Rcepteurs coupls aux protines G qui activent ou inhibent ladnylate cyclase Nous nous tournons maintenant vers un trs

vaste groupe de rcepteurs de surface cellulaire coupls aux protines G trimriques transductrices du signal. Les rcepteurs coupls aux protines G (RCPG) contiennent sept segments qui traversent la membrane, leur extrmit N-terminale se trouvant lextrieur et leur extrmit C-terminale lintrieur de la cellule . La famille RCPG comprend des rcepteurs pour beaucoup dhormones et de neurotransmetteurs, des rcepteurs oculaires activs par la lumire (rhodopsines) et des milliers de rcepteurs olfactifs prsents dans le nez des mammifres. Les protines G transductrices du signal contiennent trois sous-units, , et . Durant la signalisation intracellulaire, les sous-units et restent unies, aussi parle-t-on habituellement de sous-unit G . La sous-unit G est une GTPase ou protine commutatrice qui est alternativement active quand elle contient du GTP et inactive lorsquil sagit de GDP (voir Figure 2). Une stimulation du rcepteur partenaire active la protine G, qui son tour module lactivit dune protine e ectrice associe. Bien que celle-ci soit active le plus souvent par la G.GTP, dans certains cas, elle est inhibe. De plus, selon la cellule et le ligand, cest la sous-unit G , plutt que la G.GTP, qui transmet le signal la protine effectrice. Ajoutons que lactivit de plusieurs protines effectrices diffrentes est contrle par diffrents complexes RCPGligand. Cependant, toutes les protines effectrices sont soit des canaux ioniques membranaires ou des enzymes qui catalysent la formation de messagers secondaires (e.g. AMPc, DAG et IP3). Ces considrations sur le

thme de la signalisation par RCPG se justifient par lexistence de multiples protines G codes dans les gnomes des eucaryotes. Le gnome humain, par exemple, code 27 sous-units G diffrentes, 5 G et 13 G . Pour autant quon le sache, les diffrentes sous-units G fonctionnent de manire semblable. Le Tableau 1 rsume les fonctions des classes principales de protines G composes de sous-units G diffrentes. Dans cette section, nous dcrivons dabord comment les signaux passent des RCPG une protine effectrice, processus qui est le mme pour tous les rcepteurs du mme type. Ensuite, nous nous limiterons aux voies dans lesquelles lAMPc est impliqu comme messager secondaire, en utilisant comme exemple la dgradation du glycogne induite par ladrnaline. La sous-unit G des protines G oscille entre activit et inactivit La Fig. 3 montre comment des rcepteurs coupls aux protines G transfrent des signaux provenant dhormones extracellulaires des protines effectrices associes. Tant les sous-units G que les G sont lies de manire covalente aux lipides de la membrane (Fig. 4). En phase de repos, quand le rcepteur est inoccup, la sous-unit G est lie au GDP et couple G . La fixation dun ligand hormonal normal (e.g. ladrnaline) ou dun agoniste (e.g. lisoprotrnol) au rcepteur change la conformation de celuici, permettant ainsi sa liaison la sous-unit G de telle manire que le GDP est dplac de G et remplac

par le GTP. Ainsi le rcepteur activ par son interaction avec le ligand fonctionne comme un GEF pour la sous-unit G .2 Une fois que lchange de nuclotides a eu lieu, le complexe G.GTP se dtache de la sous-unit G , mais les deux restent ancres la membrane. Dans la plupart des cas, G.GTP interagit alors et active une protine effectrice associe, comme le montre la Figure 13-11. Cette activation est de courte dure car le GTP li G est hydrolys en GDP en quelques secondes par lactivit de GTPase exerce par la sousunit G . Ce complexe G.GDP se rassocie rapidement avec G , mettant fin ainsi lactivation de leffecteur. Dans beaucoup de cas, une protine appele RGS (regulator of G protein signaling) acclre lhydrolyse du GTP par la sous-unit G , ce qui rduit la dure pendant laquelle leffecteur reste activ. Les tudes effectues avec des substances qui, linstar du GTP, se lient aux sous-units G , mais ne peuvent tre hydrolyses par la GTPase intrinsque fournirent les premires indications en faveur du modle montr dans la Figure 13-11. Dans ces analogues du GTP, la liaison phosphodiester P-O-P connectant les phosphates et du GTP est remplace par une liaison non hydrolysable, P-CH2-P ou PNH-P. Leur ajout une prparation de membrane plasmique en prsence du ligand naturel ou dun agoniste dun rcepteur particulier entrane une activation beaucoup plus longue de la protine effectrice associe que celle qui est obtenue par lapport de GTP. En effet, une fois le GDP li G dplac par lanalogue du GTP non hydrolysable, celui-ci reste attach G . Comme ce complexe est aussi fonctionnel que le complexe normal G.GTP dans lactivation de la protine effectrice, leffecteur reste actif de manire permanente. La dissociation des protines G trimriques induite par les RCPG a t dtecte dans des cellules vivantes. Pour ces expriences, on a tir parti du phnomne de transfert dnergie de fluorescence, qui peut

changer la longueur donde de la fluorescence mise quand deux protines fluorescentes interagissent. La Figure 1312 montre comment, par cette stratgie, on a pu constater la dissociation du complexe G.G dans les quelques secondes qui suivent laddition du ligand, ce qui consolidait le modle cyclique de fonctionnement de la protine G. Ce protocole exprimental peut tre utilis pour suivre la formation et la dissociation dautres complexes protine-protine dans des cellules vivantes. Ladrnaline se lie diffrents rcepteurs coupls des protines G Ladrnaline est particulirement importante pour susciter la rponse de lorganisme un stress, comme la peur ou un exercice lourd, tous les tissus ayant ce moment besoin dune augmentation du catabolisme du glucose et dacides gras menant la production dATP. Ces principaux carburants mtaboliques deviennent disponibles dans le sang en quelques secondes la suite du clivage rapide du glycogne en glucose dans le foie (glycognolyse) et des triacylglycrols en acides gras dans les adipocytes (lipolyse). Chez les mammifres, la libration du glucose et des acides gras peut tre dclenche par la liaison de ladrnaline (ou de la noradrnaline) aux rcepteurs -adrnergiques la surface des hpatocytes et des adipocytes. Ladrnaline lie aux rcepteurs -adrnergiques du myocarde acclre le rythme des contractions, ce qui augmente lapport sanguin aux tissus. Par contre, la stimulation des rcepteurs adrnergiques des cellules musculaires lisses de lintestin cause leur relchement. Les rcepteurs dits 2adrnergiques, qui eux aussi lient ladrnaline, sont prsents sur les cellules musculaires lisses de la paroi des vaisseaux sanguins dans le tractus intestinal, la peau et les reins. La fixation de ladrnaline ces rcepteurs dclenche une contraction artrielle, rduisant la circulation dans ces organes. Ces divers effets de

ladrnaline convergent vers un but commun : fournir de lnergie afin de permettre un mouvement rapide des principaux muscles locomoteurs en rponse au stress de lorganisme. Bien que tous les rcepteurs dadrnaline soient des rcepteurs coupls aux protines G, les diffrents types sont coupls des protines G distinctes. Donc, en plus de leur importance physiologique, ces rcepteurs sont intressants parce quils ouvrent diverses voies de transduction intracellulaire du signal. Les deux sous-types de rcepteurs -adrnergiques, dits 1 et 2, sont coupls une protine G stimulatrice (Gs) qui active ladnylate cyclase, une enzyme attache la membrane (voir Tableau 1). Une fois active, ladnylate cyclase catalyse la synthse dun messager secondaire, lAMPc. Laugmentation de lAMPc qui fait suite la liaison de ladrnaline des rcepteurs -adrnergiques a t dmontre par des tests fonctionnels dexpression comme celui que la Figure 6. Quand lADNc clon codant le rcepteur adrnergique est transfect dans des cellules dpourvues de ce rcepteur, ces cellules accumulent lAMPc3 en rponse une stimulation par ladrnaline. Des expriences semblables dans lesquelles des rcepteurs mutants sont exprims ont aid dfinir les fonctions dacides amins spcifiques dans la liaison des hormones et lactivation des diffrentes protines G. Les deux sous-types de rcepteurs -adrnergiques, 1 et 2, sont coupls des protines G diffrentes. Le rcepteur 1-adrnergique est coupl la protine G1 qui inhibe ladnylate cyclase, lenzyme effectrice associe aux rcepteurs -adrnergiques. Par contre, la protine Gq couple au rcepteur 2adrnergique active une enzyme effectrice diffrente qui gnre des messagers secondaires diffrents (Tableau 1). Mdecine Certaines toxines bactriennes contiennent une sous-unit qui pntre dans la membrane plasmique des cellules et catalyse une modification chimique de Gs.GTP qui empche lhydrolyse du

GTP li en GDP. En consquence, Gs reste activ et stimule en permanence ladnylate cyclase en absence de stimulus hormonal. La toxine cholrique produite par la bactrie Vibrio cholerae et des entrotoxines produites par certaines souches de E. coli agissent de cette manire sur les cellules pithliales de lintestin. Laugmentation excessive de lAMPc qui en rsulte conduit une perte dlectrolytes et deau dans la lumire intestinale et, en consquence, une diarrhe aqueuse caractristique de ce type dinfection. Bordetella pertussis, une bactrie qui infecte frquemment les voies respiratoires est responsable de la coqueluche. La toxine quelle produit catalyse une modification de Gi qui prvient la libration du GDP li, bloquant ainsi Gi dans un tat inactif. Ceci entrane une augmentation de lAMPc dans les cellules pithliales des voies ariennes et induit de la sorte une perte de liquide et dlectrolytes ainsi quune hyperscrtion de mucus. Dans les rcepteurs et les protines G associes, on a identifi des domaines qui exercent une fonction critique Tous les rcepteurs coupls aux protines G, comme nous lavons vu, comprennent sept hlices transmembranaires et partagent probablement une mme conformation tridimensionnelle. Des tudes de rcepteurs adrnergiques chimriques, suggrent que la longue boucle C3 entre les hlices 5 et 6 est importante pour les interactions entre un rcepteur et la protine G associe. Il est probable que la fixation au ligand oblige ces hlices se mouvoir lune par rapport lautre. En consquence, la boucle C3 reliant ces deux hlices change de conformation et devient ainsi capable dactiver la sous-unit transductrice G. Des rgions spcifiques dans la boucle C3 sont supposes avoir une structure tridimensionnelle unique dans tous les rcepteurs qui lient la mme protine G (e.g. Gs ou Gi). Dautres observations indiquent que

