo de agua abierto utilizado para recibir reproductores.

Mensualmente

se

analizaron 30 individuos de F. cumingi y 30 de F. latimarginata, se determin para cada ejemplar la longitud mxima y ancho de la concha, utilizando un vernier con precisin 0,05 mm., adems se determin el peso total, peso de partes blandas, peso del pie y peso de gnada a travs de una balanza semi-analtica digital marca Libror con precisin 0,01 gr. Para el clculo del ndice gonadosaomtico (IGS) se utiliz la siguiente formula:
Peso de la gonada ( g ) 100 Peso partes blandas ( g )

IGS =

(Bretos, 1988)

Adems, se realiz una descripcin macroscpica de la anatoma interna de las lapas. Paralelamente se extrajo una porcin de la gnada de aproximadamente 1 cm3, para anlisis histolgicos. Para el tratamiento de las muestras, cada porcin de la gnada se fij en solucin Davidson durante 24 horas. Luego, aplicando la tcnica de Martoja & Martoja-Pierson (1967), el tejido gonadal fue deshidratado en alcohol al 70%, aclarado en xilol e incluido en parafina (punto de fusin 57-

22

60C ) de cada bloque se obtuvieron cortes paralelos al eje basal de la gnada de 5m de espesor. Los cortes se tieron con hematoxilina frrica de Harris y eosina acuosa amarillenta, se conservaron en refrigeracin para su anlisis.

3.2.-Traslado y mantencin de reproductores Una vez que el IGS en la poblacin del Totoral fue superior o igual a 12%, en los meses de diciembre del 2001 y enero del 2002, se recolectaron 55 lapas frutillas y 95 lapas negras con una longitud de concha superior a 60mm., las que fueron transportadas a las dependencias de la UCN. Al llegar, fueron recibidas en tres estanques rectangulares de 733 litros que contenan diatomeas bentnicas de la baha de La Herradura asentadas en su superficie (Fig. 7).

3.3.- Induccin al desove Los reproductores se limpiaron, midieron y pesaron, posteriormente se ubicaron en una esponja hmeda durante una hora antes de someterlos a la induccin a la evacuacin de gametos. Las inducciones se realizaron en el laboratorio hmedo, donde las lapas se mantuvieron hasta 36 horas en observacin. (Fig. 8)

Figura 8.- Estructura de madera utilizada para sostener los acuarios con circuito abierto de agua de mar para la induccin al desove.

Los mtodos de induccin al desove en F. cumingi fueron los siguientes:

23

3.3.1.- Perxido de hidrgeno (H2O2) interno Se utilizaron 20 acuarios, con un individuo cada uno, donde se inyecto en la parte posterior izquierda del pie directo a la gnada un volumen de 1,0 mL de H2O2 para esto, se utilizaron 4 concentraciones diferentes de H2O2. Estas concentraciones fueron 1,0%, 2,0%, 3,0% y 4,0%, cada concentracin se replic en 5 lapas. Luego de la inyeccin, cada lapa se ubic en un acuario individual donde se esper la respuesta al inductor.

3.3.2.- Perxido de hidrgeno (H2O) externo Siguiendo el mtodo que uso Morse en 1977 con Haliotis rufescens, se utilizaron 15 acuarios de 12 litros cada uno, cada acuario con una lapa en su interior, se subi el pH al agua de mar a 9,1, adicionando un volumen de 1,1 mL de hidrxido de sodio (NaOH) a una concentracin de 1M (mol soluto/litro de agua destilada) por cada litro de agua de mar. Luego de 10 minutos se adicionaron 3 concentraciones diferentes de perxido de hidrgeno, cada solucin fue aplicada a 5 acuarios. El H2O2 utilizado fue Pedrogen 30 % (PA) marca Riedel-de Han con PM= 34.01 gr/mol con una concentracin del 30%, este fue diluido en agua destilada para obtener concentraciones de 6%, 8% y 10%, para esto se utiliz la formula de dilucin C1*V1=C2*V2 donde C es la concentracin del soluto y V el volumen. Cada concentracin fue adicionada a 5 acuarios, en volmenes de 3 mL. por litro de agua de mar. Estas condiciones se mantuvieron por 2,5 horas, donde transcurrido este tiempo las lapas fueron trasladadas a acuarios con agua de mar fresca, donde se esper la respuesta al inductor. 3.3.3 .- Luz ultravioleta Se utilizaron 15 acuarios, previo a la induccin, se inspeccion el equipo del filtro de luz ultravioleta, marca Life Gard modelo QL-40 con una potencia de 40 watts y una dosis germicida aplicada de 30.000 watts.seg/cm2 (Fig. 9) la

inspeccin consisti en ver la vida til de la lmpara y revisar en la hoja de vida de ella cuantas horas haba sido utilizada anteriormente, se limpi el tubo y las partes internas de la tubera de PVC. El equipo se ubic a una distancia de 20 cm. de la estructura donde se encontraban los acuarios. Se utilizaron 3 caudales diferentes que pasaron por la luz, estos caudales fueron 0,5 L/min, 1,0 L/min y 1,5 24

L/min, cada caudal abasteci a 5 acuarios, y las lapas se mantuvieron en estas condiciones durante 36 horas.

Figura 9.- Equipo de luz ultravioleta utilizado durante las experiencias de induccin al desove en F. cumingi y F. latimarginata.

