Microbiologia Materiales

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA
MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA

Dr. Q.F. HCTOR ALEXANDER VILCHEZ CCEDA
Mg EN GERENCIA DE SERVICIOS DE SALUD
LIMA PER 2010
UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA
PROLOGO
La Universidad Inca Garcilaso de la Vega, est empeada en realizar importantes innovaciones en la concepcin y prctica educativa con el propsito de brindar a sus alumnos una formacin profesional ms competitiva, que haga posible su ingreso con xito al mundo laboral, desempendose con eficacia y eficiencia en las funciones que les tocar asumir. El marco referencial est dado por los cambios significativos de la sociedad contempornea, expresados en la globalizacin y los nuevos paradigmas del conocimiento, de la educacin y la pedagoga as como los retos del mundo laboral. Uno de los medios para el logro de nuestros propsitos lo constituye el MANUAL DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGA el cual ha sido concebido como un material educativo que va ha servir para afianzar conocimientos, desarrollar habilidades y destrezas, as como orientar la autoeducacin permanente. por ello se ubica como un material de lectura independiente, sirve de informacin y recreacin, desempea un papel motivador, se orienta a facilitar la lectura comprensiva, a ampliar conocimientos en otras fuentes, crear hbitos y actitudes, as como a desarrollar destrezas para el procesamiento de informacin, adquisicin y generacin de conocimientos. El presente Manual, constituye material de apoyo al desarrollo de la asignatura y est organizado en dos unidades: Unidad I: Microbiologa Generalidades, Unidad II: Microbiologa Aplicada comprende: Microbiologa Clnica, Microbiologa Alimentaria, Microbiologa en la Industria Farmacutica y Cosmtica y de un Trabajo de Campo. Los alumnos deben leer detenidamente cada prctica, antes de su realizacin, para una mejor comprensin en la observacin del fenmeno biolgico de cada microorganismo en estudio. Adems debe realizar diagramas de flujo de lo observado el cual ser revisado por el profesor responsable de cada grupo de prctica. El autor agradece anticipadamente la(s) crtica(s) o sugerencia(s) que puedan tener los lectores que sirvan para mejorar el presente trabajo.
Dr. Q.F. HCTOR ALEXANDER VILCHEZ CCEDA DOCENTE DE MICROBIOLOGA
Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA
INDICE
PRLOGO INDICE INTRODUCCIN INSTRUCCIONES GENERALES MATERIALES QUE DEBEN TRAER LOS ALUMNOS A LAS PRCTICAS SISTEMA DE EVALUACIN PROTOCOLO DE ANLISIS MICROBIOLGICO
01 02 04 06 08 09 10
UNIDAD I: MICROBIOLOGA GENERALIDADES
12
PRACTICA N01 Bioseguridad, Toma de Muestra y Acondicionamiento de Materiales. PRACTICA N02 Mtodos de Esterilizacin y Desinfeccin (Antispticos y Desinfectantes). PRACTICA N03 Medios de cultivo: Preparacin de Medios de Cultivo. PRACTICA N04 Coloracin Gram y Coloracin de Bacterias cido Alcohol Resistentes. PRACTICA N05 Anlisis Cualitativo y Cuantitativo Bacteriano. PRACTICA N06 Metabolismo Bacteriano. 70 59 39 32 20 13
REFERENCIA BIBLIOGRFICA
79
ANEXO I: Flora Microbiana del Cuerpo Humano Normal
80
ANEXO II: Fundamentos e Interpretacin de Agares y Caldos
83
INTRODUCCIN
La Microbiologa es la ciencia encargada del estudio de los organismos microscpicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeo), bios (vida) y logos (ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscpica. Son considerados Microbios todos los seres vivos microscpicos consistentes en una sola clula, es decir unicelulares, as como aquellos que forman agregados celulares en los cuales todas las clulas son equivalentes. Los microorganismos pueden ser Eucariotas (Las clulas poseen ncleo), tales como los hongos y los protistas, o Procariotas (clulas carentes de ncleo), como las Bacterias y los Virus (Aunque los virus no son considerados seres vivos estrictamente hablando).
El Qumico Farmacutico y Bioqumico, es el profesional universitario de las Ciencias Mdicas con formacin cientfica, tecnolgica y humanstica, con capacidad gerencial, ejecutiva y de liderazgo. As mismo altamente capacitado para poder ejercer profesionalmente en los campos de la Industria Farmacutica e Industria Cosmtica siendo Jefe de Control de Calidad, del Laboratorio de Anlisis Clnicos y Bioqumicos ejerciendo la Microbiologa Clnica y del Laboratorio de Bromatologa realizando los Controles Microbiolgicos a los Alimentos.
Hoy en da el Profesional Qumico Farmacutico y Bioqumico es el profesional responsable de la produccin de los medicamentos y de los cosmticos de calidad, seguros y eficaces y para lograr este objetivo el control microbiolgico se considera de gran importancia, ya que en estos productos se pueden presentar las condiciones necesarias para la multiplicacin de microorganismos capaces de deteriorar al producto o, lo que es peor, afectar la salud del consumidor.
El cuidado de los alimentos y la industrializacin de los mismos se ha convertido en una ciencia y cada vez ms se estudia e investiga la forma de mejorar la calidad. Da a da surgen nuevas tcnicas, nuevos tipos de envases, nuevos aditivos, nuevos conservadores, etc. Esto ha llevado al establecimiento de normas, al desarrollo de mtodos y sistemas de control, que aseguren la inocuidad de los mismos. Para lograr este objetivo el Qumico Farmacutico y Bioqumico, realiza los Controles Microbiolgicos donde cuantifica e identifica los microorganismos presentes en los alimentos.
Las infecciones intrahospitalarias cada vez ms constituyen un serio problema de salud pblica, ya sea por su efecto sobre la salud de los pacientes, como por los costos que este problema implica. Esto hace, que en el pas se estn aunando esfuerzos para implementar sistemas de vigilancia, prevencin y control, orientados a enfrentar este problema. Por lo que el Medico debe basar su diagnstico en evidencias disponibles, como son los aspectos epidemiolgicos, y la importante contribucin del Laboratorio de Microbiologa, que adems de permitir el diagnstico etiolgico, orienta el manejo clnico teraputico del paciente.
El estudiante de Microbiologa de la Facultad de Ciencias Farmacuticas y Bioqumica de la Universidad Inca Garcilaso de la Vega, en el futuro ser el profesional Qumico Farmacutico y Bioqumico, quien con los conocimientos presentes en este manual estar en la capacidad de poder afrontar y resolver con criterio los problemas presentados ya sea en la Jefatura de Control de Calidad de una Industria Farmacutica Cosmtica, como en un Laboratorio Clnico Microbiolgico un Laboratorio Bromatolgico.
INSTRUCCIONES GENERALES
NORMAS DE BIOSEGURIDAD
PRINCIPIOS GENERALES
1. La seal internacional de riesgo biolgico debe colocarse en las puertas de los locales en que se manipulan microorganismos del Grupo de Riesgo 2,3,4. 2. En la zona de trabajo del laboratorio o aula de prcticas no se permitir al personal: comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicar cosmticos. 3. No pipetear con la boca. 4. Mantener el laboratorio limpio y aseado, retirando del mismo cualquier material que no tenga ninguna relacin con el trabajo. 5. Las superficies de trabajo se descontaminarn al terminar la prctica y en caso derramamiento de sustancias potencialmente peligrosas. 6. El personal de laboratorio y/o alumnos se lavarn las manos despus de haber manipulado material infeccioso, as como al abandonar el laboratorio. 7. Todos los procedimientos de siembra se practicarn de manera que no se produzca la formacin de aerosoles. 8. En el laboratorio se utilizarn obligatoriamente: mandiles, batas, uniformes u otras prendas apropiadas, esta no se llevar fuera del laboratorio. 9. Utilizar guantes en todos los trabajos con riesgo de contaminacin como sangre, material infeccioso o productos infectados. 10. Todos los derramamientos, accidentes y exposiciones reales o potenciales a material infeccioso se notificarn inmediatamente al profesor.
RECOMENDACIONES PARA EL MANEJO DEL MICROSCPIO
En microbiologa el manejo del microscopio es de gran ayuda para el reconocimiento de los microorganismos, por lo que es necesario conocer su correcto manejo. Las preparaciones coloreadas necesitan el uso de objetivos de inmersin, en las cuales se utiliza aceite de cedro en la interfase objetivo portaobjetos, el condensador prximo a la platina y el diafragma abierto para permitir una buena iluminacin. Antes y despus de su uso limpie los objetivos con papel para lentes.
DE CMO MANIPULAR LOS CULTIVOS Y EL MATERIAL CONTAMINADO
Siempre trabajar cerca de la llama de un mechero de gas o alcohol. Nunca dejar tubos ni placas destapadas. Colocar las placas Petri en posicin invertida para evitar que caiga el agua de condensacin la cual puede estar contaminada. Mantener los tubos con caldo en posicin vertical para evitar que se mojen los tapones. Abrir los tubos en forma adecuada, flamear la boca del tubo antes y despus de efectuarse el trabajo. No dejar el tapn del tubo sobre la mesa. Las placas deben ser cubiertas cuidadosamente para evitar que se contaminen. Esterilizar las asas de alambre antes e inmediatamente despus de usarlas. Si se ha empleado para trabajar un material que crepita como el caso del esputo, previamente al flameado introducir el asa en un frasquito de vidrio que contenga arena y alcohol. Nunca dejar asas sobre la mesa de trabajo sino en frascos especiales y en posicin vertical con el alambre hacia arriba. Aprender a usar las pipetas adecuadamente: para el trabajo bacteriolgico stas vienen estriles y envueltas en papel. Manipularlas exclusivamente por su extremo posterior, desenvolvindolas en el momento de usarlas. No quitar el algodn que llevan, por ser un elemento de proteccin para el que la usa. Emplear micropipetas para realizar la succin. No pipetear con la boca Eliminar pipetas, lminas y todo el material contaminado en un recipiente con solucin desinfectante. En caso de accidentes como, ruptura de una placa o un tubo con materiales infectante, contaminacin del mandil o de la mesa, etc. Durante el trabajo, avisar inmediatamente al profesor.
DE CMO TERMINAR EL TRABAJO DE PRACTICA
1. Todos los cultivos que se incuben deben tener las siguientes anotaciones: nombres iniciales de los estudiantes, nombre del microorganismo, grupo de prctica y fecha de siembra. 2. En caso de las placas, todas deben incubarse invertidas a menos que sean dadas instrucciones contrarias por el profesor. 3. Los tubos deben estar bien tapados y colocados en gradillas de metal. 4. Los alumnos se responsabilizarn de colocar estos cultivos en estufas a 37 por 24 horas C
TERMINADA LA PRACTICA, AL FINALIZAR EL TRABAJO
1. 2. 3. 4.
Limpiar la mesa de trabajo con algodn embebido en desinfectante. Comprobar que las llaves de gas estn cerradas. Lavarse prolijamente las manos con jabn germicida. Se llevar un cuaderno de laboratorio donde se apuntar todos los diagramas de flujo.
MATERIALES QUE DEBEN TRAER LOS ALUMNOS PARA LAS PRACTICAS
Dos pliegos de papel kraft (Por alumno). Un asa de siembra (Por alumno). Aguja de siembra (03 Unidades) (Por alumno). Papel Toalla y Encendedor a Gas (Por grupo de prctica). Jabn Germicida (Por Grupo de Practica). Desinfectante para limpiar las mesas trabajo (Por Grupo de Prctica). Plumn Marcador (Por alumno). Guantes para cada laboratorio (Por alumno). Mascarilla para cada laboratorio (Por alumno). Gorro para cada laboratorio (Por alumno). Mandil blanco (Por alumno). Baja - lengua (04 Unidades) (Por alumno). Torundas (04 Unidades) (Por alumno). Algodn industrial (No hidrfilo 500 gramos (Por grupo de prctica). Un rollo de pavilo (Por grupo de prctica).
SISTEMA DE EVALUACIN
Habr tres evaluaciones como se describe a continuacin:
1. La Primera Evaluacin es Escrita despus de la sexta prctica de Laboratorio. 2. La Segunda Evaluacin es Prctica, al finalizar las prcticas programadas. Comprender de un trabajo de campo y la elaboracin de un Protocolo de Anlisis Microbiolgico; y 3. La Tercera Evaluacin es la exposicin de sus respectivos resultados. Los temas del trabajo de campo y el orden de las exposiciones son las siguientes:
a. Microbiologa Clnica: Coprocultivo y Antibiograma. b. Microbiologa Clnica: Urocultivo y Antibiograma. c. Microbiologa Alimentaria: Anlisis Microbiolgico de productos lcteos Ejemplo: Leche, queso, etc. d. Microbiologa Alimentaria: Anlisis Microbiolgico de Salsas Ejemplo: Mayonesa, tomate, Mostaza, etc. e. Microbiologa en la Industria Farmacutica y/o Cosmtica: Monitoreo de Ambiente, Superficies y Personal. Ejemplo: Laboratorio N06 de la Facultad, etc. f. Microbiologa en la Industria Farmacutica y/o Cosmtica: Anlisis Microbiolgico de Envases. Ejemplo: Cpsulas, Tapas, Potes, Frascos, etc.
PONDERACIN DE LAS EVALUACIONES
1. Primera Evaluacin 2. Segunda Evaluacin: Protocolo de Anlisis Microbiolgico 3. Tercera Evaluacin: Exposicin de los Resultados
1A 1B 1C
PROMEDIO FINAL =
1A + 1B + 1C 3
TIPO DE CALIFICACIN: La calificacin es vigesimal, de cero a veinte.
PROTOCOLO DE ANLISIS MICROBIOLGICO
PROTOCOLO DE ANLISIS DE ENVASES O EMPAQUE
PROTOCOLO N
CDIGO DE ENVASE: FORMA: LOTE: FECHA DE ANLISIS:
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ENSAYO
ESPECIFICACIONES
RESULTADOS
TCNICA ANALTICA
ENSAYO MICROBIOLGICO
ESPECIFICACIONES
RESULTADOS
TCNICA ANALTICA
OBSERVACIONES: ------------------------------------------------------------------------------------FECHA: -----------------------------------------------------------------------------------------------------
ANALISTA
JEFE DE CONTROL DE CALIDAD
10
CONTROL MICROBIOLOGICO DE AMBIENTES
AREA: ________________
NANALISIS: ____________
MAPA DE PLAQUEO
A1 A2
Puerta de Ingreso
Leyenda: A1: Placa en el Piso A2: Placa sobre la mesa o equipo
FECHA: RESULTADOS:
_____________________ ___________________________________________________
OBSERVACIONES:___________________________________________________ ___________________________________________________________________
REALIZADO POR: ______________
VERIFICADO POR: _____________
Especificaciones:
Mximo 500 microorganismos viables permitidos
11
UNIDAD I: MICROBIOLOGA GENERALIDADES
12
PRACTICA N01 BIOSEGURIDAD, TOMA DE MUESTRA Y ACONDICIONAMIENTO DE MATERIALES.
Para trabajar en un laboratorio de Microbiologa se requieren tcnicas especficas y diferentes a las que se utilizan en otras disciplinas. Es imprescindible trabajar en condiciones aspticas: el material e instrumental que se va a utilizar, as como los medios de cultivo, deben ser sometidos con algunas excepciones (Caldo Selenito, Agar XLD) a procedimientos de esterilizacin, eliminndose de ellos posibles microorganismos contaminantes. Para mantener las condiciones de esterilidad, debemos trabajar en campana de flujo laminar o en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen. En el laboratorio, el trabajo con microorganismos suele realizarse utilizando cultivos axnicos o puros, es decir, que contienen organismos de una sola especie microbiana. La posibilidad de contaminacin est siempre presente porque los microorganismos se encuentran en todos los ambientes: en el aire, en el agua, en nuestra piel y, en general, en todo lo que tocamos. Para evitar las contaminaciones hemos de observar las siguientes normas: El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estriles. Los tubos o matraces deben ser tapados con algodn hidrfobo estril o cubiertos con un capuchn metlico, para impedir la entrada de microorganismos. Si se usan placas Petri deben mantenerse tapadas mientras no se estn manipulando. Los instrumentos que van a entrar en contacto con el medio de cultivo, con los distintos recipientes o con los microorganismos en estudio (asa de siembra, pipetas, etc.) deben ser previamente esterilizados.
MATERIALES EMPLEADOS Y FORMA DE USO ASA E HILO DE SIEMBRA: Antes de su utilizacin, se esterilizan sometindolos a la accin de la llama de un mechero hasta que el filamento quede incandescente, luego se flamear la parte inferior del filamento. Una vez utilizados, deben flamearse de nuevo para eliminar los microorganismos que quedan en ellos. PIPETAS GRADUADAS DE VIDRIO O PLSTICO Se suministran ya estriles a los alumnos, dentro de estuches metlicos o bien empaquetadas de forma individual (envueltas en papel Kraft o aluminio para mantener su esterilidad), en cualquier caso deben abrirse cerca de la llama del mechero. La pipeta, si es de cristal, y por lo tanto reciclada, debe flamearse ligeramente antes de ser usada. Las pipetas llevan un algodn en la boquilla, que acta como filtro, para evitar la contaminacin y para impedir la llegada de lquido al sistema de succin. Dicho algodn debe permanecer en la boquilla durante el uso. Bajo ningn concepto se debe pipetear con la boca una muestra microbiolgica. Para pipetear suspensiones de microorganismos se utilizan propipetas o bombillas que permitan controlar la succin y el dispensado de los lquidos o los dispositivos semejantes a jeringas en los que se coloca la pipeta y que operan por medio de un mbolo. Tambin se pueden utilizar micropipetas o pipetas automticas.
13
TUBOS DE ENSAYO CON CULTIVOS PROBLEMA Y PLACAS PETRI Se destapan cerca de la llama del mechero utilizando para ello slo los dedos que quedan libres en la mano que sostiene el asa de siembra. Se flamea la boca del tubo, se toma una pequea muestra del cultivo con asa de siembra estril, previamente atemperada, y tras flamear de nuevo la boca del tubo colocamos el tapn. Todo el proceso se realiza cerca de la llama. Si el medio es lquido, se debe agitar el tubo antes de tomar la muestra, porque los microorganismos tienden a sedimentar. En el caso de que el medio sea slido (tubos de agar inclinado y placas Petri), la muestra se obtendr rozando ligeramente con el asa la zona en la que se aprecia masa microbiana. Los tubos y las placas deben permanecer abiertos el menor tiempo posible con el fin de evitar contaminaciones.
INSTRUMENTOS PARA SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
A.- Asa de Siembra B.- Hilo de Siembra
C.- Pipeta de Pasteur. D.- Cayado.
PIPETAS A.- Pipeta automtica de 0,2 - 1mL. C-- Pipeta de vidrio de 10mL. B.- Pipeta automtica de 0,02 - 0,2mL. D.- Pipeta de vidrio de 1mL.
MANEJO DEL ASA DE SIEMBRA DURANTE UNA INOCULACIN
14
PROCEDIMIENTOS DE BIOSEGURIDAD
La BIOSEGURIDAD es una combinacin de procedimientos tcnicos uso de equipos, materiales e infraestructura que se debe practicar diariamente y que no debe olvidar el personal de laboratorio. Los procedimientos de BIOSEGURIDAD tienen por finalidad: PROTEGER: Al personal de laboratorio contra la exposicin innecesaria e injustificada a microorganismos infecciosos. EVITAR: La contaminacin de las muestras que puede echar a perder el trabajo del laboratorista con resultados falsos. MANTENER (Contencin): Los microorganismos infecciosos dentro del ambiente del laboratorio.
MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGOS Es IMPORTANTE conocer los tipos de microorganismos infectantes con los que trabajamos, para tomar las medidas de BIOSEGURIDAD respectivas. La capacidad infectante del microorganismo. Los modos de transmisin (por Ej: aerosoles). Si son prevenibles por medio de inmunizacin (vacuna contra la Hepatitis B, Fiebre amarilla, etc.). Si se dispone de medidas eficaces para el tratamiento contra el microorganismo infectante (por ejemplo: uso de Antibiticos).
Alerta de Riesgo Biolgico Alerta de Ondas Radiales Alerta de Peligro Txico
15
MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGO

MICROORGANISMO INFECTANTE RIESGO 1 Agrupa microorganismos que tienen escaso o nulo riesgo de provocar enfermedades Ej: Plasmodium, helmintos intestinales, etc. humanas. RIESGO 2 Agrupa microorganismos que pueden provocar enfermedades humanas de riesgo Ej: Entamoeba histolytica, Leishmania, moderado. Si provoca una infeccin al Salmonella typhi, Staphylococcus, etc. personal de laboratorio, sta tiene tratamiento y cura. RIESGO 3 Agrupa microorganismos que pueden Ej: Mycobacterium tuberculosis, Taenia provocar enfermedades humanas graves. solium, Yersinia pestis, etc. Tiene tratamiento, cura y se limita. RIESGO 4 Agrupa microorganismos que provocan Ej: Virus de la Inmunodeficiencia humana enfermedades graves en el ser humano. No (VIH), etc. hay tratamiento para su cura. GRUPO DE RIESGO
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
Grupo de Microorganismo Infectante Nivel de Bioseguridad Laboratorio Bsico RIESGO 1 Nivel de Bioseguridad 1. Ejemplos de Laboratorio Laboratorio de Enseanza. Laboratorio Universitario Equipos de Seguridad Ninguna.
Laboratorio Bsico. RIESGO 2 Nivel de Bioseguridad 2.
RIESGO 3
Laboratorio de Contencin. Nivel de Bioseguridad 3.
RIESGO 4
Laboratorio de Contencin Mxima. Nivel de Bioseguridad 4.
Slo mesas de Laboratorio al descubierto. Mesa de Servicio de Atencin Laboratorio al Primaria de Salud. descubierto o Cmara de Hospital de nivel Seguridad primario, diagnstico. Biolgica. Cmara de Seguridad Biolgica o Diagnstico Contencin Especial. Primaria para todas las actividades. Cmara de Seguridad Unidades Patgenas Biolgica Clase III o Ropa de Presin Peligrosas. Especial, Aire Filtrado.
16
LABORATORIOS BSICOS NIVELES DE BIOSEGURIDAD 1 y 2 Las Reglas Ms Importantes: Del Ambiente: Del Personal:
17
TOMA DE MUESTRA SANGUNEA
18
Recepcin de los pacientes Nombres y apellidos Tipo de muestra Tipo de anlisis
Recepcin de la orden de anlisis Toma de muestra Orina, sangre, otros
Preparacin del paciente para la toma de muestra
Colocar la ligadura, limpiar la zona de aplicacin, indicar al paciente que haga puo. Introducir la aguja
Aspirar, retirando suavemente el mbolo. El ingreso de sangre a la jeringa nos indicar que estamos en vena.
19
PRACTICA N02 MTODOS DE ESTERILIZACIN Y DESINFECCIN
En Microbiologa se define Esterilizacin como el proceso por el que se destruye o elimina de un objeto o de una sustancia todos los microorganismos vivos: virus, bacterias, esporas. La esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de esterilidad. OBJETIVO Conocer la importancia de la Esterilizacin y Desinfeccin familiarizarse con el manejo de los procedimientos ms frecuentemente utilizados para llevarla a cabo. MATERIAL Mechero Bunsen, horno, autoclaves, equipos de filtracin y materiales a tratar. TCNICAS El mtodo ms comnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre otras razones porque es el ms econmico y el ms fcil de controlar. El calor utilizado con este fin puede aplicarse en forma de calor seco o de calor hmedo. El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidacin y se requieren temperaturas muy elevadas. El calor hmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrgeno responsables de la estructura tridimensional de las protenas, haciendo que stas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad. En el laboratorio clnico, la esterilizacin y la desinfeccin se logra con los siguientes mtodos: Calor hmedo: Vapor saturado a presin, olla de presin, ebullicin, vapor fluente Calor seco: Horno de aire caliente, flameado. Desinfeccin intensiva por inmersin en productos qumicos: Leja. Desinfeccin por frotacin con un producto qumico. Filtracin.
MECHERO DE BUNSEN
20
CALOR SECO
FLAMEADO Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas, esptulas, etc. Consiste en someter directamente a la accin de la llama de un mechero Bunsen los utensilios que se vayan a esterilizar. Este mtodo es rpido y su eficacia es altsima, sin embargo no se puede aplicar a objetos termolbiles.
ESTERILIZACIN POR AIRE CALIENTE Se lleva a cabo en estufas de aire caliente y consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se contaminen una vez esterilizados, en el interior de un horno. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio: pipetas, matraces, tubos, etc. U otros materiales termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy elevadas (180C durante 2 horas). Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar lquidos (como medios de cultivo), ya que al llegar a los 100C comenzaran a hervir y continuaran hirviendo sin elevar su temperatura por encima del punto de ebullicin del agua a presin atmosfrica, y a esta temperatura las endosporas bacterianas pueden sobrevivir durante horas. Pero incluso en muestras en las que supisemos que no existen endosporas, esta metodologa puede implicar cambios en la concentracin de los componentes del medio, a causa de la fuerte evaporacin sufrida.
CALOR HUMEDO:
EBULLICIN: El agua hirviendo (100C) tiene accin limitada, ya que aplicada durante 10 20 minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados.
21
Se podra utilizar el bao Mara o bao de agua hirviente (slo con fines de desinfeccin en el laboratorio), cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros mtodos mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc.) como para medios de cultivo que no puedan esterilizarse en autoclave.
VAPOR FLUENTE Esta tcnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior a 100C sin que pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azcares, suero, etc. Se utiliza un autoclave a presin atmosfrica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100C, y se realiza el proceso durante tres das consecutivos, dejndose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100C) durante 30-45 minutos destruyndose en este proceso las formas vegetativas pero no las endosporas termorresistentes. Si stas se encuentran presentes en la muestra germinan despus del calentamiento y estas formas vegetativas sern destruidas en los siguientes ciclos. Este mtodo de esterilizacin se denomina tambin Esterilizacin Fraccionada o Tindalizacin.
VAPOR SATURADO A PRESIN La esterilizacin por esta tcnica utiliza vapor de agua saturado que se somete a una atmsfera extra de presin sobre la presin atmosfrica normal, elevndose con ello el punto de ebullicin del agua de 100C a 121C y consiguindose la destruccin de todos los microorganismos en un tiempo de 15 minutos. Esta temperatura es tambin necesaria para la destruccin de las endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia trmica y que pueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100C durante horas. El vapor de agua difunde por smosis a travs de las membranas de las esporas, coagulando su protoplasma, fenmeno que se acenta si el vapor es saturado y a sobrepresin.
22
Esta tcnica de esterilizacin requiere el uso del Autoclave. FILTRACIN Es el paso de un lquido o gas a travs de un material filtrante, con poros lo suficientemente pequeos como para retener clulas microbianas. Los filtros que se utilizan en la actualidad son, generalmente, los denominados filtros de membrana y estn integrados por pequeas piezas de material sinttico, generalmente Acetato de celulosa o policarbonato, que pueden tener poros con tamaos de 0,22 y 0,45 m, diseados para retener bacterias. La accin combinada de los poros, la trama del filtro y la naturaleza qumica del material utilizado retiene los microorganismos, pero no el fluido.
ELIMINACIN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO
En Microbiologa es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada limpieza del material. Asimismo, es muy importante la recuperacin del material reciclable y la eliminacin del material desechable. Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes adecuados, provistos de tapa. El material de vidrio, tubos, matraces y pipetas, se separa del resto del material recogindose en un contenedor vertical u horizontal lleno de una solucin desinfectante, como por ejemplo una solucin diluida de leja, en la que permanecer antes de su lavado durante 24 horas. Como los objetos contaminados contienen, con frecuencia, cantidades importantes de materia orgnica (procedente de los medios de cultivo) que protegen a los microorganismos de los agentes fsicos o qumicos utilizados en la descontaminacin de los mismos, no puede asegurarse la total destruccin de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por ello, se recomienda utilizar mayores concentraciones de desinfectante y tiempos ms largos de tratamiento que para la desinfeccin o la esterilizacin de material limpio.
23
Generalmente se utiliza el autoclave para la descontaminacin de instrumentos, equipos y material que sean estables al calor, as como de material desechable. A tal objeto se coloca este material en recipientes adecuados y se introducen en el autoclave sometindolos a la accin del vapor de agua a una atmsfera de sobrepresin (121 C) en ciclos ms prolongados de lo habitual (1 hora en lugar de 30 minutos). Una vez efectuado este tratamiento, se procede a su lavado para eliminar toda materia extraa, sumergiendo el material en agua caliente jabonosa o utilizando detergentes, mezcla sulfocrmica o cualquier otro procedimiento enrgico, tanto mecnico como qumico. Se aclara bien con abundante agua y se deja escurrir y secar a temperatura ambiente. En el caso de las pipetas, y antes de ser lavadas, debe extraerse con ayuda de un alambre o pinzas especiales, el trozo de algodn que tienen en la boquilla. Algunos de los objetos sucios y contaminados (portaobjetos, pipetas, etc), despus de lavados, se sumergen en una mezcla sulfocrmica donde se dejan 24 horas al cabo de las cuales se lavan con agua y se dejan escurrir. Los portas se secan con un pao de hilo limpio, procurando que no queden hilazas sobre la superficie. El material que contiene colorantes se trata, segn las condiciones del material, durante un tiempo variable con una solucin que puede ser de cido clorhdrico, ntrico o mezcla sulfocrmica. El resto del material (tubos de plstico, jeringas, etc) se trata con distintas soluciones desinfectantes como hipoclorito sdico, formol, etc, pero debe recordarse que se utilizan a concentraciones superiores a las utilizadas con otros fines.
24
MANEJO DEL AUTOCLAVE
PROCEDIMIENTO: Cerciorarse que el agua desionizada o destilada cubra la rejilla (aproximadamente 6 litros de agua). Colocar cuidadosamente en la bandeja el material a autoclavar (para el caso de placas colocarlas como si fuera a plaquear y para el caso de tubos se pueden colocar con sus gradillas); si es necesario utilizar las dos bandejas. Luego colocar encima de la bandeja la cubierta protectora. Bajar la tapa y colocar todas las manoplas, despus realizar en forma simultanea el ajuste de las mismas, en forma diagonal o en (cruz). Encender el equipo (llave principal pared) ON y posteriormente girar la perilla AUTOMATICO en HI y la perilla RELOJ hasta 50 minutos. Cuando el equipo se encuentre aproximadamente entre 90 C 100 C cerciorarse si por la espita ya no sale aire y que en su lugar salga VAPOR se puede corroborar colocando un pedazo de papel a la salida de la espita si se humedece entonces cerrar la espita. Simultneamente el equipo empezar a elevar la presin y cuando se encuentre entre 15 a 17 libras de presin, entonces girar la perilla AUTOMTICO a 3 para mantener la presin constante a partir de ese momento controlar 15 minutos (121C por 15 libras por 15 minutos). Terminado el equipo apagarlo y girar la perilla AUTOMTICO en OFF y la perilla RELOJ O y finalmente la llave principal pared OFF. Esperar que la presin comience a disminuir por si sola y cuando llegue a CERO entonces proceder a abrir por completo la llave de la espita, posteriormente aflojar las manoplas y retirarlas: como precaucin mantenerse atrs del autoclave para la apertura de la tapa (cuidndose del vapor). Retirar el material autoclavado.
25
DESINFECCIN INTENSIVA POR INMERSIN EN PRODUCTOS QUMICOS
DESINFECTANTES QUMICOS: Las frmulas de los productos desinfectantes presentan grandes diferencias. Es esencial, por lo tanto, que las diluciones se hagan de acuerdo con lo recomendado por los fabricantes. HIPOCLORITO DE SODIO: Es un agente qumico barato y fcil de adquirir, mata bacterias y virus. Tiene dos inconvenientes importantes: se deteriora y es corrosivo. CLORAMINA: Es ms estable que el hipoclorito de sodio. Sin embargo, debe protegerse de la humedad, la luz y el calor excesivo. Puede obtenerse en forma de polvo o de tabletas.
DESINFECCIN POR FROTACIN CON UN PRODUCTO QUMICO
La frotacin con un desinfectante adecuado es un procedimiento aceptable en el caso de superficies (mesas, etc.) y de salpicaduras de sangre. Cuando stas son visibles, se empezar por derramar desinfectante sobre la superficie; luego se retirar la mezcla de sangre y desinfectante. El hipoclorito de sodio (leja) es el desinfectante ms indicado.
AGENTES QUMICOS La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actan: - Concentracin: Vara con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma concentracin del agente puede producir un efecto diferente en distintos microorganismos. - Tiempo: Los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo. - PH: Afecta tanto a los microorganismos como a los agentes qumicos. Alcoholes Yodo Agentes catinicos, aninicos y anfteros rgano mercuriales
Antispticos
26
Desinfectantes y/o Esterilizantes
Cloro y compuestos clorados Aldehdos Oxido de etileno Compuestos fenlicos cidos y lcalis
CLASIFICACION DE DESINFECTANTES Basados en las diferencias existentes entre los desinfectantes en uso, se estableci tres niveles de accin microbicida, cuyo reconocimiento servir de fundamento para establecer los procedimientos de desinfeccin efectiva en cada laboratorio. Los trminos que se define son: alto nivel, nivel intermedio y bajo nivel de desinfeccin. A. DESINFECCIN DE ALTO NIVEL Algunos instrumentos o materiales no resisten la exposicin al calor y es necesario someterlos a desinfeccin utilizando agentes qumicos. Los desinfectantes de alto nivel se diferencian de los dems por su capacidad esporocida, siendo su principal desventaja el largo tiempo de exposicin que debe tener el material (hasta 24 horas). Este mtodo requiere de tcnicas de limpieza rigurosa para reducir al mximo la contaminacin microbiana de los instrumentos y eliminar residuos orgnicos que inactivan los desinfectantes. B. DESINFECCIN DE NIVEL INTERMEDIO Los desinfectantes de nivel intermedio no son capaces de destruir las esporas bacterianas, pero tienen la capacidad de inactivar el bacilo tuberculoso, que es ms resistente a los germicidas en solucin acuosa que las bacterias vegetativas comunes. Tambin son efectivos contra los hongos (esporas asexuadas, pero no siempre clamidosporas secas o esporas sexudas) y contra los virus con cubierta lpidica de tamao mediano y algunos virus sin cubierta lpidica de tamao pequeo. C. DESINFECCIN DE BAJO NIVEL Los desinfectantes de bajo nivel son aquellos que no tienen capacidad para actuar sobre las esporas bacterianas, el Mycobacterium tuberculosis, o los virus no lipdicos de tamao pequeo. Pueden ser tiles en la prctica por tener una accin rpida sobre las formas vegetativas comunes de las bacterias y varios tipos de hongos, as como sobre los virus de tamao mediano y con cubierta lipdica. Algunos de estos desinfectantes, a mayor concentracin, pueden elevar su accin microbicida al nivel intermedio, como los yodforos y fenoles. En cambi, otros no tienen esta propiedad.
27
CARACTERSTICAS DE ALGUNOS DESINFECTANTES
CLASE Glutaraldehdo Solucin Acuosa activada
CARACTERSTICAS Esporocida, bactericida, tuberculicida, txico, solucin activada inestable. Fecha de expiracin 14 das desde su activacin. Esporocida, sol. En uso estable hasta 6 semanas, txico para ojos y va oral, menos txico para piel. Escasa inactivacin por materia orgnica.
Perxido de Hidrgeno estabilizado
Formaldehdo + Alcohol Yodo + Alcohol
Esporocida, txico, voltil. Emanaciones nocivas. Accin rpida, corrosivo, inflamable. Irrita la piel, mancha Accin microbicida rpida, bacterianas y algunos virus inflamable. Seca e irrita la piel. excepto esporas resistentes. Voltil,
Alcohol
Compuestos de Cloro
Accin rpida, inactivado por materia orgnica. Corrosivo, irrita la piel. Estable, corrosivo, irritante para la piel. Escasa inactivacin por materia orgnica. Algo inestables, escasa irritacin de la piel. Corrosivo. Poco irritante, inactivado por jabn y compuestos aninicos, absorbido por telas. Soluciones diluidas o antiguas permiten el crecimiento de Bacterias Gram Negativas.
Compuestos de Fenol
Yodforos
Compuestos Amonio Cuaternario
Poco irritante, muy inactivadas por materia orgnica, Compuestos Mercuriales dbilmente bactericidas.
28
NIVEL DE AGENTES QUMICOS
Clase Glutaraldehdo Sol. acuosa Perxido de hidrgeno Formaldehdo + Alcohol Formaldehdo Sol. Acuosa Yodo + Alcohol Alcohol Compuestos de Cloro Compuestos de Fenol Yodo, Sol. Acuosa Yodforos Compuestos Amonio Cuaternario Hexaclorofeno Compuestos Mercuriales
Concentracin 2% 6 10% 8% + 70% 3 8% 0.5 1% + 70% 70% 0.1% 0.5 3% 1% 0.007 0.015%** 0.1 0.2% 1% 0.1% - 0.2%
Nivel de Actividad Alto Alto Alto Alto a Inter. Intermedio Intermedio Intermedio Inter. a Bajo Intermedio Intermedio Bajo Bajo Bajo
LAVADO DE MANOS PROCEDIMIENTO CORRECTO
1. Acercarse al lavatorio, sin permitir que el uniforme toque el lavadero durante el mtodo de lavado. 2. Qutese los anillos, reloj, pulsera o acostumbrarse a usar bien arriba de la mueca. 3. Abrir la llave del agua, regular el flujo (para que no se disperse) y temperatura (tibia). 4. Mjese las manos, tomar la pastilla de jabn, enjabonarse bajo el chorro de agua frotndose vigorosamente con el jabn las manos, muecas, hasta la parte media del antebrazo; manteniendo las manos bajas en relacin al antebrazo y codo, con las manos enjabonadas lavar la llave del agua. 5. Enjuagar el jabn y guardar sin tocar la jabonera. 6. Por medio del frotamiento enrgico produzca espuma, realizar frotamiento firme y movimientos circulares de: antebrazo, mueca, palmas, dorso, cada dedo, cada rea interdigital. Limpiar las uas, mnimo una vez al da antes de comenzar a trabajar. 7. Enjuagarse en sentido distal: antebrazo, mueca y manos; manteniendo las manos por debajo del antebrazo. Enjuagar la llave del cao al tocarla.
29
8. Repetir los pasos 4, 5 y 6 (volver a repetir segn el grado de contaminacin).
9. Enjuguese en sentido proximal individualmente dejando correr el agua de los dedos a la mueca y antebrazo, quedando con la mano y antebrazo por encima del codo. Con una toallita se secar con golpecitos suaves las manos muecas y antebrazos.
10. Cerrar la llave del cao.
30
CONCEPTOS BSICOS
Asepsia: Ausencia de microorganismos patgenos. Microorganismos Patgenos: Es causante de enfermedad. Contaminacin: Presencia de agentes infecciosos vivos en la superficie del cuerpo, prendas de vestir o artculos sucios (no constituye infeccin). Infeccin: penetracin y desarrollo o multiplicacin de un agente infecciosos en el organismo de una persona o animal. Enfermedad infecciosa: Enfermedad resultados de una infeccin. clnicamente manifiesta del hombre
Asepsia mdica: Normas ideadas para reducir el nmero de transmisin de microorganismos patgenos, ej: lavado de manos. Desinfeccin: proceso por el que se da muerte a microorganismos patgenos pero no necesariamente a sus esporas, aplicado sobre un objeto inanimado (inerte). Desinfectante: Sustancia empleada para la desinfeccin, ej: alcohol yodado, sabln. Antisepsia: Proceso de lisis o inhibicin del crecimiento bacteriano sobre la superficie de tejidos vivos. Antisptico: Sustancia empleada para la antisepsia. Por lo general su uso es inocuo en las personas ej: alcohol 70 agua oxigen ada. , Espora: Microorganismos que en determinadas circunstancias producen una especie de cpsula que le permite pasar por una fase de inactividad, que ms tarde en situaciones adecuadas recuperan su actividad, ej: Clostridium tetan, causante del ttanos. Limpieza: Es la remocin mecnica de toda materia extraa en el ambiente, en superficies y objetos utilizando para ello el lavado manual o mecnico. Normalmente se usa agua y detergente para este proceso. El propsito de la limpieza es disminuir el nmero de microorganismos a travs de arrastre mecnico y no asegura la destruccin de stos. Bactericida: Sustancia qumica que elimina todas las bacterias, patgenas y no patgenas, pero no necesariamente las esporas bacterianas. Bacteriosttico: Sustancia qumica que previene el crecimiento de bacterias, pero no necesariamente las destruye. En muchas ocasiones la diferencia entre bactericida y bacteriosttico nicamente depende de las condiciones de aplicacin: tiempo, temperatura, pH.
31
31
PRACTICA N03 MEDIOS DE CULTIVO: PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCIN
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras bacterias necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de cultivo varan segn las necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero todos han de cumplir los siguientes requisitos:
Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo que se siembra. Han de mantenerse estriles hasta el momento de la siembra. Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categoras: Fsicos y qumicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura, el pH y la presin osmtica; entre los requerimientos qumicos se encuentran el agua, las fuentes de carbono y nitrgeno, las sustancias minerales, el oxgeno y determinados factores orgnicos de crecimiento. Finalmente, una vez sembrados, deben ser incubados a la temperatura y condiciones adecuadas.
Requerimientos para el desarrollo bacteriano: Las bacterias pueden ser divididas en auttrofas y hetertrofos. Las primeras comprenden las bacterias del suelo y el agua que obtienen carbono y nitrgeno de la atmsfera y de la materia inorgnica simple. Las bacterias hetertrofas requieren compuestos orgnicos ms complejos como fuente de carbono y nitrgeno, as como protenas o sus derivados, tambin requieren carbohidratos y grasas. Este ltimo grupo de organismos es el ms importante en bacteriologa mdica. Protenas: Se suministran generalmente como peptonas que se encuentran disponibles en el comercio, preparadas por digestin parcial de carne con enzimas ppticas, consisten en polipptidos, dipptido y aminocidos. Carbohidratos: Suministran carbono para las sntesis, y adems su fermentacin libera energa utilizable en el metabolismo.
32
Factores accesorios de crecimiento: Son tambin requeridos por algunas bacterias. Entre ellos estn las vitaminas del complejo B (tiamina, cido nicotnico, piridoxina, botina). Estas sustancias son necesarias y las bacterias no las pueden sintetizar. Otros factores necesarios para algunas bacterias son obtenidos de nutrimentos ms complejos, como el suero, la sangre la yema del huevo, etc. Sales minerales: Elementos como potasio, sodio, calcio, etc. Tambin son requeridos por algunas bacterias en su desarrollo. Atmsfera: Microorganismos aerobios obligados, anaerobios obligados, anaerobios facultativos, etc. Presin osmtica: Las clulas pueden encogerse y ser destruidas (plasmlisis) en soluciones hipertnicas, inversamente, se rompen (plasmoptisis) por entrada de agua, en las soluciones hipotnicas. Temperatura: Para la mayora de bacterias patgenas del hombre la temperatura ptima de crecimiento es de 37C. Luz: La mayora de las bacterias desarrollan en ausencia de luz porque esta puede ser letal. Reaccin: La mayora de las bacterias crece mejor en un medio ligeramente alcalino (pH 7,2- 7,6).
OBJETIVOS Aprender a preparar, esterilizar y almacenar distintos tipos de medios de cultivo. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio, la mayora de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos slo la adicin de agua o la esterilizacin. Los medios de cultivo pueden clasificarse: a) POR SU CONSISTENCIA: 1. Medios Lquidos o Caldos: Son aquellos que contienen, disueltos en agua, los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos.
33
2. Medios Slidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les aade un agente solidificante. El Agar es un polisacrido complejo que se obtiene de algas rodofceas de origen marino cuyas propiedades son de gran utilidad en la preparacin de medios de cultivo slidos: No es degradado enzimticamente por los microorganismos (a excepcin de algunos microorganismos de ambientes marinos), funde aproximadamente a 100C y permanece en estado lquido mientras la temperatura no descienda por debajo de 45-50C. Adems, una vez solidificado se puede incubar a temperaturas elevadas sin que se lice. Generalmente el Agar se aade, para solidificar un medio lquido, en una concentracin del 1,5%. Los medios con Agar se envasan en tubo o en placa de Petri. 3. Medios Semislidos: Son similares a los medios slidos, pero la concentracin del agente solidificante es menor, generalmente del 0,4% con lo que, una vez solidificados mantienen una consistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para determinar la movilidad de los microorganismos.
b) POR SU COMPOSICIN 1. Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero no se conocen todos los componentes que forman parte de ellos, ni las concentraciones exactas de cada uno de ellos. Muchos de sus componentes proceden de la degradacin parcial de tejidos o productos animales, de plantas o de microorganismos que son fuente de aminocidos, azcares, lpidos, vitaminas y minerales. Ejemplos de dichos componentes son las peptonas o triptonas (protenas animales digeridas enzimticamente), el extracto de carne y el extracto de levadura. Como ya se ha mencionado, en estos medios suelen encontrarse azcares pero en muchos casos los medios complejos son suplementados con glucosa. Un ejemplo de medio nutritivo complejo es el caldo nutritivo, que contiene peptona y extracto de carne.
34
2. Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de productos qumicos puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas. As, un medio definido que permita el desarrollo de un microorganismo hetertrofo y "poco exigente", como E. coli, debera contener sales inorgnicas y fuentes de carbono y nitrgeno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H, glucosa y NH4Cl. Otros elementos esenciales, como hierro, manganeso y cobre, se encuentran generalmente presentes como contaminantes de los productos qumicos antes citados, en cantidades suficientes para el crecimiento.
c) POR SU UTILIZACIN: Muchos medios de cultivo utilizados en el laboratorio son medios generales en los que se pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos con distintos requerimientos nutricionales. Sin embargo, en algunas ocasiones, es necesario aislar a partir de una muestra un microorganismo que se encuentre en un bajo nmero y que pueda ser enmascarado por otros microorganismos presentes en un nmero ms elevado. En esos casos es recomendable utilizar medios de cultivo que ayuden a separar y diferenciar dichos microorganismos o que, de forma selectiva, favorezcan el crecimiento de alguno de ellos. Estos medios pueden ser:
1. Medios Selectivos: Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo determinado de microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los dems. Algunos de estos medios contienen un agente selectivo como antibiticos, productos qumicos, colorantes, etc. Entre los agentes selectivos podemos citar el cloruro sdico, que en concentracin elevada inhibe la mayora de los microorganismos excepto los microorganismos halotolerantes, como son los estafilococos, o la azida de sodio, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas al fijarse al hierro de la porfirina del sistema citocromo, permitiendo seleccionar los estreptococos, que carecen de este sistema, as como otros Gram positivos. SS AGAR
AMS De la misma manera, la bilis y sales biliares convierten los medios de cultivo a los que se aaden en selectivos para Salmonella ya que, adems de inhibir a los microorganismos Gram positivos, en concentraciones elevadas inhiben tambin a bacterias Gram negativas fermentadoras de lactosa. Los colorantes, como el verde brillante, inhiben selectivamente las bacterias Gram positivas, siendo tambin inhibidor para la mayora de las bacterias intestinales excepto para Salmonella.
35
Este colorante es la base del medio Agar Verde Brillante, utilizado para el aislamiento de Salmonella a partir de muestras fecales. Los medios selectivos pueden serlo tambin por su pH, as el Agar glucosado de Sabouraud ajustado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que las bacterias.
2. Medios Diferenciales: Son aquellos diseados para distinguir unos microorganismos de otros, a partir de una poblacin mixta, por la apariencia distinta que toman sus colonias. Estos medios de cultivo ponen de manifiesto propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee. Por ejemplo, los medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de manifiesto la degradacin de un nutriente especfico (generalmente un azcar) por el cambio de color que se origina cuando ste es metabolizado, como en el caso del medio CLED.
Agar Mac Conkey
Los medios diferenciales pueden ser adems selectivos, si se aaden agentes que inhiben el crecimiento de determinados microorganismos. En este caso va a ser posible distinguir diferentes tipos microbianos dentro del limitado grupo de microorganismos que pueden crecer. As, el medio EMB de Levine es selectivo para las bacterias Gram negativas por contener dos colorantes, eosina y azul de metileno, que inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas. EMB Es tambin un medio diferencial, porque distingue las bacterias que fermentan la lactosa (con produccin de cido) de las no fermentadoras. La formacin de cidos a partir de lactosa hace que ambos colorantes precipiten en la superficie de las colonias, que aparecen de color morado. En ciertas ocasiones, como ocurre en el caso de E. coli, las colonias presentan adems un brillo metlico. El Agar Mac Conkey es otro ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias no entricas; la fermentacin de lactosa con liberacin de productos cidos hace virar un indicador de pH incorporado en el medio.
36
PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
La preparacin de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercializacin de medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran ya mezclados en las debidas proporciones, siendo slo necesario la adicin de la cantidad correcta de agua destilada para disolver sus componentes. Cuando se prepara un medio lquido se debe disolver totalmente todos sus componentes en agua destilada. A continuacin el caldo se envasa en los recipientes adecuados (matraces o tubos), tapando los mismos y esterilizndolos. La preparacin de un medio slido puede hacerse de dos maneras: Preparar el caldo y aadir Agar al 1,5% o bien utilizar un medio slido comercial. Independientemente de la forma elegida para hacerlo, la preparacin de los medios de cultivo slidos requiere procedimientos especiales, ya que el Agar es insoluble en agua. Por ello, una vez aadida el agua, se debe calentar la mezcla hasta 100C, para permitir que el Agar se funda y quede incorporado al resto de los nutrientes disueltos. El medio fundido se dispensa en tubos o matraces, que se tapan y se esterilizan. Los medios slidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posicin vertical, si van a ser inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al solidificarse en esa posicin adopte la forma inclinada que proporciona una mayor superficie de siembra. Si se desean preparar placas de Petri, se utilizar el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un matraz y, una vez atemperado, se verter en placas vacas en un ambiente asptico, como el que proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo laminar. En algunas ocasiones, el medio de cultivo destinado a placas puede conservarse estril en tubos, que se fundirn al bao Mara cuando se vayan a preparar las placas. Si se han de incorporar al medio compuestos termolbiles, como vitaminas o antibiticos, se esterilizarn stos por filtracin y se aadirn al medio de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una vez que este se haya atemperado. En todos los casos se han de seguir las instrucciones del fabricante. La conservacin de los medios ya preparados puede hacerse a temperatura ambiente, pero es preferible conservarlos a 4C para retrasar su deshidratacin.
37
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
38
PRACTICA N04 COLORACIN GRAM Y COLORACIN BACTERIAS CIDO ALCOHOL RESISTENTES
La morfologa de los microorganismos puede examinarse de dos formas: observando microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando clulas muertas teidas con colorantes.
Klebsiella pneumoniae
El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas de sus caractersticas (morfologa, tamao, movimiento, etc). Sin embargo, las microorganismos vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fcilmente al microscopio ptico normal cuando se encuentran suspendidos en agua, de ah que se utilicen colorantes para incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de esta forma hacerlos visibles. Los colorantes pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
El Colorante es aquella sustancia que tiene la propiedad de comunicar color a otros cuerpos de cualquier naturaleza. De acuerdo a su Origen los colorantes pueden ser Naturales como por ejemplo el carmn o Artificiales como el cristal violeta. De acuerdo a su Composicin Qumica los colorantes pueden ser Bsicos como la fucsina bsica y cidos como el anaranjado de metilo y Neutros como el Wright o Giemsa. Algunos colorantes teirn mejor slo despus que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina Mordiente; un mordiente habitual es el Lugol. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante.
Cristal Violeta
Carmn
39
EL MICROSCOPIO El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo Actualmente existen dos tipos de microscopios: el ptico y el electrnico. MICROSCOPIO OPTICO Los microscopios de este tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamao original. El lmite lo tienen en unas 2000 veces. Las lentes de un microscopio ptico son el condensador, el objetivo y el ocular. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparacin y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posicin que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final. Los microscopios que se usan normalmente en microbiologa estn equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersin.
40
MICROSCOPIO ELECTRNICO
Los microscopios electrnicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les permite tener un poder de resolucin muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 750 nm; violeta - rojo). Es posible con el microscopio electrnico resolver objetos separados por una distancia de 0,003 m, comparado con los 0,25 m de uno ptico. Los aumentos pueden llegar a ser de un milln de veces. A causa de la naturaleza de este instrumento slo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. OBJETIVOS Ejecutar las tcnicas bsicas de coloracin. Interpretar los procesos de coloracin de las tcnicas estudiadas. Observas diferentes formas, tamaos y agrupaciones que permitan los microorganismos.
EXAMEN MICROSCPICO OBJETIVO Observar microorganismos vivos en el microscopio de campo claro. Estudiar su morfologa y agrupacin, apreciar las diferencias de tamao entre organismos procariticos y eucariticos y aprender a diferenciar el movimiento browniano de la movilidad de los microorganismos.
TCNICA Para la observacin de microorganismos sin teir se realiza el montaje hmedo. Depositar una gota de la muestra tomada con asa de siembra previamente flameada, en un portaobjetos y colocar sobre la misma un cubreobjetos presionando suavemente. Utilizar el microscopio con el objetivo de 40 aumentos, disminuyendo la cantidad de luz incidente sobre la muestra con ayuda del diafragma o bajando el condensador. Un exceso de luz dificultar la observacin de los microorganismos, ya que poseen el mismo ndice de refraccin que el medio circundante (el vidrio del portaobjetos y el lquido en el que se encuentran suspendidos). Para reducir la evaporacin de la muestra con el calor desprendido por el foco luminoso y que los microorganismos pierdan su movilidad, debe realizarse la operacin rpidamente o bien sellar los bordes del cubreobjetos con parafina. Observar la forma y el tamao de los microorganismos.
41
Describir su movilidad, diferenciando el movimiento browniano, debido a la colisin de los microorganismos con las molculas del lquido que los rodea, de la verdadera movilidad. La movilidad se manifiesta por el desplazamiento de los microorganismos a grandes distancias y en una direccin determinada, aunque a veces pueden apreciarse rotaciones o giros. Los desplazamientos cortos y sin sentido se deben al movimiento browniano.
GRAFIQUE LO OBSERVADO
10 Aumento MTODOS DE COLORACIN
40 Aumento
1. TINCIN SIMPLE: Aquella en la que slo se utiliza un colorante, que generalmente tie a los microorganismos. Este tipo de tincin se denomina directa. Si el colorante proporciona una coloracin al fondo, sin alterar el aspecto de las clulas, que permanecen sin teir, la tincin se denomina negativa. La tincin simple permite observar morfologa celular, tamao y agrupacin de los microorganismos. 2. TINCIN DIFERENCIAL: Es aquella que emplea secuencialmente dos colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en funcin de diferencias en su estructura y composicin qumica. La tincin de Gram y la cido-Alcohol-Resistente, basadas en las propiedades de la pared celular bacteriana, son las ms utilizadas.
42
TINCIN GRAM
3. TINCIN ESTRUCTURAL: Se utiliza para identificar y estudiar determinadas estructuras que pueden estar presentes en los microorganismos. En las tinciones estructurales se colorea nicamente una parte de la clula. Se utilizan este tipo de tinciones para poner en evidencia la presencia de cpsulas, endosporas, flagelos o inclusiones (almidn, polifosfato, etc.).
Tincin de Capsula
PROCEDIMIENTO GENERAL PARA TODA COLORACIN
En la mayora de los casos, los pasos a seguir son los que se indican a continuacin: EXTENSIN: Realizar una extensin con el asa de siembra esterilizada, para ello se toma una pequea gota de cada uno de los cultivos y se extiende en un portaobjeto limpio. Si el cultivo procede de un medio slido, se coloca una gota de agua o NaCl 0,9% en el portaobjeto y se mezcla con una pequea porcin de la muestra hasta formar una suspensin homognea, extendindola con el fin de obtener una fina pelcula. Posteriormente, se deja secar al aire o en la parte alta de la llama del mechero, pero no se debe eliminar el lquido calentando el portaobjetos a la llama porque pueden distorsionarse las clulas. TCNICA DE EXTENSIN DE UNA MUESTRA SOBRE PORTAOBJETOS
43
FIJACIN: La fijacin tiene como finalidad coagular el citosol de las clulas y hacer que se adhieran al portaobjeto, siendo el calor el mtodo ms utilizado para la fijacin, aunque pueden utilizarse otros agentes, como el alcohol (metanol) u otros compuestos qumicos. La fijacin con calor se recomienda cuando se trabaja con muestras de un cultivo slido; en muestras obtenidas de un cultivo lquido es mejor hacer la fijacin con metanol ya que se retienen en el portaobjetos un mayor nmero de clulas. Es necesario que la extensin se haya secado antes de proceder a la fijacin, por ello se debe esperar hasta que el lquido de la misma se evapore. La fijacin por calor se lleva a cabo pasando varias veces la preparacin seca a travs de la llama de un mechero, con la extensin hacia arriba. El calor desnaturaliza las protenas y suele matar al microorganismo. Es importante no excederse en este proceso, para evitar que las bacterias se deformen o se rompan, siendo suficiente que el portaobjeto se note caliente sobre el dorso de la mano, pero no demasiado. COLORACIN O TINCIN: Para ello es necesario cubrir la preparacin con abundante colorante y dejarlo actuar durante algn tiempo. Pasado ese tiempo, lavar con agua las preparaciones teidas para eliminar el exceso de colorante, dejando caer con suavidad el agua sobre un extremo del portaobjeto, que se mantendr inclinado durante este proceso. No se debe dirigir el agua con demasiada fuerza sobre la preparacin para no arrastrar la muestra. Eliminar el exceso de agua del portaobjeto golpendolo ligeramente por el extremo; este proceso debe realizarse con cuidado. Permitir que se seque la preparacin, bien utilizando un papel secante, sin frotar o bien dejndola secar al aire, aunque lleva ms tiempo. Examinar la preparacin al microscopio, con el objetivo de inmersin (100x), colocando, previamente, una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin.
TINCIN SIMPLE OBJETIVO: Estudiar las caractersticas de los microorganismos en cultivo, es decir: tamao, forma y agrupacin de las clulas. TCNICA Preparar extensiones de los distintos microorganismos, dejar secar al aire y proceder a su fijacin. Realizar la coloracin cubriendo la preparacin con abundante colorante y dejarlo actuar durante algn tiempo. Para el azul de metileno un minuto. Lavar con agua las preparaciones teidas y continuar con la tcnica tal y como se indica previamente. Examinar la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin. Observar la forma y disposicin de los microorganismos teidos con el colorante.
MUESTRA
44
EXTENSIN Y FIJACIN DE LA MUESTRA
TINCIN DE LA MUESTRA
(Medio Ambiente)
Tincin con Azl de Metileno
45
TINCIN DE GRAM Es uno de los procedimientos de tincin ms tiles en la identificacin de microorganismos, ya que divide a stos en dos grandes grupos: Gram positivos y Gram negativos. En 1884, Hans Christian Gram, un Mdico dans que laboraba en Berln, accidentalmente descubri un mtodo para teir y diferenciar bacterias. Empleaba cristal violeta como colorante y una solucin yodada potsica como mordente. Mientras examinaba preparaciones de tejido pulmonar de pacientes que haban muerto por neumona, descubri que el colorante era retenido por algunas bacterias y otras permanecan incoloras despus de lavar el frotis con etanol y agua. Clasific a las primeras como Gram-positivas y Gram-negativas a las segundas. Posteriormente Carl Weigert introdujo la modificacin por la cual se incorporaba safranina como colorante de contraste al mtodo facilitando la diferenciacin entre positivas (violeta) y negativas (rosa/naranja). 1. Un primer colorante bsico, generalmente cristal violeta, que se aplica sobre la muestra y que reacciona con las clulas (cargadas negativamente), colorendolas. 2. Un mordiente, que incrementa la afinidad entre el primer colorante y las clulas. Parece ser que el mordiente (solucin diluida de yodo) se combina con el colorante, para formar un compuesto insoluble coloreado en el interior de la clula. 3. Un agente decolorante, como el etanol de 95% o la mezcla alcohol acetona (1:1), que son disolventes orgnicos capaces de eliminar el primer colorante de algunas bacterias, decolorndolas. 4. Un colorante de contraste, igualmente de carcter bsico pero de distinto color que el primer colorante. Generalmente se suele utilizar la safranina, de color rosa, que contrasta con el color violeta del primer colorante, y que teir slo a las bacterias decoloradas en el paso anterior. Los organismos que resisten la decoloracin y retienen el complejo cristal violeta-yodo aparecern de color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivos. Aquellos que pierden el color inicial del cristal violeta tras la decoloracin, se clasifican como Gram negativos y toman el color rosa debido al segundo colorante, la safranina. Las diferencias qumicas en sus paredes celulares, son las que permiten o no la salida del complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram positivas tienen una pared celular gruesa, compuesta principalmente por peptidoglicano, mientras que en Gram negativas, aunque la pared est tambin constituida por pptidoglicano, es ms delgada y presenta adems una membrana externa con lipopolisacridos.
46
Las paredes de las bacterias Gram positivas tratadas con alcohol sufren una deshidratacin y sus poros se contraen, dificultando la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las Gram negativas, el alcohol desorganiza la capa lipdica ms externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglicano. La tincin de Gram es ms reproducible cuando se aplica a cultivos jvenes de bacterias, ya que las bacterias Gram positivas, en la fase estacionaria de crecimiento, pueden aparecer como Gram negativas. OBJETIVO Aprender una tcnica de coloracin diferencial e interpretar los resultados obtenidos en la misma, distinguiendo bacterias Gram positivas y Gram negativas. TCNICA Preparar extensiones de los distintos microorganismos, que debern encontrase en fase exponencial de crecimiento. Dejar secar al aire y proceder posteriormente a la fijacin, siguiendo la tcnica ya descrita. Para la coloracin se seguir el siguiente protocolo:
Equipo para realizar la tincin de gram Colorantes: Cristal Violeta, Lugol y Safranina. Solvente: Alcohol-Cetona. Puente de tincin. Asa bacteriolgica o hisopo. Piceta o Frasco lavador. Muestra bacteriana slida (agar), lquida (caldo) o especmen clnico.
Extensin y fijacin de la muestra
Despus de llevar la lmina al puente de tincin Cubrir la preparacin con Cristal Violeta por 60 segundos y enjuagar suavemente con agua destilada.
47
Cubrir la preparacin con Lugol por 60 segundos y enjuagar suavemente con agua.
Cubrir la preparacin con Alcohol-Cetona durante algunos segundos (5-10) y enjuagar suavemente con agua.
Cubrir la preparacin con Safranina por 30 segundos y enjuagar suavemente con agua. Secar y Observar en 100x (inmersin).
Es conveniente secar el exceso de agua en el frotis cuidadosamente con un pao suave o papel desechable para proceder a la observacin al microscopio empleando el objetivo de inmersin
Bacterias Gram Negativas
Bacterias Gram Positivas
48
TINCIN DE GRAM MORFOLOGA BACTERIANA
Estafilococos Grampositivos
Diplococos Gramnegativos
Estreptococos Grampositivos
Cocobacilos Gramnegativos
Bacilos Grampositivos
Espirilos
Levaduras
Espiroquetas
49
Diplococos Grampositivos
Vibrios
Cpsula
Esporas Otras Tinciones Bacteriolgicas Simple, que emplea un solo colorante Compuesta o mltiple como el Gram, Ziehl Neelsen Especial para visualizar algunas estructuras bacterianas: Gray para flagelos Argntica para flagelos Tinta China para cpsulas Anthony para cpsulas Albert para grnulos metacromticos Schaeffer-Fulton para esporas Fontana-Tribondeau para espiroquetas.
Bacilos cidos Alcohol Resistentes
50
51
COLORACIN DE BACTERIAS CIDO ALCOHOL RESISTENTES (BAAR)
Los microorganismos pertenecientes al gnero Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes Eubacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lpidos que la hace impermeable a los agentes hidroflicos, por lo tanto estos microorganismos no se tien adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloracin de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son teidas adecuadamente por el mtodo de Ziehl-Neelsen (Tincin cido-Rpida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solucin decolorante una mezcla de etanol y cido clorhdrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloracin cido-alcohlica y por eso se denominan Bacilos cido Alcohol Resistentes (BAAR). Los microorganismos del gnero Mycobacterium contienen una membrana citoplasmtica formada por una bicapa lipdica similar a las restantes Eubacterias. Por encima de esta membrana se encuentra el rgido Peptidoglicano que contiene N-glucolilmurmico en lugar de N-acetilglucosamina.
Por medio de una unin fosfodister, el peptidoglicano se halla unido covalentemente al Arabinogalactano, un polmero de arabinosa y galactosa. En la porcin ms distal y externa de los arabinogalactanos se hallan fijados los cidos miclicos que tienen cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los glucolpidos son un grupo de compuestos (micolatos de trealosa, sulfolpidos, micsidos, etc) que se encuentran asociados no covalentemente a los cidos miclicos y se ubican perifricamente en la pared. Los micolatos de Trehalosa (llamados factores de cordn porque su presencia produce cultivos que tienen forma de cordones serpenteantes) y sulfolpidos se encuentran principalmente en las cepas de Mycobacterias ms virulentas. El Lipoarabinomanano (LAM) es un compuesto que se halla anclado en la membrana citoplasmtica. El LAM es considerado como el equivalente Mycobacteriano del lipopolisacrido de las Gram negativas debido a que provoca una importante respuesta antimicrobiana en macrfagos.
52
En las cepas de Mycobacterias ms virulentas la arabinosa terminal del LAM est recubierta con residuos de manosa (manLAM) a diferencia de las cepas no virulentas no estn recubiertas (AraLAM). Adems, el LAM tambin podra servir como poro para el paso de los nutrientes a travs de la pared celular. En la pared celular tambin se encuentran protenas inmunoreactivas que son utilizadas con fines diagnsticos (PPD). El Mycobacterium tuberculosis es el agente etiolgico de la tuberculosis, una enfermedad que primariamente produce lesiones en los pulmones y que puede causar la muerte si nos es tratada en forma adecuada. Existen otras Mycobacterias capaces de producir infecciones en el hombre. El M. bovis tambin causa tuberculosis, mientras que las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no tuberculosas. La lepra es una infeccin causada por el Mycobacterium leprae que es un parsito intracelular obligado que se multiplica lentamente en clulas fagocitarias mononucleares como los histiocitos de la piel y en las clulas de Shwan de los nervios. La tuberculosis es una enfermedad de distribucin mundial pero con consecuencias devastadoras en los pases en desarrollo. En el ao 1993 la Organizacin Mundial de la Salud (OMS - WHO World Health Organization) declar a la tuberculosis una "Emergencia Global". Se estima que un tercio de la poblacin mundial est infectada con el M. tuberculosis, y que en la prxima dcada sern infectadas ms de 300 millones de personas de las cuales 90 millones desarrollarn la enfermedad y 30 millones morirn por ella.
Micrografa Electrnica del Mycobacterium tuberculosis
53
COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN FUNDAMENTO
La capacidad de formar complejos coloreados con los derivados de trifenilmetano que resiste la accin del etanol-cido (cido-alcohol resistente), es propiedad caracterstica de las Micobacterias. MUESTRAS
Expectoracin (esputo). Se requiere de 2 muestras. El envase debe ser de boca ancha y de material descartable. Tendr cierre hermtico (tapa rosca) para evitar aerosoles. Su capacidad ser de 30 50 ml y de paredes rotulables. Lavado Gstrico. Se requiere 3 muestras. Utilizar envases de 50 100 ml. Se extraer por sondeo gstrico bucal o nasal. Lavado Bronquial. Por Broncoscopa. Orina Se requiere 3 muestras. Recoleccin de toda la orina de la maana previa higiene. Envase 300 500 ml. Boca ancha. Lquido Cefalorraqudeo. Recoger la muestra sin anticoagulante en un envase estril. Se recomienda cultivar inmediatamente. Otros Lquidos de puncin y pus. Son lquidos recogidos en forma estril Se recomienda cultivar inmediatamente. OBSERVACIN DE LA MUESTRA
Toda muestra se debe procesar inmediatamente. Se puede conservar en refrigeracin (2-8C) durante 7 das. MATERIALES Microscopio. Laminas portaobjetos nuevos. Aplicadores o palitos de madera. Mechero. Lpiz para marcar vidrio. REACTIVOS Fucsina bsica Azul de metileno Fenol al 5% cido clorhdrico Alcohol de 95.
54
METODO 1
Nunca tome muestras de esputo dentro de la clnica o laboratorio. Es ms seguro tomar las muestras fuera de stos.
3
Las mascarillas quirrgicas no evitan el contagio de TBC!
4 AREA 1
Un espacio bien iluminado con un lavabo o tarja con agua corriente para preparacin y tincin de los extendidos,
5 AREA 2
Una mesa para microscopio; de no haber electricidad, esta mesa debe colocarse directamente enfrente de una ventana, y
6 AREA 3
Una mesa para registrar resultados y almacenar portaobjetos.
Recoleccin de muestras
8
Rotular los envases de las muestras sobre la mesa de trabajo. 9 Para una mejor deteccin de los bacilos de la tuberculosis, se recomienda tomar tres muestras. Por lo menos una debe ser la primera muestra de la maana.
55
10
11 Enumerar las lminas portaobjetos con un lpiz para marcar vidrio en el tercio proximal de la lmina. En los 2/3 distales se realizar el extendido.
Siempre lvese las manos con agua y jabn Despus de manejar muestras y recipientes. 12 Abra despacio el recipiente, esto evita La produccin de aerosoles. Dividir un aplicador de madera en dos Y tomar parte de la muestra eligiendo Aquella de caractersticas Mucopurulentas. Con el aplicador, extender la muestra Tomada sobre el portaobjetos con un Movimiento de vaivn hasta lograr un Equilibrio homogneo. 13 NO LOS FLAMEE para inducir el secado. Esto tambin produce aerosoles. Ya secos, fije los portaobjetos usando La llama azul de un mechero Bunsen. Con pinzas, y con el extendido hacia arriba, Pase brevemente el portaobjetos a travs De la llama 3 veces. 14 Colocar sobre el soporte de coloraciones La lmina fijada. Cubrir la totalidad de la Superficie del extendido con el colorante Fucsina bsica fenicada previamente filtrada. Flamear el frotis con la llama de un hisopo De algodn embebido en alcohol por tres Veces consecutivas, hasta que se observe La emisin de vapores. Se debe cuidar que El calentamiento sea suave y que no se Produzca la ebullicin del colorante. Si el Volumen del colorante disminuye se debe Agregar ms para cubrir el extendido. El Tiempo mnimo de coloracin con fucsina Es de 5 minutos. Un aplicador de Madera
Un Asa
56
15 Lave suavemente el colorante de Cada portaobjetos con agua corriente Fra hasta que toda la tincin libre Quede lavada. Siempre lave Suavemente de manera que el Extendido no se barra del portaobjetos. 16 Incline individualmente cada Portaobjetos para drenar todo el Exceso de agua. Esto evita que quede Agua remanente sobre el portaobjetos Que pueda diluir el prximo reactivo. Cubra cada portaobjetos con la Solucin decolorante, tal como Alcohol cido y mantngalo sobre el Portaobjetos durante 3 minutos. 17 Lavar con agua corriente y a baja presin. Cubrir el portaobjetos con la solucin de Azul metileno la que se dejar por un minuto 18 Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua.
