Biotecnologia

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ENTREVISTA
EDUARDO MARTINS, presidente do IBAMA
Entrevista concedida a Lucas Tadeu Ferreira e Maria Fernanda Diniz Avidos
Constituio de 1988 foi um passo determinante para a formulao da poltica ambiental brasileira. Pela primeira vez na histria de uma nao, uma constituio dedicou um captulo inteiro ao meio ambiente, dividindo entre o governo e a sociedade a responsabilidade pela sua preservao e conservao. Em 22 de fevereiro de 1989, como resultado desse avano no panorama ambiental brasileiro, nasceu o Ibama - Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis. Resultado da fuso de quatro rgos: a Secretaria de Meio Ambiente - SEMA, o Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal - IBDF, a Superintendncia do Desenvolvimento da Pesca - SUDEPE e a Superintendncia do Desenvolvimento da Borracha - SUDHEVEA, esse Instituto foi criado para solucionar os problemas ambientais do pas. Misso quase impossvel, na viso do atual Presidente do Ibama, Eduardo Martins, j que alm de sua enorme dimenso territorial, o Brasil o detentor da maior biodiversidade do Planeta. Hoje, de forma bem diferente da origem, a preocupao focar e delimitar a atuao do Ibama na poltica ambiental brasileira nas reas de responsabilidade do Governo Federal, o que significa zelar pela qualidade ambiental do mar territorial, dos rios federais e do sistema de unidades de conservao (parques e reservas florestais), alm de controlar o trnsito nos aeroportos, para evitar a entrada de produtos ou empreendimentos que possam gerar problemas ambientais. Em entrevista concedida revista BIOTECNOLOGIA, Cincia & Desenvolvimento, no dia 14 de maio, Eduardo Martins falou sobre as prioridades de atuao do Ibama na poltica ambiental brasileira. Alm dos instrumentos de fiscalizao e controle, sistematicamente utilizados pelo Instituto para reduzir os riscos nossa biodiversidade, ele destacou que os instrumentos econmicos tambm tm importncia fundamental para o xito das aes preservacionistas. Esses instrumentos esto inseridos dentro do que se convencionou chamar de "protocolo verde", uma tentativa de fazer com que a atividade econmica interaja com a questo ambiental. O melhor aproveitamento dos recursos biolgicos da Amaznia, de forma sustentada, tambm uma meta do Governo Federal para os prximos anos. Um passo decisivo nesse sentido foi a criao do Centro de Biotecnologia da Amaznia que, em breve, estar iniciando suas atividades em Manaus, com um corpo tcnico altamente capacitado e especializado. Outro ponto ressaltado pelo Presidente do Ibama foi a educao ambiental. Segundo ele, o problema ambiental, inclusive o amaznico, deveria ser encarado como dever de casa por todos os brasileiros. Esses e muitos outros pontos interessantes, como a polmica "biopirataria" e a nova Lei das Penalidades e Sanes Ambientais, que confere ao Ibama mais autoridade para fiscalizar e punir os crimes contra a natureza, foram abordados por Eduardo Martins durante sua entrevista. Alis, a preocupao com a questo ambiental sempre norteou a vida desse paulista, nascido em So Jos do Rio Preto. Graduado em Cincias Biolgicas pela Universidade de Braslia - UnB e mestre em ecologia, pela mesma Universidade, Eduardo teve sua carreira voltada para assuntos ambientais, especialmente da Amaznia, desde 1983, quando trabalhou no Projeto Rondon para Assuntos da Amaznia. De l para c, ele atuou como pesquisador no Museu Paraense "Emlio Goeldi", Diretor do Ncleo de Estudos e Pesquisas do Instituto de Meio Ambiente do Acre , Coordenador do Programa Brasil do WWF - Fundo Mundial para a Natureza e do GTA - Grupo de Trabalho Amaznico, alm de Secretrio-Adjunto da Secretaria de Meio Ambiente da Presidncia da Repblica. importante ressaltar que essa a segunda passagem de Eduardo Martins pela Presidncia do Ibama - a primeira foi no perodo de 1990 a 1992. Por toda a sua experincia no cenrio ecolgico, vale a pena conferir a entrevista, e conhecer as medidas que o Governo Brasileiro vem adotando para enfrentar o enorme desafio de preservar a nossa megabiodiversidade e desenvolver mecanismos de manejo sustentado para aumentar a produo de alimentos. Vejam a seguir:
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B C & D - Qual a institucional do Ibama?
misso
Eduardo Martins - Na sua origem, o Ibama foi criado para fazer tudo, em todos os lugares ao mesmo tempo. Ou seja, era uma misso mais para semideuses do que para pessoas. Diante das dimenses territoriais do Brasil, era uma misso no apenas impossvel de cumprir, como principalmente de gerenciar. Hoje, a nossa preocupao focar e delimitar a atuao do rgo na poltica ambiental brasileira, naquilo que responsabilidade da rea federal, o que muito diferente da origem do ponto de vista de misso. Para tornar mais compreensvel, isso significa cuidar do mar territorial - daquela faixa de litoral que pertence Unio -, da qualidade ambiental dos rios federais, do sistema de unidades de conservao federal (parques e reservas), do que entra e sai dos aeroportos que podem gerar problemas ambientais e, por ltimo, do licenciamento de produtos ou empreendimentos que tenham impacto regional ou nacional. BC&D - Atravs de que instrumentos, o Ibama cumpre essa misso? Eduardo Martins - Na realidade, ns trabalhamos com os instrumentos tradicionais da gesto ambiental e, atualmente, temos tentado incluir alguns mais heterodoxos. Ns trabalhamos com instrumentos que chamamos de comando e controle, o que significa, por exemplo, fixar limites para aes normatizadas atravs de concesses e licenciamentos de projetos ambientais. Temos tambm o poder de polcia e alm disso desenvolvemos um sistema que pode-se chamar de monitoramento ambiental, atravs de sensoriamento remoto por satlites e redes de computadores, que ainda pouco utilizado no Brasil. Temos ainda feito um enorme esforo para criar instrumentos econmicos que vo alm desses instrumentos de comando e controle. Esses instrumentos econmicos esto inseridos dentro do que ns convencionamos chamar de "protocolo verde", que uma tentativa de fazer com que a atividade econmica interaja com a questo ambiental. Ns temos tido relativo sucesso ao introduzir a questo ambiental na poltica fiscal e tributria. Por exemplo, o Imposto Territorial Rural - ITR est hoje "ambientalizado", o que significa dizer que as pessoas que preservam suas
reas no so mais penalizadas pela Receita, como antigamente quando eram consideradas improdutivas. A questo hoje est equacionada e j temos uma resposta significativa dos contribuintes. Dos 3,5 milhes de pro-
instrumento importantssimo o esforo que o Brasil tem feito para o cumprimento dos acordos e convenes internacionais de preservao ambiental, embora muitas vezes os outros pases envolvidos no faam o mesmo. BC&D - Quais so hoje, no Brasil, as reas prioritrias de atuao do Ibama e por qu? O senhor poderia explicitar, por exemplo, quais so os projetos do seu Instituto para a Amaznia, a Caatinga, os Cerrados e a Mata Atlntica? Eduardo Martins - As reas de responsabilidade do Ibama so aquelas de domnio da Unio. Ns sofremos uma presso muito grande para intervir na Amaznia, Mata Atlntica e no Pantanal. Hoje, o Governo Federal investe cerca de US$ 400 milhes no Pantanal, o que representa a maior parte dos recursos destinados preservao ambiental. Essa presso decorrente da percepo que a sociedade brasileira tem a partir do que divulgado pela mdia, que por sua vez influenciada pelo exterior. A nossa agenda ambiental "verde" demais, quando na realidade deveria ser verde, azul e marrom. Isso se deve forte presso que vem de fora. Ns temos que parar com essa reatividade de colonizados. legtima a preocupao que vem do exterior, mas essa legitimidade no efetiva para mudar a nossa realidade. Em primeiro lugar, porque o alcance que os outros pases tm da nossa realidade parcial. E, segundo, porque a preocupao externa no consegue ser estvel e ns no vamos conseguir fazer no Brasil uma gesto ambiental sem estabilidade. Isso sinaliza para o seguinte: o problema ambiental, inclusive o amaznico, deve ser encarado como dever-de-casa. Se houver cooperao internacional, timo, mas no podemos contar s com ela. Por exemplo, o Programa Piloto, financiado pelo G7 grupo dos sete pases mais ricos do mundo - que foi concebido com US$ 1,5 bilho de dlares, depois foi reduzido para US$ 250 milhes, conseguiu organizar um fundo de US$ 200, que vem sendo gasto, mas para fechar os US$ 250 milhes, est com muita dificuldade. Isso porque quase 60% desses recursos eram provenientes da antiga Alemanha, que interrompeu o fluxo de recursos para solucionar os problemas internos, em funo da queda do Muro de Berlim. O fato de a agenda externa nos orientar mais para a questo do "verde" um equvoco. A
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priedades registradas, mais de dois milhes declararam o ITR, o que permite fazer um amplo monitoramento ambiental das propriedades rurais. Temos feito tambm um esforo significativo com o Banco do Brasil para reduo do consumo de agrotxicos, com base numa avaliao feita pela
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria - Embrapa que demonstra que o uso intensivo desses produtos aumenta o custo da produo agrcola no Brasil. Enfim, todas as instituies que praticam crditos oficiais hoje procuram melhorar o desempenho ambiental de suas atividades. Outro
"agenda marrom", que envolve os problemas urbanos, atinge 80% da populao brasileira que est nas cidades. Nesse contexto, o problema ambiental mais importante o urbano. Outro ponto importante que o Ibama vem enfrentando a gesto dos recursos hdricos, conhecida como "agenda azul", que tem representado um avano para a soluo dos problemas ambientais, com a introduo dos conceitos de gesto de bacias, de gesto baseada nos usurios e de valorao desses recursos. BC&D - Existem, no nosso pas, vrias Organizaes No-Governamentais - ONG's atuando na preservao do meio ambiente. Em que pontos essas ONG's se assemelham, diferem ou interagem com o Ibama? Eduardo Martins - As ONG's cumprem um papel fundamental de controle social, que de extrema importncia para a consolidao do nosso processo democrtico. Nesse sentido, ns tentamos colocar as "vsceras" vista , ou seja, sermos o mais transparente possvel, j que est mais do que demonstrado que a representao democrtica baseada na lgica representativa no suficiente para fazer uma democracia funcionar. A democracia participativa fundamental e, alis, est includa na nossa Constituio. As ONG's so uma das expresses dessa participao. Alm das crticas e do controle social que fazem sobre o Ibama, muitas vezes elas atuam como nossas parceiras. Hoje temos mais de uma centena de parcerias com essas Organizaes, que envolvem campanhas de esclarecimento e preservao ambiental, co-gesto de unidades de conservao, gerao de conhecimentos e atendimento de demandas do nosso processo de gesto ambiental. Eu diria que a nossa relao com as ONG's bastante saudvel e se d num processo de respeito muito grande. Com a morte do ecologista Chico Mendes, houve um "boom" de arrecadao das ONG's. Mas depois da derrocada da Unio Sovitica e da queda do Muro de Berlim, por exemplo, os pases desenvolvidos reduziram o fluxo de recursos financeiros para essas entidades, que hoje enfrentam uma grave situao financeira. Isso prova que ns no podemos ter uma estrutura de controle social que seja dependente exclusivamente do fluxo de poupana externa. Na realidade, ns temos que fazer com que o cida6 6 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
do brasileiro mexa no bolso e financie a sua prpria expresso de controle social. Nesse sentido, a Dona Ruth Cardoso tem feito um trabalho excelente por estar construindo o "marco legal" para o terceiro setor que cria, entre outras coisas, a possibilidade de o setor privado financiar as Organizaes No-Governamentais. BC&D - O Governo aprovou, recentemente, a Lei de Penalidades e Sanes Ambientais, que prev punies rigorosas para os infratores. Quais so exatamente essas penalidades e quais as vantagens dessa Lei? Eduardo Martins - Essa Lei tem uma dimenso educativa muito grande. Em primeiro lugar, estabelece sanes e penalidades de trs naturezas: a civil, que significa reparar o dano causado do ponto de vista coletivo; a criminal, que restringe a liberdade das pessoas e a administrativa, que a interveno do Executivo no problema. Um aspecto muito interessante dessa Lei que se o infrator reparar os danos, cessam
compensar o prejuzo ambiental, atravs da doao de reas semelhantes s que foram degradadas. Por essa Lei, s efetivamente preso quem cometer crimes ambientais que resultem na morte de pessoas. Enfim, a Lei consolida praticamente todas as sanes e punies, envolvendo os recursos naturais como gua, fauna e flora, mas tambm engloba os espaos urbanos. A Lei potencializa muito a gesto ambiental. Por exemplo, antes tnhamos cerca de 50 mil processos somente com reas de siderurgia e vnhamos perdendo todos porque eram baseados numa portaria do Ibama que, muitas vezes, no encontrava respaldo no meio jurdico por no ter fora de lei. Agora, a Lei garante a aplicao das penas e das multas. Alm disso, a fixao do valor das multas superior s vantagens econmicas obtidas pelos infratores. Ns temos a expectativa de que essa Lei vai "pegar", como se diz no Brasil. Primeiro, pelo carter educativo, do qual j falei. Segundo, em todas as pesquisas de opinio pblica, que envolviam a questo ambiental, as pessoas manifestavam o desejo de que os crimes ambientais fossem efetivamente punidos. Em terceiro lugar, o Ministrio Pblico tem sido muito ativo no cumprimento dessa Lei. Outro aspecto interessante da Lei que no alcana apenas o infrator, mas tambm quem est do outro lado do balco, ou seja, as autoridades concedentes e fiscalizadoras. Vale a pena destacar como curiosidade dessa Lei que o Deputado Luiz Eduardo Magalhes teve um papel decisivo para a sua tramitao e aprovao no Congresso Nacional. BC&D - O Brasil possui a maior biodiversidade do planeta. Entretanto, 80% dos alimentos consumidos pelos brasileiros so exticos. Na sua opinio, de que forma a nossa biodiversidade pode contribuir de maneira mais eficiente para o desenvolvimento da agricultura e oferta de alimentos? Eduardo Martins - A origem do que ns consumimos tem por base as savanas e isso contraditrio com a nossa lgica, que uma lgica florestal. Eu acho que no possvel a curto prazo uma mudana de base na nossa produo de alimentos que nos permita articular florestas. Poucas experincias, como por exemplo a do cacau, permitiriam uma revoluo com esse alcance. Eu acho que existem muitas
todas as outras punibilidades, ou seja, a dimenso civil est acima da criminal e da administrativa. Isso muito importante porque melhor do que punir educar. Outro detalhe importante que o infrator que tiver menos do que quatro anos de punio criminal, pode fazer o que se chama de comutao de pena, ou pena alternativa, prestando servios sociedade. Outra forma
espcies que podem ser aproveitadas como alimento ou como material gentico para outras finalidades. O Brasil precisa fazer um esforo bem organizado e estruturado para o melhor aproveitamento da sua biodiversidade. Outro aspecto importante mostrar aos pases que demonstram interesse pela nossa natureza que h necessidade de investimentos na formao de competncia nessa rea e que a cooperao externa bem-vinda. interessante notar que o grau do discurso preservacionista de alguns pases, como por exemplo, os Estados Unidos, inversamente proporcional ao pragmtica. A prova disso que at hoje no ratificaram a Conveno da Biodiversidade. Nesse sentido, o Governo Brasileiro tomou uma deciso bastante importante com a criao do Centro de Biotecnologia da Amaznia, localizado em Manaus. Esse um espao concreto para que os outros pases possam investir na formao de pessoal e no conhecimento do aproveitamento dos recursos biolgicos. Esse Centro vai trabalhar no desenvolvimento e melhoramento de produtos oriundos da floresta, de forma sustentada. Existem trs possibilidades de aproveitamento da Amaznia: utilizar as reas j desmatadas e fazer a reconverso, j que grande parte est abandonada (hoje, mais de 200 mil km2 de florestas j foram reconvertidas); explorao massiva com a extrao de madeiras, borracha, cip, pesca etc. Essa explorao massiva tem que ser submetida a regime de manejo e isso precisaria ser organizado em florestas pblicas, o que daria a possibilidade de ordenar o uso, estabelecer uma base de concesso e criar uma estabilidade no fluxo de matrias-primas para as indstrias. Hoje, as indstrias de explorao massiva so migrantes, ou seja, exploram, vo embora e deixam como saldo, desemprego e devastao. O pior que prejudicam a floresta, com a qual a populao estava acostumada a conviver. A outra possibilidade a utilizao da biotecnologia que, apesar de ser a mais importante, tambm a mais complexa, por depender de mais investimentos e competncia. Eu acho que o Brasil deve ser mais agressivo e assumir uma postura no cenrio internacional de romper com a hipocrisia que vem sendo repetida h muito tempo. O discurso da sustentabilidade o da convenincia diplomtica, que muitas vezes no revela a verdadeira dimenso dos interesses econmicos.