Esquema de experiencia realizada con Fissurella cumingi mtodo de inyeccin de H2O2 intra-gonadal. Inyeccin intra-gonadal H2O2 (1%) H2O2 (2%) H2O2 (3%) H2O2 (4%)
1

Estanques con individuos

2 3 4 5

1 1

2 2

3 3

4 4

5 5

25

Esquema de experiencia realizada con Fissurella cumingi mtodo externo de aplicacin de perxido de hidrgeno (H2O2) proveniente de compuesto qumico.

H2O2 diluido en el agua de mar H2O2 (6%) H2O2 (8%) H2O2 (10%) externo externo externo

Estanques con individuos

1 2 3 4 5

Esquema de experiencia realizada con Fissurella cumingi mtodo externo de aplicacin de perxido de hidrgeno (H2O2) proveniente de agua irradiada con luz ultravioleta (fotlisis del agua de mar). Caudal irradiado con luz U.V. 0.5 L/min. 1.0 L/min. 1.5 L/min.
1 2

Estanque con individuos

3 4 5

Los mtodos para la induccin a la liberacin de gametos de F. latimarginata fueron los siguientes: 3.3.4.- Cloruro de potasio (KCl) Esta solucin fue aplicada a dos grupos de 18 ejemplares, fueron inyectados con 1 mL de KCl 0,5 M. un grupo se inyect directo a la gnada, el otro fue inyectado en el msculo del pie. 3.3.5.- Serotonina (C14H19N502.H2 SO4) Esta neurohormona se inyect directamente a la gnada en 12 reproductores en una concentracin de 0,2 mM en un volumen de 0,5 mL.

26

3.3.6.- Perxido de hidrgeno al 3% (H2O2 3%) Un grupo de 18 reproductores fueron inyectados con H2O2 directo a la gnada en una concentracin de 3 % en un volumen de 0,5 mL.

3.3.7.- Temperatura Para la induccin a la liberacin de gametos mediante el aumento de temperatura, se utiliz un calentador de agua que lentamente aument la temperatura del agua (6,1 C en 7 horas), desde un valor inicial de 14,8 C.

3.3.8.- Agua irradiada con luz ultravioleta (UV) Para el proceso de induccin a liberacin de gametos mediante la utilizacin de irradiacin UV. El agua circulante en los estanques de mantencin de reproductores fue irradiada durante 12 hrs. en forma continua, una vez concluido este perodo se mantuvo en observacin respuesta. durante 24 hrs. para una posible

Esquema de la experiencia realizada con Fissurella latimarginata Inyeccin intra-gonadal H2O2 (3%)

Inyeccin intra-gonadal

KCl (0.5M)

Inyeccin al pie

KCl (0.5M)

serotonina

gnada

Caudal irradiado con luz U.V.

1.5 L/min

Incremento T 6.1C en 7 horas

27

3.4. Respuesta a los inductores Como criterio de respuesta a los distintos tipos de inductores fsicos y qumicos de ambas especies de lapas se consideraron los siguientes aspectos: 1. Existe o no evacuacin de gametos? 2. Identificacin de sexo del reproductor 3. Viabilidad de gametos (formas definidas o indefinidas) 4. Cantidad de gametos 5. Se midieron los ovocitos (dimetro) 6. En machos se observ motilidad efectiva y morfologa de los espermios.

3.5.- Fecundacin Cuando evacuaron los gametos, se recogieron desde el fondo los ovocitos a travs de una espiga de vidrio con manguera mediante sifoneo, luego fueron trasvasijados a un acuario limpio y tamizados (tamiz de 300 m.) posteriormente, se tom una muestra para contar los huevos y segn la morfologa que presentaban, se obtuvo la cantidad de huevos viables por hembra. Los criterios para determinar la viabilidad de los huevos fueron: Ncleo definido Forma esfrica del corion Los espermatozoides fueron colectados a un vaso precipitado, determinando su densidad por mL con un hematocitometro, se observ su movilidad y utilizando una relacin de 10 espermatozoides por ovocito aproximadamente. Se realiz la mezcla en un acuario completndose con agua fresca. Transcurridos 15 minutos, nuevamente fueron tamizados a 100 m, para evitar la poliespermia y eliminar focos de contaminacin. Se contaron los huevos fecundados observando el cierre del micropilo en la periferia del corion (Fig. 23), dando comienzo al lavado de huevos. Transcurridos 30 minutos, cuando los huevos decantaron, se eliminaron los huevos que permanecan flotando y se repuso el nivel de agua, estos lavados se realizaron 5 veces. Durante todo el proceso de fecundacin, se utiliz agua microfiltrada e irradiada con luz ultravioleta.

28

Primer da Transcurridas 24 horas postfecundacin se comenz con los cambios de aguas los que fueron efectuados cada 6 horas en forma parcial (80% del contenido total del acuario cada vez), dejando una densidad aproximada de 20 larvas/mL. Se utilizaron 5 acuarios, para lo cual se ocup un tamiz de 100 micrones sumergido en agua para no daar las larvas. En cada lavado, se realiz un monitoreo del estado de las larvas y de la mortalidad con un microscopio Nikon Alphaphot ys y un proyector de perfiles Nikon 758475. En los monitoreos tambin se tomaron fotografas con un microscopio Nikon Fluophot HFX-IT con cmara Nikon FX35A.