19 Dejar secar a temperatura ambiente. Realizar la lectura en un microscopio con Lente de inmersin, leyendo de izquierda a Derecha un mnimo de 100 campos tiles Durante 5 minutos. Un campo til es Aquel que contiene elementos celulares De origen bronquial leucocitos, fibras Mucosas y clulas ciliadas.
20
Despus de examinar el portaobjetos detenidamente, Desmntelo cuidadosamente de la platina del Portaobjetos. Verifique otra vez el nmero de Identificacin del portaobjetos e inmediatamente Anote el resultado en el registro del laboratorio.
57
21
Antes de examinar el prximo portaobjetos, limpie El lente de inmersin con el papel para limpiar Lentes; esto evita la transferencia de organismos Que pueden crear una lectura falsa positiva.
INTERPRETACIN
Los bacilos cido alcohol resistentes (BAAR) aparecen teidos de rojo Sobre un fondo de azul claro.
INFORMES DE LOS RESULTADOS (-) (+) (++) (+++) No se encuentran bacilos cido alcohol resistente (BAAR) en 100 campos microscpicos. < 1 BAAR por campo en promedio, en 100 campos observados. De 1-10 BAAR por campo, en 50 campos observados. > 10 BAAR por campo, en 20 campos observados.
Si en un extendido se encuentra de 1 a 9 bacilos en 100 campos observados, observar 100 campos ms. Si persistiera igual, realizar otro extendido eligiendo otra zona de la misma muestra. Proceder segn los resultados encontrados.
22
Los bacilos de la tuberculosis Semejan delgados bastoncillos Rojos que resaltan contra el fondo Azul. Pueden ser un poco Encorvados granulados y Presentarse individualmente, en Pares o en grupos.
58
PRACTICA N05 ANLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO BACTERIANO SIEMBRAS OBJETIVOS Aprender a inocular distintos medios de cultivo contenidos en tubo: caldo, agar inclinado y medio semislido sembrado en profundidad. Observar el crecimiento bacteriano en los distintos medios de cultivo. Observar el crecimiento de microorganismos en ausencia de oxgeno. Comprobar la movilidad de determinados microorganismos.
MATERIAL Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur o pipetas graduadas, suspensin de microorganismos y tubos con medio de cultivo lquido, slido inclinado y semislido. TCNICA a) En medio lquido con asa: Transferir aspticamente, con el asa de siembra, una pequea muestra de los microorganismos, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estril. Sumergir el asa en el lquido y agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recin sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperatura ptima de crecimiento.
59
b) En medio lquido con pipeta: Introducir aspticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada en el medio lquido que contiene los microorganismos y, aspirando de forma adecuada, sacar una cantidad establecida de material que se transfiere al tubo con medio de cultivo estril. Incubar en estufa durante 24-48 horas a la temperatura ms adecuada.
c) En medio slido (agar inclinado): Con el asa de siembra estril tomar los microorganismos de la muestra e inocular el tubo realizando un movimiento de zig-zag en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el rea inclinada. Incubar en estufa durante 28-48 horas a la temperatura ms adecuada.
TRIPLE AZUCAR HIERRO
LISINA HIERRO AGAR
60
d) En medio semislido: La siembra en este tipo de medio, que contiene una proporcin menor de agar que los medios slidos y que se envasa en tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirndolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura. Una siembra con asa o con un cierto movimiento de vaivn podra originar un patrn de crecimiento que se interpretara errneamente como movilidad bacteriana. Incubar durante 24-48 horas a la temperatura ptima de crecimiento.
Prueba de Movilidad en Agar Semislido
1. Microorganismo Mvil 2. Microorganismo Inmvil 3. Tubo Control sin Inocular
61
RESULTADOS a y b) En los cultivos lquidos no tiene lugar la formacin de colonias, por lo tanto se examinar la existencia de enturbiamiento ms o menos intenso, la formacin de una pelcula o velo sobre la superficie, la aparicin de sedimento en el fondo del tubo, etc. La utilizacin de medios de cultivo lquidos permite la obtencin de una poblacin microbiana grande, con un elevado nmero de microorganismos, para ser utilizados posteriormente. GRAFIQUE LO OBSERVADO
c) En medio slido (agar inclinado) se observar el aspecto general del medio y la aparicin de crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Adems, se utiliza para almacenar cultivos durante cortos perodos de tiempo, a temperaturas de 4C.
d) En medio semislido se podr comprobar si el microorganismo es o no mvil, ya que en el primer caso se observar que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura, detectndose turbidez. Por eso es tan importante que, al inocular el medio de cultivo, no se distorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo por el mismo sitio de inoculacin. Los microorganismos inmviles crecern nicamente a lo largo de la picadura. Este tipo de siembra en picadura sirve, tambin, como otro de mtodo de conservacin de microorganismos anaerobios facultativos.
62
INOCULACIN DE DISTINTOS MEDIOS DE CULTIVO
DESARROLLO BACTERIANO EN CALDO DE CULTIVO
DESARROLLO BACTERIANO EN TUBOS CON AGAR INCLINADO
63
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS INTRODUCCIN En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos o puros. Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un slo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola clula; el crecimiento de sta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que recibe el nombre de colonia. Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin microbiana mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminacin, es decir, de microorganismos no deseados, dificult el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios slidos, complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriologa, permitiendo as la separacin fsica de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas. OBJETIVOS Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las tcnicas de aislamiento en placa de Petri. Obtener colonias separadas, utilizando uno o ms mtodos. Estudiar la morfologa de cada colonia.
MATERIAL Asa de siembra, cayado, placas de Petri con medio de cultivo slido y cultivo de microorganismos. TCNICAS Existen distintas tcnicas que pueden ser usadas: a) Extensin en superficie con cayado: Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota 0,1 ml de una determinada dilucin del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que est completamente seco. Incubar la placa, en posicin invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 72 horas) segn el tipo de microorganismo. La posicin invertida evitar que el agua de condensacin se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtencin de colonias aisladas. Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado.
64
EXTENSIN EN SUPERFICIE CON CAYADO
65
b) Estra mltiple en superficie: Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el agar. Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posicin invertida. Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado nmero de bacterias.
c) Dilucin en masa: En una placa de Petri vaca se deposita un pequeo volumen conocido de muestra y a continuacin se aade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a 45C. Se mezclan ambos por rotacin suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirn de forma homognea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar. Otra variacin de esta tcnica consiste en inocular el medio de cultivo, fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de la muestra. La homogeneizacin de la muestra y el medio de cultivo se realiza por rotacin del tubo entre las manos, antes de verterlo sobre la placa. En ambos casos, tras homogeneizacin, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posicin invertida). Aunque con esta tcnica se obtienen colonias aisladas, generalmente slo se utiliza para determinar el nmero de microorganismos viables en una muestra, cuando stos son anaerobios facultativos o microaerfilos.
66
INTERPRETACIN DE LAS TCNICAS DE SIEMBRA a) Extensin en superficie: Tras el perodo de incubacin se examinarn las placas. Las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha realizado de forma correcta. Podrn diferenciarse las colonias de acuerdo a su tamao, forma, color, textura, etc. Esta tcnica de siembra, adems de permitir que se distingan las colonias por su morfologa, permite el recuento de microorganismos viables. La expresin de este recuento se hace en unidades formadoras de colonias (UFC) ya que cada una procede de un slo microorganismo (o de un grupo de microorganismos, pues en algunos casos stos tienden a formar agregados). A partir de las colonias aisladas, los microorganismos pueden transferirse a otros medios de cultivo para su estudio.
b) Por estra mltiple en superficie: Tras la incubacin, se observarn las colonias aisladas en alguna regin de la placa inoculada. Con esta tcnica se logra la separacin de los microorganismos que se encuentran en un cultivo mixto, o bien que proceden de muestras homogneas, pero en las que existe un elevado nmero. En las zonas donde existen colonias aisladas se puede estudiar la morfologa colonial. c) Dilucin en masa: Aparecen las colonias distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que estn en la superficie tendrn distintas caractersticas, dependiendo del tipo microbiano, mientras que las colonias que se desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular, aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las colonias que aparecen en la profundidad del agar son siempre biconvexas y no se diferencian unas de otras por su morfologa.
67
ESTRA MLTIPLE EN SUPERFICIE
1
Seleccionar aro o aguja de siembra
Esterilizar el aro o aguja de siembra sometindolos directamente a la accin de la llama de un mechero Bunsen
68
DILUCIN EN MASA
ASPECTOS MS COMUNES DE LAS DIVERSAS COLONIAS MICROBIANAS AISLADAS SOBRE MEDIO SLIDO.
69
PRACTICA N06 METABOLISMO BACTERIANO INTRODUCCIN Los microorganismos durante la actividad metablica realizan una serie de acciones bioqumicas. De las diferentes reacciones obtienen la energa que se consume en sntesis, crecimiento y otras actividades. El objeto de esta prctica es hacer conocer al alumno algunas de las reacciones principales que se utilizan para reconocer, diferenciar e identificar los productos formados por microorganismos durante su metabolismo: cidos, productos de putrefaccin, toxinas, enzimas, etc. I. ACCIN SOBRE LOS HIDRATOS DE CARBONO Las bacterias pueden utilizar diferentes tipos de hidratos de carbono, desde polisacridos (almidn, celulosa) hasta monosacridos (pentosa xilosa, hexosa glucosa) produciendo diversos tipos y cantidades de cidos. La fermentacin de carbohidratos, se basa en que muchas especies de microorganismos actan sobre el substrato hidrocarbonato, produciendo la acidificacin del medio, el cual se detecta por cambio de pH (con el indicador) y la presencia de gas (CO2 e H2) por la presencia de burbujas o rotura del medio de cultivo. MATERIALES Cultivo de microorganismos en medio semislido con lactosa e indicador de pH, incubado a 37 . por 18 24 horas. C Cultivo de microorganismos en medio semislido con glucosa e indicador de pH, incubado a 37 . por 18 24 horas. C
PROCEDIMIENTO Observar los cultivos presentados y notar los cambios producidos en el medio de cultivo. Produccin de cidos y acetil metil carbinol a) Prueba del rojo de metilo Esta prueba es cuantitativa para la produccin de cidos formados por microorganismos que utilizan principalmente la va de fermentacin mixta, con produccin de cido lctico, formico, actico y mantiene el pH por debajo de 4,4, luego de una incubacin prolongada (48 72 horas) contrarrestando el sistema estabilizador del medio MR VP. Algunos microorganismos que degradan la glucosa, tienen la capacidad de formar ACETIL METIL CARBINOL (acetona).
70
La acetona es un subproducto neutro de la va del butilenglicol. En la practica se detecta la acetona utilizando hidrxido de potasio al 40%, el cual es presencia de oxigeno atmosfrico se convierte en DIACETILO y el alfa naftol acta como catalizador para revelar un complejo rojo. MATERIALES Cultivo de bacterias sembradas en tubo con medio MR VP. Reactivo de rojo de metilo. Reactivos de hidrxido de potasio y alfa naftol.
PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS a) Para la prueba de rojo de metilo, aadir en el cultivo de 48 72 horas, unas gotas del indicador pH que es el rojo de metilo, cuyo rango de viraje est entre pH 4,4 (ROJO) y pH 6,0 (AMARILLO). Prueba positiva: color rojo estable en la superficie del medio. Prueba negativa: Incoloro, amarillo o naranja. b) Para la prueba de Voges Proskauer, aadir al cultivo de 18 24 horas, 0.6 mL (12 gotas) de alfa naftol al 5% y 0,2 mL (4 gotas) de KOH al 40%. Agitar el tubo por un minuto y dejarlo en reposo por 15 minutos. Es esencial aadir los reactivos en el orden sealado. Prueba positiva: color rojo dentro de los 15 minutos (colocados en la mitad superior o en todo el tubo). Prueba negativa: ausencia del color rojo. Es importante que la lectura no se realice despus de una hora, porque los cultivos de VP pueden presentar un color cobrizo dando una interpretacin falsa positiva. II. ACCIN SOBRE LAS PROTENAS a) Produccin de sulfuro de hidrgeno (H2S) Su liberacin ocurre por la accin enzimtica de ciertos microorganismos sobre la peptona, polipptidos y aminocidos como la cisteina, metionina, cistina que contienen azufre. Para su comprobacin se puede hacer en medios slidos o semislidos a base de peptonas e indicador (acetato de plomo, por ejemplo) y en contacto con ste, se produce sulfuro de plomo, dando un precipitado de color negro, en la superficie y puntura de siembra. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS Observar los cultivos sembrados en agar peptona subacetato de plomo compararlos con el tubo de control. Prueba positiva: se manifiesta por la aparicin de un precipitado de color negro insoluble en la superficie y puntura de siembra.
71
b) Produccin de indol Ciertas bacterias tienen la capacidad de desdoblar la molcula de aminocido triptfano (presente en la peptona) mediante un complejo sistema de enzimas aminolticas dando lugar a cido pirvico, amonaco y metabolitos: Indol, escatol e indolactico, productos de putrefaccin. El indol se detecta en el medio observndose el desarrollo del color rojo (en forma de anillo) luego de aadir un reactivo que contiene pdimetilamino benzaldehido (reactivo de Ehrlich o Kovac). El alcohol amlico empleado como diluyente en el reactivo de kovac extrae suficientemente el indol del medio acuoso para producir una reaccin positiva.
MATERIALES Cultivo de la bacteria en caldo peptona. Reactivo de Kovac.
PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS Aadir 5 gotas del reactivo de Kovac por las paredes del tubo al cultivo de 18 24 horas. Prueba positiva: desarrollo de un color rojo vivo en forma de anillo en la superficie del tubo. Prueba negativa: se forma un anillo del color del reactivo.
III. HIDRLISIS DE LA UREA Muchas especies de microorganismos poseen la enzima ureasa, la cual acta hidrolizando la urea con la formacin de amoniaco y dixido de carbono. Estos reaccionan en solucin para formar carbonato de amonio que alcaliniza el medio. Este efecto se manifiesta debido a la presencia de un indicador de pH que es el rojo de fenol cuyo rango de viraje est entre pH 6,8 (amarillo) y 8,4 (rojo) incluido en el medio de urea de Christensen.
MATERIAL Cultivo de la bacteria sembrado en agar de urea de Christensen.
PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS Observar los cultivos sembrados en el medio de urea de Christensen, incubados a 37 . por 18 24 horas. C El carbonato de amonio producido en una reaccin positiva, confiere reaccin alcalina al medio, lo cual se demuestra por el viraje del indicador del pH (rojo de fenol) a rosado.
72
IV. UTILIZACIN DEL CITRATO
Algunas bacterias pueden obtener energa por va distinta de la fermentacin de hidratos de carbono, utilizando el citrato como nica fuente de carbono.
La prueba de utilizacin del citrato (en el medio de Citrato de Simmons) es positiva si hay viraje del medio hacia el color azl o si se nota desarrollo aunque no haya viraje de color.
MATERIAL
Cultivos de bacterias en medio de agar citrato de Simmons.
PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS
Observar los cultivos sembrados en agar citrato de simmons, incubado a 37 por C 18 -24 horas. Prueba positiva: color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio. Prueba negativa: no hay cambio de color ni crecimiento.
V. PRODUCCIN DE TOXINAS
Accin de la Hemolisina Algunos microorganismos elaboran una serie de enzimas y sustancias txicas que ayudan al poder invasivo por cuanto lesionan el mecanismo de defensa del husped. La actividad hemoltica de enzimas que actan en cultivos sobre placas de agar sangre y causan la lisis completa de los eritrocitos, se denomina: beta hemlisis y la que produce la destruccin parcial de los glbulos rojos: alfa hemlisis
MATERIAL Placa con bacteria beta hemoltica sembrada en agar sangre.
PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS Observar la presencia de beta hemlisis en el cultivo bacteriano sembrado en la mitad de la placa con agar sangre de carnero, con aclaracin total del medio alrededor de la colonia.
73
UTILIZACIN DEL CITRATO: Agar citrato de simmons
En la figura aparecen de izquierda a derecha: Tubo sin inoculacin de bacterias, resultado Negativo y resultado positivo a la derecha.
ACCIN DE LA HEMOLISNAS
74
ACCIN SOBRE LOS HIDRATOS DE CARBONO
TRIPLE AZUCAR HIERRO NUMERO DE TUBO 1 2 3 Desaminacin de los aminocidos (Reaccin alcalino + + + aerobio.) Fermentacin de la glucosa (Reaccin cida de menor + + importancia.) Fermentacin de la lactosa y/o de la sacarosa (Reaccin cida importante.) Produccin del H2S (color negro) + Gas C: tubo control
4 +
5 +
+ +
+ + +
75
LISINA HIERRO AGAR
NUMERO DEL TUBO Desaminacin de aminocidos (Reaccin alcalino aerobio.) Desaminacin de la Lisina (pico de flauta rojo oscuro) Descarboxilacin de la Lisina (Reaccin alcalino anaerobio.) Fermentacin de la glucosa (Reaccin cida) H2S C: tubo control
1 + +
2 + + +
3 4* + + + + + + +
76
PRODUCCIN DE INDOL
Producto de la degradacin Del Aminocido triptfano
PRUEBA DE LA UREASA
Detecta presencia de la Enzima ureasa
Hidrlisis de la urea libera Amoniaco
PRUEBA DE LA MOVILIDAD
Movilidad positiva Sin inocular Movilidad negativa
77
PRUEBA DEL ROJO DE METILO
Produccin de cidos a partir de la glucosa.
PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER
En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha.
Produccin del acetil-metilcarbinol acetona
Complejo rojo com alfa naftol y creatina.
78
REFERENCIA BIBLIOGRFICA
Microbiology. Davis B, Dulbecco R, Eisen H, Gisnberg H 4th Edition 1984. Harper & Row Pub. Microbial Life Perry J, Staley JT, Lory S. Sinauer Ass Publishers Inc. MA. 2002. Ecologa microbiana y Microbiologa ambiental Atlas R M, Bartha R Pearson Educacin. Madrid, 4a ed. 1998. Microbial ecology and infectious disease Rosenberg E ed. ASM Press. Washington . 1999. Biologa de los microorganismos. Brock T D, Madigan M T, Martinko J M, Parker J. 8 Ed, Prentice Hall Madrid, 1999. Zinsser. Microbiologa. Joklik W K, Willett H P, Amos D B, Wilfert C M. 20 edicin. Panamericana. 1996. Microbes in action: A laboratory Manual of Microbiology. Seeley H W, Vanderrmark P J, Lee J, Freeman W H. 4th edition 1991. General Microbiology. Schlegel H G 7th edition Cambridge University Press UK 1997. Bacteria in Biology, Biotechnology and Medicine. Singleton J. 3rd Edition Ed. Wiley & Sons, USA. 1995. Encyclopedia of Microbiology. Lederberg J. Academic Press, Inc. USA. 1992. Microbiologa en Prctica Vullo D L, Wachsman M B, Alch L E Editorial Atlante S.R.L. Buenos Aires, 2000. Introduccin a la Microbiologa Tortora G J, Funke B R, Case C L. Editorial Acribia SA, Zaragoza Espaa, 1993. Diagnostic Microbiology Koneman E W, Allen S D, Janda W M, Schreckenberger P C, Winn W C Jr. 5 th Edition, Lippincott, Philadelphia, 1997. Antibiotics in Laboratory Medicine Lorian, Victor Editor, Williams & Wilkins, Baltimore USA, 1980. Inmunologa e Inmunoqumica Margni R A, 5edicin Editorial Mdica Panamerican a 1996. Inmunologa. Fundamentos Roitt, I M, Delves, P J, 10a Edicin, Editorial Mdica Panamericana, 2003. Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica
MacFaddin 3ra Edicin, Editorial Mdica Panamericana, 2003.
79
ANEXO I: FLORA MICROBIANA DEL CUERPO HUMANO NORMAL
80
FLORA MICROBIANA DEL CUERPO HUMANO NORMAL Los seres humanos son bombardeados de forma constante por las miradas de microorganismos que ocupan el medio ambiente. Sin embargo, por fortuna los seres humanos no constituyen un hbitat favorable para la mayora de estos saprfitos porque deben competir con la flora comensal ya adaptada al medio humano. Los microorganismos que constituyen la flora normal deben superar las barreras para la colonizacin producidas por el flujo de jugos corporales, la depuracin mucociliar y mecanismos inmunitarios locales. Adems, la persistencia de varios microorganismos en sus nichos especficos puede depender de su unin a las clulas del husped en esas reas. La piel. Conjuntivas Nariz y nasofaringe. Boca y orofaringe. Tracto intestinal - Estmago e intestino delgado. - Intestino grueso. Tracto genitourinario - Genitales externos y uretra anterior. - Vagina. Sangre y tejidos. FLORA NORMAL PREDOMINANTE EN DIFERENTES SITIOS DEL CUERPO
SITIOS DEL CUERPO
Piel. Conjuntivas. Nariz y nasofaringe.
FLORA MICROBIANA
Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium, Propionibacterium, Micrococcus, Levaduras. Staphylococcus epidermidis. Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. S. epidermidis, Estreptococo no grupo A, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis, salivarius, Neisseria, Haemophilus, Veillonella, Bacteroides, Fusobacterium, Treponema, Lactobacillus, levaduras Lactobacillus, Streptococcus spp, Enterococcus, Veillonella, Actinomicetos, levaduras. Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Lactobacillus, Peptostreptococcus, Enterococcus, Enterobacterias. Corynebacterium, Estreptococos alfa y no hemolticos, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus, Lactobacillus, Mycobacterium smegmatis, Enterobacteriaceae, Bacteroides, Estril. Estril.
Boca y orofaringe.
Tracto intestinal: intestino delgado. Tracto intestinal: intestino grueso.
Tracto genitourinario. Sangre y lquido cefaloraqudeo. Tejidos, vejiga, tero y trompas de falopio, odo medio, senos paranasales.
81
INFECCIONES NOSOCOMIALES
SITIO DE INFECCIN Tracto urinario. Herida Quirrgica. Pulmonares. Bacteriemia primaria. Otras.
PORCENTAJE 40% 20% 10% 5 10% 20 25%
AGENTES MS COMUNES Escherichia coli, Enterococcus, Proteus, Klebsiella, Pseudomona aeruginosa. Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli. Klebsiella, Pseudomonas, Escherichia coli, Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacilos G (-) Staphylococcus aureus, Escherichia coli
CONDICIONES DIVERSAS QUE COMPROMETEN LAS DEFENSAS DEL HUSPED
Frmacos: inmunosupresores, antibiticos, anestsicos Alcoholismo Desnutricin Infecciones virales: influenza, sarampin, etc. Alteraciones de las barreras mucosas cutneas normales Procedimientos iatrognicos Prtesis: Catteres intravenosos, sondas vesicales Aparatos de asistencia respiratoria: nebulizadores, respiradores, etc.
82
ANEXO II: FUNDAMENTOS E INTERPRETACIN DE AGARES Y CALDOS
83
AGARES Y CALDOS
La preparacin debe cumplir con las exigencias indicadas por el fabricante. En el caso de medios comerciales se deben tener las caractersticas optimas (pH, control de esterilidad, vigencia). MEDIO DE TRANSPORTE
MEDIO DE CARY-BLAIR: FUNDAMENTO
Para la conservacin y transporte de muestras de microorganismos patgenos, como Salmonella, Shiguella, Haemophilus, Estreptococos, Corynebacterium, con considerable conservacin de la composicin de la flora de grmenes. La carencia de una fuente de nitrgeno impide considerablemente la multiplicacin de grmenes. La composicin del medio garantiza una supervivencia suficientemente larga de los microorganismos. El medio goza de anaerobiosis.
PREPARACION
Disolver 12 grs. por litro y distribuir hasta aproximadamente 7 cms de altura en tubos con tapn de goma o cierre de rosca. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121C, luego enfriarlos en posicin vertical. pH final = 7.4 2. USO
Utilizar para el recojo del material a estudiar un hisopo de algodn estril, eventualmente impregnado con una suspensin de carbn vegetal. Introducir el hisopo en el medio de transporte hasta la mitad de su longitud. Cerrar hermticamente el tubo y conservarlo en fri hasta su transporte. MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO
CALDO SELENITO PROPOSITO Y COMPONENTES DIFERENCIALES
El caldo Selenito se recomienda para el aislamiento de bacterias del gnero Salmonella en muestras como: heces, orina o aguas cloacales con abundante concentracin de mixtura bacteriana.
El selenito de sodio es inhibidor de E. Coli y de muchos otros coliformes, incluyendo cepas de Shiguella. REACCIONES E INTERPRETACION
Dado que los coliformes y otros organismos de la flora intestinal pueden en pocas horas superar el desarrollo de las especies patgenas, se recomienda subcultivar luego de 8 a 12 horas en Agar Salmonella-Shiguella o Sulfito de Bismuto. A las pocas horas de inocular la muestra, el caldo se enturbiar. Al sobrecalentar el Caldo durante la preparacin, se producir un precipitado visible que lo hace insatisfactorio para el uso. CORAZN (MEDIO BRAIN HEART INFUSION):
CALDO CEREBRO FUNDAMENTO
Este medio de cultivo se basa en el principio del caldo de Rosenow preparado con trozos de cerebro y es adecuado para el cultivo de muchas bacterias exigentes, como estreptococos, neumococos, meningococos y otros. El caldo cerebrocorazn es especialmente adecuado para el cultivo de estafilococos destinados al ensayo de la plasmocoagulasa y para la realizacin de hemocultivos. El rendimiento del caldo para grmenes anaerobios o microaerfilos resulta decisivamente mejorado por la adicin de pequeas cantidades de Agar. (Aprox. 0.05 0.2 % ) PREPARACION
Disolver 37 gramos por litro y esterilizar en autoclave (15 minutos a 121C) pH: 7.4 0.2. El medio es ligeramente parduzco y con aspecto claro.
AGUA DE PEPTONA: FUNDAMENTO
Para el enriquecimiento previo y no selectivo. Se usa especialmente en enterobacterias patgenas a partir de alimentos y otros materiales. El enriquecimiento previo en este caldo conduce a mayores concentraciones enterobacterias patgenas, en especial si existen bacterias ligeramente daadas. El Caldo es rico en sustancias nutritivas lo que provoca una alta cuota de sobrevivencia de bacterias ligeramente daadas y un crecimiento intenso.
REACTIVOS Composicin (1 litro)