la boucle C2, entre les hlices 3 et 4, contribue aussi linteraction de certains rcepteurs avec une protine G et que les rsidus, au moins dans quatre hlices transmembranaires interagissent avec le ligand. Par cristallographie aux rayons X, on a repr les rgions dans Gs.GTP qui interagissent avec ladnylate cyclase. Cette enzyme comporte plusieurs segments transmembranaires avec deux grands domaines cytosoliques catalytiques (Figure 3-14a). Puisque de telles protines transmembranaires sont, comme on le sait, difficiles cristalliser, les chercheurs ont prpar deux fragments protiques comprenant les domaines catalytiques de ladnylate cyclase et leur ont permis de sassocier en prsence de Gs.GTP et de forskoline, qui stabilise les fragments catalytiques de ladnylate cyclase dans leur conformation active. Le complexe ainsi form tait catalytiquement actif et montrait des proprits pharmacologiques et biochimiques semblables celles de ladnylate cyclase intacte. Dans ce complexe, deux rgions de la Gs.GTP, lhlice commutatrice II et la boucle 3-5, sont en contact avec les fragments de ladnylate cyclase (Figure 7). Rappelons que le commutateur II est un des segments dune protine G dont la conformation change selon la nature du nuclotide li, le GTP ou le GDP (voir Figure 13-8). La conformation induite par le GTP de Gs qui favorise sa dissociation de G est prcisment la conformation essentielle pour la liaison de Gs ladnylate cyclase. Dautres tudes indiquent que Gi sattache une autre rgion de ladnylate cyclase, ce qui expliquerait leffet diffrent quelle exerce sur leffecteur.4 Pour comprendre comment la fixation de Gs.GTP stimule ladnylate cyclase (Fig 7), les chercheurs auront dabord dfinir la structure des domaines catalytiques de ladnylate cyclase dans leur conformation inactive (en labsence de Gs.GTP li). On a propos que linsertion de lhlice

commutatrice II dans une cavit du domaine catalytique de ladnylate cyclase entranerait la rotation dun autre domaine catalytique, ce qui stabiliserait ltat de transition et ds lors induirait lactivit catalytique. Ladnylate cyclase est stimule et inhibe par diffrents complexes rcepteur-ligand Les protines G trimriques, fonctions multiples, permettent diffrents complexes rcepteurhormone de moduler lactivit dune mme protine effectrice. Dans le foie par exemple, le glucagon et ladrnaline se lient des rcepteurs distincts, qui interagissent nanmoins avec la mme protine Gs et lactivent, ce qui stimule ladnylate cyclase et aboutit aux mmes rponses mtaboliques. Lactivation de ladnylate cyclase, et donc le taux dAMPc, est proportionnelle la concentration totale de Gs.GTP rsultant de la liaison des deux hormones leurs rcepteurs respectifs. Une rgulation positive et ngative de lactivit de ladnylate cyclase dans certains types cellulaires permet un contrle fin du taux dAMPc. Par exemple, une stimulation des adipocytes par ladrnaline, le glucagon ou lACTH active ladnylate cyclase, tandis que la prostaglandine PGE1 ou ladnosine inhibe lenzyme (Tableau 1, Fig 9). Les rcepteurs de PGE1 et de ladnosine interagissent avec la protine inhibitrice Gi , qui contient les mmes sous-units et que la protine stimulatrice Gs, mais une sous-unit diffrente (Gi). En rponse la fixation dun ligand inhibiteur son rcepteur, la protine Gi associe lche le GDP quelle contient et le remplace par du GTP ; le complexe actif Gi.GTP se dissocie alors de G , et, au lieu

de stimuler ladnylate cyclase, linhibe. La protine kinase A active par lAMPc suscite des rponses varies dans des cellules diffrentes Chez les animaux multicellulaires, pratiquement tous les effets de lAMPc dpendent de la protine kinase A (PKA), appele aussi protine kinase dpendante de lAMPc. Comme nous lavons vu dans le Chapitre 3, PKA est un ttramre compos de deux sous-units rgulatrices (R) et de deux sous-units catalytiques (C). Chaque sous-unit R possde deux sites distincts de fixation de lAMPc ; la liaison dAMPc deux sites dans une sous-unit R libre la sous-unit C associe, dmasquant son site catalytique et dclenchant ainsi son activit de kinase (voir Figure 3-27a). La capture de lAMPc par une sousunit rgulatrice seffectue de manire cooprative, cest--dire, la fixation de la premire molcule dAMPc diminue le Kd de liaison de la seconde. Ainsi, de petits changements dans le taux dAMPc cytosolique peuvent causer des changements relativement importants dans la quantit de sous-units C dissocies et, donc, dans lactivit kinasique. On retrouve frquemment ce mode dactivation rapide dune enzyme par dissociation dun inhibiteur dans diverses voies de signalisation. La plupart des cellules de mammifres expriment des rcepteurs coupls la protine Gs. Leur stimulation par diverses hormones active PKA, mais la rponse cellulaire qui sensuit dpend de lisoforme de cette enzyme et des substrats exprims par la cellule concerne. Par exemple, les effets de ladrnaline sur le mtabolisme du glycogne, qui dpendent de lAMPc et de PKA, sont restreints au foie et aux cellules musculaires, qui expriment des enzymes capables de synthtiser et de dgrader le glycogne. Dans les adipocytes, PKA active par ladrnaline phosphoryle la phospholipase qui hydrolyse alors les triglycrides de rserve en glycrol et acides gras libres. Ceux-ci, librs dans le sang, servent de source dnergie dautres tissus comme les reins, le cur et les muscles. De mme, certaines hormones hypophysaires

stimulent des cellules ovariennes via des rcepteurs coupls aux protines G, entranant lactivation de PKA qui, son tour, induit la synthse dstrognes et de progestrone, hormones strodiennes ncessaires au dveloppement des caractres sexuels fminins. Bien que PKA agisse sur diffrents substrats dans divers types de cellules, elle phosphoryle toujours un rsidu srine ou thronine insr dans un mme motif : X-Arg-(Arg/Lys)-X-(Ser/Thr)-, o X reprsente nimporte quel acide amin et un acide amin hydrophobe. Dautres srine/thronine kinases phosphorylent des rsidus cibles intgrs dans des motifs diffrents.5 Le mtabolisme du glycogne est rgul par activation hormonale de la protine kinase A La libration du glucose partir du glycogne, dans les muscles et les hpatocytes, sous laction de ladrnaline ou dautres rcepteurs hormonaux coupls aux protines G fut la premire rponse cellulaire dpendante de lAMPc tre dcouverte. Elle montre comment lactivation de la PKA coordonne lactivit dun groupe denzymes intracellulaires en vue dun mme objectif. Le glycogne, un grand polymre de glucose, est la forme principale du stockage du glucose chez les animaux. Comme les autres biopolymres, le glycogne est synthtis par une srie denzymes et dgrad par une autre. Trois enzymes convertissent le glucose en uridine diphosphoglucose (UDP-glucose), premier intermdiaire dans la synthse du glycogne. La glycogne synthase transfre ensuite le rsidu glucose de lUDP-glucose lOH-4 libre du rsidu glucose de lextrmit dune chane de glycogne. Le glycogne est dpolymris graduellement partir de la mme extrmit par la glycogne phosphorylase (le groupe coupant la liaison nest pas H2O, mais un ion phosphate) avec libration de glucose 1-phosphate. Dans le muscle et le foie, le glucose 1-phosphate issu du glycogne est converti en glucose 6phosphate.

Dans le muscle, ce mtabolite sengage dans la voie glycolytique et est mtabolis pour gnrer de lATP ncessaire la contraction musculaire. Par contre, les hpatocytes contiennent une phosphatase qui hydrolyse le glucose 6-phosphate en glucose, qui est export de ces cellules en partie par un transporteur du glucose (GLUT2) prsent dans la membrane plasmique. Ainsi, les rserves hpatiques de glycogne sont dgrades essentiellement en glucose, qui est livr immdiatement la circulation sanguine et capt par dautres tissus, notamment les muscles et le cerveau. Laugmentation de lAMPc induite par ladrnaline suivie de lactivation de PKA amplifie la conversion du de glycogne en glucose 1-phosphate de deux manires : par inhibition de la synthse de glycogne et par stimulation de sa dgradation. PKA phosphoryle, et donc inactive, la glycogne synthase, lenzyme qui synthtise le glycogne. PKA favorise la dgradation du glycogne indirectement en phosphorylant et donc en activant une kinase intermdiaire, la glycogne phosphorylase kinase (GPK), qui son tour, phosphoryle et active la glycogne phosphorylase, lenzyme qui dpolymrise le glycogne en glucose 1phosphate. Tous ces processus sinversent lorsque ladrnaline disparat de la surface cellulaire et que le taux dAMPc dcrot, ce qui inactive PKA. Ce renversement sopre par laction dune phosphoprotine phosphatase, qui enlve les groupes phosphoryles de la forme inactive de la glycogne synthase, ce qui lactive, et des formes actives de glycogne phosphorylase kinase et de glycogne phosphorylase, ce qui les inactive. La phosphoprotine phosphatase elle-mme est rgule par PKA qui, lorsquelle est active, phosphoryle un inhibiteur de cette phosphatase. Linhibiteur phosphoryl se fixe alors la phosphoprotine

phosphatase et linactive. La protine phosphatase est donc active lorsque le taux dAMPc sabaisse et que linhibiteur est dphosphoryl ; ce faisant, la synthse de glycogne par la glycogne synthase est amplifie et la phosphorolyse du glycogne par la glycogne phosphorylase inhibe. La glycognolyse induite par ladrnaline est donc soumise une double rgulation : lactivation des enzymes catalysant la dgradation du glycogne et linhibition des enzymes favorisant sa synthse. Une telle rgulation coordonne de voies de stimulation et dinhibition constitue un mcanisme efficace pour assurer une rponse cellulaire particulire et intervient frquemment en biologie. Une amplification du signal survient souvent en aval des rcepteurs de la surface cellulaire Les rponses cellulaires induites par les rcepteurs coupls aux protines G qui activent ladnylate cyclase peuvent requrir des dizaines de milliers ou mme des millions de molcules dAMPc par cellule. Aussi, le signal hormonal doit-il tre amplifi afin quil gnre suffisamment de messagers secondaires partir des quelques milliers de rcepteurs hormonaux spcifiques ports par une cellule. Lamplification du signal est possible parce que tant les rcepteurs que les protines G peuvent diffuser rapidement au sein mme de la membrane. Un seul complexe rcepteur-hormone active prs de 100 molcules de Gs. Chacune de celles-6 ci, leur tour, active probablement une seule molcule dadnylate cyclase, qui, pendant quelle est lie Gs.GTP, catalyse la synthse de beaucoup de molcules dAMPc. Bien que ltendue exacte de cette amplification soit difficile mesurer, la liaison dune seule molcule dhormone une molcule de rcepteur peut aboutir la synthse dau moins plusieurs centaines de molcules dAMPc avant que le complexe rcepteur-hormone ne se dissocie et que lactivation de ladnylate cyclase ne cesse. Une telle