Segundo da Se continu con cambios totales del contenido de agua de los acuarios, la que fue vertida suavemente sobre un tamiz de 60 m recuperando de esta forma los huevos y larvas recin eclosionadas. Luego de ser lavados, estos fueron devueltos al acuario con agua fresca (12 litros cada acuario). Este da tambin se realiz la seleccin o cosecha de larvas nadantes, la que se realiz mediante sifoneo de las larvas ya eclosionadas que se encontraban nadando en la columna de agua, estas fueron trasladadas a otro acuario.

29

4.- RESULTADOS La gnada es un saco multilobulado de morfologa y tamao variable, dependiendo del estado de madurez de los ejemplares. En ambos sexos, la gnada est bien separada de otros rganos de la masa visceral. La gnada ocupa una posicin ventral en la cavidad corporal, por debajo de la glndula digestiva y el estmago. En este estudio se obtuvo un total de 788 individuos de Fisurella cumingi de las diferentes poblaciones en estudio de las cuales 399 eran machos y 389 hembras, mientras que de la especie F.latimargimata se recolectaron 796 lapas, donde 385 fueron hembras y 411 machos, resultando una proporcin sexual de 1:1 para ambas especies (Fig. 10).

Proporcin sexual Fissurella cumingi

Proporcin sexual Fissurella latimarginata

HEMBRA MACHO

HEMBRA MACHO

Figura 10.- Proporcin sexual de F. cumingi y F. latimarginata en este estudio

4.1.- Obtencin del ndice gonadosomtico (IGS). La duracin total del ciclo gonadal para lapas es de aproximadamente un ao, periodo que puede variar de acuerdo a la subespecies, condiciones climticas y alimentacin. Los valores de IGS obtenidos de cada muestreo se promediaron, obteniendo su respectiva desviacin estndar, y se graficaron para determinar sus variaciones. Se estim que las gnadas estaban maduras cuando los valores de IGS fueron superiores al 10% en la mayora de los casos, y que el desove se produce cuando este IGS disminuye abruptamente. Los IGS por localidades fueron:

30

Caleta Maitencillos En F. cumingi como en F. latimarginata se observa que existen dos periodos claros de reproduccin durante el ao, uno mas intenso que otro, se observaron en invierno valores superiores al 6% en hembras y 10 % en machos. En verano se observaron valores superiores a 10% en hembras de F.latimarginata, mientras que en F. cumingi las hembras superaron el 15 %. En machos en poca estival el IGS supero el 15% en ambas especies (Fig.11 y Fig.12).

25 20 IGS 15 10 5 0
Ju lio A go st o Se pt ie m br e O ctu b N o v re iem br D ici e em br e En er o Fe br er o M ar zo br il M ay o Ju ni o Ju ni o A

Hembras Machos

M eses Figura 11.- Valores de IGS de Fissurella cumingi en caleta Maitencillo, Regin de

Valparaso (2000-2001)

25 20 15 IGS 10 5 0
Ju

Hembra Machos

-5

Figura 12.- Valores de IGS de Fissurella latimarginata en caleta M aitencillo , Regin de Valparaso (2001-2002)

Ju lio A go Se s pt t o ie m br e O ctu b N o v re iem b D ici re em br e En er Fe o br er o M ar zo A br il M ay o Ju ni o

ni o

M eses

31

Caleta Totoral Se observan dos periodos de reproduccin uno de mayor intensidad en enero, donde las hembras de ambas especies alcanzan IGS del 12% y los machos superiores al 15%, mientras que en agosto existe otro periodo donde las hembras y machos de F.cumingi alcanzan IGS del 12% , en tanto F.latimarginata en machos como 14) hembras alcanza un IGS del 10%.(Fig. 13 y Fig.

36 32 28 24 20 16 12 8 4 0
Ju ni o Ag os Se to pt ie m br e O ct ub No re vie m br Di e ci em br e En er Fe o br er o M ar zo Ab ril M ay o Ju ni o

IGS

Hembra Macho

Meses Figura 13.- Valores de IGS de Fissurella cumingi en Caleta Totoral, Regin de Coquimbo (2001 - 2002)

28 24 20 16 12 8 4 0
Ju ni Ag o Se os t pt ie o m b O re ct No ubr e vi em b D ici re em br e En e F e ro br er o M ar zo Ab r il M ay o Ju ni o

IGS

Hembras Machos

Meses

Figura 14.- Valores de IGS de Fissurella latimarginata de caleta Totoral IV Regin (2001 - 2002)

32

Caleta Totoralillo centro Se observa para F. latimarginata un periodo reproductivo en el mes de

noviembre , donde las hembras alcanzan IGS del 10%, en tanto los machos llegan al 12%, en marzo se observa otra alza del IGS donde los machos alcanzan un 12% mientras que las hembras el 15%. En F.cumingi en el mes de diciembre se observa un periodo reproductivo en que el IGS alcanza un 15% en machos como en hembras, en el mes de marzo se alcanzo el mximo IGS muestreado, existiendo un alza en hembras que superan el 20% y en machos superior al 15% (Fig. 15 y Fig. 16).

25 20 15 10 5 0
Fe br er o br e e En er o ct ub re ov ie m br D ic ie m O M ar z M ay o Ju ni o o Ab ril

IGS

Hembras Machos

Meses
Figura 15.- Valores de IGS de Fissurella latimarginata en Caleta Totoralillo Centro IV Regin (2001-2002)

35 30 25 20 15 10 5 0
e N ov ie m br e D ic ie m br e o A br il o O ct ub r En er Fe b M M Ju ni o ar zo re r ay o

IGS

Hembras Machos

Meses

Figura 16.- Valores de IGS de Fissurella cumingi en Caleta Totoralillo Centro, Regin de Coquimbo (2001-2002).

