Identificao de sementes de soja geneticamente modificadas, utilizando a tcnica de PCR convencional

HONNA, P.T. ; GIROTTO, L. ; SOLDERA, M.C.A. ; KANAMORI, N. ; MARCELINO-GUIMARAES, F. 4 3 4 C. ; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K ; Farias, J.R.B. . 1Universidade Estadual do Norte do Paran; 2Tcnica
JICA (Japan Internacional Cooperation Agency), Londrina PR.; 3Japan International Research Center for Agricultural Sciences - JIRCAS; 4Embrapa Soja Caixa Postal, 231, 86001-970, Londrina, Paran. e-mail: patrihonna@hotmail.com
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Introduo
A reao em cadeia da polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) uma tcnica in vitro que permite a amplificao de seqncias especficas de cido desoxirribonuclico (DNA). A PCR foi originalmente descrita por SAIKI et al.(1985) e desde ento tem sido utilizada em vrios campos da cincia. uma tcnica com alta especificidade e aplicabilidade, com centenas de mtodos descritos. A caracterstica mais importante da PCR a capacidade de amplificar exponencialmente cpias de DNA a partir de pouca quantidade de material. O passo chave na anlise gentica de plantas, atravs de fragmentos de DNA, o isolamento e a purificao de quantidades suficientes de DNA de boa qualidade, ou seja, o DNA obtido deve estar ntegro, livre de impurezas e ser passvel de amplificao (Milach, 1998). Tecidos maduros de muitas espcies de plantas contm compostos fenlicos envolvidos na defesa contra herbivoria, os quais podem interferir nos procedimentos de extrao de DNA inibindo a amplificao atravs de PCR. Estes compostos, frequentemente, esto ausentes ou encontram-se em baixas concentraes, em folhas jovens e em sementes ou plen (Mitton et al., 1979). A maioria dos mtodos de isolamento de DNA emprega detergentes na elaborao do tampo de lise. Eles auxiliam desde a solubilizao das membranas celulares at a desnaturao de protenas. Os mais utilizados so o brometo de cetiltrimetilamnio (CTAB) e o dodecil sulfato de sdio (SDS) com variaes de acordo com a espcie estudada e o tecido a ser utilizado para a extrao (Romano & Brasileiro, 1999). O objetivo deste trabalho foi detectar a presena do transgene em amostras de sementes provenientes de plantas geneticamente modificadas via Agrobacterium tumefaciens atravs da tcnica de PCR.

Material e Mtodos
O trabalho foi realizado no Laboratrio de Biotecnologia Vegetal da Embrapa Soja, durante os meses de fevereiro e maro de 2012. Sementes provenientes de plantas geneticamente modificadas, obtidas pelo mtodo de transformao via Agrobacterium tumefaciens foram coletadas e armazenadas em cmara fria at o momento da extrao. Para extrao de DNA foi utilizado um protocolo adaptado para sementes que emprega o detergente SDS com algumas modificaes. Foram extradas amostras de DNA de noventa e trs sementes e a identificao das amostras positivas foi realizada atravs de PCR convencional com primers especficos para a construo utilizada. Para a anlise foram utilizadas placas novas de PCR, DNA extrado a ser analisado, mistura da reao (gua destilada e autoclavada, Tampo para PCR 10X, dNTP, Primer Forward, Primer Reverse, Taq polimerase), termociclador 7300 Real Time System (Applied Biosystems, Foster, CA, USA), cuba e fonte para eletroforese, gel de agarose (1,2%; p/v) em tampo SB 1X e transiluminador (ultravioleta). Foram realizadas duas repeties de cada amostra de DNA, num total de cento e oitenta e seis reaes. A mistura de reao foi preparada para as 186 amostras de DNA e para trs controles, um controle positivo, um controle negativo e a ltima para o controle branco. O volume final da reao de PCR foi de 25l, sendo 22l da mistura de reao e 3l do DNA. Concluda a fase de amplificao, as amostras foram aplicadas em gel de agarose 1,2% submetendo o DNA a uma tenso eltrica (eletroforese) de 120V por 1 hora. Esse gel foi corado com brometo de etdio para permitir sua visualizao sobre luz ultravioleta e posterior anlise do DNA amplificado.

Componentes Tampo de reao 10X MgCl2, 50mM dNTP, 2mM Primer Forward

Volume (L) 2,5

Concentrao Final

Primer Reverse Taq Polimerase, 5U/L DNA (50-70 ng/L) gua destilada e autoclavada

Tabela 2. Condies do programa utilizado no termociclador para amplificar as reaes de PCR. Etapa Pr-ciclo Ciclos (35X) Temperatura 95C 95C 55C 72C Ciclo final 72C 4C Tempo 5 minutos 30 segundos 30 segundos 30 segundos 7 minutos

Resultados e Discusso
O protocolo executado permitiu a identificao de 48 sementes positivas, confirmadas nas duas repeties.

Figura 1. Eletroforese em gel de agarose 1,2% identificando as sementes positivas.

Concluses O protocolo de extrao utilizado e a tcnica de PCR foram eficientes na identificao de sementes geneticamente modificadas positivas.

Referncias
MILLACH, S.C.K. Marcadores moleculares em plantas. Porto Alegre: S.C.K. Millach,1998. 141p. MITTON, J.B.; LINHART, Y.B.; STURGEON, K.B.; HAMRICK, J.L. Allozyme polymorphism detected in mature needle tissue of Ponderosa pine. Journal of Heredity, v.70, n.2, p.86-89, 1979. ROMANO, E.; BRASILEIRO, A.C.M. Extrao de DNA de plantas. Biotecnologia, v.2, n.9, p.40-43, 1999. SAIKI, R.K., SCHARF, S., FALOONA, F., MULLIS, K.R., HORN, G.T., ERLICH, H.A.; ARRRHEIM, N. Enzymatic amplification of B-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230:1350-1354, 1985.