BC&D - O Centro de Biotecnologia, que o senhor mencionou, est vinculado a que rgo? Eduardo Martins - O novo Centro ser vinculado aos Ministrios do Meio Ambiente e Cincia e Tecnologia e faz parte do Programa de Biotecnologia da Amaznia - Probem. Esse Programa tem como objetivo principal a busca, avaliao, caracterizao, "screening" e disponibilizao de materiais da natureza para pesquisa e aproveitamento industrial. Recentemente, foi lanada a pedra fundamental desse Centro em Manaus. Atravs desse Centro, pretende-se viabilizar o surgimento de indstrias de biotecnologia na Amaznia. O Probem faz parte do "Brasil em Ao" - programa do Governo Federal que contempla todas as suas reas estrat-
te, o que j vem sendo feito pela Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana - CTNBIO, do Ministrio da Cincia e Tecnologia. BC&D - A mdia denuncia com freqncia que vrios produtos oriundos da flora e fauna brasileiras esto sendo ilegalmente levados para o exterior e, em muitos casos, patenteados - a chamada biopirataria. Como o Ibama reage a essas denncias e se existem mecanismos legais para o cancelamento dessas patentes? Eduardo Martins - No, no h como cancelar as patentes. Mas, ns estamos trabalhando em duas linhas. A primeira, envolve o levantamento de quantas e quais espcies de origem brasileira se destinaram a patentes no exterior. Ns sabemos, por exemplo, que nos EUA h mais de uma centena de patentes base de material gentico brasileiro. A segunda a participao na elaborao de um Projeto de Lei, em conjunto com outros setores do Governo, de acesso a recursos genticos, de autoria da Senadora Marina Silva, que est tramitando no Congresso Nacional. Ns achamos que o Projeto de Lei fundamental porque atende a um item da Conveno da Biodiversidade, que organizar e disciplinar de maneira rigorosa a questo do acessso a recursos genticos. Um ponto difcil do Projeto criar mecanismos de remunerao ao conhecimento dos povos da floresta; e isso depende de uma postura empresarial tica. Alm disso, temos trabalhado em parceria com o CNPq e outras instituies para ampliar a nossa capacidade de controle e fiscalizao. J conseguimos impedir a sada ilegal de materiais do pas, mas temos que agir com muita cautela, visto que boa parte do material utilizado para fins de pesquisa. Por fim, esperamos que haja um compromisso moral por parte de quem est levando o material. BC&D - Recentemente, 15% do estado de Roraima foram devastados por queimadas, o que em muito prejudicou a biodiversidade da Amaznia e revelou que o Governo Brasileiro no est preparado para enfrentar essas catstrofes. Que lies o Ibama tirou desse episdio e como est se preparando para evitar e enfrentar situaes semelhantes no futuro? Eduardo Martins - A tragdia foi menor do que a anunciada. O que aconteceu em Roraima
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gicas e prioritrias de investimentos. BC&D - Vrios organismos geneticamente modificados - OGM's j foram e esto sendo liberados pelo Governo Brasileiro para testes de campo e, em breve, estaro no mercado. Sendo o Brasil detentor dessa megabiodiversidade, o senhor v os OGM's como um risco potencial para os nossos ecossistemas? Eduardo Martins - A maior causa da extino de animais no mundo inteiro a introduo de fauna extica e, certamente, os novos organismos podem representar riscos s espcies silvestres. Mas, isso no significa que devemos adotar uma postura dogmtica com relao aos OGM's, o que seria um reativismo sem fundamento. Eu acho que importante avaliar e controlar a interao dos organismos modificados com o ambien-
foi o somatrio de dois fatores: o "El Nio" e a migrao excessiva para aquele estado em busca de terra. Alm disso, o estado passava por um perodo de seca, nunca antes verificado na histria, e ventos de at 100 km/h. uma regio mista de savanas e florestas de transio, com um grande nmero de assentados, que praticam agricultura de subsistncia fazendo uso de queimadas. Essa situao gerou uma emergncia e a vem a primeira lio: o Brasil no tem mentalidade de emergncia. No s o Governo que no est preparado para enfrentar emergncias, a sociedade civil tambm. fundamental que o Brasil crie uma mentalidade de emergncia. Na cidade do Mxico, por exemplo, qualquer criana de sete ou oito anos sabe como enfrentar um tremor de terra. A segunda lio que a Amaznia pode queimar. Antes das chuvas, ns j havamos identificado mais de 40 frentes de incndio na regio. Dessas 40, 10 j tinham sido controladas por mais de dois mil homens, que foram mobilizados, e 13 helicpteros, o que consumiu em um ms R$ 10 milhes. Isso significa dizer que mesmo se no tivesse chovido, ns teramos controlado o incndio. Uma das medidas que tomamos para evitar novas catstrofes foi reunir cinco especialistas do servio florestal americano e canadense, alm de autoridades da agncia governamental norteamericana de combate a fogo. O curioso que apesar de todas as crticas da opinio pblica, o nosso trabalho de combate ao incndio foi muito elogiado por esses especialistas e autoridades, especialmente por no ter havido perdas de vidas humanas durante a operao e pelo reduzido prejuzo patrimonial de R$ 17 milhes. BC&D - Que polticas e medidas o Ibama desenvolve para a conscientizao dos nossos jovens em relao preservao do meio ambiente? Eduardo Martins - A primeira medida que temos desenvolvido a especializao das pessoas que atuam na rea de educao ambiental, em conjunto com a UnB - Universidade de Braslia, por exemplo, no s para o nosso pessoal, como tambm para pessoas de fora. A segunda que em toda
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BC&D - O Brasil gasta mais de U$ 2 bilhes anualmente com a utilizao de defensivos agrcolas nas lavouras. Qual o papel do Ibama na liberao, registro e licenciamento desses produtos? Eduardo Martins - O Ibama, juntamente com o Ministrio da Agricultura e o Ministrio da Sade, uma das partes responsveis pela liberao desses produtos pela dimenso ambiental, ou seja, a relao desses produtos com a natureza. Esse um procedimento que na minha avaliao ainda muito cartorial, que temos tentado melhorar do ponto de vista de tempo e rotinas, inclusive otimizando, quando possvel, a informao disponvel na literatura. Em suma, na minha opinio, o sistema tende a melhorar medida em que as pessoas deixem as escrivaninhas e vo para o campo, testar os produtos. Temos pensado em criar um sistema de monitoramento, atravs do qual ser possvel avaliar o efeito de longo prazo desses produtos em condies reais. H tambm uma tentativa de iniciar um programa para reduo do consumo de agrotxicos no pas, que vai comear pela fruticultura do nordeste, j que muitas vezes partidas de frutas so recusadas pelo alto ndice ou m utilizao de agrotxicos. O mesmo ser feito com a soja em outras regies do pas. BC&D - O Brasil tem sido porta de entrada de vrias pragas agrcolas. Considerando os riscos que representam para a flora brasileira, o Ibama faz estudos de monitoramento e tem alguma participao na Defesa Fitossanitria do Ministrio da Agricultura? Eduardo Martins - No. E isso uma lacuna. Eu tenho informaes de que nos ltimos 10 anos, mais de 40 pragas entraram no Brasil, sem que no entanto ningum se preocupe com o impacto dessas pragas na natureza. Ns esperamos poder ter uma aproximao maior com a Defesa Fitossanitria, uma vez que estamos fechando escritrios do Ibama que no tem nada a ver com a nossa misso e nos organizando para ficarmos prximos s questes que so de nossa atribuio permanente, como o caso do controle do trnsito de material gentico em portos, aeroportos e fronteiras. Alis, a nossa interao no deve ser feita apenas com a Defesa Fitossanitria, mas tambm com a Receita e a Polcia Federal.
atividade de fiscalizao e controle do Ibama, ns inserimos o componente educativo. Outra linha a produo de material didtico-pedaggico, que utilizado nas salas-de-aula. Isso fruto de uma reviso curricular feita pelo Ministrio da Educao - MEC, que incluiu questes ambientais e ticas nos currculos escolares, para todos os nveis. Ns temos tambm um trabalho em parceria com a Xuxa, atravs da distribuio de carteiras de "defensores da natureza" para as crianas durante os seus programas. Alm disso, temos em cada estado um ncleo de educao ambiental, com pessoas treinadas e capacitadas para potencializar o componente educao ambiental em todas as unidades da Federao.
BIOLOGIA MOLECULAR NA
CONSERVAO DE PEIXES
FERRAMENTAS MOLECULARES E CONSERVAO GENTICA
s ecossistemas aquticos esto entre aqueles cuja diversidade de vida se expressa de maneira extraordinariamente intensa. Estima-se que cerca de 23.000 espcies de peixes existam; destas, 8.000 vivendo em guas continentais e 15.000 em ambientes marinhos. Esta diversidade tem sido, de alguma forma, utilizada pela humanidade ao longo de sua existncia. A pesca e a aqicultura so atividades h muito desenvolvidas pelo homem. Nas ltimas dcadas estes setores tm contribudo significativamente para o aumento da oferta de alimentos em escala mundial. Estimativas da FAO (Organizao das Naes Unidas para Alimentao e Agricultura) mostram que em 1996 cerca de 30 milhes de pescadores e piscicultores produziram 116 milhes de toneladas de peixes. Em simpsio sobre a conservao dos recursos genticos de peixes realizado em 1981 (FAO/UNEP), os pases participantes concluram que esforos conjuntos devem ser realizados para identificar e conhecer a diversidade gentica dentro e entre espcies de peixes. Estas medidas, entre outras, so importantes para manuteno a longo prazo dos estoques explotveis e da variabilidade necessria para o melhoramento gentico de espcies em cativeiro. As condies climticas e hdricas do Brasil possibilitaram a evoluo de uma expressiva quantidade de espcies de peixes que esto espalhadas nas diversas bacias hidrogrficas e ao longo de nossa costa martima. Muitas dessas espcies contribuem de forma significativa para produo de alimentos e manuteno da indstria pesqueira. Mantendo a diversidade gentica Os ecossistemas aquticos esto entre aqueles que mais tm sofrido agresses no processo de desenvolvimento econmico das sociedades modernas. Diversas tm sido as intervenes humanas que de uma forma ou de outra tm causado modificaes profundas na di-
Alexandre Hilsdorf, MSc. Professor colaborador adjunto Universidade de Taubat Departamento de Cincias Agrrias e Laboratrio de Biologia Molecular do Instituto do Corao. exphilsdorf@incor4.incor.usp.br Jos Eduardo Krieger Professor associado da Faculdade de Medicina da USP Departamento de Clnica Mdica Chefe do Laboratrio de Biologia Molecular do Instituto do Corao. Fotos cedidas pelos autores. 10 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
nmica dos ambientes aquticos. Pesca predatria, introduo de espcies exticas, destruio de matas ciliares, poluio, assoreamento de rios e implantao de hidreltricas so algumas que podem ser citadas, e que vm colocando em risco a rica diversidade de peixes em todo o planeta. De todas as intervenes humanas, pela magnitude com que tem sido estabelecida, a construo de barragens, para gerao de energia eltrica, tem se transformado em um dos processos de maior impacto sobre o ambiente aquti-
co. O fechamento das barragens e formao dos reservatrios leva a uma modificao profunda em todo o ecossistema. Os peixes sofrem, ento, uma alterao em seu ciclo de vida que muitas vezes leva os mesmos ao desaparecimento. No Brasil, a portaria 0001, de 04/01/77, da SUDEPE - Superintendncia do Desenvolvimento da Pesca (incorporada pelo IBAMA), que regulamentou o artigo 36 do Decreto-lei 221, de 28/02/ 67, conhecido com "Lei da Pesca", exige que qualquer entidade que sob qualquer condio esteja envolvida na construo de barragens, e que implique uma alterao de cursos d'gua, dever adotar medidas de proteo dos recursos biolgicos aquticos. O desafio maior das empresas geradoras de energia , portanto, conciliar as crescentes necessidades por energia e a conservao dos ecossistemas. A CESP - Companhia Energtica de So Paulo - a empresa responsvel por 95% da energia eltrica gerada no Estado de So Paulo e 20% de toda produo brasileira. Toda esta energia proveniente da construo de 20 reservatrios, que ao todo inundam uma rea de 7.500km2. Vrias medidas podem ser tomadas para mitigar os impactos sobre a vida aqutica, causados pela construo de barragens. Construo de escadas, elevadores e a instalao de centrais de reproduo de peixes para posterior repovoamento. Os trabalhos desenvolvidos pelas estaes de reproduo das companhias hidreltricas, como a CESP, vm cumprindo um papel importante, que, somado recuperao dos estoques de peixes na natureza, possibilita um melhor conhecimento biolgico das espcies presentes na regio, permitindo um manejo mais racional dos estoques e a sustentao de uma explorao pesqueira no-predatria. Uma das questes mais importantes em um programa de repovoamento de peixes diz respeito capacidade de sobrevivncia a longo prazo dos indivduos reintroduzidos. Um programa de repovoamento tem que ter como base a preservao da variabilidade gentica no ambiente natural, aumentando, assim, o sucesso reprodutivo e adaptativo da espcie dentro de um ambiente com contnuas alteraes. A opo pelo repovoamento deve, portanto, levar em considerao a variao gentica existente dentro e en-
tre populaes distribudas na bacia de influncia do reservatrio. Esta etapa fundamental para o estabelecimento e a manuteno dos estoques fundadores na estao de reproduo, que devero representar a distribuio da variabilidade gentica da espcie na regio (ToledoFilho, et al., 1991). Marcadores moleculares no estudo gentico populacional de peixes Desde a dcada de 60 marcadores morfolgicos e proticos tm sido usados no estudo da variabilidade populacional em peixes (Park & Moran, 1994). Com o desenvolvimento das tcnicas da biologia molecular, diversos marcadores vm sendo localizados em regies do genoma nuclear e mitocondrial. Desta forma, os marcadores
Figura 2: Estao de Hidrobiologia e Piscicultura de Paraibuna. Foto: Autor
moleculares tm-se transformado em ferramentas importantes no estudo e avaliao gentica de populaes de peixes selvagens e em cativeiro, podendo ser usados para: * Identificao de espcies e hbridos; * Estabelecimento da filogenia da espcie e da populao; * Determinao da estrutura populacional de uma espcie; * Identificao de linhagens; * Contribuio individual de uma populao em um estoque que est sendo explotado; * Variao gentica em populaes selvagens e cultivadas; * Determinao do impacto gentico da introduo de peixes cultivados em populaes naturais; * Determinao de estratgias de cruzamento para fins de criao e repovoamento; * Localizao de marcadores ligados a genes envolvidos com caracteres de interesse econmico. Diversas tcnicas so hoje utilizadas na identificao de marcadores de DNA, entre elas podemos citar: RFLP (Restriction Fragment Lentgh Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragments Lenght Polymorphism) e VNTRs (Variable Number Tandem Repeat Loci). DNA mitocondrial em populaes da pirapitinga-do-sul
Figura 3: Alevinos de pirapitinga-do-sul para repovoamento. Foto: CESP
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QUADRO COMPARATIVO DOS PRINCIPAIS MARCADORES MOLECULARES NA ANLISE DE POPULAES
A bacia do Paraba do Sul, compreendida no eixo Rio-So Paulo, uma destas regies profundamente afetadas por uma srie de impactos ambientais. Na dcada de cinqenta, a bacia do Paraba comportava uma das mais importantes reas de pesca continental do Estado de So Paulo. O declnio desta atividade na regio acompanhou o processo de deteriorao dos rios e tributrios do Paraba, com o quase desaparecimento de diversas espcies economicamente importantes. Na Estao de Hidrobiologia e Piscicultura da CESP em Paraibuna, vrias espcies da bacia do Paraba do Sul tm sido mantidas em cativeiro. Entre algumas, podemos citar: piabanha (Brycon insignis), surubim-do-vale ( ), curimbat
Figura 5: Metodologia para anlise gentico-populacional de peixes por RFLP baseado no polimorfismo do DNA mitocondrial. Foto: Autor
(Prochilodus lineattus), piavabicuda (Leporinus conirostris), piau-palhao (Leporinus copelandii) e a pirapitinga-dosul (Brycon cf. reinhardt). Os estudos sobre a diversidade gentico-populacional de espcies da bacia do Paraba teve incio em 1996. A pirapitingado-sul foi a espcie eleita para se iniciar os trabalhos. Esta espcie pertence ao gnero Brycon, o qual possui diversas espcies de valor econmico e pode ser encontrado em quase todas as bacias hidrogrficas brasileiras. A pirapitinga-do-sul um peixe endmico da bacia do Paraba, estando presente em rios de guas mais frias, nas regies serranas do Vale. Os estudos genticopopulacionais da pirapitinga-dosul na bacia do Paraba tm sido baseados no polimorfismo apresentado pelo DNA mitocondrial. Esta molcula rene algumas caractersticas, tais como: alta taxa mutacional, pequeno tamanho (16.000pb), sensvel aos processos de deriva gentica e herana materna (Avise et al., 1987), que permitem uma avaliao inicial da estrutura gentico-populacional da espcie na natureza. O trabalho tem tido a importante contribuio da equipe de tcnicos da Estao de Hidrobiologia e Piscicultura de Paraibuna na localizao, captura e manuteno das populaes selvagens da pirapitinga-do-sul. As pesquisas, em andamento, j possibilitaram a clonagem e a produo de sondas a partir do DNA mitocondrial da espcie em estudo, que possivelmente podero ser utilizadas com outras espcies importantes do gnero Brycon, tais como: matrinch, piracanjuba, piraputanga e piabanha; assim como o desenvolvi-
Figura 4: Exemplar adulto de pirapitingado-sul. Foto: Autor
mento de tcnicas de biopsia de tecido muscular, para extrao de DNA, sem o sacrifcio dos animais. A compreenso das diferenas genticas entre as diversas populaes nativas, bem como a composio das mesmas em cativeiro, uma etapa fundamental para a manuteno de estoques e possibilita um manejo gentico a longo prazo de espcies de peixes em programas de repovoamento. Desta forma, a utilizao das novas tcnicas de gentica molecular pode contribuir de forma significativa para a preservao e o desenvolvimento sustentado dos recursos genticos aquticos.