amplification se droule probablement au cours de signalisation provenant de rcepteurs coupls dautres protines G et de certains autres types de rcepteurs dont lactivation induit la synthse de messages secondaires. Un second niveau damplification est illustr par la stimulation induite par lAMPc de la glycognolyse. Comme nous venons de le voir, lAMPc favorise la dgradation du glycogne en passant par trois tapes ; il sagit l dune cascade, cest--dire une srie de ractions dans lesquelles lenzyme qui catalyse une raction est active, ou inhibe, par le produit de la prcdente. Lamplification qui survient au cours dune telle cascade dpend du nombre dtapes quelle comprend. Les deux niveaux damplification sont dcrits dans la Figure 13-18. Par exemple, des taux sanguins dadrnaline aussi bas que 10-10 M suffisent stimuler la glycognolyse hpatique et la libration de glucose. Pareille stimulation adrnergique fait monter la concentration cellulaire dAMPc 10-6 M, soit une amplification de 104 . Puisque trois tapes catalytiques supplmentaires prcdent la libration de glucose, une autre amplification de 104 lamplification peut survenir. Dans le muscle stri, la concentration des trois enzymes mises successivement contribution dans la cascade glycognolytique, protine kinase A, glycogne phosphorylase kinase et glycogne phosphorylase, sont dans le rapport 1:10:240, ce qui illustre de faon loquente lamplification des effets de ladrnaline et de lAMPc. Une telle cascade, qui peut paratre trs complique, namplifie pas seulement le signal extrieur mais permet aussi un groupe entier de ractions enzymatiques dtre rgul de manire coordonne par un seul type de molcule de signalisation. De plus, les tapes multiples entre le stimulus et la rponse finale offre des possibilits de rgulation par dautres voies de signalisation, par lesquelles la rponse

cellulaire sera finement ajuste. Nous rencontrerons dautres exemples de cascades dans les voies de signalisation dcrites dans le prochain chapitre. Plusieurs mcanismes rgulent la signalisation provenant des rcepteurs coupls aux protines G Plusieurs facteurs contribuent mettre fin la rponse aux hormones reconnues par les rcepteurs adrnergiques et dautres rcepteurs coupls aux Gs. Premirement, laffinit du rcepteur pour lhormone dcrot lorsque le GDP li Gs est remplac par un GTP la suite de la fixation de lhormone. Sous leffet de cette augmentation du Kd du complexe rcepteur-hormone, lhormone tend se dtacher. Deuximement, le GTP li Gs est rapidement hydrolys, inversant lactivation de ladnylate cyclase et la production de lAMPc. Troisimement, lAMPc phosphodiestrase hydrolyse lAMPc en 5-AMP, terminant ainsi la rponse cellulaire. Donc, la prsence continue de lhormone une concentration suffisamment leve est requise pour lactivation continue de ladnylate cyclase et le maintien dun taux lev dAMPc. Ds que la concentration de lhormone est tombe suffisamment, la rponse cellulaire se termine rapidement. Quand un rcepteur coupl une protine Gs est stimul par une hormone pendant plusieurs heures, plusieurs rsidus srine et thronine dans le domaine cytosolique du rcepteur sont phosphoryls par la protine kinase A (PKA). Le rcepteur phosphoryl peut fixer son ligand, mais cette liaison entrane une rduction de lactivation de ladnylate cyclase ; le rcepteur est donc dsensibilis. Ceci est un exemple de suppression par rtrocontrle, dans laquelle le produit final dune voie (ici PKA active) bloque une tape prcoce de la voie (ici lactivation du rcepteur). Puisque lactivit de PKA est amplifie par un taux lev

dAMPc induit par toute hormone qui active Gs, une exposition prolonge une telle hormone, disons ladrnaline, cause la dsensibilisation non seulement des rcepteurs -adrnergiques mais aussi des rcepteurs coupls aux protines Gs qui lient des ligands diffrents (e.g. glucagon). Cette rgulation croise est appele dsensibilisation htrologue.7 Des rsidus supplmentaires dans le domaine cytosolique du rcepteur -adrnergique sont phosphoryls par une enzyme spcifique du rcepteur et appele BARK (-adrenergic kinase receptor), mais seulement quand ladrnaline, ou un agoniste, est lie au rcepteur. Puisque BARK ne phosphoryle que des rcepteurs -adrnergiques activs, ce processus est appel dsensibilisation homologue. Un traitement prolong de cellules avec de ladrnaline aboutit une phosphorylation tendue et donc une dsensibilisation du rcepteur -adrnergique par PKA et BARK. Des rcepteurs phosphoryls (dsensibiliss) sont constamment resensibiliss la suite de la dphosphorylation par des phosphatases constitutives. Ainsi, le nombre de phosphates par molcule de rcepteur reflte la quantit de ligand fix dans le pass rcent (e.g. 1-10 minutes). Ceci signifie que, si une cellule est expose de manire constante une certaine concentration dhormone, celle-ci deviendra finalement insuffisante pour stimuler le rcepteur. Si la concentration hormonale passe un niveau suprieur, le rcepteur active les voies de signalisation en aval mais avec moins dintensit que si ce niveau tait atteint partir dun milieu dpourvu dhormone. Si celle-ci est compltement limine, le rcepteur est compltement dphosphoryl et ramen sa sensibilit maximale, ce qui lui permet de rpondre nouveau des taux trs bas de lhormone. Donc, une boucle de rtrocontrle impliquant la phosphorylation du rcepteur et sa dphosphorylation module lactivit des rcepteurs -adrnergiques et ceux coupls aux protines Gs, permettant une cellule dajuster la sensibilit du rcepteur au taux de

lhormone auquel elle est expose. Un autre participant la rgulation des rcepteurs -adrnergiques est la -arrestine. Cette protine cytosolique se lie aux rcepteurs abondamment phosphoryls par BARK et inhibe compltement leur interaction avec Gs et donc leur aptitude lactiver. Une fonction supplmentaire de la -arrestine dans la rgulation des rcepteurs de surface cellulaire fut suggre initialement par lobservation que la perte des rcepteurs -adrnergiques de surface en rponse la fixation du ligand est stimule par la surexpression de BARK et de la -arrestine. Des tudes ultrieures rvlrent que la -arrestine se lie non seulement aux rcepteurs phosphoryls mais aussi la clathrine et une protine associe appele AP2, deux composants essentiels des vsicules tapisses qui sont impliques dans un type dendocytose. Ces interactions favorisent la formation des puits tapisss et lendocytose des rcepteurs associs, ce qui rduit ainsi le nombre de rcepteurs exposs la surface cellulaire. Finalement, les rcepteurs incorpors sont dphosphoryls dans les endosomes, la -arrestine dtache et les rcepteurs resensibiliss reviennent la surface cellulaire, comme le fait le rcepteur des LDL. La rgulation dautres rcepteurs coupls aux protines G dpend aussi, pense-t-on, de lendocytose de rcepteurs occups par le ligand et leur squestration dans la cellule. Comme nous en discuterons plus loin, la -arrestine fonctionne aussi comme protine adaptatrice dans la transduction de signaux allant de rcepteurs coupls aux protines Gs jusquau noyau. Les fonctions multiples de la -arrestine illustrent limportance des protines adaptatrices dans la rgulation de la signalisation et de la transduction des signaux provenant des rcepteurs de surface. Lancrage des protines restreint les effets de lAMPc des rgions subcellulaires spcifiques

Dans beaucoup de types cellulaires, une augmentation du taux dAMPc peut induire une rponse qui est requise dans une partie de la cellule mais est indsirable, peut-tre dltre, dans une autre partie. Une famille de protines dancrage assigne aux isoformes de PKA des sites subcellulaires spcifiques, restreignant ainsi les rponses dpendant de lAMPc ces localisations. Ces protines, appeles protines associes la kinase A (AKAP), ont une structure en deux domaines ; lun assure la localisation subcellulaire spcifique, alors que lautre se lie la sous-unit rgulatrice de la protine kinase A. Dans certaines cellules du myocarde, une protine dancrage (AKAP15) est attache la face cytosolique de la membrane plasmique prs dun type particulier de canal calcique ouverture contrle. Il souvre sous leffet de sa phosphorylation par PKA active elle-mme la suite de linteraction de ladrnaline avec les rcepteurs -adrnergiques. Lafflux de Ca2+ qui en rsulte augmente le rythme des contractions cardiaques (prparant ainsi au combat ou la fuite). Linteraction dAKAP15 avec PKA impose celleci8 une localisation proche de ces canaux, rduisant ainsi le dlai requis la diffusion des sous-units catalytiques de PKA jusqu leur substrat. Une autre protine associe la kinase A (mAKAP) dans le myocarde accroche la fois la PKA et lAMPc phosphodiestrase (PDE) la membrane nuclaire externe. Du fait de la proximit de PDE et de PKA, le taux dAMPc, et donc lactivit de la PKA, est soumis une boucle de rtrocontrle strict. La localisation de PKA prs de la membrane nuclaire facilite aussi lentre des sous-units catalytiques dans le noyau, o elles phosphorylent et activent certains facteurs de transcription.