33

En general, en cada uno de los lugares analizados se observ un comportamiento similar en los valores de IGS en las dos especies estudiadas, donde se observan valores relativamente altos en los meses de invierno (agosto), el cual disminuye a finales de ste y comienzo de primavera, reiniciando su ascenso alrededor de los meses de octubre y noviembre.

Los resultados muestran en todos los casos, un ciclo reproductivo continuo y asincrnico. Con tendencia a dos temporadas de evacuacin, observando que en ambas especies para un mismo lugar los periodos de desove y gametognesis son similares por lo que estn estrechamente ligados a los parmetros ambientales del lugar. Al pesar la gnada, se observ la presencia en ella del trematodo Proctoeces spp. que en algunos casos tenia completamente parasitada las gnadas de las lapas. Los resultados muestran que en ambas especies y sexos el sistema reproductivo se relaciona con el sistema excretor ya que al momento de la induccin algunos reproductores reaccionaron con fecas inmediatas. No se detectaron diferencias anatmicas marcadas del sistema reproductivo que permitan diferenciar las especies inequvocamente por lo que este sistema tiene bajo valor taxonmico a nivel especfico.

4.2. Histologa del ciclo reproductivo de ambas especies. En forma general la descripcin de los estados de desarrollo de los gametos observados es la siguiente: Hembras: En los ovarios se distinguieron los siguientes tipos celulares: ovogonias, ovocitos premaduros y ovocitos maduros . El desarrollo de estos citos se presenta en forma de racimos originados a partir del epitelio germinativo. Las ovogonias son clulas pequeas cuyo dimetro flucta entre 4 y 20 m, de forma esfrica, el citoplasma es delgado y el ncleo es grande, esfrico y de 34

posicin relativamente central, con la cromatina condensada en pequeos grnulos basfilos. Los ovocitos previtelognicos son de tamaos que fluctan entre 30 y 55 m., Poseen un citoplasma fuertemente basfilo que se prolonga en un pednculo que los mantiene unidos al epitelio germinativo, lo que les confiere un aspecto piriforme. El ncleo es grande, esfrico u ovalado. ste ocupa una posicin apical en la clula y presenta la cromatina condensada en grnulos pequeos y difusos, de caractersticas basfilas. El nuclolo es esfrico y de posicin central. Los ovocitos premaduros son en su mayora de forma esfrica, ya que se han desprendido del epitelio germinativo, su dimetro vara entre 60 y 90 m. En este estado celular es posible distinguir el inicio de la formacin de grnulos de vitelo, los que se tien de un color rosado suave por ser eosinfilos. Comienza a aparecer una cubierta gelatinosa que rodea al ovocito. El ncleo de estas clulas puede encontrarse en posicin central o excntrica con un nuclolo eosinfilo. Los ovocitos maduros son fcilmente reconocidos en las preparaciones histolgicas, puesto que se caracterizan por la presencia de una cubierta gelatinosa gruesa, de coloracin blanca (sin respuesta a la tincin usada) que se encuentra rodeando la cubierta vitelina. Los ovocitos maduros adems, presentan un gran vitelo fuertemente eosinfilo, con ncleo de forma irregular y de posicin generalmente central en estado de vescula germinativa. El dimetro celular de estos ovocitos vara entre 90 y 120 m alcanzando los 180 m una vez liberado, considerando la cubierta gelatinosa y los 300 m con la envoltura gelatinosa. En las preparaciones histolgicas de gnadas maduras, las clulas predominantes son los ovocitos maduros. Debido a su gran tamao y elevado nmero en el interior del ovario, se comprimen unos a otros adoptando formas irregulares. Por esta razn, los otros tipos celulares (ovogonias, ovocitos previtelognicos y ovocitos premaduros) que siempre estn presentes, se encuentran entre los ovocitos maduros y generalmente es posible observarlos slo cercanos al epitelio de recubrimiento de la gnada. Esta condicin es una

caracterstica clave para reconocer el grado de madurez que presentan las 35

gnadas, presencia de ovogonias en individuos inmaduros, ausencia de ellas en individuos maduros.

Machos: En la gnada masculina se distinguieron los siguientes tipos celulares: espermatogonias, espermatocitos, espermtidas y espermatozoos. Estas clulas se generan desde el interior de numerosas varillas germinativas, las cuales se forman por evaginacin del tejido conectivo denso hacia el interior del testculo. Este tejido es rodeado por el epitelio germinativo. Las varillas se encuentran distribuidas irregularmente en el interior de la gnada. Cada una de stas contiene los cuatro tipos celulares; los primeros estados se ubican en la porcin central de las varillas y los estados subsecuentes se ordenan hacia la parte externa, de tal forma que en el extremo ms distal de las varillas se localizan los espermatozoos con sus colas dirigidas hacia el lmen de la gnada. Las espermatogonias son clulas esfricas u ovales con un dimetro promedio que vara entre 2 y 8 m. Poseen un ncleo esfrico grande y de posicin central que presenta granulaciones basfilas; el nuclolo es grande y muy basfilo. Los espermatocitos son clulas esfricas, pequeas de aproximadamente la mitad del tamao de las espermatogonias. Los espermatocitos presentan ncleos con distintos estados de concentracin de la cromatina, producto de las divisiones reductivas. Las espermtidas son clulas pequeas (1 a 2 m.), de forma esfrica que posteriormente se hacen ovales; el ncleo es alargado u oval. La zona apical de las clulas ovales es fuertemente eosinfila y marca el comienzo del desarrollo del acrosoma. Los espermatozoos se encuentran siempre en grandes concentraciones y se distribuyen ordenadamente formando paquetes de espermios parecidos a una espiga de trigo. La cabeza est compuesta por un acrosoma, que mide 2 m. y en las preparaciones histolgicas se presenta intensamente eosinfilos y un ncleo fuertemente basfilo. Escala de madurez sexual en machos. 36