Figura 6: Polimorfismo de duas enzimas de restrio do DNA mitocondrial da pirapitinga-do-sul usadas como marcadores. Foto: Autor
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MARCADORES DE
DNA
Aplicaes no melhoramento de plantas
Sandra C.K. Milach UFRGS, Departamento de Plantas de Lavoura Sandra Millach autora do Livro "Marcadores Moleculares em Plantas" millach@vortex.ufrgs.br
sucesso da produo agrcola depende fortemente do uso de variedades com desempenho superior e adaptadas aos ambientes de cultivo. Na inexistncia de materiais genticos superiores, no possvel obter alta produtividade e qualidade do produto. Desta forma, o melhoramento de plantas tem tido papel fundamental no desenvolvimento da agricultura, gerando novas variedades em espcies de interesse agronmico. O aumento na eficincia de seleo, o melhor conhecimento e caracterizao do germoplasma e a maximizao dos ganhos genticos tm sido objetivos de melhoristas de plantas do mundo inteiro. Novas formas de alcanar estes objetivos tm sido constantemente perseguidas pelo melhoramento de plantas. Por isso o interesse em tecnologias como as de marcadores de DNA ou moleculares. Os melhoristas de plantas tm tradicionalmente selecionado variabilidade com base no fentipo (aparncia de um indivduo). Esta estratgia tem sido de sucesso para caractersticas de alta herdabilidade (fentipo reflete a constituio gentica do indivduo), mas nem sempre para caractersticas de baixa herdabilidade (fentipo pode no refletir o gentipo). Pelo fato de a maioria das caractersticas selecionadas no melhoramento de plantas ser de natureza quantitativa, estratgias como teste de prognies e seleo em geraes avanadas tm sido utilizadas para minimizar as dificuldades da seleo. Estas, contudo, no diminuem ou evitam os efeitos da interao gentipo x ambiente, que podem mascarar o fentipo. Este a expresso do gentipo (constituio gentica de um indivduo) sob condies ambientais especficas, e assim pode mudar. Desta forma, selecionar o fentipo como perseguir um alvo mvel, que muda com o ambiente. Uma forma de evitar este problema seria sele-
cionar indivduos superiores com base no gentipo, pois este independe do ambiente e no muda durante o ciclo de vida de um indivduo. Embora isto parea difcil, novas tecnologias esto disponveis que permitem ao melhorista acessar e selecionar variabilidade a nvel de DNA. O objetivo deste artigo o de apresentar as diferentes tecnologias de marcadores moleculares e discutir como estas podem auxiliar o melhoramento de plantas. Tecnologias de marcadores moleculares Marcadores moleculares so caractersticas de DNA que diferenciam dois ou mais indivduos e so herdadas geneticamente. Os distintos tipos de marcadores moleculares hoje disponveis diferenciam-se pela tecnologia utilizada para revelar variabilidade a nvel de DNA, e assim variam quanto habilidade de detectar diferenas entre indivduos, custo, facilidade de uso, consistncia e repetibilidade. Os principais tipos de marcadores moleculares podem ser classificados em dois grupos, conforme a metodologia utilizada para identific-los: hibridizao ou amplificao de DNA. Entre os identificados por hibridizao esto os marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; Botstein et al., 1980) e minissatlites ou locos VNTR (Variable Number of Tandem Repeats; Jeffreys et al., 1985). J aqueles revelados por amplificao incluem os marcadores do tipo: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA; Williams et al., 1990); SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions); STS (Sequence Tagged Sites) (Paran & Michelmore, 1993); Microssatlite (Litt & Lutty, 1989); e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism; Vos et al., 1995). As principais etapas requeridas para obteno de resultados variam com o tipo de marcador molecular utilizado (tabela 1).
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Mais detalhes sobre as tcnicas aqui apresentadas podem ser encontrados em Milach (1998a) e Ferreira & Gratapaglia (1995). As tecnologias de marcadores moleculares esto evoluindo rapidamente e modificaes j existem para algumas das tcnicas acima mencionadas. Contudo, os tipos de marcadores aqui listados so ainda os mais utilizados em estudos genticos e programas de melhoramento. Atributos como consistncia e tempo para obteno de resultados, nvel de polimorfismo obtido, custo e facilidade de uso so importantes para a implementao de marcadores moleculares na rotina de um programa de melhoramento. A comparao dos tipos de marcadores para essas caractersticas encontra-se na tabela 2. Enquanto que marcadores de RFLP tm sido utilizados em estudos de mapeamento comparativo por causa da consistncia dos resultados obtidos, estes tendem a ser mais caros e mais difceis de implementar em programas de melhoramento de plantas. Por outro lado, marcadores identificados por amplificao, especialmente RAPDs, so mais fceis de manipular e de custo menor, embora sejam de resultados menos consistentes. A converso de marcadores de RFLP em STS e RAPD em SCAR tem sido apontada como uma excelente opo para a seleo assistida por marcadores moleculares. Com exceo do tipo de primer utilizado, SCAR e STS so muito semelhantes tcnica de RAPD, com a vantagem de serem mais consistentes e a desvantagem de envolverem o desenvolvimento de primers, o que eleva o custo. Uma vez que os primers estejam disponveis, estas tcnicas apresentam custo comparvel ao RAPD. Este fato, associado consistncia de SCAR e STS, inclui estas entre as tcnicas mais promissoras para implantao rotineira em programas de melhoramento de plantas. Outros marcadores como microssatlites e AFLP revelam mais polimorfismo e tm sido a melhor opo para espcies onde este limitado. Muitos so os aspectos envolvidos na escolha do tipo de marcador molecular a ser utilizado, por isso no existe aquele que possa ser considerado superior para todos os atributos. Por esta razo, as opes disponveis devem ser analisadas antes de ser decidido o tipo de marcador a ser empregado. Aplicaes de marcadores de DNA no melhoramento de plantas As etapas fundamentais de um programa de melhoramento de plantas so: obteno da variabilidade gentica; seleo de indivduos superiores; e avaliao de materiais genticos promissores
para lanamento comercial. Apesar de ganhos genticos significativos terem sido obtidos na seleo de caractersticas de interesse na maioria das espcies de importncia agronmica, a expectativa de progresso gentico e obteno de indivduos ainda melhores permanece. Por esta razo, os melhoristas de plantas tm buscado formas de continuar obtendo ganhos genticos, tornando cada vez mais eficiente cada uma das etapas do programa. A essncia deste progresso est em o quanto o fentipo de um indivduo expressa o seu gentipo. Por isso que o uso de marcadores moleculares pode auxiliar o melhoramento de plan-
tas, pois possibilita acessar diretamente o gentipo de um indivduo. Assim, entre as principais aplicaes de marcadores de DNA em programas de melhoramento de plantas esto: o monitoramento e organizao da variabilidade gentica; a seleo assistida por marcadores moleculares; e a proteo de cultivares (Lee, 1995). Cabe salientar, contudo, que estas aplicaes no devem ser generalizadas a todos os programas de melhoramento, e no tero a
mesma importncia em todas as espcies de plantas. Isso porque o modo de reproduo, as caractersticas de interesse, o valor da unidade de seleo, o progresso gentico j obtido e outros aspectos pertinentes variam grandemente entre espcies e programas de melhoramento. Por isso, identificar as caractersticas de interesse e estabelecer objetivos claros para um programa de melhoramento so passos que precedem a questo: como os marcadores de DNA podem auxiliar o programa? Como outras tecnologias, os marcadores moleculares tero grande impacto e utilizao em algumas situaes, mas no em todas. Assim, cabe aos melhoristas junto com os especialistas na rea molecular decidirem caso a caso se devem ou no utilizar esta tecnologia. Para tomar esta deciso, contudo, necessrio vislumbrar o potencial de aplicao dessas tcnicas, o qual discutiremos a seguir. Responder a questo "como os marcadores moleculares podem auxiliar o melhoramento de plantas?" no difcil. O difcil e nem sempre claro responder "quando, em que situaes, utilizar marcadores moleculares?". Vamos abordar uma questo de cada vez. Em termos de variabilidade gentica, marcadores moleculares permitem: compreender e organizar a variabilidade gentica de um programa de melhoramento de forma nica, isto , acessando variabilidade de DNA, que no influenciado pelo ambiente como so, por exemplo, os caracteres morfolgicos e fenotpicos em geral de uma planta. A primeira conseqncia disto a possibilidade de planejar os cruzamentos de um programa de forma a maximizar as diferenas genticas entre gentipos elites, diferenas essas que muitas vezes no podem ser observadas a nvel de fentipo. A segunda a possibilidade de organizar o germoplasma do programa em pools gnicos, facilitando a escolha e diminuindo o nmero de combinaes a serem feitas pelo melhorista. Em espcies algamas como milho e girassol, os marcadores podem ainda auxiliar no estabelecimento de grupos heterticos (Hongtrakul et al., 1997), diminuindo substancialmente o nmero de cruzamentos-testes a serem avaliados e posteriores combinaes hbridas. Como conseqncia do estudo da variabilidade gentica, muitas vezes possvel identificar o padro molecular (ou fingerprinting) de gentipos de interesse, que pode ser posteriormente utilizado para a proteo do germoplasma. Para maior discusso sobre o uso de marcadores moleculares na caracterizao de cultivares ver Milach (1998b). Marcadores moleculares podem ser empregados tambm na seleo de caracteBiotecnologia Cincia & Desenvolvimento 15
rsticas de interesse. Neste caso, necessrio primeiro identificar marcadores associados a essas caractersticas atravs do mapeamento molecular (Milach, 1998c). Uma vez que esta informao esteja disponvel, possvel selecionar os indivduos com o marcador de interesse, sem que haja necessidade de avaliar o fentipo dos mesmos. Esta, tambm conhecida como seleo assistida por marcadores moleculares (SAMM), pode ter grande impacto nos casos em que a caracterstica de interesse de avaliao difcil e cara. Tambm no caso de espcies perenes, de ciclo longo, quando houver necessidade de esperar alguns anos at que a caracterstica fenotpica se expresse. O sucesso da SAMM depender do grau de associao entre marcador e caracterstica de interesse: quanto maior, menor a chance de ocorrer recombinao entre marcador e gene que controla a caracterstica, e maior ser a eficincia da seleo. Salientamos que o marcador, na maioria das vezes, est associado caracterstica, no sendo o gene que controla a mesma. De acordo com Lee (1995), a expectativa da maioria dos melhoristas de plantas questionados em seu estudo em relao SAMM foi do uso desta para reduzir o tempo necessrio na transferncia de
genes de interesse, especialmente transgenes, por retrocruzamento. Neste caso, os marcadores podem ser utilizados de duas formas: para selecionar os indivduos com o maior nmero de marcadores semelhantes queles do pai recorrente e que possuam o transgene de interesse. Os exemplos de SAMM ainda so escassos na literatura, especialmente porque as informaes de programas de melhoramento de empresas privadas, que so hoje, possivelmente, os principais executores de SAAM, no esto disponveis. Alm disso, o limitado uso de SAAM em programas de melhoramento pode ser conseqncia do custo e os procedimentos elaborados da maioria dos marcadores disponveis. Mesmo assim, alguns exemplos publicados, como o caso da transferncia de genes favorveis de espcies selvagens para cultivada para aumento de tamanho de fruto em tomate (Tanksley et al., 1996; Tanksley & McCouch, 1997), indicam o grande potencial da SAAM para o melhoramento de plantas. Tambm utilizando um marcador associado caracterstica de baixa absoro de cdmio em Triticum durum (Penner et al., 1995a), o grupo do Dr. Penner avaliou em 1996/1997 duas mil linhagens avanadas de trigo duro
no Canad, selecionando as com menor capacidade de absoro deste metal (Penner, comunicao pessoal). A possibilidade de converter tipos de marcadores mais elaborados e caros, como RFLP, em mais simples, como STS (Penner et al., 1995b), indica que o uso destes para seleo indireta tende a crescer nos prximos anos. Por fim, o conhecimento do padro molecular de gentipos poder ser utilizado, alm da proteo legal, para garantir a pureza gentica dos mesmos durante os anos de avaliao, bem como aps o lanamento comercial. Em relao pergunta "em que circunstncias utilizar marcadores moleculares no programa de melhoramento de plantas?", acreditamos que o melhorista deva resolver este aspecto com base na resposta a outras perguntas que agora formulamos. Em termos de variabilidade gentica: i) quo difcil para o melhorista escolher os gentipos genitores e decidir que combinaes fazer em nmero razovel? Se muito difcil em funo do grau de parentesco dos gentipos elites do programa, marcadores podem auxiliar; ii) a variabilidade gentica disponvel entre gentipos adaptados suficiente ou h necessidade de buscar variabilidade em outras espcies (selvagens)? Se espcies
selvagens forem alvo de interesse, marcadores podem auxiliar a transferncia de alelos favorveis destas espcies e na reduo de genes desfavorveis ligados aos mesmos. Em termos de seleo: i) ir a SAMM levar a ganhos genticos superiores se comparada seleo feita com base no fentipo? A regra geral a mesma para a seleo indireta, isto ,
carga distintas. Fentipo: aparncia de um indivduo. Gentipo: constituio gentica caracterstica de um indivduo. Germoplasma: conjunto de gentipos de uma espcie. Herdabilidade: poro da variao fenotpica devido constituio gentica. Hibridizao: pareamento de fitas complementares de DNA. Pools gnicos: grupos de gentipos com caractersticas comuns dentro de uma espcie. Primer: seqncia de DNA com dez ou mais pares de bases, utilizada
comportamento de sua prognie. Transgenes: genes transferidos para um gentipo atravs da transformao gentica. Referncias bibliogrficas Botstein, D.; White, R.L.; Skolnick, M.; Davis, R.V. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet., 32:314-331. Ferreira, M.E.; Grattapaglia, D. 1995. Introduo ao uso de marcadores RAPD e RFLP em anlise gentica. EMBRAPACENARGEN, Documento 20, 220p. Hongtrakul, V.; Huestis, G.M.; Knapp, S.J. 1997. Amplified fragment length polymorphisms as a tool for DNA fingerprinting sunflower germplasm: genetic diversity among oilseed inbred lines. Theor. Appl. Genet., 95:400-407. Jeffreys, A.J.; Wilson, V.; Thein, S.L. 1985. Hypervariable 'minisatelite' regions in human DNA. Nature, 316:76-79. Lee, M. 1995. DNA markers and plant breeding programs. Advances in Agronomy, 55:265-343. Litt, M.; Luty, J.A. 1989. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. Hum. Genet., 44:388-396. Milach, S.C.K. Principais tipos de marcadores moleculares e suas caractersticas. In: S.C.K. Milach (ed.). Marcadores Moleculares em Plantas. Porto Alegre, UFRGS, 1998a, p. 17-28. Milach, S.C.K. Uso de marcadores moleculares na caracterizao de cultivares. In: A. Borm e outros (ed.). Biossegurana, Proteo de Cultivares, Acesso aos Recursos Genticos e Propriedade Industrial na Agropecuria, Viosa, 1998b, p. 43-58. Milach, S.C.K. Mapeamento molecular de caractersticas de importncia agronmica. In: S.C.K. Milach (ed.) Marcadores Moleculares em Plantas. Porto Alegre, UFRGS, 1998c, p. 67-73. Paran, I.; Michelmore, R.W. 1993. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet., 85:985-993.
