Clonagem de expresso

Tpicos
Significado da clonagem de expresso Expresso heterloga em E. coli Tipos de vectores de expresso Expresso heterloga em Saccharomyces cerevisiae Vectores de clonagem em leveduras Expresso heterloga em clulas de mamfero Vectores de clonagem em clulas de mamfero

Significado da clonagem de expresso

Muitas das manipulaes em clonagem molecular (clonagem geral) no requerem a expresso do DNA clonado.

A clonagem de expresso permite obter o produto do gene clonado.

O produto utilizado para diferentes fins: O transcrito da sequncia clonada (transcrio in vitro) pode servir como sonda de hibridao. A protena expressa pode servir para identificar o gene clonado, numa biblioteca de expresso, por hibridao com o anticorpo especfico. O DNA recombinante pode servir para produzir protenas de valor comercial.

Expresso heterloga em E. coli (1)

Objectivo Produo de grande quantidade de protena recombinante Factores de seleco do sistema de expresso Principais factores da expresso de genes clonados Expresso em E. coli - Vantagens e desvantagens - Razes da expresso no eficiente - Configurao de vectores eficientes - Regulao transcricional Promotor Terminador - Regulao traducional Iniciao da traduo Estimuladores traducionais Terminao da traduo

Expresso heterloga em E. coli (2)

- Promotores - Frequncia de utilizao de codes - Protelise - Expresso citoplasmtica - Expresso periplasmtica - Secreo extracelular - Fuses transcricionais - Fuses traducionais Adio de tags Adio de sinais de secreo (Protein targeting)

Factores de seleco do sistema de expresso

Caractersticas do crescimento celular Nveis de expresso (intracelular e/ou extracelular) Modificaes ps-traducionais Actividade biolgica da protena relevante Dificuldades, custos

Principais factores da expresso de genes clonados

Vantagens e desvantagens da expresso em E. coli

Vantagens
Vasto conhecimento da gentica e fisiologia de E. coli

Desvantagens
No realiza modificaes pstraducionais e tem capacidade limitada de formar pontes dissulfdricas

Diversidade de vectores de clonagem

Fcil controlo da expresso gnica

Actividade biolgica e imunogenicidade podem diferir da protena natural Elevado endotoxinas contedo de

Fcil crescimento produes

com

elevadas

Secreo do produto no meio de cultura

Falta de um mecanismo de secreo

Razes da expresso no eficiente em E. coli

Caractersticas estruturais da sequncia de nucletidos do gene Instabilidade do mRNA Reduzida eficincia traducional Dificuldade de enrolamento da protena Diferenas de utilizao de codes Toxicidade da protena para o hospedeiro

Configurao de vectores de expresso eficientes

MCS

Elevado n de cpias, elevado n de moldes de transcrio

Caractersticas do promotor (P)

- Sequncias -10, -35 - Elemento UP (sequncia a montante da box -35, estimulador da transcrio) - Forte (eficientemente reconhecido pela polimerase de RNA) - Regulao forte (baixo nvel de expresso basal devido ao gene regulador, R, presente no vector ou integrado no cromossoma de E. coli) - Induo fcil (trmica ou qumica) - Posicionamento (10-100 pb da sequncia de ShineDalgarno - SD)

Funes do terminador da transcrio TT

- A jusante da sequncia clonada impede a transcrio atravs de outro promotor, o que pode inibir a sua funo, fenmeno conhecido por ocluso do promotor - Aumenta a estabilidade do mRNA UAA - codo stop mais frequente UAAU - codo stop mais eficiente

Promotores utilizados em E. coli

Promotor (origem)
Plac (E. coli)

Regulao
lacI, lacIq

Induo
IPTG IPTG

Ptac, P hbrido (E. coli, box -35 do P do opero do lacI, lacIq triptofano, box -10 do P do opero da lactose) PL ( ) PT7 (T7) cIts857 cIts857 lacI, lacIq

Trmica Trmica IPTG

Representao esquemtica da represso do promotor PL de

O repressor codificado pelo gene cI857 sensvel temperatura.

Utilizao do gene cI857 no sistema de expresso PT7

Sistema de expresso: Plasmdio com PL a montante do gene 1 Vector com PT7 a montante do gene em estudo Genoma do hospedeiro com cI857

O gene 1 codifica a polimerase de RNA T7 especfica do promotor PT7 A polimerase de RNA de E. coli reconhece PL A polimerase de RNA de E. coli selectivamente inibida pela rifampicina 1 Induo Sntese da polimerase de RNA T7 por elevao da temperatura de incubao de E. coli 2 Adio de rifampicina Inibio da polimerase de RNA de E. coli Nestas condies s ocorre sntese da protena do gene em estudo.

