CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA CLAE (HPLC)

ELAINE LOPES
JULHO/2012

INTRODUO A CROMATOGRAFIA LQUIDA

CROMATOGRAFIA

Vem do grego CHROMA, que significa COR

Vem do grego GRAPHE, que significa ESCREVER

Mtodos cromatogrficos, de uma forma geral, permitem a separao, quantificao e identificao de espcies qumicas, ENTRETANTO a Cromatografia Lquida uma tcnica de separao de grande resoluo, mas no identifica com preciso o composto.

INTRODUO A CROMATOGRAFIA LQUIDA

Entre as vantagens desta tcnica Diversidade de suas aplicaes;

Desvantagens custo dos equipamentos, tempo para formao de um tcnico ; Uma expresso usada que os tempos de reteno so caractersticos, porm no so exclusivos. Emprega-se outras tcnicas espectrometria de massas, espectrometria de infravermelho ou ressonncia magntica;

INTRODUO A CROMATOGRAFIA LQUIDA

Princpio da Tcnica

Separao pela distribuio destes componentes em duas fases que se

encontram em contato;

Durante a passagem da fase mvel pela estacionria, os componentes da

mistura so seletivamente retido pela

fase estacionria;

A reteno seletiva pode operar por mecanismos entrpicos e entlpicos.

CROMATOGRAFIA LQUIDA
Tipos

Cromatografia Lquida Clssica colunas de vidro; Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) ou High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) auxlio de uma bomba de alta presso;

CROMATOGRAFIA LQUIDA
Classificao pelos mecanismos de separao

Adsoro-Cromatografia Lquido-slido Competio pelos stios ativos da fase estacionria; Partio-Cromatografia lquido-lquido Baseada nas diferenas de solubilidade dos componentes; Troca inica Diferentes tendncias dos componentes inicos da amostra a permutar com os ons da fase estacionria;

Excluso Os componentes so separados conforme o tamanho efetivo das

molculas.

CROMATOGRAFIA LQUIDA
Definies

Cromatografia em Fase Normal

Fase Mvel APOLAR Fase Estacionria POLAR Exemplo uso de slica gel com hexano ou diclorometano.

Fase Mvel

Fase Estacionria

Cromatografia em Fase Reversa

Fase Mvel POLAR Fase Estacionria APOLAR Exemplo: uso de slica gel modificada (C18) com metanol/gua.

CROMATOGRAFIA LQUIDA
Definies

Tempo de Reteno de A (Tra) Amostra introduzida no sistema at o ponto mximo do

pico da amostra.

Tra = tr-to

Fator de Capacidade (K) de A Velocidade com que um dado composto migra ao longo da coluna. Ka = Tra-to

Tempo morto(to) Amostra no retida na coluna; Tempo de reteno da fase mvel.

Resoluo Medida quantitativa da separao de dois picos consecutivos. OBS: Quando R = 1,5 separao completa; Quando R = 1,0 os picos esto somente 90% resolvidos.

CROMATOGRAFIA LQUIDA
Definies

Figura: Resoluo entre dois picos.

CROMATOGRAFIA LQUIDA
Definies
Eficincia da coluna Nmero de pratos tericos (N); Quanto maior o valor de N MAIOR a eficincia da coluna;

Exemplos de Eficincias de Colunas:

CROMATOGRAFIA LQUIDA
Aplicabilidade Alimentos Cosmticos Frmacos

HPLC
Polmeros
Corantes Aminocidos, etc.

SISTEMA CROMATOGRFICO
Esquema Bsico do Aparelho

O sistema cromatogrfico composto de:

Reservatrio e sistema de Bombeamento da Fase Mvel (Solvente ou Solventes) Sistema de Introduo da Amostra Sistema Analtico (Coluna Cromatogrfica Fase Estacionria) Sistema de Deteco Sistema de Registro e Tratamento dos Dados

SISTEMA CROMATOGRFICO
Bombas cromatogrficas Aspectos Importantes

Presso mxima de operao, fluxo, reprodutibilidade e constncia do fluxo;