Peptona de carne 10.0 gr. Cloruro sdico 5.0 gr. Cloruro sdico 5.0 gr. Tampn de fosfato 10.0 gr. PROCEDIMIENTOS
Sembrar el medio de cultivo con el material de muestra. Incubacin: Aproximadamente 18 hrs. a 37C. A continuacin se siembra en medios nutritivos de enriquecimiento selectivo.
CALDO DE TIOGLICOLATO: FUNDAMENTO
Para el cultivo y aislamiento de anaerobios estrictos y facultativos, de grmenes microaerfilos y para ensayo de esterilidad.
Las sustancias reductoras, tioglicolato y cistena, proporcionan una anaerobiosis suficiente, incluso para anaerobios exigentes. Debido a sus grupos sulfhidrlicos, son inactivados los compuestos de arsnico, mercurio y de otros metales pesados por lo que los medios con tioglicolato son adecuados para la investigacin de materiales que contengan materiales pesados. La elevada viscosidad del medio de cultivo impide la penetracin rpida de oxigeno. El eventual aumento del nivel en oxgeno se manifiesta por un viraje a rojo del indicador. REACTIVOS Preparar del medio comercial 29 gr por litro, distribuir en tubos, esterilizar en autoclave 15 minutos a 121C y a un pH = 7.1. 0.2 Los medios de cultivo varan de un color amarillento hasta parduzco. De ser posible, estos medios de cultivo deben usarse recin preparados. El medio no puede utilizarse cuando presenten una coloracin rosa en ms del tercio superior de la altura del tubo debido a la penetracin de oxigeno. Tampoco cuando dicha coloracin no quede eliminada por la ebullicin. PROCEDIMIENTOS DE SIEMBRA
El material objeto de ensayo se siembra en profundidad en el medio de cultivo. A continuacin puede superponerse una capa de aproximadamente 1 cm de altura de parafina estril.
INCUBACION
Varios das a temperatura segn requiera el germen a investigar. INTERPRETACION
Los grmenes anaerbicos crece en la parte inferior del tubo de cultivo. MEDIOS MEJORADOS DE AISLAMIENTO NO SELECTIVO
AGAR CHOCOLATE: FUNDAMENTO
La liberacin de hemoglobina por el hemate es producto de la accin del calor sobre el medio. El hemate lisado por el calor aporta al agar chocolate, el factor X (hemina o hematina) que es termoestable y el factor V (NAD Nicotinamida Adenina Dinucletido) termolbil, factores que potencian el crecimiento de algunos grmenes. PREPARACION
Para su preparacin se utiliza los agares base y sangre. Cuando los medios base se encuentren entre 60 a 80C, aadir la sangre y agitar frecuentemente manteniendo el medio de cultivo a aproximadamente 80C en bao Mara o estufa bacteriolgica durante unos 10 minutos hasta que adquiera un color pardo o achocolatado. UTILIZACION
Para el desarrollo de bacterias del gnero Neisseria, Haemophilus, cocos gram positivos, etc. INTERPRETACION COLONIA MICROORGANISMOS
Pequeas, grises, traslcidas, de bordes enteros o festoneados. A las 40 h visibles y opacos.
Neisseria gonorrhoeae
INTERPRETACION
COLONIA
MICROORGANISMOS
Pequeas, transparentes, puntiformes (como roco). Desarrollan alrededor de estra estafiloccica.
Haemophilus influenzae
Opacas, blanquecinas, a veces amarillentas y con bordes irregulares. Pueden encontrarse colonias mucosas. Neisseria. meninigitidis
Medio sin inocular
MEDIO BIFSICO (RUIZ CASTAEDA): FUNDAMENTO
Medio de cultivo que consta de 2 fases; una slida, la cual se deja solidificar en plano inclinado, despus del cual se agrega 30 ml de fase lquida.
PREPARACION
Se reparte en frascos estriles de 100 mL de capacidad. Inicialmente se aaden 25 mL de fase slida, la cual se deja solidificar en plano inclinado, despus del cual se agrega 30 mL de fase lquida.
PROCEDIMIENTO DE USO
Se usa generalmente para hemocultivos y mielocultivos. Se siembra 10 mL de sangre en forma asptica y se deja en incubacin de 15 a 21 das a 37 C segn sea el caso. Al cabo de 6 - 24 48 - 72 hrs., 4 7 - 15 y 21 das de incubacin se realizan subcultivos en Agar Sangre y Agar Mac Conkey. INTERPRETACION
Indican desarrollo bacteriano:

Presencia de turbidez, Hemlisis. Indicios de presencia de gas. Presencia colonias sobre la superficie slida.
AGAR MUELLER HINTON: FUNDAMENTO
Para el ensayo de la sensibilidad o para ensayos de resistencia de agentes patgenos mdicamente importantes frente a antibiticos. Se utiliza para la realizacin del ensayo de disco difusin en placas. La composicin de este medio de cultivo garantiza condiciones favorables de crecimiento y adems esta libre de antagonistas de sulfamidas. Para mejorar de forma considerable el crecimiento de microorganismos exigentes, puede aadirse sangre. Esto puede sin embargo conducir a resultados errneos en el ensayo de enterococos frente a aminoglicsidos.
AGAR NUTRITIVO CALDO NUTRITIVO
Medios universalmente utilizados para el cultivo de microorganismos poco exigentes. Se puede utilizar el caldo nutritivo como medio de enriquecimiento excelente para Listeria monocytogenes, aadiendo 0.05% de telurito potsico. EMPLEO E INTERPRETACION
Se orientan segn los fines de utilizacin previstos.
AGAR SANGRE: FUNDAMENTO

Producto preparado con un medio base completo de gran calidad nutritiva. El cultivo de microorganismos incluye los exigentes. El medio base puede ser agar columbia, agar mueller, agar tripticase soya y agar sangre base. Para la determinacin de los tipos de hemlisis es adecuado aadir sangre de carnero, recin obtenida y desfibrinada.
PREPARACION
Preparar cualesquiera de los medios base, esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121C. Dejar enfriar y cuando se encuentre entre 4550C incorporar de 5-8% de sangre desfibrinada. Mezclar y luego verter en las placas. Obtener un pH= 6.8. 0.2.
RESULTADO