Sistema de expresso PT7 sob controlo do Plac

Regulao lacI, lacIq Induo por IPTG

Efeito da diferente utilizao de codes na expresso gnica

com baixa frequncia de utilizao em E. coli

Haver baixa expresso proteica se o DNA clonado tiver codes pouco utilizados em E. coli. Solues: Mutagnese stio-especfica (alterao de nucletidos sem alterao de aminocidos) Coexpresso do gene argU que codifica o tRNA Arg (AGG/AGA)

Tipos de vectores de expresso

Os vectores de expresso so de dois tipos:

Vectores de fuso transcricional fornecem apenas o promotor Vectores de fuso traducional fornecem o promotor e os sinais de traduo (RBS e codo de iniciao da traduo)

Fuses transcricionais e traducionais (1)

Em ambos os vectores o inserto deve estar clonado na orientao correcta.

Fuses transcricionais e traducionais (2)

Na fuso transcricional, o promotor e o gene constituem uma unidade transcricional, isto , a transcrio iniciada a partir do promotor continua atravs do gene clonado. O vector fornece o promotor. O inserto contm os sinais de traduo RBS e codo de iniciao da traduo. produzida protena nativa. Na fuso traducional tambm se forma uma unidade transcricional. O vector fornece o promotor e os sinais de traduo. produzida protena de fuso ou protena hbrida, em que parte do produto da traduo (protena ou polipptido) derivado do inserto e parte do vector.

Requisitos da fuso traducional

preciso conhecer a sequncia de nucletidos do inserto e avaliar o resultado da clonagem num determinado local. O inserto deve estar na mesma grelha de leitura do ATG do vector. Pode ser necessrio mudar de vector, ou modificar o vector ou o inserto (utilizando linkers ou adaptadores). Alternativamente, o inserto pode ser produzido por PCR, com primers que contm um local de restrio que produz a grelha correcta. fundamental testar por sequenciao o produto recombinante para confirmar a correcta insero do fragmento de DNA. A perda de uma base durante a ligao resulta numa grelha de leitura incorrecta. As protenas toleram uma variao considervel de aminocidos na extremidade N, mas para fins teraputicos em humanos devem ser utilizados produtos iguais aos naturais.

Exemplo de fuso traducional em fase

1.

2.

Em 1., fuso traducional em fase; em 2., fuso traducional incorrecta.

Clonagem num vector de expresso plasmdico

A sequncia de DNA que codifica a protena relevante clonada num vector de expresso.

lac

O vector de expresso tem um promotor forte, adjacente ao gene que codifica a protena, que origina grandes quantidades de mRNA.

O DNA recombinante introduzido em bactrias, leveduras, clulas de insecto, ou clulas de mamfero, onde o gene clonado transcrito e traduzido eficientemente.

A clonagem de expresso permite a produo de grandes quantidades da protena relevante.

Vectores de expresso em duas etapas

Expresso de genes letais PT7 promotor com um controlo muito apertado

Vector pET-3
NdeI BamHI

O promotor do fago T7 permite elevado nvel de expresso; a sequncia lder do gene 10 (estimulador da traduo) do fago T7 assegura elevado nvel de traduo; NdeI e BamHI so locais de clonagem. A clonagem em BamHI origina uma protena de fuso contendo 13 aminocidos N-terminal do gene 10 do fago T7.

Clonagem num vector de expresso (1)

Vector gt11

A identificao do DNA clonado feita por hibridao com um anticorpo especfico da protena expressa.

Figure 7-21. [Adapted from J. D. Watson et al., 1992, Recombinant DNA,2d ed., Scientific American Books.]

Deteco de protenas com anticorpos

Funes do tag
O tag uma curta sequncia de nucletidos que codifica um pptido com poucos aminocidos.
Pode ser adicionado extremidade N ou C do produto do gene clonado. Permite a deteco e purificao de protenas. Pptidos de fuso especficos conferem vantagens protena alvo durante a expresso: aumentam a solubilidade, protegem da protelise, melhoram a conformao, aumentam a produo. So vrios os tags utilizados nos vectores de clonagem: His6 Glutationa-S-transferase (GST) Protena de ligao a maltose (MBP) Protena verde fluorescente (GFP) Eptopos

Tag adicionado ao inserto

Por engenharia gentica, um tag (eptopo) pode ser adicionado ao inserto.