baseada na equao: ii) os fatores tempo, custo e eficincia da seleo favorecem a SAMM, em vez da seleo com base no fentipo? iii) em relao ao tempo, qual a necessidade de diminuir consideravelmente o nmero de anos para colocar um novo cultivar no mercado? Se muito grande, a SAMM pode ser fundamental. Em termos de avaliao e lanamento de variedades: h necessidade de proteo legal do germoplasma do programa? Se a resposta for sim, marcadores podem auxiliar. Muitas outras perguntas pertinentes poderiam ainda ser formuladas, cujas respostas dependero da realidade do programa de melhoramento, da espcie, e dos recursos financeiros, fsicos e humanos em questo. A mensagem principal que gostaramos de deixar aps a discusso aqui apresentada que: marcadores moleculares representam, sem dvida, uma ferramenta poderosa que j est tendo e ainda ter grande impacto no melhoramento de plantas. A deciso do uso desta ferramenta nos diversos programas de melhoramento depende, contudo, da avaliao cautelosa da situao dos mesmos e das circunstncias em que se pretende aplic-los. Glossrio Algamas: espcies com reproduo por fecundao cruzada. Eletroforese: metodologia utilizada para separao de molculas com tamanho e
para iniciar a amplificao de DNA Sonda molecular: fragmento de DNA de mais ou menos 1.000 pares de bases de extenso, utilizado na hibridizao. Termociclador: aparelho utilizado para amplificao de DNA. Teste de prognie: avaliao de um indivduo com base no
INTRODUO A agrobiodiversidade um componente crtico de biodiversidade global. Mais de 75% da produo mundial de alimentos so produzidos por pouco mais de 25 espcies domsticas de plantas e animais. A manipulao e manejo destes recursos genticos essencial para a segurana alimentar do mundo. A presso por aumento de produtividade e sustentabilidade dos sistemas de produo intensa e crescente. Assim, a identificao e desenvolvimento de germoplasma animal e vegetal que seja altamente produtivo e adaptado s condies ecolgicas uma prioridade mundial reconhecida pela Organizao das Naes Unidas para Alimentao e Agricultura (FAO). Durante a reproduo, origina-se um conjunto de gentipos pela recombinao dos alelos. Certos gentipos tm menor chance de sobreviver e reproduzir que outros. Esta discrepncia pode surgir devido s condies naturais de trs formas: a) devido viabilidade diferencial dos gentipos nos diferentes estgios de desenvolvimento; b) devido fertilidade diferencial; c) devido seleo familial, significando que a descendncia de um dado tipo de acasalamento pode ter diferentes viabilidades, dependendo do gentipo dos descendentes. Assim sendo, a seleo natural expresso das diferenas de adaptao entre indivduos. Esta depende da capacidade relativa de os indivduos doarem genes s geraes futuras, sendo o valor adaptativo a habilidade de um gentipo sobreviver e reproduzir,
Urbano Gomes Pinto de Abreu CPAP-Embrapa, Cx. Postal 109, Corumb-MS, 79320-900 urbano@cpap.embrapa.br Arthur da Silva Mariante CENARGEN-Embrapa, Cx. Postal 02372, Braslia-DF, 70849-970 mariante@botunet.com.br Sandra Aparecida Santos CPAP-Embrapa, Cx. Postal 109, CorumbaMS, 79320-900 sasantos@botunet.com.br Fotos cedidas pelos autores
determinando a contribuio deste gentipo atravs do nmero de descendentes na prxima gerao. Os recursos genticos animais existem na forma de vrias raas e populaes de animais domsticos que evoluram e se adaptaram ao longo de sculos s mais diferentes condies ambientes verificadas atravs do mundo. A presso de seleo imposta pelo clima, tipo de solo, altitude, oferta alimentar, doenas endmicas, parasitismo, manejo tradicional e demanda do mercado resultou em centenas de raas, linhagens e tipos, que possuem composio gentica prpria e adaptadas a nichos ecolgicos especficos. O incremento da velocidade da perda da diversidade dos recursos genticos animais vem sendo relatado h vrios anos, e vem ocorrendo em diferentes locais do planeta. Particularmente nos pases em desenvolvimento, a velocidade tem sido grande e raas ainda no caracterizadas esto desaparecendo. Nas regies tropicais, tal fato importante, pois nas raas naturalizadas possvel determinar combinaes genticas de grande interesse de serem utilizadas, em casos de: a) diminuio da variabilidade gentica aditiva, nas raas economicamente mais exploradas, havendo necessidade de doao de genes capazes de gerar novas combinaes genticas; b) necessidade de resistncia gentica a doenas e parasitas, pois ao longo de sculos os animais foram continuamente expostos ao ataque de organismos infecciosos e parasitrios, sendo que muitas dessas doenas foram controladas naturalmente, permitindo a sobrevivncia das ra-
as naturalizadas; c) conservao de ecossistemas que exigem animais domsticos que historicamente produzam de forma harmnica com a regio, no havendo necessidade de grandes modificaes ambientais. CONSERVAO DE RECURSOS GENTICOS ANIMAIS NO PANTANAL A pecuria de corte representa a principal atividade econmica do Pantanal, tendo sido implantada no planalto de Camapu e plancie de Coxip e Cuiab no sculo XVIII, mostrando grande capacidade de adaptao s caractersticas especiais da regio. Durante trs sculos de competio entre animais das raas naturalizadas no Pantanal, indivduos foram eliminados, no acidentalmente, mas diferencialmente, advindo desta eliminao alteraes nas freqncias gnicas da raa. O bovino e o cavalo pantaneiros so, portanto, considerados possuidores de certas caractersticas vantajosas, comparativamente a outras raas, para sua sobrevivncia e reproduo na plancie pantaneira. A Embrapa atravs do Centro de Pesquisa Agropecuria do Pantanal (CPAP) e do Centro Nacional de Recursos Genticos e Biotecnologia (CENARGEN) vem desenvolvendo projeto de conservao atravs dos mtodos: 1) In situ - envolve a manuteno das populaes de animais em seu ambiente nativo. Nas espcies domsticas a conservao de rebanhos vivos denomina-se de conservao in situ; 2) Ex situ - envolve a preservao de animais fora de seu ambiente nativo, sendo o termo utilizado para a coleta e posterior congelamento, em nitrognio lquido, do smen, ocitos ou embries dos recursos genticos animais. Podem tambm ser preservados segmentos de DNA atravs de clulas sanguneas ou de outros tecidos. O projeto conta ainda com parceiros importantes como o Instituto de Zootecnia de So Paulo (IZ-SP), a Universidade Estadual Paulista - campus de Rio Claro - SP e a University of Kentucky - USA. Atualmente, o bovino e o cavalo encontram-se em situaes completamente diferentes em relao conservao gentica. Enquanto o bovino corre risco de extino, devido ao cruzamento absorvente com raas zebunas, o eqino est em posio mais favorvel, principalmente devido existncia da Associao Brasileira de Criadores de Cavalo Pantaneiro
(ABCCP), com sede em Pocon - MT, que trabalha na conservao e melhoramento da raa. CONSERVAO IN SITU DO BOVINO PANTANEIRO Em 1991, foi estimado, em levantamento junto aos produtores rurais, um efetivo de bovinos pantaneiros de 8.300 reses, incluindo as propriedades do norte do Pantanal e o ncleo de conservao da fazenda Nhumirim (cam-
po experimental do CPAP). Tendo em vista que 42% do total de animais sejam fmeas em reproduo, chegamos a uma estimativa de 3.500 matrizes, sendo a raa classificada como vulnervel de acordo com a classificao da FAO. O bovino pantaneiro permanece em trs tipos de propriedades de determinadas sub-regies: - Grandes propriedades situadas no Pantanal de mxima inundao nas sub-regies de Pocon e Cceres; - Pequenas propriedades situadas no Pantanal de mxima inundao, nas sub-regies de Santo Antnio de Leverger e Baro de Melgao na regio do Pantanal do Mimoso; e - Pequenas propriedades situadas
na borda do Pantanal. Em 1984, foi implantado o ncleo de conservao do bovino pantaneiro, na fazenda Nhumirim, na sub-regio da Nhecolndia. O plantel fundador foi constitudo de 40 fmeas e 5 reprodutores, oriundos de duas fazendas, Porto Jofre e So Joo, ambas no municpio de Pocon - MT. O pice do trabalho tcnico nos dez primeiros anos (84/94) foi a edio do livro intitulado Etnobiologia e Conservao do Bovino Pantaneiro, de autoria da Dra. Maria Cristina Mazza e colaboradores (1994). Um dos principais problemas na conservao so os ncleos com pequeno tamanho efetivo da populao que resulta em incremento da taxa de endogamia por gerao, e, conseqentemente, em perda da heterozigose e diversidade gentica. O ncleo de conservao in situ do bovino pantaneiro hoje composto de 55 vacas e 13 touros. A relao touro/vaca alta (praticamente 1 touro para 4 vacas) pela necessidade de aumentar o nmero de animais que contribuem com material gentico para a gerao seguinte (tamanho efetivo da populao - Ne), diminuindo a taxa de endogamia. Existem vrios mtodos de estimativa de Ne. Utilizando a expresso matemtica descrita por Crow e Kimura (1970): Ne = (4 MF)/(M + F) onde M - nmero de machos adultos, e F - nmero de fmeas adultas. Podemos estimar o Ne do ncleo em 42 indivduos. Com um percentual de incremento na taxa de endogamia por gerao de 1,2%, considerada pequena pelos programas de conservao de animais domsticos. praticamente impossvel estimar o valor adaptativo da raa de bovino pantaneiro em relao as outras criadas no Pantanal. Porm o acompanhamento reprodutivo do ncleo mostra resultados superiores (mdia de taxa de natalidade dos trs ltimos anos de 65%), em relao aos ndices tradicionais dos rebanhos de cria na regio em torno de
raas foi possvel construir um dendrograma com trs clusters distintos, com as populaes caracu, crioulo argentino, mantigueira e holandesa agrupadas em um mesmo clusters, enquanto que as raas pantaneiro e nelore ficaram em clusters isolados e distintos (figura 1). CONSERVAO IN SITU DO CAVALO PANTANEIRO O cavalo pantaneiro no corre perigo de extino, principalmente devido ao trabalho de conservao gentica realizado pela ABCCP, sediada em Pocon - MT. Atualmente a associao conta com cerca de 1.500 guas e 300 garanhes com registro definitivo. O ncleo de conservao do cavalo pantaneiro foi implantado em 1988 na fazenda Nhumirim com objetivo de conservar, avaliar e incentivar a criao da raa. Atualmente o ncleo composto de 37 guas e 3 garanhes, e os animais vm sendo avaliados em relao ao desempenho reprodutivo. O crescimento vem sendo acompanhado atravs de pesagens e medidas corporais visando definir a curva de crescimento em condies naturais. Vale ressaltar que as universidades de Mato Grosso (UFMT) e de Mato Grosso do Sul (UFMS) tambm possuem ncleos de criao da raa. Em paralelo ao trabalho de caracterizao zootcnica dos ncleos, duas aes de pesquisa de importncia para raa vm sendo desenvolvidas: - Anlise da fisiologia do esforo, que envolve avaliao do desempenho e do tipo de fibra muscular da raa, sendo realizada em parceria com a UNESP - Rio Claro. - Caracterizao gentica atravs da anlise de 10 sistemas bioqumicos e 7 grupos sanguneos, visando estimar a variabilidade e similaridade gentica, alm do nvel de endogamia, sendo desenvolvido em conjunto com a University of Kentucky. Para anlise da fisiologia do esforo foi realizada uma prova de resistncia, numa distncia de 76km atravs de passo trotado, sendo coletadas amostras de sangue, antes, no meio e ao final da prova. Tambm foi colhido sangue aps um perodo de descanso de 30 minutos. Os resultados preliminares mostraram um aumento significativo dos nveis sricos mdios de glucose e cidos graxos livres (AGL) no decorrer da prova. Aps o descanso os nveis de AGL diminuram e os de
50% de taxa de natalidade. Embora os pesos dos animais em crescimento serem considerados baixos, tanto os tourinhos quanto as novilhas apresentam maior precocidade sexual do que o gado anelorado comum no Pantanal. As novilhas pantaneiras, recriadas extensivamente, possuem idade primeira cria (IPC) mdia de 24,95 meses. J as aneloradas possuem IPC, no Pantanal, estimada em 47,76 meses. Analisando o crescimento testicular dos tourinhos, verificamos que aos 365 e 550 dias a circunferncia escrotal observada foi de 18,20 e 25,02cm, res-
atividade que vem se desenvolvendo no Pantanal. A raa pantaneira foi includa em uma ampla avaliao da variabilidade gentica, atravs de polimorfismos de protenas, que inclui seis raas de bovinos. Esta avaliao vem sendo realizada pela Dra. Maria Aparecida Lara do IZ-SP, tendo o CPAP como um dos parceiros. Nas seis raas estudadas (pantaneiro, crioulo argentino, holands, mantiqueira, caracu e nelore), foram estimadas as freqncias gnicas de oito locos estruturais (hemoglobina, anidrase carbnica, peptidase-B, fosfogliconato
pectivamente. As medidas so semelhantes s de tourinhos da raa nelore que fazem parte do Programa de Melhoramento Gentico da Raa Nelore (1996). O principal ponto de estrangulamento na conservao do bovino pantaneiro a no-existncia de uma associao de criadores que garanta a conservao e difuso da raa. A partir do momento em que os animais forem valorizados economicamente, haver o interesse na formao de novos ncleos de criao, podendo a raa ser utilizada em programas de cruzamento e tambm em propriedades com interesse de trabalhar com o ecoturismo,
desidrogenase, superxido dismutase, amilase-I, transferrina e albumina). A raa pantaneira foi a que apresentou a maior variabilidade gentica, sugerindo a participao de 32,12% de genes de origem espanhola, 31,76% de genes de origem portuguesa e 36,12% de genes zebunos. Portanto, baseado nas ocorrncias de alelos especficos, atualmente h participao de genes ibricos e zebunos, e apesar destes, o ncleo ainda retm um pool gnico que lhe confere adaptabilidade s condies ecolgicas do Pantanal. Atravs das estimativas das distncias genticas padronizadas (Ds) entre as seis
glucose aumentaram. Isto demonstra que os animais utilizaram glucose e AGL, mas que a mobilizao dos substratos energticos dependeu da condio fsica e treinamento. No final da prova os animais perderam cerca de 7% do peso corporal, mas no apresentaram nenhuma disfuno metablica, demonstrando adaptao e resistncia s condies ambientes. A caracterizao gentica primordial para qualquer programa de conservao de recursos genticos. Numa amostra de 100 animais da raa pantaneira foi verificado que a variao gentica individual (Ho) dentro da raa foi levemente maior que a mdia para 103 populaes de cavalos domsticos (0,387 e 0,375, respectivamente). Conseqentemente, no h preocupao imediata sobre a variao gentica reduzida dentro da raa, desde que se mantenha o tamanho da populao e sem mudanas nas prticas de acasalamento. Os dados de variabilidade gentica no indicam uma grande influncia de cruzamentos recentes na raa, embora se saiba que no tem havido um completo isolamento da raa. Por outro lado, o alto grau de adaptao da raa ao ambiente do Pantanal suporta fortemente este isolamento. As relaes genticas de uma raa com outras podem ser determinadas atravs do coeficiente de similaridade (S) e distncia gentica (Da). As medidas de S e Da da raa com outros grupos de cavalos domsticos so apresentadas na tabela 1. A mdia mais alta de S foi com as raas da Pennsula Ibrica com um
valor mdio de 0,871. Na anlise da filogenia, o pantaneiro pareou com o manga-larga cujo clusters incluiu as raas brasileiras campolina e mangalarga marchador. Este resultado foi considerado surpreendente visto que a similaridade gentica do pantaneiro com o manga-larga foi relativamente baixa (0,853). A principal concluso desta anlise que todas as raas brasileiras so estreitamente relacionadas umas com as outras. CONSERVAO EX SITU DO BOVINO E DO CAVALO PANTANEIROS
Como j mencionado anteriormente, a conservao de smen e de embries em nitrognio lquido, a -196oC, denominada de conservao ex situ. O CENARGEN conta com um Banco de Germoplasma Animal (BGA) no qual so estocadas doses de smen e embries de diversas raas e/ou espcies de animais domsticos ameaadas de extino. A fim de aumentar a quantidade de material gentico do bovino e do cavalo pantaneiros estocado no BGA, doadores entre os animais mais repre-
sentativos de cada uma destas populaes foram levados para a Fazenda Experimental do CENARGEN, localizada em Braslia - DF. Os touros pantaneiros tm permanecido na coleta de smen at que um mnimo de 200 doses tenham sido coletadas e congeladas. A literatura sugere que os doadores, alm de representativos da raa, devam ser o menos aparentados possvel e que o mnimo de doses coletadas por touro dever ser 100. Como se prev que algumas doses passem a ser utilizadas, estabelece-se este mnimo nas 200 mencionadas. At o momento foi impossvel estabelecer o nmero mnimo de embries que cada doadora dever deixar no BGA, embora se saiba que a literatura estabelece um mnimo de 25 embries/doadora. Tal dificuldade decorre do fato de as vacas das raas naturalizadas (entre as quais se inclui a raa pantaneira) no responderem ao tratamento de superovulao de forma semelhante s doadoras de raas comerciais. Desta forma, h necessidade de se realizar mais estudos sobre a coleta de embries nas raas naturalizadas, a fim de se ajustar o processo como um todo. Os problemas acima mencionados vm indicando que uma das possibilidades futuras ser o congelamento de ovcitos. Assim sendo, se a longo prazo se decidir produzir animais a partir do material estocado no BGA, os pesquisadores descongelariam o smen (gameta masculino) e o ovcito (gameta feminino) e os utilizariam na fecundao in vitro. O produto desta fecundao in vitro seria ento transferido para uma receptora. A grande vantagem nesta forma de conservao que no futuro, quando se espera ter caracterizado geneticamente todos os doadores, os pesquisadores podero fazer um acasalamento dirigido, utilizando o smen e o ovcito dos animais mais indicados. A conservao ex situ de eqinos bastante mais complexa. Em primeiro lugar, porque embora o garanho ejacule um volume muito maior do que o touro, a concentrao de espermatozides muito menor. E em segundo lugar, porque as guas no respondem superovulao. Assim sendo, a produo de material para armazenamento no BGA muito mais lenta com eqinos do que com bovinos.