Rgulation de canaux ioniques par des rcepteurs coupls aux protines G Comme nous lavons appris au Chapitre 7, beaucoup de rcepteurs des neurotransmetteurs sont des canaux ioniques ouverture contrle par le ligand. Ceux-ci comprennent certains types de rcepteurs au glutamate et la srotonine, ainsi que le rcepteur nicotinique lactylcholine qui se trouve dans les synapses neuromusculaires. Cependant, il existe galement beaucoup de rcepteurs de neurotransmetteurs qui sont coupls des protines G. Pour certains de ceux-ci, la protine effectrice est un canal Na+ ou K+ . La liaison du neurotransmetteur ces rcepteurs dclenche louverture ou la fermeture du canal concern, ce qui entrane des changements de potentiel de membrane. Dautres rcepteurs de neurotransmetteurs ainsi que les rcepteurs olfactifs et les rcepteurs oculaires la lumire sont coupls aux protines G, qui modulent indirectement lactivit des canaux ioniques par lintermdiaire de messagers secondaires. Dans cette section, deux exemples de rcepteurs coupls aux protines G illustrent les mcanismes directs et indirects de rgulation des canaux calciques : le rcepteur muscarinique lactylcholine et le rcepteur coupl Gt. Dans le cur, les rcepteurs muscariniques lactylcholine activent une protine G qui ouvre les canaux K + La liaison de lactylcholine aux rcepteurs nicotiniques dans les muscles stris gnre un potentiel daction qui dclenche leur contraction (voir Figure 7-45). Par contre, les rcepteurs muscariniques de lactylcholine dans le muscle cardiaque sont inhibiteurs. La liaison de lactylcholine ces rcepteurs ralentit le rythme des contractions en causant une hyperpolarisation de longue dure (plusieurs secondes)

de la membrane cellulaire. Ceci peut tre tudi exprimentalement par lajout direct dactylcholine au myocarde en culture. Lactivation du rcepteur muscarinique lactylcholine, qui est coupl une protine Gi , conduit louverture des canaux K+ associs. Lafflux dions K+ qui sensuit cause lhyperpolarisation de la membrane plasmique. Comme dcrit dans la Figure 13-21, le signal des rcepteurs activs est transmis la protine effectrice par la libration de la sous-unit G plutt que par G.GTP. Que G active directement le canal K+ fut dmontr par des expriences de patch-clamping, qui mesurent le flux ionique travers un seul canal ionique dans un site membranaire restreint. Lorsque la protine G fut ajoute la face cytosolique dun patch de membrane plasmique de myocarde, les canaux K+ souvrirent immdiatement, mme en absence dactylcholine ou dautres neurotransmetteurs. Des rcepteurs coupls Gt sont activs par la lumire La rtine humaine contient deux types de photorcepteurs, les btonnets et les cnes, qui sont les premiers soumis la stimulation visuelle. Les cnes sont impliqus dans la vision de la couleur, tandis quune lumire faible faite dun large spectre de longueurs dondes, celle dun clair de lune, suffit stimuler les

btonnets. Les photorcepteurs forment des synapses avec une double couche dinterneurones innervs par diffrentes combinaisons de cellules photorceptrices. Tous ces signaux sont traits et interprts par la partie du cerveau appele cortex visuel.9 La rhodopsine, (Fig 12-14) un rcepteur coupl une protine G et qui est activ par la lumire, est localise dans les quelque mille disques membranaires remplissant le segment extrieur des btonnets (Figure 1322). La protine G trimrique couple la rhodopsine, souvent appele transducine (Gt ), se trouve uniquement dans les btonnets. Un btonnet humain contient environ 4 x 107 molcules de rhodopsine, qui consiste en une protine sept segments transmembranaires, lopsine, et en un pigment absorbant la lumire, le 11-cis-rtinal, qui est li lopsine de manire covalente. Lors de labsorption dun photon, le groupement rtinal est trs rapidement converti en son isomre tout-trans-rtinal, ce qui cause un changement de conformation dans la portion opsine et ce qui lactive (Figure 13-23). Ceci est quivalent au changement de conformation qui survient lors la fixation dun ligand par dautres rcepteurs coupls aux protines G. La forme rsultante dans laquelle lopsine est lie par covalence au tout-trans-rtinal est appele mta-rhodopsine II ou opsine active. Analogue dautres rcepteurs coupls aux protines G, la rhodopsine active par la lumire interagit avec une protine G associe (i.e. Gt) et lactive. Lopsine active est instable et se dissocie spontanment en ses parties constitutives, librant lopsine et le touttrans-rtinal, terminant ainsi la signalisation visuelle. Dans lobscurit, le tout-trans-rtinal est reconverti en 11-cis-rtinal, qui peut se lier nouveau lopsine, et reformer ainsi la rhodopsine. Dans lobscurit, le potentiel de membrane dun btonnet est denviron -30 mV, considrablement moins

que le potentiel de repos (- 60 90 mV) typique des neurones et dautres cellules lectriquement actives. Comme consquence de cette dpolarisation, les btonnets, dans lobscurit, scrtent en permanence des neuromdiateurs, et les interneurones bipolaires avec lesquels ils communiquent subissent une stimulation continue. Ltat dpolaris de la membrane plasmique des btonnets au repos est d louverture dun grand nombre de canaux ioniques non slectifs qui admettent le Na+ , le Ca2+ ainsi que le K+ . Labsorption de la lumire par la rhodopsine entrane la fermeture de ces canaux, ce qui rend le potentiel de membrane plus ngatif. Plus de photons sont absorbs par la rhodopsine, plus de canaux sont ferms, moins dions Na+ pntrent dans la cellule, plus ngatif devient le potentiel de membrane et moins de neuromdiateur est libr. Ce changement est transmis au cerveau o il est peru comme sensation de lumire. Un seul photon absorb par un btonnet au repos produit une rponse mesurable, une diminution du potentiel de membrane denviron 1 mV, qui chez les amphibiens dure une seconde ou deux. Les humains sont capables de dtecter un clair de cinq photons seulement. Lactivation de la rhodopsine induit la fermeture des canaux cationiques contrls par le GMPc Le messager secondaire qui sert dintermdiaire entre lopsine active et les canaux cationiques de la membrane plasmique des btonnets est le GMP cyclique (GMPc) (Fig 1214). Dans le segment extrieur dun btonnet, la concentration de GMPc est exceptionnellement leve (0,07 mM). Il est form

continuellement partir de GTP sous laction de la guanylate cyclase, qui elle-mme parat insensible la lumire. Labsorption de lumire par la rhodopsine induit lactivation dune GMPc phosphodiestrase qui hydrolyse GMPc en 5-GMP. Ainsi, la concentration de GMPc diminue avec lintensit de la lumire. Quand il fait sombre, le taux lev de GMPc maintient les canaux cationiques ouverts, alors que la diminution du GMPc induite par la lumire entrane successivement la fermeture du canal, une hyperpolarisation de la membrane et une diminution de la libration de neuromdiateur. La GMPc phosphodiestrase est la protine effectrice pour Gt. Le complexe Gt.GTP libre qui est gnr aprs absorption de la lumire par la rhodopsine se lie aux deux sous-units inhibitrices de la GMPc phosphodiestrase, librant les sous-units catalytiques actives et , qui convertissent alors le GMPc en GMP. Il sagit l dun mcanisme frquemment mis en uvre dans les voies de signalisation ; le signal, en cartant un inhibiteur, active rapidement une enzyme. Une seule molcule dopsine active dans la membrane dun disque peut activer 500 molcules de Gt, chacune delles leur tour active la GMPc phosphodiestrase. Ce qui constitue la premire phase damplification du signal dans le systme visuel. Mme si lactivation de la GMPc phosphodiestrase entrane une diminution du messager secondaire, le GMPc, cette activation passe par le mme mcanisme gnral dcrit plus tt, sauf que labsorption de la lumire par la rhodopsine plutt que la fixation dun ligand sert de signal dactivation.10 La conversion de Gt.GTP en la forme inactive Gt.GDP est acclre par la protine activatrice de la GTPase (GAP) spcifique de Gt.GTP. Chez les mammifres, la sous-unitGt ne reste normalement active, c.--d. lie GTP, que pendant une fraction de seconde. Ainsi, la GMPc phosphodiestrase est rapidement inactive, ce qui permet au taux de GMPc de revenir son niveau original correspondant labsence de lumire. Ceci permet lil de rpondre rapidement la mobilisation ou aux modifications

subies par les objets observs. Les analyses cristallographiques aux rayons X ont rvl rcemment comment les sous-units de la protine Gt interagissent entre elles ainsi quavec la rhodopsine sensible la lumire. Elles ont aussi permis de comprendre comment G se dtache de G la suite de la liaison du GTP. Deux surfaces de Gt interagissent avec G : une rgion N-terminale proche de la surface membranaire et les deux rgions commutatrices adjacentes I et II, que lon trouve dans toutes les protines G. G et G sont au contact lune de lautre, mais G est distante de Gt. Les tudes des rcepteurs adrnergiques dcrites plus haut indiquent qu la suite de la fixation du ligand un rcepteur coupl une protine G, les hlices transmembranaires de celui-ci se mettent glisser lune par rapport lautre, entranant ainsi des changements de conformation dans les boucles cytosoliques, ce qui cre un site de liaison pour la protine G trimrique correspondante. Les structures cristallographiques de la Figure 13-25 suggrent que le domaine de Gt liant le nuclotide, avec les squences dancrage lipidique aux extrmits C-terminale de G et N-terminale de Gt, forme une surface qui sattache la rhodopsine (O* dans la Figure 13-24), ce qui favoriserait la libration du GDP partir de la Gt et la fixation subsquente de GTP. Les changements de conformation qui sen suivent dans Gt, particulirement ceux qui surviennent dans les commutateurs I et II, rompent les interactions molculaires

entre Gt et G , entranant leur dissociation. Les tudes structurales de la rhodopsine et de Gt ont donn des rsultats qui sont cohrents avec les donnes concernant dautres rcepteurs coupls aux protines G et lon pense que ce modle est applicable lensemble des rcepteurs de ce type. Un argument direct en faveur du rle du GMPc dans lactivit des btonnets a t fourni par les tudes de patch-clamping appliques des lambeaux isols de membrane plasmique du segment externe des btonnets, une rgion comptant de nombreux canaux cationiques dpendant du GMPc. Lorsque le GMPc est ajout la surface cytosolique, le nombre de canaux ouverts augmente rapidement. Leffet survient en absence de protine kinases ou phosphatases, et le GMPc agit directement sur les canaux pour les maintenir ouverts, ce qui indique que ceux-ci dpendent bien du nuclotide. Comme les canaux voltaques K+ dcrits dans le Chapitre 7, la protine constitutive du canal dpendant du GMPc contient quatre sous-units, chacune tant capable de lier une molcule de GMPc. Trois ou quatre molcules de GMPc doivent sy lier afin que le canal puisse souvrir ; cette interaction allostrique rend louverture trs sensible de petits changements dans les taux de GMPc. Les btonnets sadaptent aux diffrents niveaux de lumire ambiante Les cnes sont insensibles un clairage faible, alors que lactivit des btonnets est inhibe par un clairage intense. Ainsi, quand nous passons de la lumire du jour dans une chambre faiblement claire, la pice nous parat tout fait obscure. Les btonnets devenant lentement sensibles cette faible luminosit, nous sommes progressivement capables de distinguer les objets. Ce processus dadaptation visuelle permet