Figure 8-48. 2000 by W. H. Freeman and Company

Vectores com tag

Deteco de protenas com tag

Purificao de protenas com tag

As protenas com tag so purificadas em colunas de cromatografia de afinidade.

Vectores de fuso gnica pGEX-4T

A partir de EcoRI os locais mltiplos de clonagem de pEGX-4T-1, -2 e 3 configuram as trs grelhas de leitura possveis dos codes.

A protena de fuso constituda pela componente N-terminal de GST (tag) e pela componente C-terminal da protena pretendida. Pode ser purificada numa coluna de purificao de afinidade de glutationa (ex. sefarose 4B glutationa) e clivada com trombina.

Purificao de complexos proteicos associados a protenas de fuso com GST (1)

Figure 8-50. 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.

Vectores de fuso gnica pRSET

tag

EK local de clivagem pela enterocinase para remoo do tag

Funes do pptido sinal

A secreo de protenas por bactrias depende normalmente da presena de um pptido sinal na extremidade N. As protenas so reconhecidas pela maquinaria de secreo e transportadas atravs da membrana citoplasmtica. A sequncia de nucletidos que codifica o pptido sinal existe no vector ou incorporada no inserto. A secreo nem sempre acontece, dependendo da estrutura da protena.

Gene reprter

Gene reprter um gene que produz uma protena que pode ser detectada e quantificada utilizando um teste simples.

Exemplos de genes reprter: GFP (Green fluorescent protein) lacZ (-galactosidase) luc (luciferase)

Utilizao de genes reprter na localizao de protenas recombinantes

A) Protena com tag GFP B) Ratinho transgnico com GFP em fuso com uma protena epitelial

A) O gene recombinante codifica uma protena de fuso que contm GFP C-terminal. B) O ratinho contm um transgene marcado com GFP expresso no corpo; o ratinho fluoresce quando iluminado com luz UV.
Figure 19. 18 Genetics: From genes to Genomes, 2/e. ( McGraw-Hill Companies, 2004)

Vectores promoter-probe

Os vectores promoter-probe permitem detectar a existncia de promotor no fragmento clonado, atravs da expresso do gene reprter (gene lacZ)

Avaliao do nvel de expresso de promotores

Teste de deteco da -galactosidase em que se utiliza o substrato ONPG

A anlise dos dados revela: A eficincia de traduo do gene lacZ maior do que a do gene em estudo (por comparao entre fuses transcricionais e traducionais). No h ocluso de promotor (por comparao entre resultados de diferentes fragmentos). A activao da transcrio do gene em estudo maior quando os dois promotores esto presentes.

Expresso heterloga em Saccharomyces cerevisiae

Vantagens Organismo unicelular (altemativa eucaritica de E. coli) Gentica e fisiologia conhecidas Crescimento rpido Vrios promotores fortes (CYC1, ADH1, GAL1O) Plasmdio natural denominado 2-m Modificaes ps-traducionais No patognico Elevada produo proteica Produo industrial

Vectores de clonagem em leveduras

Nestes vectores, a funo dos insertos estudada por transfeco da estirpe de levedura de gentipo adequado. So necessrias marcas de seleco para a deteco de clones recombinantes. As origens de replicao so os locais necessrios para as enzimas de replicao bacterianas e de levedura iniciarem o processo de replicao. O DNA derivado do plasmdio natural de levedura, 2-m, tem a sua prpria origem de replicao.

ARS Sequncia de replicao autnoma

Representaes simplificadas de quatro tipos diferentes de vectores de clonagem em leveduras.

Figure 13-11. 2000 by W. H. Freeman and Company.

Especificidades da clonagem em leveduras

Mtodos de transfeco em leveduras Protoplastos Acetato de ltio Electroporao Leveduras utilizadas como hospedeiros Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces lactis Schizosaccharomyces pombe Yarrowia lipolytica Hansenula polymorpha Pichia pastoris (Os vectores de expresso com o promotor AOX1- gene que codifica a
enzima lcool oxidase - geram nveis elevados do produto pretendido (gramas/litro), com menores custos do que os sistemas de insectos e de mamferos. Ao contrrio dos sistemas bacterianos, os vectores de P. pastoris no so mantidos epissomicamente, mas so construdos para serem integrados num cromossoma da levedura. So vectores shuttle com origens de replicao em levedura e em E. coli.)

As leveduras utilizadas como hospedeiros so geralmente mutantes auxotrficos. Exemplos: TRP1, LEU2, URA3 A seleco das clulas transfectadas feita por complementao de deficincias metablicas.