PRAGAS
Agnes Melo e Tatiana Flores da Fonseca
AMEAA CONSTANTE
Ministrio da Agricultura e do Abastecimento concluiu um levantamento mostrando que cerca de 38 pragas no-existentes no Brasil, sendo que a maioria est presente nos pases vizinhos, como Venezuela, Bolvia e Guiana Inglesa, podem entrar no pas a qualquer momento, caso nenhuma medida de preveno seja adotada. Para se evitar a introduo dessas pragas no pas, ser feito um alerta mximo, por meio de portaria, que ser publicada em breve, pela Secretaria de Defesa Agropecuria do Ministrio da Agricultura e do Abastecimento, sobre as pragas quarentenrias, que so aquelas noexistentes no pas (quarentenria A1), ou, se existentes, encontrando-se sob controle ativo do governo federal (quarentenria A2). O alerta ser dirigido especialmente aos fiscais agropecurios dos postos de fronteira, portos e aeroportos, para intensificar a fiscalizao nos locais e produtos de maior risco, s empresas de transportes internacionais e aos passageiros, que s podero trazer vegetais de outros pases se cumprirem as normas da legislao vigente no Brasil. As trs pragas com maior potencial de risco de introduo no pas so a cochonilha rosada (Maconellicoccus hirsutus), que ataca cerca de 200 gneros de plantas, como citrus, cacau, mamo, hortalias, caf, uva e ornamentais; o amarelecimento-letal-das-palmeiras (Phytoplasma palmae), que ataca o coco e outras palmceas; e a Sternochetus mangifera, que ataca os frutos da mangueira. Todas essas pragas se encontram em pases prximos ao Brasil. Segundo a Conveno Internacional de Prote22 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
o dos Vegetais, promulgada pelo decreto 318 de 31 de outubro de 1991, seguido por cerca de 140 pases do mundo, praga significa qualquer forma de vida vegetal ou animal, ou agente patognico, daninho ou potencialmente daninho para os vegetais ou produtos vegetais, como vrus, insetos, fungos, bactrias e ervas daninhas. A portaria de alerta mximo de pragas quarentenrias determinar que a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa) elabore planos emergenciais de preveno e controle no caso da ocorrncia de alguma dessas pragas no Brasil; e um aviso aos engenheiros agrnomos de todo o pas para redobrarem a ateno quanto ocorrncia dessas pragas, alm da obrigatoriedade de notificao junto ao rgo do Ministrio da Agricultura e do Abastecimento mais prximo no caso de suspeita de introduo das pragas mencionadas na portaria. Essa norma estabelecer, ainda, que as Delegacias Federais de Agricultura divulguem os alertas quarentenrios para seus fiscais agropecurios, profissionais que atuam na rea de controle de trnsito internacional de vegetais e seus produtos, e aos meios de comunicao interessados no trabalho de divulgao do alerta. As empresas de transporte internacional, areo, terrestre e martimo devero informar aos seus clientes sobre a proibio do transporte de vegetais e seus produtos, que possam hospedar pragas sob qualquer forma, inclusive os originrios ou que estiveram em trnsito antes do destino no Brasil por regies onde existam as pragas listadas. Haver tambm um trabalho de esclarecimento mostrando que o no-cumprimento das disposies na portaria sujeitar os infratores
ao disposto no Decreto-lei n 24.114, publicada do Dirio Oficial de 4 de maio de 1934, que probe o trnsito de vegetais e partes de vegetais portadores de doenas ou pragas perigosas, de insetos vivos, caros e outros parasitas nocivos s plantas, e ao que diz o Cdigo Penal sobre o tema, que prev pena de recluso de dois a trs anos para o responsvel pela introduo de pragas no pas. Cochonilha rosada Uma das principais pragas com o risco de entrar no pas a cochonilha rosada, inseto que est localizado em muitos pases tropicais e atualmente encontra-se na Guiana Inglesa. Ela pode entrar pela Regio Norte do pas, principalmente pelos estados de Roraima e Par, sendo de fcil disseminao para outros estados, atacando culturas de importncia econmica, como as da famlia Malvaceae (algodo e plantas ornamentais), cacau e citrus. Ela pode chegar ao Brasil facilmente, atravs do transporte de frutas infestadas ou de passageiros que transportam vegetais vivos. Alm disso, a cochonilha um inseto muito pequeno, protegido por uma camada de cera branca, e pode vir disseminado at nas roupas dos passageiros. Quando a cochonilha ataca a planta, ela diminui a velocidade de crescimento desta, causando m-formao e murchamento das folhas e frutos, resultando em reduo de produtividade. Segundo a tcnica especialista em entomologia da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa) Denise Nvia, as Delegacias Federais de Agricultura desses estados j esto em alerta, principalmente nas regies de fronteira, para que qualquer foco da praga detectado seja controlado, havendo a possibilidade de erradicao imediata. O principal mtodo para evitar a entrada de produtos infestados por pragas de outros pases a inspeo de vegetais e produtos vegetais, alm da bagagem de passageiros nas fronteiras. O Ministrio da Agricultura e do Abastecimento j comeou a divulgar informaes para os fiscais, para que eles alertem os passageiros quanto importncia da preveno, evitando que eles tragam produtos vegetais de outros pases, onde pode haver a incidncia de pragas quarentenrias. A Diviso de Vigilncia e Controle de Pragas do Ministrio da Agricultura j distribuiu 12 mil alertas em 97, descrevendo seis pragas com o risco de entrar no pas, e j esto sendo produzidos mais 11 alertas para serem colocados disposio das Secretarias
de Agricultura dos estados, agrnomos, produtores e fiscais. Somente o alerta da mosca-branca, praga que j causou prejuzos da ordem de R$ 500 milhes para o Brasil, foram distribudos cerca de 10 mil exemplares. O objetivo do alerta mximo conscientizar quanto ao controle e preveno das pragas, atravs da distribuio de folhetos, cartazes e implantao de planos emergenciais de preveno e controle elaborados pelo Ministrio da Agricultura e do Abastecimento e pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa). Os manuais contm explicaes sobre a identidade da praga, distribuio geogrfica, hospedeiros, controle e preveno, risco fitossanitrio e importncia econmica. No Caribe e na Guiana Inglesa, que esto prximos do Brasil, j existem programas de controle da cochonilha rosada. Denise Nvia explicou que os tcnicos desses pases usam o controle qumico e o biolgico. "Com produtos qumicos fica difcil o controle, pois a praga apresenta estratgias de resistncia, sendo encoberta com uma cera, que a protege da ao de agrotxicos, alm de o inseto viver em reas protegidas, tais como fendas e rachaduras de cascas de rvores. J o controle biolgico, que ainda est sen-
do desenvolvido no Brasil como medida preventiva, o melhor mtodo, pois utiliza inimigos naturais da cochonilha para combat-la, como joaninhas da espcie Cryptolaemus montrouzieri e vespas que parasitem a cochonilha, como a da espcie Anagyrus kamali". Tambm como parte da estratgia do Brasil de evitar a entrada da cochonilha rosada, os pesquisadores do Centro Nacional de Pesquisa e Monitoramento Ambiental (CNPMA), localizado em Jaguarina, So Paulo, esto realizando estudos com inimigos naturais da praga, como mtodo de preveno. Caso a praga entre no pas, os inimigos naturais no podem ser introduzidos imediatamente e liberados nas culturas agrcolas, pois so necessrios cuidados quarentenrios e estudos sobre o impacto ambiental que causam. Por isso necessrio um trabalho preventivo antes da introduo ou estabelecimento da praga no pas. Segundo Denise Nvia, os agricultores brasileiros no esto preparados para combater a cochonilha, pois os mtodos de controle biolgico ainda esto sendo pesquisados no Brasil e os produtos qumicos usados para combat-la ainda no foram registrados, ou esto sendo utilizados para controlar outra praga, sendo necessrio fazer
a extenso de uso, para controlar a cochonilha. Os produtos que ainda no foram registrados podem levar at um ano para serem utilizados pelos agricultores, tempo suficiente para a disseminao da praga. Para evitar que ela se alastre, os primeiros focos devem ser extintos com a queima de restos culturais e poda da planta afetada. Amarelecimento-letal-das-palmeiras Para evitar a entrada de outra praga que traz prejuzos aos produtores, o ex-ministro da Agricultura, Arlindo Porto, assinou a portaria 70, do dia 5 de maro de 98, proibindo, a partir de 5 de maio, a importao de qualquer planta hospedeira da praga conhecida como amarelecimento-letal-das-palmeiras, que ataca a famlia das palmceas, como coco e macaba, plantas ornamentais e aa. Com a portaria, o Brasil quer preservar a sanidade do cultivo de palmceas do pas que so importantes para o mercado interno e externo. A importao desses produtos s ser permitida quando feita a anlise de risco de pragas, garantindo que o pas exportador livre da praga ou apresenta garantias fitossanitrias quanto sanidade do lote a ser exportado. O Brasil proibiu, por exemplo, a importao de coco dos pases da Amrica Central, Caribe e de alguns pases da
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sia, onde existe a incidncia da praga. Segundo o chefe da Diviso de Vigilncia e Controle de Pragas do Ministrio da Agricultura, Odilson Ribeiro, o controle deste micoplasma difcil, pois os vetores que o disseminam esto presentes na pas: "A importncia da portaria sobre o alerta mximo que ela evita um aumento de custo para os agricultores brasileiros, que tm que utilizar produtos qumicos e novas prticas agrcolas para o seu controle no caso de entrada de nova praga quarentenria. Alm disso, a competitividade dos produtos brasileiros pode ser preservada, devido a menores restries quarentenrias para exportao e menor impacto ambiental pela no-utilizao de maior quantidade de agrotxicos". Sternochetus mangifera Mais uma praga que pode entrar no pas a Sternochetus mangifera, coleptero que ataca os frutos da mangueira. H notificao que a praga est localizada na Venezuela e pode vir para o Brasil por meio do transporte de material hospedeiro, trazido por passageiros. Nos casos onde h maior risco da praga entrar no pas, seria necessria a inspeo do produto no seu pas de origem, por tcnicos brasileiros, que deveriam ir at as regies produtoras do pas exportador fazer a anlise de risco e inspeo de pr-embarque. Isso garantiria maior segurana quanto qualidade fitossanitria, e prtica comum no Servio de Agricultura dos Estados Unidos. Segundo o Coordenador de Proteo de Plantas do Ministrio da Agricultura, Joo Carlos de Souza Carvalho, nos ltimos anos, foram introduzidas pragas, como a moscabranca e minador da folha de citrus, por falta de fiscalizao fitossanitria e vigilncia nos postos de fronteira, portos e aeroportos. Por isso, importante a atualizao dos fiscais quanto ao reconhecimento da praga, o comportamento reprodutivo e sua ecologia. Sigatokanegra O fungo causador da doena conhecida como sigatoka-negra (Mycosphaerella fijiensis), que afeta o crescimento e produtividade das bananeiras, acaba de ser introduzido no Brasil, onde existem 520 mil hectares de bananais. Um relatrio, elaborado por tcnicos da Embrapa do Amazonas, acusa o aparecimento da doena nos municpios de Tabatinga, Benjamin Constant e Coari. A sigatoka-negra foi encontrada nos cem hectares vistoriados no Estado do Amazonas e pode entrar, tambm, em Roraima. Segundo
Odilson Ribeiro, ela deve ter sido propagada por mudas da Colmbia e do Peru, transportadas pelo rio Solimes. A sigatoka-negra considerada a doena mais grave das bananeiras, e j dizimou pomares na frica, sia, Amrica Central e Amrica do Sul, deixando-os improdutivos. O Brasil, que o segundo maior produtor mundial de banana, nunca tinha registrado a doena. No documento enviado ao Ministrio da Agricultura, os tcnicos da Embrapa pedem medidas emergenciais para controlar a doena e alertam sobre a dificuldade de controlar o transporte de mudas no Estado do Amazonas, principalmente no rio Solimes, onde no existem barreiras fitossanitrias. O Ministrio da Agricultura e do Abastecimento est convocando especialistas sobre a praga e fiscais para examinarem os pomares do Amazonas e sugerirem medidas de defesa sanitria vegetal. O controle da sigatoka-negra se d atravs do uso de fungicidas, de preferncia sistmicos, os quais apresentam maior eficincia quando aplicados em mistura com leo para uso agrcola e tambm pode ser feita a poda sanitria das folhas, que consiste em eliminar, a cada semana, na estao chuvosa, e a cada duas semanas, na seca, as partes das folhas necrosadas pela ao do patgeno. Esse mtodo diminui a intensidade de novas infeces. Existem produtos no Brasil registrados para outras pragas, que, com extenso de uso, podem ser usados para combater a sigatoka-negra. Uma das medidas que eram usadas para evitar a entrada da Mycosphaerella fijiensis no Brasil constava na portaria 128, de 18 de julho de 94, que probe a importao de mudas e frutos da bananeira produzidos em pases onde o fungo est presente. Tetranychus pacificus Um caro que entrou no pas por meio de frutas importadas e foi rechaado, podendo entrar novamente, o Tetranychus pacificus. Em So Paulo, j foram interceptados carregamentos de pssegos e nectarinas infestados pelo caro. O governo brasileiro incinerou, ainda no Aeroporto Internacional de Guarulhos, cerca de 17,5 toneladas das frutas, avaliadas em R$ 93,5 mil, vindas da Califrnia, Estados Unidos. O caro, que de importncia quarentenria para o Brasil, apresenta cerca de 50 hospedeiros, entre eles, o citrus, ma, milho e soja, alm de estar presente nos pases da Amrica do Norte (Canad, Estados Unidos e Mxico), que exportam para o Brasil.
O Tetranychus entrou no Brasil por falta de controle adequado nos produtos importados nos pases de origem. E agora pode ser introduzido atravs da importao de uvas, mudas de videiras, mas, pssegos, ameixas e meles, vindos dos Estados Unidos, pas que exporta esses produtos para o Brasil. S em 96, foram importadas, dos Estados Unidos, 100 toneladas de uva, 500 toneladas de pssego, 200 toneladas de ameixa e 150 toneladas de nectarina. Neste caso, como o Brasil no apresenta fronteira com pases que tm este caro, a melhor maneira de prevenir a sua entrada a inspeo rigorosa de passageiros, cargas e bagagens, assim como de vegetais e de produtos vegetais, oriundos desses pases. O Brasil ainda no adota o sistema de inspeo na origem dos produtos que sero importados, como os Estados Unidos faz com o Brasil quando importa mangas brasileiras. Nesse caso, o custo da inspeo paga por produtores nacionais. Cydia pomonella Uma praga que est no Brasil, mas est sendo controlada pelo governo federal (quarentenria A2) a Cydia pomonella, que provavelmente foi introduzida junto com mas vindas da Argentina. Ela apresenta distribuio restrita, em reas dos estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina, onde est sendo feito um monitoramento da rea infestada e das proximidades, com armadilhas de feromnio, que atraem a praga e impedem sua disseminao. Esta mariposa originria da Europa e da sia, e est estabelecida em todas as reas que cultivam ma, exceto no Japo, parte da China, Coria e Brasil. No Brasil, ela no foi detectada em pomares comerciais, somente em reas urbanas, no havendo no mercado produtos qumicos que combatam a praga. Tambm esto sob controle do governo federal, como as pragas quarentenrias A2, o cancro-ctrico, que ataca frutas ctricas, a Tilletia indica, que afeta as plantaes de trigo e a mosca-da-carambola, que ataca frutas em geral. Segundo o secretrio de Defesa Agropecuria do Ministrio da Agricultura, nio Marques, a publicao da portaria de alerta mximo quarentenrio ser fundamental para que os centros de pesquisa comecem a desenvolver os modelos de vigilncia e erradicao das pragas de maior risco. "A portaria ser importante, pois colocar a comunidade em alerta quanto ao perigo que essas pragas representam para a agricultura brasileira".
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OPINIO
JUSTAPOSIES COMO INVENTO CIENTFICO

A LEI DE PATENTES E A BIOTECNOLOGIA
e o final do sculo XX pode ser reconhecido como a era dos computadores, com absoluta segurana, o sculo XXI j nascer na era da biotecnologia. Constituindo uma cincia complexa, amlgama de cincias como a engenharia gentica, microbiologia, bioqumica, entre outras, a biotecnologia tornou-se alvo dos olhares atentos da comunidade internacional. Novas formas de vida, novos tipos de alimentos nunca encontrados na natureza, a possibilidade de descoberta de doenas muitos anos antes de virem a se manifestar, a terapia gnica, bem como a biodiversidade da Terra, entre eles o mar, campos, florestas, ar e o solo, so exemplos do que poder ser alcanado ou atingido com o avano desta cincia. Todavia, o emprego e a prtica desta nova tecnologia em nossa sociedade necessitam da devida ateno da comunidade jurdica, e por devida ateno entende-se discutir seus efeitos, abrangncia e aplicabilidade no apenas do ponto de vista interno, mas sim com observncia internacional. A INTERAO NECESSRIA Como cincia do comportamento, o direito se responsabilizar pela harmonizao e regularizao dos atos dos homens que usufrurem deste novo tipo de conhecimento. O escopo do direito biotecnolgico no e nem ser o de sobrestar o avano cientfico nem social que a biotecnologia certamente viabilizar ao mundo. Neste contexto, os direitos de propriedade sobre os produtos biotecnolgicos possuem grande importncia para a evoluo e desenvolvimento desta tecnologia, pelos diferentes personagens que atuam na rea, entre eles o Estado, os meios acadmicos e o setor privado, sendo este ltimo atualmente quem mais investe no desenvolvimento e pesquisa biotecnolgica. As questes sobre a titularidade deste direito, que viger a partir das descobertas intelectuais do homem, sero imprescindveis para o futuro da sociedade, como ns a conhecemos. Na atualidade, um dos problemas enfrentados pelos que atuam nesta rea consiste em ajustar s suas criaes o conceito de inveno, critrio sine qua non para ser as mesmas objetos de privilgio de patente pela Lei de Propriedade Industrial - Lei 9.279/96. Sem dvida, inmeras so as questes ainda hoje duvidosas sobre quais os produtos biotecnolgicos que podem lhes ser atribudo o carter de inveno. Na maior parte das legislaes nacionais, inclusive na brasileira, ao se tentar definir inveno costumeiro fazer a distino entre a mesma e a descoberta, sendo a segunda excluda do privilgio da patente. AIguns pases, todavia, usaram as duas palavras como sinnimos, gerando celeuma na jurisprudncia internacional. Nos dias atuais, salvo uma minoria de pases orientais, no se privilegia descoberta e sim inveno, porm persiste o problema da distino. A NOVIDADE NA BIOTECNOLOGIA No campo da biotecnologia, alguns elementos, destacados por Joseph Strauss (apud Douglas Gabriel Domingues - Privilgios de Inveno, Engenharia Gentica e Biotecnologia, Forense, Rio de Janeiro, 1989, p.93/94), devem ser levados em conta no que pertine patenteabilidade de produtos biotecnolgicos: 1) As novas tecnologias no campo da biotecnologia so em inmeros casos baseadas em descobertas cientficas, e
Cludio O. Mattos Advogado da Demarest e Almeida omattos@uol.com.br

Fotos cedidas pelo autor.
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2) O material bsico de trabalho desta rea provm de matria viva, entre eles plantas, microrganismos e DNA, constituindo um interessante objeto de discusso sobre a questo de reconhecer quando o produto final alterado foi objeto de uma descoberta e justaposio ou inveno. Ressalta-se que o problema no discutir se os produtos biotecnolgicos so privilegiveis, mas, sim, saber se a descoberta e justaposio de matrias naturais, ao originar algo novo, inalcanvel pela natureza, adicionado ao estado da tcnica, fruto do intelecto e da atividade inventiva do homem e suscetvel de aplicao industrial, pode ser objeto de patente. Como bem observa Paul Mathly (In Brevet d'inventions, Journal des Notaires et des Avocats, s.d., Paris), inventar criar o que ainda no existe, uma formulao do pensamento referente a qualquer coisa que aparece pela primeira vez. Sendo suscetvel aplicao industrial e resultante do labor intelectual humano e de sua capacidade inventiva, o problema da concesso de privilgio de patente s "descobertas cientficas", sob a tica da legislao brasileira, encontra bice apenas quanto ao critrio da novidade. A LEI A exigncia da novidade como requisito indispensvel, disposta no artigo 8 da Lei 9.279/96, que regula os direitos e obrigaes relativos propriedade industrial, deve ser objeto de estudos e cuidadosas interpretaes quando confrontada com fatos gerados pelas novas
cincias e tcnicas, as quais nos referimos no incio deste comentrio. No contexto atual, de acordo com o artigo 10 da lei em epgrafe, no so consideradas invenes as descobertas cientficas e, portanto, no-suscetveis de patente. O que o legislador deixou de considerar foi o avano tcnico e o pioneirismo do homem em explorar e alterar a realidade que no enxergamos, ou seja, sua atuao no mundo microscpico. Aplicando este conceito de novidade absoluta inserido na lei, o legislador, no meu entender, injustamente, iguala os desiguais ao comparar descobertas no menos importantes do que outras, porm fruto apenas e to-somente de uma observao e pesquisa apuradas, com descobertas e justaposies inventivas, fruto no s do reconhecimento e pesquisa pelo homem, mas de sua atuao direta empregando meios e ambientes apropriados e complexos para a revelao de um novo produto, isolado e diferente dos encontrados na natureza at o determinado momento. Encontramos na jurisprudncia internacional posicionamento e esforos em direo uniformizao do tema ento discutido. Oportunos so os exemplos elencados pelo ilustre Douglas Gabriel Domingues (Privilgios de Inveno, Engenharia Gentica e Biotecnologia, Forense, Rio de Janeiro, 1989, p.112). O caso Menthonthiole, na Alemanha, ficou clebre por estabelecer que a novidade de um produto da natureza deve ser reconhecida desde que confirmado que um complexo esforo intelectual foi necessrio para o reconhecimento da inveno.