Todo solvente deve ser filtrado e desgaseificado; Deve apresentar resistncia a lquidos corrosivos, a facilidade de troca de fase

mvel e a limpeza do sistema;

importante o estudo do manual da bomba;

SISTEMA CROMATOGRFICO
Introduo da Amostra (Injeo) Aspectos Importantes

Preciso das medidas Reprodutibilidade com a qual as amostras podem ser

introduzidas na coluna.
Injeo Manual pouca repetibilidade; Injeo Automtica maior repetibilidade;

SISTEMA CROMATOGRFICO
Detectores Aspectos Importantes
Podem ser universal ou seletivo; Os detectores seletivos so compatveis com eluio em gradiente e so usados

quando se quer minimizar interferentes;

Sensibilidade a razo entre o sinal gerado e a quantidade de amostra que produziu o sinal; Rudo a variao do sinal que no atribudo amostra; Linearidade deve-se guardar uma relao linear com a concentrao da amostra; Estabilidade o detector deve ser indiferente as variaes de temperatura e fluxo.

SISTEMA CROMATOGRFICO
Detectores Tipos

Ultra Violeta
Seletivo Detecta a quantidade de luz UV absorvida;
Proporcional a concentrao da amostra; relativamente insensvel as mudanas de fluxo e de temperatura

ndice de Refrao
Universal Detecta a diferena de ndice de refrao entre a soluo e o solvente empregado; Menor sensibilidade do que detectores de UV; No h destruio da amostra; Muito sensvel a mudana de temperatura e presso.

Fluorescncia
Mais sensvel Compostos que fluorescem;

Massas
Combina sensibilidade, versatilidade e universalidade alto custo

17

CROMATOGRAMA

Identificao dos picos

SISTEMA CROMATOGRFICO
Colunas Aspectos Importantes

Em todo sistema cromatogrfico a coluna o corao do sistema;

Segmento de tubo de ao inoxidvel; Dimetro uniforme; Capaz de resistir a altas presses; Paredes internas finamente polidas; O ao inoxidvel o material mais usado.

SISTEMA CROMATOGRFICO
Colunas Aspectos Importantes

A capacidade da coluna Comprimento, dimetro e material de empacotamento. Dimetro interno de cerca de 0,45 micra para separaes analticas e na faixa de 2,2 micra para preparativas; O comprimento varivel, sendo comuns colunas analticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. O tamanho e a configurao das partculas variam segundo a aplicao cromatogrfica.

Estas partculas geralmente so de slica ou

alumina e podem ser recobertas com outras substncias.

As partculas devem ter a menor variao de

dimetro possvel.

SISTEMA CROMATOGRFICO
Colunas Aspectos Importantes

Quanto maior o tamanho da partcula porosa mais lento o processo de difuso;

Em consequncia, mais lenta a transferncia de massa entre a fase estacionria e a fase mvel. Conforme diminui o tamanho da partcula a profundidade dos poros diminui, permitindo obter anlises rpidas, sem perda na eficincia.

SISTEMA CROMATOGRFICO
Colunas Fase Normal x Fase Reversa

Fase Normal
Fase estacionria polar Slica, alumina, grupo amino(-NH2), grupo nitrilo (-CN); Fase mvel relativamente apolar (Ex. hexano, ter isoproplico); O componente menos polar eludo primeiro; O componente mais polar eluido depois;

Fase Reversa
Fase estacionria no polargrupos octil (C8H17), octadecil (-C18H37); Fase mvel relativamente polar (gua, metanol,acetonitrila). O componente mais polar eludo primeiro; O componente menos polar eluido depois;

SISTEMA CROMATOGRFICO
Colunas Aspectos Importantes

Slica gel

Figura: Estrutura da slica gel mostrando um possvel poro da partcula

SISTEMA CROMATOGRFICO
Colunas Aspectos Importantes
Slica gel

Figura: Diferentes formas de ligao entre molculas de gua e os grupos silanis da superfcie

SISTEMA CROMATOGRFICO
Registro e Tratamento de Dados
Registrar ou manipular os dados obtidos
Registrador; Computador

Vantagens do Computador
Aumentar a versatilidade, exatido e preciso; Processar os dados; E tambm controlar parmetros de anlise.