un btonnet de percevoir un contraste de 1 100.000 fois dans lintensit de la lumire ambiante. En consquence, ce sont des diffrences dans les niveaux de luminosit, plutt quune quantit absolue de lumire absorbe, qui forment les images que nous distinguons. Un processus contribuant ladaptation visuelle implique la phosphorylation de lopsine active (O*) par la rhodopsine kinase. Cette enzyme des btonnets est analogue la kinase des rcepteurs adrnergiques (BARK) dont il a t prcdemment question. Chaque molcule dopsine a trois sites principaux de phosphorylation de srine ; plus il y a de sites phosphoryls, moins lO* est capable dactiver Gt et ainsi dinduire la fermeture des canaux cationiques dpendant du GMPc. En effet, les btonnets de souris avec des rhodopsines mutes contenant zro ou seulement un des rsidus srine ont une vitesse de dsactivation la lumire intense beaucoup plus lente que normalement. Puisque le degr de11 phosphorylation de lopsine est proportionnel au temps que chaque molcule dopsine passe sous forme active par la lumire, il constitue une mesure de lintensit de la lumire de fond (ambiante). Dans des conditions de forte luminosit, lopsine phosphoryle est abondante et lactivation de Gt rduite ; ainsi, une augmentation plus prononce dans le niveau de luminosit sera ncessaire pour gnrer un signal visuel. Quand le niveau de lumire ambiante est rduit, les opsines sont dphosphoryles et leur aptitude dactiver Gt augmente ; dans ce cas, moins de photons supplmentaires seront ncessaires pour gnrer un signal visuel. Quand la lumire ambiante est intense ( lextrieur, midi), le degr de phosphorylation de lopsine est tel que la -arrestine se lie au segment C-terminal de lopsine et prvient ainsi linteraction de Gt avec O*, ce qui bloque totalement la formation du complexe Gt.GTP actif et suspend toute activit des btonnets. Ce

mcanisme de contrle par la rhodopsine kinase et larrestine ressemble ladaptation (ou dsensibilisation) des autres rcepteurs coupls aux protines G lorsquils sont exposs des taux levs de ligand. Les btonnets disposent dun second mcanisme dadaptation visuelle qui parat unique. Dans les cellules adaptes lobscurit, pratiquement toutes les sous-units Gt and G sont dans le segment externe. Mais, une exposition pendant 10 minutes la lumire du jour dintensit modre entrane le dplacement de 80 % des sous-units Gt and G du segment externe vers dautres compartiments cellulaires. On ignore comment ces protines se dplacent, mais une consquence est lincapacit physique pour les protines Gt de lier lopsine active. Comme dans les autres voies de signalisation, de multiples mcanismes contribuent linactivation de la signalisation durant ladaptation visuelle, probablement afin quelle puisse tre strictement contrle tout au long dune vaste chelle dintensit lumineuse. Rcepteurs coupls aux protines G et activateurs de la phospholipase C Dans cette section, nous discutons des voies de transduction du signal provenant des RCPG et passant par plusieurs messagers secondaires ainsi que les mcanismes par lesquels ils rgulent diverses activits cellulaires. Un certain nombre de ces messagers secondaires drive du phosphatidylinositol (PI). Le groupe inositol dans ce phospholipide, qui stend dans le cytosol voisin de la membrane, peut tre phosphoryl de manire rversible en plusieurs positions par laction combine de diverses kinases et phosphatases. Les taux de beaucoup de phospho-inositides dans les cellules sont rguls de manire dynamique par des mdiateurs extracellulaires, spcialement ceux qui se fixent aux rcepteurs du type tyrosine kinases ou aux rcepteurs de cytokines, dont il est question dans le prochain chapitre. Le phospho-inositide PIP2 (PI 4,5-

bisphosphate) lie beaucoup de protines cytosoliques la membrane plasmique. Certaines dentre elles sont requises pour former et remodeler le cytosquelette dactine ; dautres sont ncessaires la fixation de protines impliques dans lendocytose et la fusion des vsicules. Par ailleurs, PIP2 est cliv par une enzyme associe la membrane (Fig 15), la phospholipase C (PLC) et fournit ainsi deux messagers secondaires importants : le 1,2-diacylglycrol (DAG), une molcule lipophile qui reste intgre la membrane et linositol 1,4,5-trisphosphate (IP3), qui diffuse dans le cytosol. Nous dsignons les vnements qui impliquent en aval ces deux messagers secondaires comme la voie IP3/DAG. La liaison dune hormone au rcepteur coupl soit la protine Go ou Gq active lisoforme de la phospholipase C (PLC). Linositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 ) dclenche la libration de Ca 2+ par le rticulum endoplasmique La plupart des ions Ca2+ intracellulaires sont squestrs dans les mitochondries et dans la lumire du rticulum endoplasmique (RE) et dautres vsicules. Les cellules recourent divers mcanismes pour rguler la concentration des ions Ca2+ dans le cytosol, qui est maintenu habituellement en dessous de 0,2 M. Par exemple, les Ca2+ ATPases pompent les ions Ca2+ cytosoliques travers la membrane plasmique lextrieur de la cellule ou dans la lumire des compartiments de stockage du Ca2+

intracellulaire. Comme nous le discutons ci-dessous, une augmentation modre du Ca2+ cytosolique induit diverses rponses cellulaires ; aussi la concentration cytosolique de Ca2+ est-elle strictement contrle.12 La liaison de beaucoup dhormones aux rcepteurs de surface des hpatocytes, des adipocytes et dautres cellules fait augmenter le Ca2+ cytosolique, mme quand les ions Ca2+ sont absents du liquide extracellulaire environnant. Dans cette situation, le Ca2+ passe dans le cytosol partir de la lumire du RE par les canaux calciques dpendant de lIP3 et prsents dans la membrane du RE. La grande protine constitutive de ces canaux comprend quatre sous-units identiques, chacune contenant un site liant IP3 dans le domaine cytosolique N-terminal. La fixation de lIP3 induit louverture du canal, permettant aux ions Ca2+ dchapper du RE dans le cytosol. Quand divers inositols phosphoryls trouvs dans la cellule sont ajouts des prparations de vsicules du RE, seul lIP3 cause la libration des ions Ca2+ des vsicules. Cette simple exprience dmontre la spcificit de leffet dIP3. Laugmentation du taux de Ca2+ cytosolique dpendante dIP3 nest que transitoire car les Ca2+ ATPases localises dans la membrane plasmique et la membrane du RE pompent activement le Ca2+

du cytosol lextrieur de la cellule et dans la lumire du RE. De plus, dans la seconde de sa formation, un phosphate spcifique dIP3 est hydrolys, ce qui donne linositol 1,4 bisphosphate, qui est incapable de stimuler la libration de Ca2+ partir du RE. Sans certains moyens de restaurer les rserves du Ca2+ intracellulaire, une cellule stimule par une hormone serait rapidement incapable dlever le taux cytosolique de Ca2+ en rponse lIP3. Des tudes de patchclamping ont rvl que le canal calcique membranaire appel canal TRP ou canal dpendant des rserves souvre en rponse la dpltion des rserves calciques du RE. Par un mcanisme qui reste incompris, la dpltion de Ca2+ dans la lumire du RE mne un changement de conformation du canal calcique dpendant dIP3, ce qui lui permet de se lier au canal calcique TRP dans la membrane plasmique, obligeant celui-ci souvrir. En effet, lexpression dans des cellules dun fragment spcifique dun canal calcique dpendant dIP3 de la membrane du RE prvient louverture du canal TRP la suite de la dpltion des rserves calciques dans le RE, ce qui implique une interaction entre les deux canaux calciques pour louverture du canal TRP. Louverture des canaux calciques dpendant de lIP3 est favorise par les ions Ca2+ cytosoliques, qui augmentent laffinit de ces canaux rcepteurs pour lIP3, ce qui aboutit une libration plus abondante du Ca2+ de rserve. Des concentrations plus leves de Ca2+

cytosolique, cependant, inhibent la libration de Ca2+ induite par IP3 partir des rserves intracellulaires par rduction de laffinit du rcepteur pour IP3. Cette rgulation complexe des canaux calciques dpendant dIP3 dans les membranes du RE par le Ca2+ cytosolique peut mener des oscillations rapides dans le taux de Ca2+ cytosolique quand la voie de lIP3 dans les cellules est stimule. Par exemple, la stimulation de cellules pituitaires scrtrices dhormones par la LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone) cause des pics rapides et rpts daugmentation du Ca2+ cytosolique, chaque pic tant associ une pousse de scrtion dhormone lutinisante (LH). On ignore pourquoi la cellule recourt ces fluctuations de Ca2+ plutt qu une augmentation soutenue du Ca2+ cytosolique. Une possibilit est quune augmentation soutenue du Ca2+ serait toxique pour les cellules. Le diacytglycrol (DAG) active la protine kinase C, qui rgule beaucoup dautres protines Aprs sa formation par hydrolyse de PIP2 ou dautres phospho-inositides (Fig 15), DAG reste associ la membrane plasmique. Sa fonction principale est dactiver une famille de protine kinases dont lensemble est dnomm protine kinase C (PKC). Celle-ci, en absence de stimulation hormonale, est une protine cytosolique soluble inactive sur le plan catalytique. Une augmentation du taux de Ca2+ cytosolique entrane la fixation de la protine kinase C au feuillet intracellulaire de la membrane plasmique, o le DAG membranaire peut lactiver. Ainsi lactivation de la protine kinase C dpend dune augmentation la

fois des ions Ca2+ et de DAG, ce qui suggre une interaction entre les deux branches de la voie IP3/DAG. Lactivation de la protine kinase C dans diffrentes cellules aboutit diverses rponses cellulaires ; elle joue ainsi un rle cl dans beaucoup de processus lis la croissance et au mtabolisme de la cellule. Dans les hpatocytes, par exemple, la protine kinase C contribue la rgulation du mtabolisme du glycogne en phosphorylant et donc en inhibant la glycogne synthase. La protine kinase C phosphoryle aussi divers facteurs de transcription ; selon le type cellulaire, ceux-ci induisent la synthse dARNm qui dclenchent la prolifration cellulaire.13 Le complexe Ca 2+ /calmoduline intervient dans beaucoup de rponses cellulaires des signaux extrieurs La fixation dun ligand plusieurs types de rcepteurs, en plus des rcepteurs coupls aux protines G, peut activer une isoforme de la phospholipase C, ce qui conduit, par lintermdiaire dIP3, une augmentation du taux de Ca2+ libre dans le cytosol. Une telle augmentation localise du Ca2+ cytosolique dans des types cellulaires particuliers est critique pour sa fonction de messager secondaire. Par exemple, la stimulation par lactylcholine des rcepteurs coupls aux protines G dans les cellules scrtrices du pancras et de la glande parotide induit une augmentation du Ca2+ par lintermdiaire dIP3, ce qui