Ainda nesse pas, no caso Antonamide, a Corte Federal de Patentes firmou o princpio de que o simples fato de existir a substncia na natureza no basta por si s para prejudicar a novidade do invento, provado que os profissionais do ramo no esto cientes de sua existncia. De acordo com este entendimento, portanto, as justaposies oriundas de materiais encontrados na natureza podem ser objeto de patente desde que atendidos os critrios estabelecidos em lei e que comprovadamente dem origem a algo fruto de um alto grau de inventabilidade, tamanha a complexidade que envolve as atividades biotecnolgicas. O acrscimo ao estado da tcnica, a complexidade do meio em que se trabalha, a capacidade e a criatividade intelectual do homem formariam elementos suficientes para conceder o carter de novidade justaposio cientfica ou, como alguns autores preferem denominar, de "descoberta cientfica". Destarte, o critrio da novidade absoluta em algumas legislaes internacionais, como por exemplo a brasileira, deve ser objeto de nova discusso, a fim de se evitar recuos ou desmotivaes por partes daqueles que desenvolvem rduas pesquisas e altos investimentos tanto de carter pessoal como financeiro na rea das novas cincias, entre elas a biotecnologia. A correta criao, interpretao e aplicao da lei nesta rea ser parte de uma poltica estratgica para um desenvolvimento sustentvel da comunidade mundial. O debate est a.
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ENTREVISTA
Agronegcio une pases e soma investimentos

JONATHAN MALKIN, diretor geral da ATP
Entrevistaconcedida a Lucas Tadeu Ferreira e Maria Fernanda Diniz Avidos
os ltimos trinta anos, a populao mundial passou de 3,1 para mais de cinco bilhes de habitantes. Por volta do ano 2035, se mantidas as taxas de crescimento, a populao mundial dever duplicar, o que levar a um aumento dramtico no consumo de alimentos, enquanto as reas cultivadas, devido a questes ambientais, permanecero praticamente as mesmas em termos de espao ocupado. O conhecimento tecnolgico um dos principais instrumentos disponveis para que o agronegcio possa enfrentar os desafios do prximo milnio, decorrentes do aumento populacional, demanda por melhoria da dieta alimentar, escassez de terras cultivveis e segurana alimentar. Estima-se que o consumo dirio de calorias, em nvel mundial, que hoje de 14 trilhes de quilocalorias, chegar a 20 trilhes no ano de 2015, e a 27 trilhes no ano de 2050. Se no houver investimento macio em desenvolvimento e comercializao de tecnologias do agronegcio, no ser possvel atender a essas assustadoras demandas nutricionais. A Agricultural Technology Partners - ATP um fundo especializado de investimentos dedicado ao desenvolvimento do agronegcio em nvel mundial, que tem interesse em realizar investimentos nos pases do sudeste asitico e da Amrica do Sul. O diretor geral da ATP, Jonathan Malkin, esteve no Brasil acompanhado do diretor do Comit Assessor de Cincia, Nam-Hai Chua, que tambm chefe do Laboratrio de Biologia Molecular de Plantas da Rockfeller University. Durante a sua estada no Brasil, Malkin visitou o Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genticos e Biotecnologia - Cenargen, uma das 39 unidades de pesquisa da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria - Embrapa, com o objetivo de identificar projetos de pesquisa de biotecnologia vegetal e animal passveis de formao de parceria. Malkin formado em Master Business Administration - MBA pela Universidade de Harvard, tem experincia no gerenciamento de empresas de cincia e tecnologia e acredita que o agronegcio o principal caminho para colocar o Brasil como quinta potncia mundial nos prximos vinte anos, devido s suas dimenses geogrficas e condies geopolticas. Nesta entrevista revista BIOTECNOLOGIA Cincia & Desenvolvimento, ele externou seu interesse em investir recursos financeiros nas pesquisas de biotecnologia agrcola que vm sendo desenvolvidas no Brasil.
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BC&D - Como o senhor v o potencial da biotecnologia agrcola hoje e no futuro? Malkin - A biotecnologia tem um potencial inestimvel de incremento da agricultura. A biotecnologia o campo da cincia e da tecnologia que melhor se nos apresenta para enfrentar as demandas crescentes de alimentos mais nutritivos e saudveis, j que hoje o instrumento mais eficiente utilizado no desenvolvimento de novas variedades resistentes a pragas, com reduzido impacto ambiental. BC&D - A ATP tem como critrio de seleo de projetos a preservao ambiental? Malkin - A ATP jamais financiou ou financiar qualquer projeto de pesquisa ou agronegcio que possa causar danos ao meio ambiente. Na realidade, ns da ATP somos muito rigorosos na anlise e aprovao dos projetos que vamos financiar ou formar parcerias. A preservao ambiental uma das nossas principais preocupaes. E no poderia ser diferente. A presso dos consumidores atualmente muito forte em relao questo da preservao ambiental. BC&D - O senhor poderia descrever de maneira sucinta a situao atual e perspectivas da biotecnologia nos EUA? Malkin - A biotecnologia comeou a se mostrar uma ferramenta eficiente nos EUA, a partir do incio da dcada de 70 e, hoje, no limiar do terceiro milnio, a biotecnologia j se espalhou por quase todo o mundo e tem produtos sendo amplamente comercializados nas reas de sementes, animal, microrganismos e sade humana, entre outras. Os produtos biotecnolgicos vm ocupando vrios segmentos de mercado e apontam cenrios bastante promissores tanto para os EUA como para os demais pases. BC&D Quantos produtos transgnicos aproximadamente esto sendo comercializados hoje nos EUA e quais poderiam ser destacados pelo senhor? Malkin - Existem "dzias" de produtos biotecnolgicos sendo comercializados no mercado norte-americano. Hoje, muito difcil enumer-los, j que a cada dia surgem novos produtos transgnicos a partir de vegetais, animais e microrganismos. Para se ter uma idia, somente com Bt (Bacillus thuringiensis), existem mais de 50 produtos agrcolas resistentes a pragas e muitos outros resistentes a herbicidas, como algodo, soja, milho etc. Contudo, o primeiro produto agrcola
durecimento. Entretanto, todos esses produtos so modificados a partir de trs ou, no mximo, quatro genes diferentes. BC&D - Na sua opinio, como a aceitao dos produtos geneticamente modificados pelo consumidor norte-americano? Malkin - No meu pas, a populao acredita e confia muito nos rgos fiscalizadores do governo, j que a legislao muito rigorosa com os infratores. Portanto, as pessoas sabem que para que um produto chegue ao mercado consumidor, ele j foi testado, no causa problemas sade humana e seguro. Alm disso, o consumidor norte-americano espera que esses produtos melhorem a sua qualidade de vida. Os produtos transgnicos com Bt so os que tm melhor aceitao por parte da opinio pblica, pois h uma expectativa de que eles reduzam o emprego de agrotxicos nas lavouras. Um produto que conquistou a opinio pblica americana foi o algodo transgnico com Bt, resistente a insetos. Como os produtos com Bt reduzem a utilizao de agrotxicos e, conseqentemente, os custos de produo, os produtores tm ficado muito satisfeitos com os resultados obtidos. Em suma, a biotecnologia permite a resoluo de problemas da agricultura de forma direcionada e objetiva, sem causar estresses ao meio ambiente e sade humana. BC&D - Pelo que entendemos, a ATP um fundo de investimentos especializado em promover o financiamento do agronegcio em nvel mundial. O senhor poderia explicar como o funcionamento da ATP? Malkin - A ATP um fundo especializado de investimentos em agronegcio para a introduo de novas tecnologias ou para o aprimoramento dos mtodos de gerenciamento das tecnologias j existentes. Ela foi organizada com o propsito de investir em tecnologias indispensveis produo, processamento e distribuio de alimentos e produtos agrcolas. O agronegcio mundial vai enfrentar desafios sem precedentes nas prximas dcadas decorrentes do aumento populacional, de demandas por melhorias na dieta alimentar, escassez de terras agricultveis e segurana alimentar. A ATP acredita que o desenvolvimento e o gerenciamento de novas tecnologias sero imprescindveis para que a indstria do agronegcio possa enfrentar estes desafios.
transgnico comercializado nos EUA aconteceu em 1996 e foi o tomate "FLAVRSAVR", modificado por tcnicas de engenharia gentica para retardar o seu ama-
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BC&D - Em funo desses desafios, em que reas a ATP pretende ser mais atuante e por qu? Malkin - A ATP pretende atuar de forma mais incisiva em quatro reas, que so: desenvolvimento e comercializao de novas tecnologias de produo para melhoria da fertilidade dos solos, reduo de perdas de ps-colheita e segurana alimentar; desenvolvimento e comercializao de produtos biotecnolgicos; transferncia de tecnologias agrcolas para pases em desenvolvimento do sudeste da sia e da Amrica do Sul e aquisio de empresas de tecnologias agrcolas em processo de falncia para torn-las modernas e eficientes. A ATP participa atualmente de 15
a ATP tem na Amrica do Sul e, em particular, no Brasil? Malkin - O interesse da ATP na Amrica do Sul est centrado em oferecer alternativas para a comercializao de tecnologias de transformao gentica
de tecnologia, atravs da ATP? Malkin - A ATP identifica as empresas parceiras nas regies de nosso interesse (sudeste asitico e Amrica do Sul) e leva a tecnologia at elas, atravs de um processo direto de transferncia, de acordo com as necessidades e o perfil tecnolgico de cada uma. Contudo, a ATP se cerca de todas as cautelas tcnicas necessrias para manter o gerenciamento e o controle das tecnologias e do processo como um todo, de forma a assegurar o interesse da ATP e das empresas contratadas ou parceiras. BC&D - De que forma a ATP capta recursos para realizar seus investimentos? Malkin - Trabalhamos com instituies dos EUA e de pases da Europa e da sia que, na verdade, so tambm nossos parceiros na realizao de investimentos e transferncia de tecnologias para os pases em desenvolvimento.
e agilizar a comercializao de produtos que estejam prximos do mercado consumidor. O agronegcio nessa regio est passando por profundas modificaes e acena com grandes possibilidades de crescimento tanto internamente como em relao ao mercado externo. Por isso, a ATP pretende participar desse processo, investindo em tecnologias e formando parcerias com empresas interessadas no desenvolvi-
BC&D - Qual o perfil dos investidores da ATP? Malkin - So visionrios como ns. Na maioria, investidores privados e instituies que j vm aplicando seus recursos no agronegcio ou aquelas que no tm tradio de investir nesse setor, mas que tm base tecnolgica e ultimamente vm reconhecendo no agronegcio uma boa oportunidade de aplicao de recursos financeiros e expanso dos seus negcios. BC&D - O que motivou a sua vinda ao Brasil? Que instituies foram visitadas e por qu? Malkin - O que motivou a nossa vinda ao Brasil foi conhecer a Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia e mostrar aos pesquisadores e dirigentes o que a ATP, seu interesse na Amrica Latina, sua forma de atuao, e que possvel estabelecer parcerias com as instituies brasileiras ligadas ao agronegcio. Alm disso, estamos interessados em identificar oportunidades concretas de investimentos em empresas brasileiras e a Embrapa, por se tratar de uma empresa que tem um grande prestgio internacional, uma excelente porta de entrada no Brasil. Por isso viemos ao seu pas, exclusivamente para conhec-la.
empresas. BC&D - O senhor saberia estimar o valor do agronegcio em nvel mundial? Malkin - O agronegcio em nvel mundial movimenta cerca de US$ 5 trilhes por ano. Nos ltimos 30 anos, ocorreram mudanas significativas na produo global, distribuio e consumo de produtos agrcolas e alimentos, devido incorporao de novas tecnologias ao processo produtivo, com a conseqente melhoria da qualidade dos alimentos e outras vantagens. A ATP espera participar ativamente desse processo de evoluo e mudana tecnolgica do agronegcio. BC&D - Que interesses especficos
mento e comercializao de tecnologias agrcolas. BC&D - Como se d a transferncia
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FORMULAO DE ENTOMOPATGENOS
UMA BOA FORMULAO A BASE PARA O SUCESSO DE UM INSETICIDA MICROBIANO
Introduo A necessidade de se formular um microrganismo entomopatognico justifica-se pela utilizao deste como um bioinseticida, da mesma maneira que se usa um inseticida organossinttico. Embora os entomopatgenos possam ser aplicados puros ou na forma em que so produzidos, muitas vezes tais condies no permitem a distribuio e a cobertura homogneas. Isto pode ser conseguido pela formulao, acrescentando-se certos adjuvantes que melhoram o seu desempenho no campo, facilitam o manuseio e a aplicao e, principalmente, permitem o armazenamento sob condies onde minimiza-se o custo de armazenamento, com mnima perda das qualidades do produto. O estudo das formulaes de entomopatgenos tem avanado pouco no mundo, pois as formulaes so, em geral, guardadas com grande segredo pelas companhias que as desenvolvem, de modo que a quantidade de informao disponvel na literatura cientfica bastante reduzida. No Brasil, instituies pblicas e privadas desenvolvem seus estudos, testando produtos importados ou desenvolvendo tecnologia nacional, avaliando a eficincia no controle de pragas e vetores de doenas e a estabilidade do produto (vida de prateleira) em condies de armazenamento. Uma boa formulao a base para o sucesso de um inseticida microbiano. A possibilidade de serem obtidos produtos adequados depende das prprias caractersticas do microrganismo e sua relao com os adjuvantes e o ambiente de armazenamento. Deve-se tambm considerar os aspectos relacionados com a produo do microrganismo e a adequao do tipo de formulao a ser empregada com as caractersticas da cultura e, principalmente, com a biologia e o comportamento do inseto. Alm do potencial de uso do patgeno selecionado, a anlise econmica da formulao tambm deve ser criteriosa, uma vez que na comercializao o preo final um determinante na opo pelo produto. Portanto, as pesquisas devem ser dirigidas no sentido de se incorporar s formulaes produtos de baixo custo, preferencialmente resduos e subprodutos agroindustriais. A formulao de um agente de controle microbiolgico tem, em geral, o mesmo objetivo proposto para os inseticidas qumicos, e que em ltima anlise significa liberar o ingrediente ativo em uma forma apropriada de uso, de fcil aplicao, com alta eficincia e baixo custo. Entretanto, agentes microbiolgicos de controle apresentam problemas especficos, prprios de sua natureza biolgica e que exigem maior ateno durante esta fase do trabalho. Exposio ao calor, compostos txicos, secagem nocontrolada e condies que permitam a germinao prematura do patgeno podem inviabilizar o bioinseticida. Para tornar a explorao comercial mais vivel, o ideal seria que o produto permanecesse estvel, em condies ambientes, por pelo menos 20 a 24 meses. Em geral, pelo menos 18 meses de estabilidade so exigidos para tornar a formulao economicamente vivel. Isto nem sempre possvel com o uso de microrganismos vivos, no entanto, em alguns casos, o produto pode ser refrigerado e utilizado dentro de um perodo restrito, como o caso de nematides. Alguns estudos j realizados alertaram que, no desenvolvimento de formulaes de entomopatgenos, a pesquisa deve orientar-se para a manuteno da viabilidade e virulncia do microrganismo durante o processo de
Luis Francisco A. Alves Bilogo, prof. assist., Departamento de Cincias Biolgicas, UNIOESTE, Cascavel - PR lfaalves@unioeste.br Antnio Batista Filho Eng. agr., pesquisador cientfico, Instituto Biolgico de So Paulo, Campinas - SP 32 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
produo, de forma a se obter um produto no qual sejam preservadas ou aumentadas estas propriedades. Devem ser considerados os efeitos da temperatura, umidade e tipos de inertes sobre a estabilidade do patgeno antes e depois de ele alcanar o ambiente de aplicao. Os componentes presentes nas formulaes devem contribuir para o incremento da estabilidade, virulncia e eficcia do agente de biocontrole. Estes componentes devem, tambm, aumentar a persistncia do produto, a adesividade sobre a planta hospedeira e/ou inseto e a atratividade para a praga. A persistncia no ambiente caracterstica desejvel principalmente no caso em que o microrganismo depositado sobre a superfcie foliar, para ser ingerido pelo inseto. A maior parte dos patgenos de insetos so altamente suscetveis luz solar e exigem sistemas de proteo para prolongarem sua atividade. A quantidade reduzida de informaes sobre a compatibilidade entre os entomopatgenos e os componentes de formulaes um dos obstculos que dificultam o avano da rea e deve ser priorizada pela pesquisa. Outro ponto importante a ressaltar a necessidade de que o bioinseticida formulado seja compatvel com as tcnicas de aplicao e os equipamentos existentes, caso contrrio encontrar dificuldades para concorrer no mercado e ter sua aceitao limitada. Em geral, a aplicao de inseticidas microbianos tem sido realizada com equipamentos e tecnologia desenvolvidos para os inseticidas qumicos. Em alguns casos, pequenas adaptaes tm permitido melhor distribuio do produto microbiano no campo. Alm dessas exigncias, a formulao deve ser submetida aos testes de segurana para fins de registro e que consideram, entre outros parmetros, a pureza, a toxicidade a vertebrados e espcies no-alvo, a segurana cultura, e o risco de exploso e inflamabilidade. Devido multiplicidade de aspectos a serem considerados na formulao de inseticidas microbianos, pesquisas neste assunto devem envolver tcnicos especialistas em diversas reas. Formulaes de vrus de poliedrose nuclear de Anticarsia gemmatalis (VPNAg) semelhana dos inseticidas qumicos, muitas das pesquisas sobre formulao de vrus entomopatognicos tm sido realizadas pelo setor privado, o que torna, muitas vezes, indisponvel ao