SISTEMA CROMATOGRFICO
Registro e Tratamento de Dados

FASE MVEL
Caractersticas dos Solventes

Os solventes devem possuir:

Alto poder de solubilizao das amostras;

Baixa reatividade; Compatibilidade com o detector utilizado; Baixa viscosidade; Altssimo grau de pureza (Grau HPLC); Exemplos de solventes

FASE MVEL
Importncia e recomendaes para uma separao cromatogrfica

Verdadeiro motor das separaes cromatogrficas;

Deve ser livre de impurezas; Recomenda-se sua filtrao e sua desgaseificao antes do uso; Armazenamento em garrafas de vidro;

A gua um solvente comum na CLAE. Entretanto, esta deve ser purificada. Sua armazenagem em tambores plsticos no recomendada.

FASE MVEL
Tipos de Eluio

Isocrtica quando se mantm a composio da fase mvel constante;

Programao de gradiente quando altera-se a composio da fase mvel durante a execuo da anlise.

PARMETROS DE ANLISE
O que usar??
Antes de desenvolver um mtodo, preciso definir alguns parmetros:
Qual coluna?
Qual fase mvel? Qual detector?

PARMETROS DE ANLISE
Como definir??
A regra bsica :
Fase Estacionria com polaridade semelhante amostra e uma Fase Mvel de

polaridade diferente;
Se o analito apresentar na sua estrutura parte polar e apolar Usar coluna de fase

reversa;
Comear a eluio com uma fase mvel com alto poder de eluio:
Fase Normal 100% diclorometano, metanol ou clorofrmio; Fase Reversa 50 a 100% de metanol ou acetonitrila em gua;

Obs: Nestas condies todos os componentes devem eluir no volume morto.

PARMETROS DE ANLISE
Como definir??
Incio da eluio:
Fase Normal 100% diclorometano, metanol ou clorofrmio; Fase Reversa 50 a 100% de metanol ou acetonitrila em gua;

Para aumentar a reteno, adicionar:

Fase Normal Hexano ou Heptano; Fase Reversa Aumentar a porcentagem de solvente mais fraco (H2O)

PARMETROS DE ANLISE
Como melhorar a eficincia da separao??
Baixar o fluxo; Trocar a coluna;

Reduzir a concentrao da amostra e/ou volume da amostra.

Obs: A amostra deve ser filtrada e solvel na FM.

PARMETROS DE ANLISE
Ajustes necessrios
Fazer uma limpeza prvia na amostra usando um cartucho de extrao de slica ou

fase reversa;
O uso de uma pr-coluna tambm recomendado; Sempre correr um branco antes de comear a analisar a amostra; A escolha do detector deve ser feita considerando se a amostra contm grupos cromforos;

PARMETROS DE ANLISE
Anlise com gradiente de eluio Quando usar??
Vantagens:
Anlises mais rpidas; Melhora na separao; Maior simetria dos picos.

DEFININDO OS PARMETROS DE ANLISE

Exemplo 1
Mistura contendo 5 componentes; FM: Hexano; Eluio: Isocrtica (tempo de anlise longo); Picos largos no final do cromatograma; E o 5 componente no saiu.

DEFININDO OS PARMETROS DE ANLISE

Exemplo 2
Mesma mistura contendo os 5 componentes do exemplo anterior;

FM mais forte: Diclorometano;

Eluio: Isocrtica; O 5 componente foi eludo; Tempo de anlise reduzido;

Perda de resoluo entre os picos 1 e 2, 3 e 4

DEFININDO OS PARMETROS DE ANLISE

Exemplo 3
Mesma mistura contendo os 5 componentes dos exemplos anteriores;

Empregou-se um gradiente de eluio resoluo dos picos foi resolvida;

FM: 100% de Hexano at a eluio do 2 pico; A partir da, adio de DCM a uma taxa de 2%/min;

Composio final da FM 100% DCM.