Madurez inicial: Septos gonadales con lnea germinativa amplia, integrada por espermatogonias basales, enseguida espermatocitos en varias capas en ordenacin radial centrifuga hacia el antro gonadal y eventualmente espermtidas redondas de ncleo pequeo.(Fig. 18 A)

Madurez avanzada: septos gonadales con lneas germinativas amplias, aumentan las espermtidas alongadas representadas por largas espigas radiales, las colas de las espermtidas se orientan hacia el antro.(Fig. 18 B) Madurez total: Los septos gonadales la lnea germinativa es predominante, la altura de las espigas de espermtidas alongadas es mayor que la banda radial. (Fig. 18 C)

Evacuacin inicial: Son caracteristicos los diferentes grados de desorganizacin de las espigas de espermtidas alongadas, y estan siendo liberadas . el espacio es mayor por la evacuacin de espermatozoides , aun cuando se conservan masas de espermatozoides que eventualmente van a ser evacuados de la gnada.

Evacuacin total: se observa una banda de espermatogonias sustentadas en los septos de paredes perivasculares engrosadas. (Fig.18 D)

Escala de madurez sexual en hembras La escala de madurez gonadal utilizada distingue cuatro estados. En este estudio, la diferenciacin de estados se bas principalmente en la predominancia de los elementos celulares durante la gametognesis. Los estados de madurez de las especies de fisurelidos, incluidos en este trabajo fueron los siguientes:

37

Estado I Previtelognesis Abundantes ovogonias en el epitelio germinativo. Predominio de oocitos previtelognicos y en menor proporcin de oocitos en fase temprana de la vitelognesis. El ovario presenta en este estado escasos ovocitos en vitelognesis tarda y maduros. Pared folicular generosa (Fig. 17 A).

Estado II Vitelognesis Predominio de ovocitos vitelognicos tempranos y en vitelognesis y en menor proporcin vitelognicos tardos. Escasos ovocitos previtelognicos y maduros. Pared folicular mas delgada que en estado I ( Fig. 17 B).

Estado III Madurez Escasos ovocitos previtelognicos y en vitelogensis temprana. Se caracteriza por la abundancia de oocitos maduros y en menor cantidad los oocitos vitelognicos tardos. La pared folicular es ntida y delgada ( Fig. 17 C).

Estado IV Evacuacin Este estado se reconoce por el incremento en el nmero de oogonias y el predominio de oocitos previtelognicos y maduros. En menor proporcin oocitos previtelognicos tempranos. Pared folicular ms gruesa que la etapa precedente. (Fig. 17 D)

38

4.2.1.-Histologa de gnada femenina.

Ovocitos vitelognicos ovogonias Ovocitos previtelognicos Cubierta gelatinosa

A C

B D
Septo gonadal

Ovocitos maduros

Envoltura gelatinosa

Figura 17.- Histologa de la gnada femenina de Fissurella cumingi, se observa el estado de previtelognesis (A), con abundantes ovocitos previtelognicos y ovogonias (40X), en el recuadro B se observa el estado de vitelognesis con predominio de ovocitos vitelogenicos (100X), en C se ve el estado de madurez con gran cantidad de ovocitos maduros(100X) y en D la evacuacin con abundantes ovogonias y algunos ovocitos residuales(40X).

39

4.2.2.-Histologa de gnada masculina

Espermatocitos

Espermatogonias

A
Vaso sanguneo del septo

B D

Espermtidas en forma de espigas

Figura 18.- Histologa de la gnada masculina de F. cumingi A) madurez inicial integrada por
espermatogonias y espermatocitos en ordenacin radial centrfuga alrededor del vaso sanguneo del septo (100X). B) Madurez avanzada espermatidas avanzadas ordenadas en espigas(100X). C) Madurez total representada por abundantes y largas espigas de espermatidas avanzadas(100X). D) Evacuacin total representada por espermatogonias(100X).

40

4.3.-Respuesta a los mtodos de induccin Fissurella cumingi 4.3.1.- Perxido de hidrgeno externo Slo individuos machos respondieron al estimulo del perxido disuelto en el agua. Su evacuacin se caracteriz por la escasa cantidad de espermatozoides, no respondi ninguna hembra al estimulo.

4.3.2.-Perxido de hidrgeno (H2O2) interno Al inyectar lapas con H2O2 stas respondieron de forma positiva. Al

introducirlas al agua, emergen burbujas desde el orificio apical de la concha, transcurridos 15 minutos en los individuos con respuesta, existi una primera evacuacin, la cual se caracteriz por la mala calidad de los gametos. Transcurridas 12 horas, contina la evacuacin de gametos, donde la respuesta a las distintas concentraciones se diferenci por l nmero de individuos con evacuacin de gametos como tambin la cantidad y calidad de gametos (tabla III).