Los medios ptimos son color sangre, no debe haber hemolizados. Se guardarn entre 2-8C. Las placas de agar sangre preparadas y listas para el uso son utilizables durante 3 meses como mximo. UTILIZACION
La siembra de las muestras biolgicas a investigar se realizan por diferentes mtodos Es este medio desarrollan casi todas las bacterias hetertrofas y se aprecia muy bien la hemlisis Alfa o Beta. INTERPRETACION COLONIA Blanquecina con halo verdoso estrecho Crateriforme con halo verdoso Blanquecino con halo transparente, 2 3 veces el dimetro de la colonia. Falta de hemlisis. MICRORGANISMOS Streptococcus viridans S. faecalis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Algunos S. faecalis y todo estreptococo hemoltico. S. Faecalis Estreptococos no patgenos.
AGAR TRIPTICASA SOYA: FUNDAMENTO
Este medio es generalmente utilizado con sangre otros medios enriquecidos para el aislamiento y cultivo de diversos microorganismos exigentes. Cuando se aade sangre, el medio es adecuado para determinar reacciones hemolticas. Cuando el medio es preparado para chocolate, soporta el crecimiento de bacterias del gnero Neisseria, Haemophilus y otros microorganismos. En una baja concentracin de oxigeno, bacterias del gnero Clostridium y de grmenes anaerobios no esporulados crecen.
MEDIOS DE AISLAMIENTO SELECTIVO AGAR MC CONKEY PROPOSITO Y MEDIOS DIFERENCIALES