pblico. Quanto s pesquisas realizadas pelo setor pblico, tm sido usualmente dirigidas para as misturas de tanque com vistas a aumentar a eficincia do patgeno com relao a uma determinada praga. O desenvolvimento comercial de inseticidas virais no poder deixar de considerar que as formulaes sejam biologicamente e fisicamente estveis no armazenamento e distribuio. Os vrus entomopatognicos sendo constitudos de nucleoprotenas so suscetveis a desnaturao quando expostos a altas temperaturas. Entre 38 e 42oC, foi observada perda de atividade dentro de poucos meses ou mesmo semanas. Acima de 50oC, a atividade do patgeno perdida em questo de horas ou minutos. Contudo, necessrio frisar que, em condies de campo, a temperatura tem pouca influncia na inativao do vrus, ao contrrio da radiao ultravioleta, considerada por diversos autores como o principal fator responsvel pela perda de atividade do entomopatgeno. Foi observado que preparaes de Baculovirus anticarsia expostas radiao UV apresentaram atividades significativamente reduzidas. Nesse caso, formulaes oleosas e p molhvel reduziram o impacto da radiao sobre o vrus tanto a nvel de laboratrio como de campo. A manuteno da atividade promovida pelas formulaes permite que ocorra uma reposio natural do vrus no campo, aliada contribuio dos artrpodes predadores e parasitides na disseminao do patgeno, chegando a provocar focos primrios da doena. Outro ponto importante a ser considerado a possibilidade de se aplicar o produto formulado durante todo o dia, ao contrrio das preparaes impuras de B. anticarsia, que normalmente so aplicadas ao entardecer, com vistas a minimizar os efeitos da radiao ultravioleta, garantindo assim um maior nmero de horas de atividade do vrus. A contribuio de outros fatores para inativao de viroses de insetos em condies de campo parece no ser to significante quando comparada radiao solar. A umidade relativa do ar tem pouco efeito sobre o vrus. Contudo, a umidade proveniente do orvalho encontrado sobre a superfcie das folhas pode reduzir a estabilidade do microrganismo. A remoo de vrus das plantas pela ao da chuva e do vento tem sido pouco estudada. No caso de folhagens de couve, foi observado que poucos vrus so retirados das folhas pela simulao de chuva ou lavagem. Alm das caractersticas fsicas do vegetal, as formulaes podem auxiliar na fixao do patgeno planta. Quanto ao
armazenamento de Baculovirus em ambiente, os trabalhos apresentam uma grande variao de resultados, conseqncia dos diferentes tipos de formulaes e do perodo de tempo estudado. Em todos os casos desejvel que a atividade do patgeno seja preservada por pelo menos 18 meses. Raros so os trabalhos que avaliam o efeito da umidade em formulaes de Baculovirus. Em geral, a estabilidade das preparaes virais aumenta medida que decresce a umidade do produto. Entretanto, existe relato de que o vrus de granulose de Pieris rapae foi mais estvel quando armazenado mido. Temperaturas elevadas aceleram os efeitos danosos da alta umidade. A concentrao de ons hidrognio importante para a estabilidade das formulaes de vrus durante o armazenamento. Alguns autores tm observado que Baculovirus inativado por valores extremos de acidez ou alcalinidade e sugerem que o pH de uma formulao deveria ser prximo ao da neutralidade. As formulaes podem aumentar ou inibir a alimentao da praga e provocam maior ou menor mortalidade em menor ou maior tempo. Devem possuir partculas de tamanho adequado e fagoestimulantes, para assim garantir a ingesto das toxinas ou propgulos associados aos inertes, pois, na maioria dos casos, h relao direta entre taxa de ingesto e eficincia de controle. Existem no mercado produtos fagoestimulantes para serem utilizados em mistura durante o preparo da calda, mas nem sempre os resultados tm aumentado a eficincia do bioinseticida. Os processos de produo e formulao devem ser orientados tambm com base econmica. O preo do produto deve ser compatvel com a realidade do mercado, em relao a inseticidas qumicos e demanda potencial, para que o bioinseticida possa tornar-se competitivo. A partir de 1985, o Instituto Biolgico e a ESALQ/ USP iniciaram um projeto de desenvolvimento de formulaes de Baculovirus anticarsia que resultou no estabelecimento de uma formulao oleosa dentro das caractersticas fsicas desejveis e com boa estabilidade, razovel persistncia e alta eficincia no controle de Anticarsia gemmatalis. Formulaes de fungos entomopatognicos Em funo das prprias dificuldades impostas por suas caractersticas naturais, existem poucos casos de sucesso de produtos formulados de fungos entomopatognicos, embora estes sejam bastante estudados. O grande problema est na manuteno de sua atividade ao longo do perodo de armazenamento,
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principalmente quando so preparados na forma slida. De modo geral, maior destaque dado aos Deuteromicetos, pela amplitude de utilizao, principalmente no Brasil. Ainda assim, alguns estudos j realizados no Instituto Biolgico demonstraram o sucesso de Metarhizium anisopliae formulado em p seco (fub de milho) no controle da broca dos citros (Diploschema rotundicole) ou mesmo misturado ao substrato de crescimento (arroz cozido) modo, usado no controle de diversas espcies de cigarrinhas em cana-de-acar e pastagens. Sendo, para este ltimo caso, avaliado o efeito de moagens (moinho de martelo), que no afetaram a viabilidade e tambm a compatibilidade com inertes e adjuvantes de diversos grupos qumicos, com resultados variados. Alm das preparaes slidas, existem tambm formulaes granuladas e formulaes lquidas, grnulos de miclio, encapsuladas em amido ou alginato de sdio. No caso do miclio seco, preserva-se o material vegetativo em baixa umidade, que aps o contato com o meio torna-se ativo novamente, continuando seu crescimento at a fase de reproduo. As formulaes encapsuladas, principalmente com amido, atuam de maneira similar, porm conferem maior proteo ao fungo e ainda podem fornecer nutrientes para o crescimento das hifas, podendo tambm ser includos outros produtos que venham a aumentar a eficincia do produto no campo ou aumentar a preservao. A formulao oleosa tem a vantagem de, em muitos casos, dispensar a incorporao de agentes molhantes ou adesivos, sendo estudada para o controle de gafanhotos, cigarras e moscas-brancas nos EUA e tambm no Brasil, principalmente por pesquisadores do Cenargen/ Embrapa, visando melhorar a eficincia e estabilidade de Metarhizium flavoviride para o controle de gafanhotos migratrios. Algumas formulaes especiais, como pastas e iscas, preparadas no momento da aplicao, tambm tm se mostrado bastante eficientes. Como exemplo, B. bassiana, para o controle de Cosmopolites sordidus. O fungo, produzido em arroz, homogeneizado com o substrato at se obter a consistncia pastosa, sendo aplicado sobre iscas de pseudocaules de bananeiras que j produziram e que exercem forte atrao sobre adultos da praga. Testou-se tambm a impregnao de iscas de papelo Termitrap com condios e pasta de arroz + condios e miclio seco do fungo B. Bassiana, obtendo-se excelentes resultados em condies de laboratrio e tambm no campo, com manuteno da populao bai34 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
xa durante cinco meses. Uma isca base de condios de B. bassiana (447), tendo, alm de outros inertes, amendoim como atraente, foi desenvolvida para o controle de Solenopsis spp. e outras formigas, nos EUA. Deve-se ressaltar, contudo, que produtos base de outros fungos como Hirsutella thompsonii e Verticillium lecanii foram ou ainda so comercializados em pases do hemisfrio norte, o que demonstra seu potencial. Formulaes de Bacillus sphaericus O interesse comercial pelas bactrias entomopatognicas surgiram em meados da dcada de 50, quando, atentas aos resultados de pesquisas, as indstrias ligadas rea farmacutica introduziram em sua linha de produo o gnero Bacillus. Inicialmente as variedades conhecidas tinham sua a atividade restrita a insetos da ordem Lepidoptera. Ainda hoje a variedade kurstaki utilizada na maioria dos produtos comerciais, em diferentes formulaes, sendo que outras variedades patognicas tambm a lepidpteros foram descobertas e so tambm produzidas. O grande impulso na utilizao de bactrias para o controle de insetos ocorreu aps a descoberta de variedades e isolados patognicos a larvas de culicdeos, principalmente dos gneros Culex, Anopheles e Aedes. Nestas descobertas incluem-se B. sphaericus (B.sph.) e B. thuringiensis var. israelensis (Bti). Isto porque tais agentes de controle mostravam-se altamente promissores no controle de vetores de doenas e abriam nova perspectiva de mercado a ser explorado. Atualmente, a maioria dos produtos base de Bti, sendo este utilizado no mundo todo em formulaes lquidas e slidas. O tipo de formulao a ser desenvolvido deve estar de acordo com os hbitos do inseto e tambm com as caractersticas dos locais onde se encontram os criadouros. Por esta razo que se encontram disponveis preparaes slidas flutuantes (liberao lenta) para aplicaes em reas cobertas por vegetao, visando insetos que se alimentam prximo superfcie, ou lquidas para aplicaes em reas abertas e com disperso mais rpida que atinge tambm larvas que se alimentam no fundo. No Brasil, h em andamento alguns projetos de pesquisa com formulaes de bactrias entomopatognicas utilizadas no controle de vetores. A Fundao Oswaldo Cruz (Fiocruz) desenvolve, em associao com uma empresa privada, uma formulao lquida (concentrado emulsionvel), a qual se encontra em fase de patenteamento, o que impe algumas restries com relao divulgao dos resultados obtidos. Ainda assim, os primeiros dados obtidos em
testes realizados em Montes Claros/MG garantem boas perspectivas, e os estudos de estabilidade em condies ambiente, aps 14 meses, mostraram apenas reduo de 10% na CL50. A partir de 1995, o Departamento de Entomologia da ESALQ e a Seo de Controle Biolgico das Pragas e o Centro Piloto de Formulaes de Defensivos Agrcolas, ambos pertencentes ao Instituto Biolgico de So Paulo, vm desenvolvendo, em conjunto, um projeto de pesquisa no qual visa-se uma formulao slida de B. sphaericus. Neste trabalho foram avaliados diversos isolados do entomopatgeno, obtidos de diferentes regies do Brasil e tambm realizados diversos experimentos com inertes e adjuvantes para serem incorporados formulao, avaliando-se, alm da compatibilidade, a flutuabilidade e disperso na superfcie da gua. Aps uma srie de experimentos chegou-se a uma formulao granulada (G4) preparada pelo mtodo de spray-on, usando-se como veculo sabugo de milho triturado, alm de adjuvantes que aumentam a adesividade do complexo esporo-cristal ao inerte e promovem a liberao gradativa, comprovada em testes especficos. Estudos de armazenamento em diferentes condies indicaram a proteo da formulao ao patgeno em relao temperatura elevada, pois lotes mantidos durante 60 dias a 50oC mantiveram cerca de 50% da atividade original, enquanto o preparado no-formulado neste mesmo perodo no se mostrou patognico. Alm disso, a formulao tambm apresentou maior atividade que o microrganismo no-formulado quando exposto radiao UV proveniente de lmpada germicida. Neste caso, aps 15 minutos de exposio a formulao manteve-se prxima da totalidade em sua ao entomopatognica, enquanto o no-formulado no causou mortalidade superior a 30% Atualmente, o produto em teste encontra-se armazenado h 12 meses com reduo de 30% da atividade, em testes de laboratrio (CL), mas sem qualquer prejuzo nos testes em maior escala, sendo a mortalidade obtida pelas amostras prxima de 100% em 48 horas. Estudos de campo vm sendo realizados em conjunto com a Universidade Estadual de Londrina/PR, visando avaliar o potencial do produto em condies reais, uma vez que em criadouros simulados, ricos em matria orgnica, a atividade entomopatognica frente a larvas de 3 e 4 nstar de C. quinquefasciatus foi detectada aps 18 dias, com valores prximos a 100%. Esta ltima tambm abriga um projeto de pesquisa, porm visando o desenvolvimento de uma formulao base de Bti.
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SANGUE ARTIFICIAL
Eliete Bouskela Laboratrio de Pesquisas em Microcirculao, Universidade do Estado do Rio de janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil Marcos Intaglietta Departamento de Bioengenharia, Universidade da Califrnia, San Diego, CA, EUA. Foto cedida pelos autores
MAIOR SEGURANA NO TRATAMENTO EM EMERGNCIAS
O sangue uma necessidade bsica em cirurgia e no tratamento do trauma. Sua disponibilidade um fator crtico para salvar pacientes quando h perdas de sangue graves. Seu uso, em condies ideais de assistncia mdica, estimado como sendo de 1 unidade (500ml) por 20 pessoas por ano. Entretanto, as estatsticas da Organizao Mundial de Sade (OMS) indicam que no mundo o uso de sangue de 1 unidade/100 pessoas/ano. A diferena entre a quantidade necessria e a disponibilidade ainda aumentada pelos riscos inerentes ao sangue per se que vo desde 3% (3 reaes adversas em cada 100 unidades transfundidas), com reaes menores, at 0,001%, com reao hemoltica fatal. Superimpostos a estes riscos h a transmisso de doenas infecciosas como a hepatite B (0.002%) e da hepatite no-A e no-B (0.03%) e, nos pases desenvolvidos, o risco de contrair Aids de 1/400.000. Deve ser enfatizado que estes so os riscos para a transfuso de 1 unidade de sangue e que muitas intervenes cirrgicas e/ou situaes traumticas necessitam de transfuses mltiplas, com um aumento proporcional de reaes adversas. O risco de contaminao por transfuso de sangue fez com que o servio militar americano investisse no desenvolvimento de substitutos de sangue a partir de 1985, para uso em campos de batalha, que fossem livres de doenas contagiosas e de fcil armazenamento. Com o final da guerra fria, diminuiu um pouco este interesse, mas ainda assim existem hoje cerca de 12 potenciais substitutos de sangue, sendo alguns em testes clnicos. Estes produtos restauram a volemia e oxigenam os tecidos, as duas principais funes do sangue. Entretanto, a maior parte destes produtos tem efeitos colaterais inesperados, sendo o principal o de causar hipertenso. Este efeito colateral indesejado parece ser devido filosofia de desenvolvimento destes produtos que enfatizou os estudos sistmicos para a determinao da eficcia e biocompatibilidade sem a anlise do transporte ao nvel da microcirculao, o sistema microscpico de vasos onde ocorrem os processos de troca. Os estudos da troca de O2 na microcirculao s foram possveis a partir de 1990, atravs da medida tica de sua distribuio e troca nos vasos sanguneos dez vezes mais finos que o fio de cabelo. Ao mesmo tempo ficamos sabendo do papel fundamental do fluxo do sangue nas clulas da parede interna destes vasos (clula endotelial) para a produo de substncias que controlam o fluxo de sangue e sua troca, atravs da autorregulao. Os resultados obtidos para o transporte e os experimentos farmacolgicos na microcirculao esto sendo usados em modelos da circulao para o desenvolvimento do sangue artificial.
HISTRIA MODERNA DA TRANSFUSO DE SANGUE E DOS SUBSTITUTOS DE SANGUE A necessidade da transfuso de sangue para restaurar a volemia em perdas sanguneas graves foi reconhecida desde a descoberta da circulao. O primeiro fluido usado com este objetivo foi NaCl 0.9%, em 1875. O uso de sangue humano se tornou possvel em 1900, quando as substncias responsveis pelas reaes de incompatibilidade e hemlise foram descobertas com a conseqente tipagem do sangue. A descoberta que o citrato de sdio previne a coagulao do sangue foi a etapa final para a introduo do uso da transfuso de sangue relativamente segura. O sistema de bancos de sangue foi desenvolvido durante a 2. Guerra Mundial. A adio de K+ e Ca++ melhorou significativamente a eficcia da soluo de NaCl 0.9% na manuteno da viabilidade do tecido e a adio final do lactato, que evita a alcalose, constitui o que chamamos de Ringerlactato, que a soluo mais usada para restaurar a volemia. Este fluido injetado em volumes que so cerca de trs vezes o volume de sangue perdido, e a diluio das protenas plasmticas diminui a presso osmtica do plasma causando edema. A vantagem das solues cristalides que grandes volumes podem ser injetados em perodos curtos e o volume em excesso rapidamente retirado da circulao pela diurese. O plasma sanguneo (fluido onde as hemcias esto suspensas) e o soro (plasma sem os fatores de coagulao e as plaquetas) so melhores que as solues cristalides para a manuteno da viabilidade tecidual devido presso osmtica, cujo principal responsvel a albumina, peso molecular 69kDa. Em
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1947, demonstrou-se que o plasma bovino poderia ser usado em pacientes desde que as globulinas fossem removidas. As dextranas, polissacardeos de alto peso molecular (40-70kDa), podem ser usadas como substitutas coloidais da albumina. Seu uso causou o desenvolvimento da hemodiluio como meio de se restabelecer o volume de sangue, sendo que, atualmente, o hidroxietilamido tambm usado com esta finalidade. Os perfluorocarbonos foram introduzidos na dcada de 60 e so polmeros com flor, similares ao Teflon, que se ligam de maneira reversvel ao O2. So insolveis em gua e se dispersam em meio aquoso como emulso. Dissolvem O2 em uma relao linear com a pO2 e em condies fisiolgicas carreiam cerca de 2 a 3 vezes a quantidade de O2 que carreada em soluo pela gua. Para comparao, o sangue arterial de uma pessoa respirando ar tem 20 vezes a quantidade de O2 presente no mesmo volume de gua (ou plasma). Assim, para que estes produtos oxigenassem os tecidos adequadamente, os pacientes teriam que respirar O2 hiperbrico. A hemoglobina, presente nas hemcias, uma protena que se liga de maneira reversvel ao O2 e que tem alta capacidade carreadora de O2. Entretanto, a hemoglobina pura no pode ser usada como carreadora de O2 na circulao
porque se dissocia em dmeros que so txicos para os rins. Por outro lado, a hemoglobina o nico material biocompatvel atualmente disponvel que transporta O2 nas quantidades necessrias para o metabolismo tecidual, e por isso modificaes qumicas da hemoglobina so usadas na formulao de expansores plasmticos com capacidade carreadora de O2 ou substitutos de sangue. HEMODILUIO E SUBSTITUTOS DE SANGUE NO-CARREADORES DE O2 Em geral, possvel sobreviver a perdas de hemcias da ordem de 70%, mas nossa habilidade para compensar perdas comparativamente menores da volemia limitada. Uma diminuio de 30% da volemia pode levar ao choque irreversvel se no for corrigida rapidamente. Como conseqncia, a manuteno da normovolemia o objetivo da maioria das formas de reposio ou substituio de sangue, o que leva diluio dos seus componentes originais. A hemodiluio causa efeitos sistmicos e microcirculatrios e um ponto de referncia para a compreenso do comportamento de substitutos de sangue. Para reposio de volume com solues no-carreadoras de O2, os parmetros mais importantes a serem considerados so viscosidade, ca-
Figura 1: A microcirculao, composta pelos menores vasos do sistema circulatrio, onde ocorre a troca de O2 entre o sangue e o tecido. Este sistema de tubos conecta artrias e veias e assegura que cada clula do organismo esteja situada dentro do campo de difuso para o O2 proveniente da hemcia.