dclenche la fusion des granules scrtoires avec la membrane plasmique et la libration de leur contenu dans lespace extracellulaire. Dans les plaquettes sanguines, laugmentation du Ca2+ induite par la thrombine dclenche un changement de conformation dans ces fragments de cellules entranant leur agrgation et ainsi lobturation des brches dans la paroi des vaisseaux sanguins. La scrtion dinsuline par les cellules pancratiques est aussi dclenche par le Ca2+ , bien que son augmentation relve dun autre mcanisme. Une petite protine cytosolique appele calmoduline, qui est ubiquitaire dans les cellules deucaryotes, fonctionne comme un commutateur multifonction qui intervient dans beaucoup deffets cellulaires du Ca2+ . La liaison de cet ion aux quatre sites de la calmoduline forme un complexe qui, en interagissant avec de nombreuses enzymes et protines, module leur activit. Puisque le Ca2+ se lie la calmoduline dune manire cooprative, un lger changement dans le taux du Ca2+ cytosolique aboutit un changement important dans le niveau dactivit de la calmoduline. Une enzyme bien tudie active par le complexe Ca2+ /calmoduline est une kinase des chanes lgres de myosine, qui rgule lactivit de la myosine dans les cellules musculaires. Une autre est la phosphodiestrase de lAMPc, lenzyme qui dgrade lAMPc en 5-AMP et met ainsi fin son activit. Cette raction qui relie le Ca2+ lAMPc constitue un des nombreux exemples dans lesquels deux messagers secondaires interagissent pour ajuster finement

certains processus de rgulation cellulaire. Dans certaines cellules, laugmentation du Ca2+ cytosolique la suite dun signal passant par le rcepteur et lIP3 gnr par la PLC conduit lactivation de facteurs de transcription spcifiques. Dune part, le complexe Ca2+ /calmoduline active des protine kinases qui, leur tour, phosphorylent des facteurs de transcription, ce qui modifie leur activit et rgule lexpression gnique. Dautre part, le complexe Ca2+ /calmoduline active une phosphatase qui enlve les groupes phosphate du facteur de transcription. Un exemple important de ce mcanisme intervient dans les cellules T du systme immunitaire dans lequel les ions Ca2+ renforcent lactivit dun facteur de transcription essentiel, NFAT (nuclear factor of activated T cells). Dans les cellules non stimules, NFAT phosphoryl est localis dans le cytosol. la suite de la stimulation du rcepteur et de laugmentation du Ca2+ cytosolique, le complexe Ca2+ /calmoduline se lie la calcineurine, une protine-srine phosphatase, et lactive. La calcineurine active dtache alors des groupes phosphate occupant des positions critiques dans le NFAT cytosolique, ce qui expose une squence de localisation nuclaire qui permet NFAT de gagner le noyau et de stimuler lexpression des gnes essentiels lactivation des cellules T. Le complexe Ca2+ /calmoduline joue aussi un rle cl dans le contrle du diamtre des vaisseaux sanguins et ainsi de leur capacit livrer loxygne aux tissus. Cette voie implique une nouvelle molcule de signalisation et fournit un autre exemple de la fonction du GMPc comme messager secondaire.

Les muscles lisses des vaisseaux se relchent sous leffet dun signal passant par le GMPc qui active la protine kinase G La nitroglycrine a t utilise depuis plus dun sicle comme traitement de la douleur intense de langine de poitrine. On sait quelle se dcompose lentement dans le corps en oxyde nitrique (NO), qui cause le relchement des muscles lisses des parois vasculaires qui nourrissent le muscle cardiaque, augmentant ainsi le diamtre des vaisseaux sanguins et amplifiant le flux de sang fournissant loxygne au myocarde. Une des s les plus intrigantes en mdecine moderne est que le NO, un agent toxique que lon trouve dans les gaz dchappement des voitures, est en fait une molcule de signalisation naturelle. La preuve dfinitive du rle du NO dans linduction du relchement des muscles lisses a t fournie par une srie dexpriences dans lesquelles lactylcholine fut ajoute des prparations de muscles lisses qui14 entourent les vaisseaux sanguins. Lapplication directe de lactycholine ces cellules dclenchait leur contraction, effet attendu de ce mdiateur sur des cellules musculaires. Cependant, quand lactylcholine tait introduite dans la lumire de petits vaisseaux isols, les muscles lisses sous-jacents se relchaient au lieu de se contracter. Des tudes ultrieures ont montr quen rponse lactylcholine, les cellules endothliales qui bordent la lumire des vaisseaux sanguins librent une substance particulire qui son tour entrane le relchement musculaire. Il sest avr quil sagissait du NO. Nous savons maintenant que les cellules endothliales contiennent un rcepteur coupl la protine Go et quil fixe lactylcholine et active la phospholipase C, menant une augmentation du taux cytosolique de Ca2+

. Aprs fixation de ce cation par la calmoduline, le complexe stimule lactivit de la NO synthase, une enzyme qui catalyse la formation de NO partir dO2 et dun acide amin, larginine. Puisque le NO a une demi-vie brve (2-30 secondes), il ne peut diffuser que localement dans les tissus partir de son lieu de synthse. En particulier, le NO diffuse de la cellule endothliale dans les cellules musculaires lisses voisines, o il dclenche le relchement musculaire. Leffet du NO sur le muscle lisse passe par le messager secondaire GMPc, qui peut tre form par un rcepteur intracellulaire du NO exprim par les cellules musculaires lisses. La fixation du NO au groupe hminique de ce rcepteur entrane un changement de conformation qui augmente son activit intrinsque de guanylate cyclase, menant une augmentation du taux de GMPc. La plupart des effets du GMPc sont assurs par une protine kinase dpendante du GMPc et connue sous le nom de protine kinase G (PKG). Dans le muscle lisse vasculaire, la protine kinase G active une voie de signalisation qui aboutit linhibition du complexe actine-myosine, au relchement de la cellule et la dilatation du vaisseau sanguin. Dans ce cas, le GMPc agit indirectement par la protine kinase G, tandis que dans les btonnets, le GMPc se lie directement aux canaux cationiques de la membrane plasmique et les ouvre. Le relchement du muscle lisse vasculaire est aussi dclench par fixation du facteur natriurtique atrial (ANF) et quelques autres hormones peptidiques leurs rcepteurs prsents sur les cellules musculaires lisses. Le domaine cytosolique de ces rcepteurs de surface, linstar du rcepteur intracellulaire du NO, exerce une activit intrinsque de guanylate cyclase. Quand une augmentation du volume sanguin distend les cellules musculaires des oreillettes cardiaques (atrium), elles librent lANF, qui se lie alors ses rcepteurs spcifiques sur les cellules musculaires lisses des parois vasculaires, o il stimule lactivit de

guanylate cyclase et la formation de GMPc. Lactivation subsquente de la protine kinase G cause la dilatation du vaisseau par le mcanisme dcrit plus haut. Cette vasodilatation rduit la pression sanguine et contrecarre le stimulus responsable de la libration initiale dANF. Activation de la transcription gnique par des rcepteurs coupls aux protines G Comme nous lavons dj mentionn dans ce chapitre, les voies de signalisation intracellulaire peuvent aboutir des effets court ou long terme. Les rsultats obtenus en quelques secondes ou minutes proviennent de la modulation de lactivit denzymes ou dautres protines dj prsentes, ce qui mne des changements dans le mtabolisme ou la fonction cellulaire. La plupart des voies actives par les rcepteurs coupls aux protines G appartiennent cette catgorie. Cependant, les RCPG peuvent aussi envoyer des signaux dont les effets ne se manifestent quaprs des heures ou des jours, car ils passent par lactivation ou la rpression de la transcription gnique, qui entrane la prolifration ou la diffrenciation en un autre type cellulaire. Plus haut, nous avons vu comment un signal augmentant le taux du Ca2+ cytosolique peut activer des facteurs de transcription. Ici, nous allons dcrire dautres mcanismes par lesquels certains rcepteurs coupls aux protines G rgulent lexpression gnique. Le facteur de transcription Tubby localis dans la membrane est libr par activation de la phospholipase C Le gne tubby, qui est exprim surtout dans certaines zones du cerveau impliques dans le contrle du comportement alimentaire, a dabord attir lattention parce quil intervient dans lobsit. Des souris15 porteuses de mutations dans le gne tubby deviennent obses lge adulte, et leur mtabolisme ressemble par certains aspects celui de patients obses.

Selon la squence du gne tubby, la protine correspondante contient un domaine liant lADN et un domaine activateur de transcription. Cependant la protine Tubby a t trouve prs de la membrane plasmique, ce qui paraissait incompatible avec une fonction de facteur de transcription. Des tudes ultrieures ont rvl que Tubby liait fermement PIP2, et de la sorte tait ancre dans la membrane plasmique. La fixation dune hormone des rcepteurs coupls aux protines Go ou Gq, qui activent la phospholipase C, entrane lhydrolyse de PIP2 et libre dans le cytosol Tubby, qui entre alors dans le noyau o elle active la transcription dun gne (ou de plusieurs) encore inconnu. Lidentification de ces gnes et des protines quils codent devrait fournir des indications sur leur mode dintervention dans le mcanisme menant lobsit. Le facteur CREB sert de pont entre lAMPc et la transcription Chez les mammifres, une augmentation du taux dAMPc dans le cytosol stimule lexpression de beaucoup de gnes. Elle induit, par exemple dans certaines cellules endocrines, la synthse de somatostatine, un peptide qui inhibe la libration de diverses hormones ; dans le foie, lAMPc suscite la production de plusieurs enzymes qui convertissent des composs trois carbones en glucose. Tous les gnes rguls par lAMPc contiennent une squence dADN agissant en cis et appele CRE (cAMP-response element) qui lie la forme phosphoryle dun facteur de transcription appel CREB (CREbinding protein), que lon ne trouve que dans le noyau. Comme dcrit plutt, la liaison de neuromdiateurs et dhormones aux rcepteurs coupls la protine Gs active ladnylate cyclase, aboutissant une augmentation de lAMPc et la libration subsquente de la sous-unit catalytique active de la PKA. Certaines des sous-units catalytiques sont alors transfres dans le noyau et phosphorylent la srine 133 de la protine CREB. La protine CREB phosphoryle se lie aux gnes cibles contenant CRE et interagissent aussi avec un coactivateur appel CBP/P300, qui permet CREB dinteragir avec la machinerie assurant la