El agar Mac Conkey es un medio diferencial para la seleccin y recuperacin de enterobacterias y bacilos Gram negativos entricos relacionados. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de bacterias gram positivas y de algunos Gram negativos exigentes. La lactosa es el nico hidrato de carbono. Las bacterias fermentadoras de lactosa forman colonias de diferentes tonos de rojo debido al viraje del indicador rojo neutro (rojo a pH < de 6.8) por la produccin de cidos mixtos. Las colonias no fermentadoras de lactosa aparecen incoloras o transparentes.
REACCIONES E INTERPRETACION

Los fermentadores fuertes de lactosa forman colonias rojas rodeadas de una zona de bilis precipitada, tales como: E. Coli, Klebsiella y Enterobacter. Los fermentadores dbiles o lentos de lactosa, tales como Citrobacter, Providencia, Serratia o Hafnia pueden formar colonias incoloras a las 24 horas o ligeramente rosadas a las 48 horas.
Las colonias de Proteus, Edwardsiella, Salmonella y Shiguella, con raras excepciones son incoloras o transparentes.
LACTOSA POSITIVO
LACTOSA NEGATIVO
AGAR MANITOL SALADO: FUNDAMENTO
Es un gran medio selectivo para la demostracin de estafilococos patgenos en alimentos y otros materiales. Debido a la concentracin extremadamente alta de sal, permite solo el crecimiento de microorganismos tolerantes a ella, entre otros, los del gnero Staphylococcus. La degradacin del manitol, con formacin de cido, est notablemente correlacionada con la patogenicidad del germen en cuestin y sirve, por lo tanto, como indicativo de la presencia de Staphylococcus aureus. PROCEDIMIENTO
La siembra se realiza en superficie, por estra. Debido al potente efecto inhibidor de este medio debe sembrarse masivamente. INCUBACIN
Hasta 3 das a 37 C. INTERPRETACION COLONIA Con halo amarillo luminoso y crecimiento intenso Sin cambio de color: Crecimiento leve, casi siempre MICROORGANISMOS Manitol positivo: Stafilococcus aureus. Manitol negativo: Staphylococcus epidermis y otros.
AGAR SALMONELLA SHIGUELLA (SS) PROPOSITO Y COMPONENTES DIFERENCIALES
El Agar es un medio altamente selectivo, que inhibe el desarrollo de la mayora de los coliformes y permite el crecimiento de especies de Salmonellla y Shigella en muestras ambientales y clnicas. La alta concentracin de sales biliares y citrato de sodio inhibe a todas las bacterias Gram positivas y a muchas Gram negativas, incluyendo las coliformes. La lactosa es el nico hidrato de carbono y el rojo neutro detecta la produccin del cido. El Tiosulfato de sodio es una fuente de azufre. Las bacterias que producen (H2S) se detectan, por el precipitado negro formado con el citrato frrico (relativamente insensible). REACCIONES E INTERPRETACION
Las colonias fermentadoras de lactosa se tornan rojas. Raras cepas de Salmonella (cepas de Arizona) fermentadoras de lactosa, pueden simular Escherichia coli. El desarrollo de especies de Salmonella traduce colonias incoloras con centro negro debido, a la produccin de H2S Las especies de Shiguella muestran Inhibicin variable y sus colonias incoloras no presentan ennegrecimiento.
SALMONELLA
AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD) PROPOSITO Y COMPONENTES DIFERENCIALES
Las sales biliares en concentraciones relativamente bajas, hacen a este medio menos selectivo que otros. Puede haber produccin de cido a partir de tres hidratos de carbono y el rojo de fenol es el indicador del pH Las cepas de Salmonella enteritidis, forman colonias iniciales amarillas por utilizacin de xilosa y colonias tardas rojas por descarboxilacin de lisina.
REACCIONES E INTERPRETACION
La Escherichia coli, especies de Klebsiella y Enterobacter pueden utilizar ms de un hidrato de carbono y formar colonias color amarillo brillante. Las colonias de muchas especies de Proteus son tambin amarillas. La mayor parte de Salmonellas forman colonias rojas, la mayora con centro negro por el gas H2S. Los gneros Shiguella y Providencia y muchas especies de Proteus no utilizan ningn hidrato de carbono y forman SALMONELLA colonias traslcidas. Las colonias de Citrobacter son amarillas con centro negro, las de muchas especies de Proteus son amarillas o traslcidas con centro negro; las de Salmonella son rojas con centro negro.
AGAR TCBS (AGAR SELECTIVO PARA VIBRIO): FUNDAMENTO
Las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato, as como el medio fuertemente alcalino, inhiben notablemente a las enterobacterias. La bilis del buey y el colato inhiben sobre todo, a los enterococos. Solamente algunas cepas de Proteus sacarosa positiva pueden formar colonias amarillas semejantes a la de los vibriones. El indicador mixto de azul de timol azul de bromotimol presenta un claro viraje a amarillo por la formacin de cido incluso en medio fuertemente alcalino. EMPLEO DEL AGAR Sembrar las placas en superficie, por estra, con el material objeto de investigacin o con el procedente de un cultivo de enriquecimiento. INTERPRETACION COLONIAS MICROORGANISMOS Vibrio cholerae Planas de 2 3 mm de dimetro, amarillas Vibrios tipo El Tor. Pequeas, con el centro Vibrio parahaemolyticus verde azulado Grandes amarillas Vibrio alginotycus Azules Pseudomonas, aeromonas y otros Diminutas, transparentes. Enterobacterias y otros.
TCBS Agar - Vibrio chol. eltor ogava
MEDIO DE CULTIVO LOWENSTEIN JENSEN: FUNDAMENTO
Para la demostracin y ensayo de resistencia de bacterias de la tuberculosis, segn Lowenstein modificado por Jensen.
PROCEDIMIENTOS DE SIEMBRA
Sembrar masivamente el medio de cultivo, por estra, en superficie. Cerrar hermticamente los tubos.
Mycobacterium tuberculosis
INCUBACION
Hasta las 12 semanas a 37C
INTERPRETACION
Al cabo de 10 a 14 das y despus semanalmente se inspecciona el medio de cultivo en cuanto al crecimiento de cultivos.
MEDIOS DE IDENTIFICACIN AGAR CITRATO DE SIMMONS: PRINCIPIO
La utilizacin del citrato por una bacteria se detecta en este medio mediante la formacin de subproductos alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, un anin, como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de amonio con produccin de amoniaco (NH3+), llevando a la alcalinizacin del medio por conversin del NH3+ en hidrxido de amonio (NH4OH). El azul de bromotimol es amarillo a un pH menor de 6 y azul a un pH mayor de 7.6.
TECNICA
Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario e inocularla en una sola estra en el pico del agar citrato. Incubar a 35C durante 24 a 48 horas. INTERPRETACION
El desarrollo de un color intenso en 24 a 48 hs. indica una prueba positiva y revela que el organismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formacin de productos alcalinos. La prueba es tambin positiva en ausencia de color azul s existiera un desarrollo visible de colonias a lo largo de la estra de inoculacin.
CITRATO NEGATIVO
La interpretacin positiva a partir del desarrollo en la lnea de siembra se puede confirmar incubando el tubo durante 24 horas ms, en que usualmente aparece un color azul. CITRATO POSITIVO
AGAR LISINA HIERRO (LIA): FUNDAMENTO
Agar de ensayo para la demostracin simultnea de lisina decarboxilasa (LD) y de la formacin de hidrogeno sulfurado (H2S) para la identificacin de enterobacterias, sobre todo de Salmonellas y Arizona. La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD positivas que la transforman en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH prpura de bromocresol, puesto que la descarboxilacin slo tiene lugar en medio cido (pH inferior a 6.0). Es necesario que se produzca previamente la acidificacin del medio de cultivo, por fermentacin de la glucosa. Este medio de cultivo solo puede utilizarse para la diferenciacin de bacterias que fermentan glucosa. Los microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubacin prolongada puede ocasionar alcalinizacin en la zona de la superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La formacin de H2S produce una coloracin negra debido al sulfuro de hierro producido.
PROCEDIMIENTOS
Este medio nutritivo se siembra con el cultivo puro sometido a ensayo, tanto por estra sobre la superficie inclinada como por puncin central en la columna vertical subyacente. INTERPRETACION
MICROORGANISMOS
COLOR DEL MEDIO DE CULTIVO
Arizona Salmonella Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus morgani Proteus rettgeri Providencia Citrobacter Escherichia Coli Shiguella Klebsiella
Columna Violeta Violeta Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Violeta
Superficie - inclinada Violeta Violeta Pardo rojizo Pardo rojizo Pardo rojizo Pardo rojizo Pardo rojizo Violeta Violeta Violeta Violeta
FORMACIN DE H2S
+ + + + + -
AGAR TRES AZUCARES HIERRO (TRIPLE SUGAR IRON AGAR TSI): FUNDAMENTO
La degradacin del azcar con formacin de cido se manifiesta por un cambio de color del indicador Rojo de fenol que vira de anaranjado rojizo a amarillo o por un viraje a rojo intenso en caso de alcalinizacin. El tiosulfato es reducido por algunos grmenes a cido sulfhdrico, el cual reacciona con la sal frrica produciendo sulfuro de hierro de color negro. INCUBACION
Hasta 48 horas a 37 C
INTERPRETACION
BACTERIAS SUPERFICIE FORMACIN De H2S + Solo en la parte superior de la columna vertical, frecuente formacin de anillo eventualmente slo al cabo de 48 horas.
VERTICAL S SG SG SG SG SG SG S SG SG SG SG** SG** SG** S (A) S/SG OA OA
INCLINADA OA OA OA OA OA OA OA OA SG SG SG SG** SG** SG** S (A) S/SG OA* OA*
S. typhi S. paratyphi A S. cholerae suis S. pullorum S. paratyphi B S. typhimurium S. enteritidis S. gallinarium Escherichia coli Citrobacter Klebsiellla Proteus vulgaris Pr. Mirabilis Pr. Morganii Pr. Rettgeri Kleb. pneumoniae Pse. aeruginosa Alcalige. faecalis
+ ++ + + + + + -
Columna No vertical Negra
Verde Negrusco Sucio
EXPLICACION DE LETRAS Y SIGNOS UTILIZADOS EN EL CUADRO A OA S SG + * ** *** = = = = = = = = = Viraje a rojo, por formacin de lcali
Sin alteracin del color original del medio de cultivo, o rojo por formacin de cido.
Viraje a amarillo, por formacin de cido Viraje a amarillo y formacin de gas. Ennegrecimiento, por formacin de H2O Ausencia de ennegrecimiento Eventualmente, tambin formacin de pigmento Muchas cepas eventualmente sin formacin de gas. Cultivado en Agar Kliger: OA

Microbiologia Materiales

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Microbiologia Materiales

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA

LIMA PER 2010

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

Dr. Q.F. HCTOR ALEXANDER VILCHEZ CCEDA DOCENTE DE MICROBIOLOGA

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

UNIDAD I: MICROBIOLOGA GENERALIDADES

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

ANEXO I: Flora Microbiana del Cuerpo Humano Normal

ANEXO II: Fundamentos e Interpretacin de Agares y Caldos

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

RECOMENDACIONES PARA EL MANEJO DEL MICROSCPIO

DE CMO MANIPULAR LOS CULTIVOS Y EL MATERIAL CONTAMINADO

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

DE CMO TERMINAR EL TRABAJO DE PRACTICA

TERMINADA LA PRACTICA, AL FINALIZAR EL TRABAJO

MATERIALES QUE DEBEN TRAER LOS ALUMNOS PARA LAS PRACTICAS

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

Habr tres evaluaciones como se describe a continuacin:

PONDERACIN DE LAS EVALUACIONES

TIPO DE CALIFICACIN: La calificacin es vigesimal, de cero a veinte.

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

PROTOCOLO DE ANLISIS MICROBIOLGICO

PROTOCOLO DE ANLISIS DE ENVASES O EMPAQUE

CDIGO DE ENVASE: FORMA: LOTE: FECHA DE ANLISIS:

OBSERVACIONES: ------------------------------------------------------------------------------------FECHA: -----------------------------------------------------------------------------------------------------

JEFE DE CONTROL DE CALIDAD

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

CONTROL MICROBIOLOGICO DE AMBIENTES

Leyenda: A1: Placa en el Piso A2: Placa sobre la mesa o equipo

REALIZADO POR: ______________

VERIFICADO POR: _____________

Mximo 500 microorganismos viables permitidos

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

UNIDAD I: MICROBIOLOGA GENERALIDADES

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

PRACTICA N01 BIOSEGURIDAD, TOMA DE MUESTRA Y ACONDICIONAMIENTO DE MATERIALES.

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

A.- Asa de Siembra B.- Hilo de Siembra

C.- Pipeta de Pasteur. D.- Cayado.

MANEJO DEL ASA DE SIEMBRA DURANTE UNA INOCULACIN

Mg. Q.F. HCTOR VILCHEZ CCEDA

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS Y BIOQUMICA

Alerta de Riesgo Biolgico Alerta de Ondas Radiales Alerta de Peligro Txico