TABLA III: Cantidad y calidad de los gametos evacuados por hembras y machos de F. cumingi frente al estimulo H2O2 interno con distintas concentraciones. Perxido de hidrgeno interno 2% 3% 545000 1059520 378600 928000 18930 648000 300000 5 2 3 1,44*10E8 5 2 2

Total de huevos evacuados Total de huevos viables Total de huevos fertilizados Cantidad espermios Individuos inducidos Respuesta machos Respuesta hembras

1% 43000 18700 7500 250000 5 1 3

4% 31000 3870 0 0 5 2 2

41

4.3.2.1: Perxido de hidrgeno (H2O2) interno al 1% Cuatro individuos tuvieron evacuacin de gametos, las hembras desovaron 43.000 huevos, donde slo el 43% fue viable, el macho se caracteriz por desovar espermatozoides de mala calidad ya que su mayora presentaba poca movilidad.

4.3.2.2: Perxido de hidrgeno (H2O2) interno al 2% Existi evacuacin de gametos de individuos, las hembra desovaron 545.000 huevos pero los machos desovaron espermatozoides de mala calidad. Hubo un aborto donde los espermios, que fueron expulsados en forma de grumos, no sobrepasaron la concha de la lapa y al observarlos al microscopio no presentaron movilidad. 4.3.2.3: Perxido de hidrgeno (H2O2) interno al 3% Con sta concentracin, existi respuesta de 4 individuos. El desove de las hembras fue de muy buena calidad y la evacuacin de gametos de uno de los machos tambin, cabe sealar que ac se produjeron tenues evacuaciones de gametos de las hembras, al cabo de 18 horas se produjo un desove sincronizado de hembras, es decir que comenzaron a desovar las hembras al mismo tiempo y gran cantidad de gametos al momento de encender las luces las luces del laboratorio, rgimen que se utiliz en todos los mtodos de induccin.

4.3.2.4.- Perxido de hidrgeno (H2O2) interno al 4% Se observ evacuacin de gametos, caracterizndose por la mala calidad de stos, slo abortos se produjeron en machos y hembras (Fig. 19).

42

Figura 19.- Gametos femeninos abortados por Fissurella cumingi con inyeccin de perxido de hidrgeno.

4.3.3.- Agua de mar irradiada con luz ultravioleta Ningn individuo respondi a este estimulo como muestra tabla IV.
Tabla IV: Respuestas positivas de F.cumingi a los diferentes tratamientos. TRATAMIENTO Lapas estimuladas Perxido hidrgeno interno 1% 2% 3% 4% Perxido hidrgeno externo 6% 8% 10% Luz ultravioleta 0.5 litros/min 1.0 litros/min 1.5 litros/min 5 5 5 0 0 0 0% 0% 0% Lapas c/evacuacin de gametos Porcentaje de respuestas positiva

5 5 5 5

4 (1M, 3H) 5 (2M, 3H) 4 (2M, 2H) 4 (2M, 2H)

80% 100% 80% 40%

5 5 5

1M 2M 1M

20% 40% 20%

43

Fissurella latimarginata: 4.3.4.- Cloruro de potasio (KCl) Present respuestas positivas, hubo respuesta de 8 hembras y 5 machos, las respuestas se presentaron 24 horas despus de ser inyectado el qumico (Tabla V).

4.3.5.- Serotonina (C14H19N502.H2 SO4) No hubo respuesta positiva al estmulo.

4.3.6.- Perxido de hidrgeno 3% (H2O2 3%) La respuesta a ste inductor fue positiva, con evacuacin de gametos tanto de hembras como de machos. De 18 individuos estimulados, 8 tuvieron respuesta positiva: 5 machos y 3 hembras (Tabla V).

4.3.7.- Temperatura No hubo respuestas positivas para este estmulo.

4.3.8.- Agua irradiada con luz ultravioleta (UV) Slo hubo una respuesta de un macho para sta estimulacin, caracterizndose por la escasa cantidad de espermios.

Tabla V: Respuestas positivas en los tratamientos de induccin al desove en lapa negra TRATAMIENTO Lapas estimuladas Perxido hidrgeno 3% inyeccin a la gnada KCl(0.5 M) inyeccin a la gnada KCl(0.5 M) inyeccin al pie Serotonina Luz ultravioleta 0,5 litros/min Temperatura
Porcentaje de respuestas Lapas c/evacuacin de positiva gametos 18 8 (5M, 3H)

46% 18 18 12 12 12 13 (5M, 8H) 68% 0 0 1M 0 0% 0% 7% 0%

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4.4.-Fecundacin Los ovocitos de F. cumingi se caracterizaron por presentar una forma esfrica, poseyendo una envoltura gelatinosa (Fig. 20) con un dimetro promedio de 320.52 9.51 m y un dimetro sin envoltura de 222.4 8.91 m (n= 155), se destaca la presencia de un micropilo entre la membrana plasmtica y la cubierta gelatinosa, el cual est encargado de permitir el paso de los espermios en la fecundacin, cuando existe fecundacin, el micropilo se cierra (Fig. 21). Los espermios son de tipo primitivo donde su regin acrosomal es cnica y cuando son viables se aprecia su gran movilidad.