transcription, et ainsi de la stimuler. Selon des tudes antrieures, la phosphorylation induirait un changement de conformation dans la protine CREB, mais un travail plus rcent indique que CBP/P300 lie spcifiquement la phosphosrine 133 dans CREB activ. Comme discut dans le Chapitre 11, dautres facteurs de transcription rguls par des signaux sappuient sur CBP/P300 pour exercer leur effet activateur. Ainsi ce coactivateur joue un rle important en intgrant les signaux provenant de multiples voies de signalisation rgulatrices de la transcription gnique. Larrestine lie aux RCPG active plusieurs cascades de kinases qui contrlent lexpression gnique Nous avons vu plutt que la liaison de la -arrestine aux srines phosphoryles du domaine cytosolique des rcepteurs coupls aux protines G la fois bloque lactivation de G et induit lendocytose des complexes RCPG-arrestine. Cela peut paratre surprenant, mais ces complexes entrent dans la constitution dune sorte dchafaudage qui lie et active plusieurs kinases cytosoliques, parmi lesquelles c-Src, qui active la voie de la MAP kinase et dautres voies menant la transcription de gnes ncessaires la division cellulaire. Un complexe de trois protines lies larrestine, entre autres une Jun N-terminale kinase (JNK1), dclenche une cascade de kinases qui aboutit lactivation du facteur de transcription c-Jun. Celuici induit lexpression de certaines enzymes favorisant la croissance et dautres protines qui aident les cellules rpondre certains stress. La liaison de ladrnaline aux rcepteurs -adrnergiques du myocarde stimule la glycognolyse et acclre le rythme cardiaque. Un traitement prolong ladrnaline, cependant, induit la prolifration des cellules musculaires du cur. Dans les cas extrmes, une telle hypertrophie entrane une dcompensation de ces

muscles et donc une insuffisance cardiaque. Cette prolifration induite par ladrnaline provient en partie16 de lactivation de la cascade de la MAP kinase, qui, nous venons de le voir, peut tre dclenche par le complexe RCPG-arrestine. Une autre voie, peut-tre plus importante, par laquelle lactivation des rcepteurs -adrnergiques conduit lhypertrophie cardiaque implique un autre type de rcepteur. La protine Gs active par les rcepteurs adrnergiques peut dune certaine manire activer une mtalloprotase spcifique extracellulaire qui, son tour, clive le prcurseur transmembranaire de lEGF (epidermal growth factor). LEGF soluble libr dans lespace extracellulaire lie et active, de manire autocrine, les rcepteurs de lEGF sur la mme cellule. Comme nous lapprendrons dans le prochain chapitre, le rcepteur de lEGF appartient la classe des rcepteurs RTK (receptor tyrosine kinases), qui activent frquemment la cascade de la MAP kinase menant la prolifration cellulaire. Semblable interaction entre deux types de rcepteurs survient dans beaucoup dautres systmes de signalisation. Comme aucune cellule ne vit de manire isole, aucun rcepteur et aucune voie de transduction de signal ne fonctionnent de manire autonome. Perspectives pour le futur Trs bientt nous connatrons lidentit de toutes les pices intervenant dans les voies de transduction du signal, mais il est impossible de prvoir comment on assemblera ce puzzle et comment on pourra prvoir de la sorte les rponses cellulaires. Par exemple, nous pouvons numrer les protines G, les kinases, les phosphatases, les arrestines et dautres protines qui participent la signalisation dclenche par les rcepteurs -adrnergiques des cellules hpatiques, mais nous sommes encore loin de pouvoir prdire, comment les hpatocytes vont ragir quantitativement au cours du temps une dose donne dadrnaline.

La difficult tient en partie la complexit des boucles complexes de rtroaction (et dans certains cas, dantroaction) qui rgulent lactivit de multiples enzymes et autres intermdiaires. Bien que les expriences de biochimie et de biologie cellulaire nous disent comment ces interactions se droulent, nous ne pouvons dcrire quantitativement la vitesse et ltendue de ces ractions dans les cellules vivantes. Une discipline nouvelle se dveloppe dans laquelle, en analysant les systmes biologiques, on sefforce dobtenir une vue intgre de la rponse cellulaire aux signaux extrieurs. Des quations mathmatiques sont formules qui incorporent les constantes de vitesse de catalyse enzymatique, de formation des complexes protine-protine ainsi que les concentrations et les vitesses de diffusion des diverses protines de transduction du signal. Ces modles incorporent les changements de localisation intracellulaire des protines avec le temps (e.g. le mouvement des facteurs de transcription vers le noyau ou lendocytose des rcepteurs de surface) et leffet de lactivit dune protine donne (e.g. la glycogne phosphorylase), de la concentration du Ca2+ local et de la prsence de multiples kinases et phosphatases. En comparant les rsultats de tels calculs avec les rsultats exprimentaux (obtenus aprs augmentation ou diminution slective de la concentration dun intermdiaire) nous pouvons contrler, en principe, si nous avons tenu compte de tous les agents impliqus dans la voie tudie. Une telle modlisation mathmatique aidera lindustrie pharmaceutique dvelopper de nouveaux mdicaments susceptibles dactiver ou dinhiber, de manire spcifique, certaines voies. Par cette modlisation, il devrait tre possible dextrapoler les effets exercs par des mdicaments sur des protines en tubes essai ou sur des cultures cellulaires et de prdire ainsi leur efficacit et leurs effets secondaires sur les organismes vivants.

Dans ce chapitre, nous nous sommes intresss surtout aux voies de transduction du signal actives par des rcepteurs coupls aux protines G. Cependant, mme ces voies relativement simples font prsager la la complexit des interactions lintrieur des cellules vivantes. Comme nous lavons vu, lactivation dun seul type de rcepteur conduit souvent la production de multiples messagers secondaires ou lactivation de plusieurs types de protines transductrices en aval. De plus, la mme rponse cellulaire (e.g. la dgradation du glycogne) est affecte par de multiples voies de signalisation actives par de multiples types de rcepteurs. Linteraction de voies diffrentes de signalisation permet un ajustement fin des activits cellulaires, ce qui est indispensable au droulement correct des processus complexes du dveloppement et du mtabolisme. Laptitude des cellules de rpondre de manire approprie aux signaux extracellulaires dpend de la rgulation des voies de transduction elles-mmes. TSHR = Figures 16-232 tre phosphoryles, NF-b est rprim en permanence ; la phosphorylation dI-B est donc indispensable lactivation de cette voie. La dgradation de I-B expose les signaux de localisation nuclaire de NF-B, qui est alors transfr dans le noyau o il active la transcription dune multitude de gnes cibles (Figs 1-3). Malgr son activation par protolyse, la signalisation par NF-B se termine par une boucle de rtrocontrle ; en effet un des gne dont la transcription est induite immdiatement par NF-B code I-B. Celui-ci, dont les taux sont ainsi augments, se lient au NF-B actif dans le noyau et le ramne dans le cytosol. NF-B stimule la transcription de plus de 150 gnes, entre autres ceux qui codent des cytokines et des chimiokines qui attirent dautres cellules du systme immunitaire et des fibroblastes dans les foyers infectieux. Il favorise aussi lexpression de protines servant de rcepteurs qui permettent aux

neutrophiles (un type de globules blancs) de migrer partir du sang dans les tissus. De plus, NF-B stimule dune part lexpression de iNOS, lisoforme inductible de lenzyme qui produit loxyde nitrique, qui est toxique pour les bactries, et celle dautre part de plusieurs protines anti-apoptotiques, qui prviennent la mort cellulaire. Ainsi, cet unique facteur de transcription coordonne et active la dfense de lorganisme soit directement en raction aux pathognes et au stress, soit indirectement en rpondant des molcules de signalisation libres par dautres cellules ou tissus infects ou blesss. ct de sa participation aux processus inflammatoires et immunitaires, NF-B joue un rle cl durant le dveloppement des mammifres. Par exemple, des embryons de souris incapables dexprimer une des sous-units de lI-B kinase meurent au milieu de la gestation dune dgnrescence hpatique par apoptose excessive de cellules qui normalement doivent survivre ; NF-B est donc indispensable au dveloppement normal de ce tissu. The text below is adapted from R. A. Bradshaw and E. A. Dennis HANDBOOK OF CELL SIGNALING, Academic Press TNF Receptors and Associated Factors Among all the members of the tumor necrosis factor (TNF) family, TNF-a and TNF-b are the most pluripotent. TNF-a was first discovered as a factor generated by endotoxin-stimulated macrophages that induces hemorrhagic necrosis of transplanted tumors. TNF-b (lymphotoxin, or LTa) was identified as a lymphocyte-derived cytotoxin. Cachectin, a mediator of fever and cachexia, was shown to be identical to TNF-a (hereafter, TNF refers to both cytokines) (Figs 4, 5). Although the systemic toxicity of TNF-a precludes its use in cancer chemotherapy, inhibitors of TNF-a have become important agents in the treatment of certain inflammatory diseases such as

rheumatoid arthritis and Crohns disease. The two cell-surface receptors for TNF TNF-R1 (p55, CD120a) and TNF-R2 (p75, CD120b)are coexpressed by many types of cells. These receptors are trimers. Stimulation of TNF-R1 induces apoptosis by activation of procaspase 8. The same receptor can induce proinflammatory cell 3 proliferation by activating nuclear factor kB (NF-kB) and possibly mitogen-activated protein (MAP) kinases such as p38. TNF-R2 induces proliferation, but not cell death, and appears to be the less potent of the two receptors. TNF-a is widely expressed and is the prototypical member of a family that includes at least 19 members. Family members have diverged such that they are only 25 to 30% identical to each other in amino acid sequence. Like many of its homologs, TNF-a is a type II membrane protein; the human ortholog has a 76-residue N-terminal propeptide composed of a 25-residue intra-cytoplasmic domain followed by a transmembrane sequence. TNF-a is released from the cell surface after cleavage by an extracellular, ADAM family metalloprotease. Secreted and cell-surface TNF-a may play distinct roles in signaling. TNF-b, which is expressed predominantly in lymphocytes, has a normal signal sequence and is secreted. TNF Receptors Nearly 30 TNF-R homologs have been identified. Most are type I membrane proteins with cytoplasmic C-terminal domains and single transmembrane segments. Extracellular domains are composed of two or more cysteine-rich modules that contain binding sites for TNF family ligands. Both TNF-R1 and TNF-R2 are N-glycosylated. TNF-R1 and TNF-R2 have cytoplasmic domains of 221 and 174 residues, respectively. Those of other family members range from 30 to over 300 residues in length. None are known to exhibit enzymatic (kinase or phosphatase) activity. The cytoplasmic regions of TNF-R1, Fas and others that mediate apoptotic responses