CUIDADOS, MANUTENO E RESOLUO DE PROBLEMAS

Amostras:
Obter sempre o MXIMO de informaes sobre a amostra;
Sempre filtrar! Testar a solubilidade com a fase mvel;

Sempre que possvel, usar a FM para dissolver a amostra

CUIDADOS, MANUTENO E RESOLUO DE PROBLEMAS

Fase Mvel:
Usar SEMPRE solventes grau HPLC;
Filtrar a FM; Usar filtro no reservatrio da FM; Evitar o uso de solventes alcalinos em colunas

base de slica;
FM com pH < 2 pode provocar o rompimento da

ligao Si-C

CUIDADOS, MANUTENO E RESOLUO DE PROBLEMAS

Para desenvolvimento, usar solvente de um mesmo fabricante at o final da pesquisa; Causa: altera o Tr, pode parecer uma dobra de pico, interferncia no sinal, etc.

CUIDADOS, MANUTENO E RESOLUO DE PROBLEMAS

Utilizao de um solvente do fabricante B necessita de uma etapa de purificao Remoo de contaminantes coluna de alumina

CUIDADOS, MANUTENO E RESOLUO DE PROBLEMAS

Colunas:
Deixar a coluna equilibrar com a FM;
Nunca deixar a coluna exposta a fontes instveis de radiao trmica; Evitar queda da coluna;

Controlar a presso do sistema.

CUIDADOS, MANUTENO E RESOLUO DE PROBLEMAS

No deixar que o leito da coluna seque; Antes de usar uma coluna nova, avaliar sua eficincia;

Guardar a coluna no solvente adequado;

Nunca guardar uma coluna com solues-tampo ou solventes halogenados; Fechar as conexes da coluna.

CUIDADOS, MANUTENO E RESOLUO DE PROBLEMAS

Mudanas em parmetros T e P durante uma anlise influenciam a resposta do detector ;

Impurezas produzem a diminuio da resposta do detector e interferncia;

Limpeza da clula do detector:
Passar solvente pelo sistema sem coluna;

Pode-se usar HNO3 6 N, MeOH, ACN, clorofrmio e hexano

Pisos achatados solues concentradas resposta do detector no linear

CUIDADOS, MANUTENO E RESOLUO DE PROBLEMAS

Bombas:
Mudanas bruscas de presso do sistema pode ser consequncia de

vazamento, bolhas, etc.;

Verificar miscibilidade dos solventes; Exemplo: Uma FM com gua mudando

para hexano;
Fase mvel deve ser filtrada.

CUIDADOS, MANUTENO E RESOLUO DE PROBLEMAS

O que causa perda de resoluo?
Componentes fortemente retidos na coluna;
Coluna fisicamente danificada; Perda de eficincia da coluna;

Coluna com sobrecarga de amostra.

CUIDADOS, MANUTENO E RESOLUO DE PROBLEMAS

O que causa diminuio do Tr?
Perda de stios ativos da coluna;
A coluna pode ter sido m regenerada; Contaminantes podem estar adsorvidos na coluna. na coluna

O que causa aumento do Tr?

Fluxo baixo; Solvente com baixo poder de eluio. na coluna

CUIDADOS, MANUTENO E RESOLUO DE PROBLEMAS

O que causa alargamento na forma do pico?
Fora inica da FM pode estar muito baixa;
Adsoro da amostra; Perda de fase ligada baixa eficincia;

Sobrecarga de amostra.

GRADIENTE ADEQUADO
Resoluo

Inadequado Solvente forte em todo cromatograma

Inadequado no incio Solvente A muito forte e causa uma eluio rpida

Inadequado no final A troca do solvente A por B no foi suficientemente forte e causa uma eluio rpida

GRADIENTE ADEQUADO
Resoluo
O que fazer para aumentar a resoluo?
Diminuir a fora do solvente;
Se for FN diminuir a polaridade; Se for FR aumentar a polaridade;

Diminuir as condies iniciais;

Aumentar o tempo do gradiente; Dobrar o fluxo.

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

CROMATOGRAMAS
Exerccios de Fixao

Obrigada pela ateno !

CONTATOS e-mail: nanequimica@gmail.com celular: (21) 9346-9809