Figura 20.- Partes de un gameto femenino de Fissurella cumingi, observndose la vescula germinativa, la membrana plasmtica y la cubierta gelatinosa.

Slo con el mtodo de inyeccin de H2O2 y KCL se pudieron mezclar los gametos para observar y analizar el cierre del micropilo y posterior divisin celular de los huevos, con las concentraciones de 1% y 2% existi un porcentaje de huevos que presentaron cierre del micropilo, pero despus no existi divisin celular. Al mezclar los gametos obtenidos con la inyeccin de H2O2 al 3%, se observ una gran cantidad de huevos fecundados con desarrollo larval. Desde el comienzo 45

se diferenci la superioridad de la calidad de stos con respecto a los dems gametos obtenidos.

Figura 21.- Micropilo cerrado

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Figura 22.- huevo no fecundado, se observa micropilo roto.

Figura 23.- Gametos fecundados.

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Nde huevos fecundados posterior a la inyeccin de H2O2 interno

1200000 1000000 800000 n de huevos 600000 400000 200000 0 huevos evacuados huevos viables huevos fecundados 1 43000 18700 7500 2 545000 378600 18930 3 1059520 928000 648000 4 31000 3870 0

Concentraciones (%)

Figura 24.- Grfico que muestra la diferencia existente entre las distintas concentraciones utilizadas en la induccin con H2O2 interno.

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5.- DISCUSIONES Y CONCLUSIONES.

La variacin mensual del IGS es un buen indicador para estudiar los ciclos reproductivos en moluscos, ya que muestra los cambios gonadales a travs del ao (Grant y Tyler, 1983). Sin embargo, como nico indicador debe ser utilizado solamente cuando los ciclos de maduracin son sincrnicos. Cuando el ciclo reproductivo que se estudia es asincrnico, es necesario el uso de observaciones histolgicas para obtener una mejor comprensin del proceso reproductivo. (Morricone, 1999). La determinacin del ndice gonadosomtico es una forma eficaz de determinar el estado de madurez sexual de una poblacin de Fissurella cumingi, en el sector del Totoral (Regin de Coquimbo) los resultados que nos entreg el IGS indican que existen dos desoves parciales en un ciclo reproductivo continuo, teniendo un alza en invierno (agosto) y otro mayor en verano tal como lo haban indicado Andrade en 1995, Olguin en 1996, Bretos 1979 y Brown en 1997 encontrndose individuos sexualmente maduros durante todo el ao. Esto nos dice que en los periodos de mayor desarrollo gonadal poblacional, vale decir, cuando el IGS es ms alto, existe mayor cantidad de individuos sexualmente maduros, poca adecuada para buscar reproductores del medio ambiente natural, mientras se busca la forma de madurar las lapas en ambiente controlado, encontrando el alimento y condiciones ambientales adecuadas para la maduracin. Las fluctuaciones observadas avalan la presencia de un patrn rtmico en el cual se detectan dos desoves poblacionales en el ao. No obstante, se encontraron individuos sexualmente maduros durante todo el ao, coincidente con lo sealado 49

para F. cumingi (Bretos, 1979; Brown, 1997) y F. latimarginata (Brown,1997). Siguiendo un patrn reproductivo similar como en otra especie F. barbadensis (Ward, 1966), que tiene dos ciclos de reproductivos. En trminos reproductivos, la fraccin adulta de estas especies presenta un ciclo continuo y asincrnico, con tendencias a dos temporadas de evacuacin, las cuales no son coincidentes entre las distintas especies a lo largo de su distribucin geogrfica. El comportamiento reproductivo en relacin a la temperatura es similar a la observada en F. mxima (Bretos et al. 1983), F. crassa (Huaquin et al. 1998) y F. nigra (Perez et al .2007). Como se ha observado en F. latimarginata y F.

cumingi, la madurez gonadal se relaciona con cambios graduales en la temperatura del agua de conformidad con la ley de Orton, lo que indica que un cambio gradual en la temperatura del agua induce a la gametognesis, mientras que un cambio rpido provoca el desove (Giese y Pearse 1974). Sobre la base de los resultados obtenidos para Fissurella nigra (Perez, 2007), F. cumingi, F. latimarginata y F.crasa (Huaquin,1998) se puede concluir que los ciclos de cra son comunes a los de arqueogastrpodos y otras especies del gnero Fissurella que habitan en la costa chilena (Perez, 2007). Los antecedentes obtenidos, tanto a nivel microscpico (histologa), como macroscpico (IGS), presentan coincidencias en la determinacin de pocas de desove. Sin embargo, se puede afirmar, que este ltimo representa en forma aproximada el grado de maduracin, debido a que est influenciado por la estructura de talla, de esta manera, asociando ambas fuentes de informacin obtenida del estudio realizado en las localidades analizadas, se puede apreciar que existen dos perodos de mayor intensidad de maduracin y evacuacin de 50

gametos, durante la poca invernal y durante los meses de verano, observndose una mayor actividad durante este ltimo perodo. La presencia en la gnada del parsito Proctoeces lintoni, se observa