include 80-residue protein modules known as death domains (DDs). Death domains participate in specific homotypic interactions with DDs in other proteins, exaclty like TIR (Toll-Interleukin Receptor) domains (Fig. 21). Death domains belong to a superfamily that includes death effector domains (DEDs) and caspase recruitment domains (CARDs), to which they have structural but little sequence identity. Mutagenic and structural studies indicate that DDs and their cousins can interact with each other through at least three distinct molecular surfaces, suggesting possible mechanisms by which single domains could interact simultaneously with different partners. Consequences of LigandReceptor Complex Formation The death domain of TNF-R1 is capable of self-association and subsequent apoptotic signaling, as demonstrated by over-expression of DD constructs for TNF-R and Fa. It is probable that, upon formation of the TNFTNF-R complex, interactions among receptor DDs generate interdomain binding sites for adaptor proteins such as the TNFa receptorassociated death domain protein (TRADD) or Fas-associated death domain protein (FADD) that are not present in unliganded receptor molecules. TRAFs Unlike receptors with intrinsic kinase activity in their intracellular domains or in direct association with intracellular enzymes, members of the tumor necrosis factor (TNF) 4 receptor superfamily and the interleukin-1 (IL-1) receptor/ Toll-like receptor (IL1R/TLR) superfamily use adapter proteins to couple to enzymatic activation and signal amplification. The TNF-receptor-associated factors (TRAFs), which currently consist of six members (TRAF16) in mammals, have emerged to be the major adapter proteins for these receptors. Through versatile proteinprotein interactions, TRAFs link receptor activation to downstream kinase activation and eventually the stimulation

of nuclear factor kB (NF-kB) and AP-1 transcriptional activity. Collectively, a wide range of cellular effects including cell survival, proliferation, and differentiation may be elicited by TRAF signaling. For Toll-like Receptors, structure, function and role in inflammatory responses see Figures 6-20.Part of the text below is adapted from "Handbook of Cell Signalling", by Bradshaw, A. and Edward, A.D., Elsevier 2003; Annu. Rev. Biochem. 2003. 72:137174. The present file is used for non-commercial teaching purposes. Nuclear Receptors

Introduction: Nuclear receptors comprise a group of intracellular proteins found either in the cytosol, or in the nucleus, or both, that, in combination with small molecule ligands, bind tightly in the nucleus, recruit appropriate cofactors, and regulate transcription in target genes. Included in this superfamily are receptors for the steroid hormones (estrogens, progestins, androgens, glucocorticoids, mineralocorticoids, ecdysteroids, vitamin D), for thyroid hormone and retinoids, and for an ever-increasing number of orphan receptors, which show structural similarity to the other receptors but for which ligands are not yet identified or are non existing. Nuclear receptor structure: Receptors for steroid and thyroid hormones, vitamin D, and retinoids represent a superfamily of regulatory agents, consisting of DNA-binding (C) and ligand-binding (E) domains, a small, highly conserved hinge region (D) joining these two units, and, at the amino acid terminus, a large region (A/B)

that shows little homology among the different receptors. Receptors for estrogens and thyroid hormones contain a small additional region (F) at the carboxy terminus, the function of which is not entirely clear (Fig. 1). Fig. 1 Nuclear receptor signaling: The classic model of steroid hormone receptor (SHR) action dictates that steroid receptors interact with chaperones in the cytoplasm and be dissociated in a ligand-dependent fashion, leading to the reorganization of the 2 receptor and exposure of nuclear localization signal(s) and translocation to the nucleus (Fig. 2). Fig. 2 Although this model is widely accepted for SHRs, there are important exceptions. The Estrogen receptors (ER) are clearly localized to the nucleus despite being part of a complex with chaperone proteins. Perhaps more striking is the finding that the two forms of Progesterone Receptors (PR) , PR-A and PR-B, that differ only in the length of their amino-terminal domains have distinct cellular localization. PR-A is found predominantly in the nucleus, whereas PR-B is mainly located in the cytoplasm in the absence of hormone. Intracellular redistribution of ligand-bound SHRs is accompanied by the recognition of specific DNA-binding sites, referred to as hormone response elements. The hormone response elements are short cis-acting sequences located within the promoters or enhancers of target genes. Typically, SHRs bind DNA as homodimers to hormone response elements composed of inverted repeats of AGGTCA or AGAACA motifs spaced by three nucleotides. However, a number or nuclear receptors bind to direct repeats.

The transcriptional activity of the SHRs is mediated by the AF-1 and AF-2 domains, located in the A/B and E regions. AF-1 is ligand-independent and constitutive since it can activate transcription in the absence of the ligand 3 when fused to a heterologous DNA-binding domain. The structural determinants and mode of action of the distinct AF-1 domains found in each SHR have yet to be characterized. In contrast, the ligand-dependent AF-2 is well defined: a short amphipathic -helix located at the carboxy-terminal end of the ligand-binding domain is repositioned on hormone binding (Fig. 3). Fig. 3. Upper panel: C-terminal helix is repositioned upon ligand binding, allowing recruitment of a coactivator. Lower panel: C-terminal helix is not repositioned when ligand is replaced by antagonist The resulting structural change provides a functional interface for coactivator recruitment by the receptor. These coactivators possess various enzymatic activities such as acetylase, deacetylase, methylase, and kinase functions. The cofactors participate in the remodeling of chromatin and the formation of a stable transcription initiation complex.4 Modulation of SHR Activation SHRs are phosphoproteins and targets of kinase cascades involved in the response to growth factors and cytokines. Many aspects of SHR function can be modulated in this way, including dimerization, DNA-binding, and both ligand-independent and -dependent activation. Interaction of SHR with Other Transcription Factor s Steroid hormone regulation of a number of target genes does not require the presence of a hormone response element within the transcriptional unit of

those genes. Instead, SHRs can bind to a transcription factor and thus modify its activity. The formation of a SHRtranscription factor complex can provide a hormone-dependent transcriptional activation function to a non-hormone response element site. Nuclear Receptor Coactivators Several nuclear receptor coactivators are components of complexes that remodel chromatin, modify histone tails, or act to recruit core transcription factors (Fig. 4). The ligand-dependent transactivation function of nuclear receptors has been demonstrated to depend on a short conserved sequence within the C terminus of the ligand-binding domain. Mutations within this region have been identified that have little or no effect on ligand binding, but abolish ligand-dependent transcription. Crystallographic analysis of several nuclear receptor are consistent with the idea that ligand-dependent changes in the conformation of the AF-2 domain result in the formation of a surface that facilitates coactivator interactions (see Fig. 3). Fig. 45 Extensive analysis of the amino acid sequences of several nuclear receptor coactivators revealed that a short helical sequence LXXLL (L: leucine and X: any amino acid) within the nuclear receptor interaction domain was necessary for ligand-dependent recruitment to the nuclear receptor ligand-binding domain. LXXLL motifs have been identified within nearly all of the putative coactivators that interact with NRs (Fig. 5). Structural studies of LXXLL motifs revealed that these motifs form short -helices. Fig. 5. Upper: Structure of the co-activator SRC, which contains three LXXLL motifs. Lower: interaction of the LXXL motifs of Src with a heteromeric

nuclear receptor.6 Components of coactivator complexes are targets for various signal transduction pathways, providing an additional level at which these pathways may be integrated. An example is provided by PGC-1, initially reported as a fat cell-specific coactivator for PPAR. PGC-1 has been found to enhance the expression of key gluconeogenic enzymes, including phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) and glucose-6-phosphatase in the livers of fasting mice, leading to increased glucose synthesis. These genes are under combinatorial control of several sequence-specific transcription factors, including the glucocorticoid receptor and the tissue-specific transcription factor HNF-4, which collectively utilize PGC-1 as a coactivator. The expression of PGC-1 is stimulated by glucagon and suppressed by insulin, suggesting that it may be a key target of these hormones in the maintenance of blood glucose homeostasis. Fig. 6 7 Nuclear receptors and regulation of bile acid synthesis

It has been known since the late 1960s that the amount of bile acid synthesized by the liver is regulated precisely. When bile acids accumulate, synthesis is reduced by a negative feedback mechanism that decreases the expression of two enzymes in the biosynthetic pathway, cholesterol 7 alpha hydroxylase and sterol 12 alpha-hydroxylase. Conversely, cholesterol accumulation induces bile acid synthesis by activating cholesterol 7 alpha hydroxylase. The regulatory responses of cholesterol 7 alpha -hydroxylase

were shown to be mediated at the transcriptional level in the late 1980s. Since that time, transcription factors that mediate negative and positive feedback regulation of bile acid synthesis have been identified, and the mechanisms by which these proteins act have been elucidated. A striking finding from this body of work is that many of the transcription factors regulating the expression of the cholesterol 7 alpha hydroxylase and sterol 12 -hydroxylase genes are nuclear receptors (Fig. 7, 8). Suppression is triggered by the binding of bile acids (when in excess) to the farnesoid X receptor (FXR, NR1H4), which then activates transcription of the short heterodimeric partner (SHP, NR0B2) gene, a second nuclear receptor. SHP binds to and inhibits a third receptor, the liver receptor homologue-1 (LRH-1, NR5A2), which normally activates the genes encoding cholesterol 7 alpha-hydroxylase and sterol 12 -hydroxylase. In the absence of LRH-1 activity, transcription from these two genes decreases, and consequently, the synthesis of bile acids declines. The increase in bile acid synthesis that occurs when cholesterol accumulates in rodents is mediated by the liver X receptor (LXR, NR1H3), a nuclear receptor that is activated on binding oxysterols. In conjunction with LRH-1, LXR stimulates transcription from the cholesterol 7 alpha-hydroxylase gene. Three retinoid X receptors (RXRalpha, beta, and gamma; NR2B13) serve as coreceptors for FXR and LXR, which brings the basal number of receptors that activate and suppress bile acid synthesis to seven. Fig. 7. Regulation of bile acid synthesis by nuclear hormone receptors and other

inputs. Black arrows indicate the pathways by which cholesterol is converted into bile acids. Green arrows indicate positive regulatory inputs, and red brakes indicate negative inputs. LXR, liver X receptor; LRH-1, liver receptor homologue-1; SHP, short heterodimer partner; FXR, farnesoid X receptor.8 Fig. 8 7 hydroxylase sterol12 hydroxylase conjugation Taurocholic acid Glycocholic acid