Clonagem num plasmdio epissmico de levedura

H menor nmero de antibiticos disponveis para os quais as leveduras so sensveis (embora alguns fungicidas possam ser utilizados) e, por isso, a seleco baseiase, frequentemente, na complementao de mutaes auxotrficas da estirpe hospedeira. Os vectores que replicam como plasmdios em S. cerevisiae so muitas vezes bastante instveis, na medida em que tendem a ser perdidos na cultura devido acumulao de clulas sem plasmdio. Isto devido a uma partio errada durante a mitose. Os vectores com ARS so muito instveis, mas quando incluem o centrmero so mais estveis. Os vectores so, em geral, vectores de expresso porque expressar o gene clonado uma das finalidades da utilizao de leveduras como hospedeiro.

Clonagem num vector YAC

Caractersticas do vector YAC e do hospedeiro

As sequncias do vector so:
CEN4 - sequncia centromrica TEL - sequncias telomricas ARS1 - sequncia de replicao autnoma em levedura Amp - gene que confere resistncia ampicilina para seleco em E. coli ori - origem de replicao para propagao em E. coli SUP4 - gene que codifica o tRNA supressor da mutao ade-2 do hospedeiro e restaura a actividade selvagem, originando colnias brancas TRP1 e URA3 - genes envolvidos no metabolismo do triptofano e uracilo, respectivamente Caractersticas do hospedeiro (estirpe AB1380 de levedura): ade-2 - mutao ocre no gene envolvido no metabolismo da adenina que resulta na acumulao de pigmento vermelho (colnias vermelhas). A clonagem de um fragmento de DNA exgeno no gene SUP4, inactiva a funo supressora do gene, originando o fentipo mutante. trp1 e ura3 - alelos complementados pelos alelos correspondentes do vector, constituindo um sistema de seleco para identificar as clulas que contm o vector YAC.

Expresso heterloga em clulas de mamfero

Realizao de modificaes ps-traducionais idnticas s naturais. Expresso transitria expresso obtida sem integrao do vector Expresso estvel expresso resultante da integrao do vector de expresso num dos cromossomas do hospedeiro Promotores utilizados na construo de vectores de clulas de mamfero: PSV40 (Simian Virus) PRSV-LTR (Rous Sarcoma Virus) PMSV-LTR (Murine Sarcoma Virus) PBPV-1 (Bovine Pappilomavirus Type 1) PCMV (Citomegalovirus)

Vector de expresso em clulas de mamfero, pcDNA3.1/myc-HIS

Caractersticas do vector pcDNA3.1/myc-HIS

Vector shuttle que permite elevado nvel de expresso constitutiva em clulas de mamfero PCMV promotor forte de citomegalovrus que assegura elevado nvel de expresso BGH pA elemento da sequncia de poliadenilao da hormona de crescimento bovino que permite a produo de uma extremidade 3 definida no mRNA obtido a partir do inserto. neo gene marcador, regulado por um promotor/estimulador e sequncia poli A SV40, que permite a seleco por crescimento em G418 (geneticina) Polylinker contm locais mltiplos de clonagem 6xHis sequncia que especifica seis resduos de histidina consecutivos que facilita a purificao da protena recombinante Eptopo myc tag que permite a triagem com anticorpos da protena recombinante utilizando um anticorpo especfico para esta sequncia Term sinais de terminao da traduo SV40 ori origem de replicao em clulas de mamfero Componentes de propagao em E. coli pUC ori origem de replicao derivada do plasmdio ColE1 Amp gene que confere resistncia ampicilina f1 ori origem de replicao do fago filamentoso f1 que permite produzir recombinantes de cadeia simples

Caractersticas das clulas COS

As clulas COS permitem que qualquer DNA circular com uma origem de replicao SV40 replique independentemente do DNA celular. uma linha estvel de clulas de rim de macaco verde Aficano derivada da linha celular de macaco, CV1, permissiva de SV40. Quando as clulas CV1 so infectadas com SV40, ocorre o ciclo ltico normal do vrus. As clulas CV1 foram transformadas por integrao nos cromossomas de um fragmento de DNA genmico de SV40 contendo uma origem de replicao mutante. As clulas COS resultantes (CV1 com origem defectiva de SV40) expressam constitutivamente (estavelmente) o antignio T codificado por SV40, a nica protena viral que necessria para activar a origem de replicao de SV40.

Vector pBK-CMV

Caractersticas do vector pBK-CMV