predominantemente en la especie Fissurella cumingi durante todo el ciclo anual. Esta situacin podra tener efectos negativos no comprobados sobre el rendimiento reproductivo de la especie tanto en el medio natural as como bajo condiciones de laboratorio. El perxido de hidrgeno disuelto en el agua de mar induce al desove en machos y hembras de Haliotis rufescens y Nordotis gigantea, donde el posible mecanismo es el estmulo directo de la sntesis enzimtico de la prostaglandina endoperoxidasa (Morse et al 1977; Tanaka 1979; Hahn 1989), en Fissurella cumingi Vega et al 1996, tuvieron xito en el desove con H2O2 combinado con macerado de gnada. En este experimento slo dio resultados positivos en machos aunque los espermios obtenidos fueron escasos y con poca motilidad. El perxido de hidrgeno inyectado directo a la gnada en F. cumingi y F. latimarginata dio resultados positivos, al igual que Vega et al en 1996, en una concentracin del 3% logrando buenas fecundaciones y posteriores desarrollos larvales en ambas especies pudiendo controlar el desove de estas especies cuando los IGS poblacionales son altos. Se sabe que el agua irradiada con luz ultravioleta induce al desove en varios moluscos (Kikuchi & Uki 1974; Kagawa & Nagahama 1981;Seki 1980). Pero los datos avalan que no es efectiva por si sola para F. cumingi y F. latimarginata como tampoco ha sido efectivo en pruebas hechas por Moss en 1995 para Haliotis iris.

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La inyeccin de Cloruro de Potasio directo a la gnada es un buen inductor al desove en F. latimarginata y F.crassa (Huaquin 1998), por la contraccin de los musculos lisos, ocasionando abortos en reproductores inmaduros, lo que permite controlar el desove solo en poblaciones maduras. La induccin al desove con agua irradiada con luz ultravioleta, mostr que en F.cumingi no es eficaz como si lo es en otros moluscos y especialmente los del gnero Haliotis perteneciente a la misma sper familia que las Fissurellas, debido que los requerimientos fisiolgicos necesitan oxidantes especficos que no son entregados por la fotlisis del UV. Con los resultados obtenidos con agua irradiada con luz ultravioleta y perxido de hidrgeno adicionado al agua de mar, se concluye que las necesidades fisiolgicas de las lapas en la ciclooxigenacin del cido araquidnico para la conversin a endoperxido prostaglandina y posterior biosntesis de

prostaglandinas, no son las mismas que en otros gastrpodos del gnero Haliotis, por lo cual se debe experimentar con otro tipo de oxidantes para buscar mejores resultados (Hahn 1989). Los resultados positivos obtenidos con inyeccin de perxido de hidrgeno pueden suponer la activacin de la enzima endoperxido prostaglandina en las gnadas de ambas especies estudiadas, lo que produjo la evacuacin de gametos. Teniendo en cuenta que existi diferencia entre las concentraciones utilizadas, donde la concentracin mayor produjo muchos abortos, por lo cual se debe buscar la concentracin ptima.

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La rpida descomposicin del perxido de hidrgeno, al ser inyectado en individuos de Fissurella cumingi y F. latimarginata, no causa la muerte en ellos ya que acta una catalasa que descompone el H2O2 en H2O, con lo cual los reproductores pueden ser acondicionados para futuros desoves. Al comparar numricamente la cantidad de huevos fecundados con las distintas maneras de suministrar perxido, se concluye que la concentracin al 3% fue altamente superior en cantidad y calidad debido que fue la nica concentracin de H2O2 con la que se logr desarrollo embrionario. Aunque con la concentracin al 2% hubo respuesta positiva del 100% de los individuos, la calidad de estos gametos fue baja lo que puede ser por el azar de la eleccin de los reproductores. Para tener mayor seguridad del estado de la gnada y poder diferenciarla sexualmente, se puede realizar una puncin gonadal (Huaquin, 1998) antes de la induccin y observarla al microscopio y as tener mayor xito en la fecundacin. A los mtodos de inyeccin de H2O2 u otro oxidante se pueden adicionar factores adicionales que influyen en la evacuacin de gametos en lapa, como inducirlos en oscuridad y despus (tiempo determinado) aplicarles gran cantidad de luz, ya que se comprob con experiencias paralelas que las lapas frutillas son fotosensibles y este estrs ayuda para el desove sincronizado de la especie en condiciones controladas. Al momento de la fecundacin se debe tener en cuenta la edad en horas de los espermatozoides y ovocitos, porque si estos son muy viejos la calidad de ellos decrece y la posibilidad de fecundacin tambin. De ah la importancia de lograr 53

un desove sincronizado de machos con hembras. Si los espermatozoides son evacuados antes que los ovocitos, se recomienda bajar la temperatura para as lograr mayor cantidad de huevos fecundados. Al comparar la eficiencia de los distintos tipos de inductores se concluye que los mejores inductores son los qumicos KCl 0.5M y H2O2 (3%) inyectados directo a la gnada y que su respuesta es 1 24 horas despus de inyectado el inductor. La comunicacin del ovocito con el exterior es a travs del micropilo, lugar por donde penetra el espermatozoide para fecundarlo, la gelatina tiene poros y la cubierta externa presenta marcas especiales observadas en microscopia de barrido como pequeas huellas finas de la superficie. Estas marcas, poros u otras ornamentaciones y detalles de la cubierta de los ovocitos son especificas, es decir cada especie tiene sus propios tipos de marcas definidas (Huaquin, 1997). Es fundamental poder lograr la sincronizacin en el desove, para lo cual se deben sumar a los inductores qumicos, indicios ambientales que ocurren en el desove y la posterior fecundacin externa de las fissurellas en su ambiente natural.

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