pacidade carreadora de O2e presso osmtica da mistura de sangue + volume injetado. O objetivo final de qualquer mudana das propriedades do sangue a oxigenao adequada do tecido, um fenmeno que ocorre a nvel da microcirculao. Assim, a hemodiluio deve ser analisada no somente em termos de seus efeitos sistmicos, mas tambm como estes, acoplados composio alterada do sangue, influenciam a troca de O2na microcirculao. Uma caracterstica importante do sangue a sua viscosidade que determinada pela concentrao de hemcias ou pelo hematcrito. O sangue normal tem uma viscosidade aproximada de 4cp, enquanto que a viscosidade do plasma de cerca de 1cp. A viscosidade do sangue proporcional ao quadrado do hematcrito, e portanto pequenas mudanas na concentrao de hemcias tm efeitos importantes na viscosidade do sangue. A diminuio da viscosidade por hemodiluio permite que o corao bombeie sangue em maiores volumes
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sem aumentar seu gasto energtico, uma vez que as necessidades metablicas do corao, quando a presso arterial mantida, so iguais ao produto do dbito cardaco x viscosidade do sangue. Fisiologicamente, a diminuio da viscosidade do sangue aumenta a presso venosa central e o retorno venoso, o que aumenta o dbito cardaco, com conseqente aumento na velocidade do fluxo de sangue e da fora de cisalhamento (shear rate) na parede vascular. A diminuio do hematcrito diminui a capacidade intrnseca de carrear O2 do sangue, mas este efeito pode ser compensado pelo aumento da velocidade do sangue (devido diminuio da viscosidade), que aumenta a taxa com que as hemcias chegam microcirculao. Como conseqncia, a capacidade carreadora de O2 sistmica e ao nvel capilar permanece prxima do normal at hematcritos de 25%. Isto explica por que o organismo tolera perdas de sangue que diminuem o nmero de hemcias a aproximadamente metade do seu valor original. HEMODILUIO COM SUBSTITUTOS DE SANGUE BASEADOS EM HEMOGLOBINA O limiar para transfuso aceito hoje a concentrao de hemoglobina menor que 7%, quando o organismo comea a ter risco de se tornar isqumico. Assim, na maioria dos casos, a restaurao da capacidade carreadora de O2 feita por hemodiluio. A formulao do fluido que restaura a oxigenao tecidual requer a compreenso dos princpios fsicos envolvidos. A principal barreira para a sada de O2 do vaso sanguneo a resistncia difuso tecidual que uniforme e semelhante que existe na gua. Esta afirmativa vlida para a maioria dos tecidos moles incluindo a parede vascular. Quando este processo analisado matematicamente evidente que a viscosidade o parmetro mais importante a ser considerado em relao molcula carreadora de O2 na circulao. Vrios substitutos de sangue contendo hemoglobina esto em testes clnicos. Eles podem ser classificados quanto origem da hemoglobina (humana, animal ou bacteriana) e so capazes de oxigenar e manter as funes teciduais. Os problemas quanto toxicidade e eficcia ainda no esto totalmente resolvidos e o efeito hipertensivo o problema mais comum, grave princi38 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
palmente em trauma (o aumento da presso arterial aumenta o sangramento e simultaneamente diminui a oxigenao tecidual). A toxicidade renal se deve tendncia que a molcula de hemoglobina tem de se fragmentar em subunidades (que pode ser resolvido usando a diaspirina como um agente que liga estas subunidades). Os produtos resultantes so a aa-hemoglobina do exrcito americano e a HemeAssist da Baxter Healthcare Inc. e ambos causam hipertenso. Um terceiro produto o Hemolink, produzido pela Hemosol Ltda., que a hemoglobina humana com ligao cruzada (para manuteno das subunidades) e polimerizada. Este produto est na fase II de testes clnicos no Canad. Tambm se pode evitar a dissociao da hemoglobina por ligao cruzada entre os dmeros com glutaraldedo, o que foi feito pelo Lab. Northfield e o produto se chama PolyHeme, em testes clnicos com resultados ainda no divulgados. A hemoglobina bovina usada por dois laboratrios: Biopure Inc. (Hemopure, hemoglobina polimerizada com glutaraldedo, aprovado para uso veterinrio e tambm com efeito hipertensivo) e Enzon Inc. (peg-Hb, hemoglobina conjugada com polietilenoglicol, com viscosidade semelhante do sangue). A hidratao da molcula de peg-Hg aumenta o seu dimetro em 30 vezes, sua viscosidade e ao mesmo tempo a torna "invisvel" ao sistema imunolgico. Este produto tem uma vida mdia na circulao de cerca de 48h e no causa hipertenso. O laboratrio Somatogen responsvel pela produo de um substituto de sangue com hemoglobina produzida por bactrias usando engenharia gentica. H problemas para produo em larga escala e para purificao. Os genes responsveis pela produo da hemoglobina humana tambm foram usados em mamferos transgnicos. importante enfatizar que nenhum destes produtos foi desenvolvido com o objetivo de assegurar que a cintica de troca entre o sangue e o tecido, que ocorre na microcirculao, fosse preservada, o que s parece acontecer com o uso da peg-Hb. O USO DE SANGUE ARTIFICIAL A aplicao mais direta para o sangue artificial so as emergncias devidas ao trauma. A mdia de perda de sangue nesses casos cerca de 2,5 litros e a vtima necessita de reposio de (1) volume e (2) capacidade
carreadora de O2. Os expansores plasmticos so usados no tratamento inicial de perdas de sangue graves e depois feita a transfuso de sangue aps a chegada do paciente ao hospital, onde se realizam os testes de compatibilidade (apenas a parte inicial destes testes demora 15min). Assim, um carreador de O2 universal que no necessite de testes de compatibilidade de grande importncia em emergncias e reduz o seu custo. A perda aguda de sangue em trauma determina uma diminuio da oxigenao tecidual que no remediada at que o paciente seja atendido no hospital e receba a transfuso de sangue, o que normalmente demora 1h. Neste perodo de tempo, chamado de "hora de ouro", o sangramento deve ser controlado e um aumento da presso arterial pode ser perigoso porque aumentaria o sangramento. Atualmente, tenta-se restaurar a volemia, mas no necessariamente a presso nestas situaes. Como conseqncia, a maioria dos produtos desenvolvidos como substitutos de sangue no ideal em emergncia devido ao seu efeito hipertensivo. A maior parte dos produtos propostos como "sangue artificial" obtm a hemoglobina do sangue descartado (aps 30 dias de armazenamento) e o uso de hemoglobina bovina pode ser uma opo se esta fonte for aceitvel clinicamente. RESUMO O sangue artificial necessrio em cirurgia e trauma em condies onde no h disponibilidade de sangue natural. Este produto aumentar a segurana no tratamento de emergncias. O progresso tem sido lento porque at recentemente no era possvel estudar o transporte de O2 ao nvel da microcirculao, importante para o desenvolvimento de um produto adequado. REFERNCIAS: Dodd, R.Y. "The risk of transfusion transmitted infeccion". N. Eng. J. Med. 327: 419-420, 1992. Intaglietta, M. "Whitaker Lecture 1996: Microcirculation, Biomedical Engineering and artificial blood". Ann. Biomed. Eng. 25: 593-603, 1997. Tuma, R.R., White J. V. and K. Messmer, eds. The Role of Hemodilution in Optimal Patient Care. Zuckeschwerdt Verlag GmbH, Munich, 1989.
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Vacinas de DNA
O paradigma das vacinas gnicas
acinas podem ser apresentadas em diferentes formas. O estado de imunidade pode ser induzido atravs do uso de variados tipos de vacinas, as quais encontram-se comercialmente disponveis e so baseadas em microrganismos vivos atenuados, microrganismos vivos inativados, extratos de microrganismos ou protenas recombinantes. Alm das formas j disponveis, encontram-se em estgio experimental as vacinas base de peptdios, as que utilizam microrganismos vivos recombinantes e as vacinas de DNA. A vacina de DNA a mais recente forma de apresentao que veio revolucionar o campo da vacinologia. Ela representa um novo caminho para a administrao de antgenos. O processo envolve a introduo direta do DNA plasmideano, que possui o gene codificador da protena antignica, e ser expressa no interior das clulas. Este tipo de vacinao apresenta uma grande vantagem, pois fornece para o organismo hospedeiro a informao gentica necessria para que ele fabrique o antgeno com todas as suas caractersticas importantes para gerao de uma resposta imune. Isto sem os efeitos colaterais que podem ser gerados quando so introduzidos patgenos, ou os problemas proporcionados pela produo das vacinas de subunidades em microrganismos. As vacinas de DNA, em teoria, representam uma metodologia que se aproxima da infeco natural, alcanando a induo da proteo desejada.
VANTAGENS E PROBLEMAS POTENCIAIS DAS VACINAS DE DNA
Vasco Azevedo Prof. adjunto do Departamento de Biologia Geral do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Minas Gerais UFMG. Obteve o seu grau de doutor pelo Institut National Paris-Grignon e pelo Institut National de La Recherche Agronomique de Jouy-en-Josas na Frana e fez seu psdoutorado na Universidade da Pensilvnia. vasco@icb.ufmg.br Sergio Costa Oliveira Prof. adjunto do Departamento de Bioqumica e Imunologia do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG. Obteve o seu grau de doutor pela Universidade de Wisconsin-Madison (USA), onde tambm fez o seu ps-doutorado. scozeue@icb.ufmg.br
O uso das vacinas de DNA oferece uma srie de vantagens econmicas, tcnicas e logsticas quando compara-
do com as vacinas clssicas, especialmente se considerarmos a sua utilizao nas condies oferecidas pelos pases em desenvolvimento. Por exemplo, a produo em larga escala bem mais barata, a manuteno do controle de qualidade mais fcil, e a comercializao no necessita de uma rede de refrigerao, pois estas vacinas so estveis temperatura ambiente. Estes fatores facilitam o transporte e a distribuio, e viabilizam a transferncia desta tecnologia para estes pases. Alm disso, tcnicas de biologia molecular possibilitam a modificao de seqncias e a adio de epitopos heterlogos a uma protena antignica, usando-se somente manipulaes simples feitas diretamente no plasmdeo, que o componente das vacinas gnicas. Essas manipulaes genticas podem nos dar subsdios para entendermos as relaes entre estrutura e funo destes antgenos com a resposta imune. Como possveis desvantagens podem ser citadas a possibilidade de integrao do plasmdeo ao genoma hospedeiro de maneira danosa ou a exposio do sistema imune a nveis constitutivos de antgenos durante o perodo de expresso do gene. No primeiro caso, o DNA plasmideano pode gerar patogenias, especialmente se este se integrar em clulas somticas, gerando mutagnese por insero, que pode levar a ativao de protoncogenes ou inativar genes supressores de tumor. No segundo caso, a apresentao constitutiva de um antgeno pode ter conseqncias desastrosas, como induo de tolerncia e auto-imunidade. Nenhuma evidncia destes fenmenos foi comprovada, e testes rigorosos devem ser feitos para que se possa passar dos modelos experimentais para o homem. VETORES DE EXPRESSO PARA A
CONSTRUO DE VACINAS DE DNA Nas ltimas duas dcadas foram desenvolvidos diferentes tipos de vetores de expresso. A expresso de protenas heterlogas em clulas de mamferos tornou-se uma tcnica essencial para ajudar a elucidar os mecanismos dos processos celulares e da transferncia gnica. Os vetores usados rotineiramente para a transferncia gnica so os retrovrus, vrus vaccinia ou adenovrus, que necessitam de uma etapa de empacotamento do DNA. O sistema de vacinas de DNA contrasta com os sistemas de expresso acima citados, pois no necessita desses vetores complexos. O princpio das vacinas de DNA se baseia na clonagem do gene desejado em plasmdeos, o qual dever ser expresso dentro das clulas do hospedeiro sem posteriores manipulaes. Os plasmdeos, fragmentos de DNA extracromossmico circulares presentes nas bactrias, foram inicialmente isolados espontaneamente da natureza. A partir destes, alguns pesquisadores comearam a construir plasmdeos quimricos reunindo os elementos importantes de cada um. Hoje chegamos terceira gerao de plasmdeos, com alta performance e maior complexidade, dos quais derivam a atual famlia de vetores de expresso em clulas de mamferos. ELEMENTOS QUE INFLUENCIAM NA EXPRESSO GNICA EM CLULAS DE MAMFEROS Os vetores de expresso usados em vacinas de DNA em geral possuem uma regio promotora e acentuadora forte, um ntron quimrico otimizado e um sinal de poliadenilao (figura 1). Esses trs elementos combinados so essenciais para uma expresso alta e constitutiva nas clulas de mamferos. Possuem tambm um elemento adicional, como os stios nicos de clonagem especialmente desenhados para no comprometer a expresso das seqncias clonadas. Ressaltamos outro elemento adicional que no tem ligao com a expresso, mas de extrema importncia para a produo de vacinas de DNA: a origem de replicao do plasmdeo ColE1 da Escherichia coli.
doadores crpticos. Estes, se presentes, podem ser utilizados na exciso da molcula supracitada, o que resulta em uma diminuio ou na ausncia de expresso. Experimentos de transfeco com os genes reprteres CAT e luciferase demonstraram que a presena deste ntron flanqueando os insertos de cDNA aumenta o nvel de expresso, variando de acordo com o tipo de cDNA. No caso do CAT houve um aumento de 20 vezes na expresso gnica, e no caso da luciferase, um incremento de apenas trs vezes. Sinal de poliadenilao O sinal de poliadenilao possui a funo de adicionar a cauda poli (A) e de ser reconhecido no trmino da transcrio pela RNA polimerase II. A poliadenilao aumenta a estabilidade e traduo da molcula de RNA. Como pode ser observado na figura 1, ele colocado imediatamente aps a enzima Not I dos stios nicos de clonagem. Elementos adicionais Na literatura, foi demonstrado in vitro e in vivo que grandes estruturas de "grampo" na extremidade 5' notraduzida do RNA mensageiro reduzem o nvel de traduo em eucariotos superiores. Os stios nicos de clonagem dos vetores de expresso so desenhados atravs de predies para que no se adicionem estas estruturas aos RNAs transcritos. A origem de replicao de procariotos que geralmente utilizada em plasmdeos de expresso a ColE1. A manuteno do alto nmero de cpias est diretamente ligada a eventos que ocorrem no incio da replicao e so controlados pela origem ColE1. Ele o mais bem caracterizado sistema de nmero de cpias, sendo capaz de manter mais de 20 plasmdeos por clula de Escherichia coli, o que resulta em uma alta produo de DNA plasmideano em bactria. PRINCIPAIS VIAS DE ADMINISTRAO As vacinas gnicas podem ser administradas atravs da injeo direta de DNA diludo em soluo salina no msculo do animal; ou atravs do processo da biobalstica, utilizando-se o gene gun (arma de genes), aparelho que promove a acelerao e introduo de
Figura 1. Plasmdeo pCMV-bgal. Elementos que influenciam na expresso gnica
Discutiremos abaixo a importncia de todos estes elementos: Regio acentuadora e promotora Esta a regio que controla a expresso do gene clonado. Geralmente obtida do citomegalovrus humano (CMV), contudo, outros promotores podem ser usados. A caracterstica intrnseca importante a capacidade de conduzir uma expresso forte em vrios tipos de clulas. A sua natureza promscua foi comprovada quando um plasmdeo contendo o gene codificador para a cloranfenicol acetiltransferase (CAT) regulado pelo CMV (acentuador/promotor) foi transfectado em clulas de camundongos. A atividade desta enzima foi encontrada em 24 de 28 tecidos analisados. ntron quimrico Logo em seguida regio acentuadora/promotora, os vetores possuem um ntron quimrico. A composio deste ntron feita com o stio doador do primeiro ntron do gene da betaglobulina humana e o stio aceptor da regio varivel da cadeia pesada do gene da imunoglobulina. Sua localizao na regio 5' anterior (no caso do inserto ter sido clonado a partir de cDNA) impede a utilizao de stios
Figura 2. Avaliao histoqumica da expresso do gene que codifica a bgalactosidase em orelhas de camundongos BALB/c que foram vacinados pelo processo da biobalstica, utilizando-se o plasmdeo pCMV-bgal. A b-galactosidase hidrolisa o substrato X-Gal, gerando uma colorao azulada que detectada nas clulas e tecidos transfectados.
gentica e terapia gnica. Atravs do uso destas metodologias, pode-se induzir uma resposta imune longeva mesmo com apenas uma dose da vacina gnica, ativando linfcitos T citotxicos e linfcitos B para a produo de anticorpos. Injeo direta de DNA no msculo A possibilidade da transferncia de genes sem a utilizao de um vetor viral estimulou o desenvolvimento de uma nova tcnica de imunizao que
micropartculas de ouro encobertas com o DNA de interesse na derme do animal. Em menor escala, podemos tambm mencionar o uso de DNA encapsulado em lipossomos como mecanismo utilizado na imunizao
uma simplificao radical na metodologia de vacinao. Para obterse uma resposta imune desejvel basta introduzir o DNA plasmideano contendo o gene que codifica uma protena antignica, a qual ser expressa dentro de clulas do organismo hospedeiro. O sistema de imunizao gnica mais comumente utilizado baseia-se na injeo intramuscular (i.m.), geralmente nos msculos femural ou quadrceps de camundongos, utilizando-se uma seringa usada para insulina com agulha de dimetro em torno de 27. Inoculase em torno de 50 microlitros (ml) do plasmdeo em uma concentrao de 1mg/ml em cada perna do animal a ser imunizado. Nveis satisfatrios da expresso de genes reprteres j foram detectados mesmo depois de um ano e meio aps uma nica injeo de DNA no msculo. Em nosso laboratrio, utilizamos uma administrao de cardiotoxina a 10mM cinco dias antes da injeo com o DNA de interesse, para induzir um ciclo de necrose e reparo muscular com o objetivo de aumentar os nveis de expresso gnica. A biobalstica O processo da biobalstica uma metodologia simples e efetiva para a introduo e expresso de genes em diferentes organismos, incluindo clulas e tecidos animais. Em 1992, o grupo do Dr. Stephen Johnston, da Universidade do Texas (Southwestern Medical Center, TX), foi o primeiro a utilizar esta tecnologia para induzir uma resposta imune contra a luciferase atravs do bombardeamento de DNA na derme de camundongos BALB/c. A biobalstica utiliza microprojteis em alta velocidade para introduzir cidos nuclicos em clulas e tecidos in vivo. Foram desenvolvidos e construdos diferentes sistemas capazes de acelerar micropartculas (0,2 a 4mm de dimetro) encobertas com cidos nuclicos a velocidades superiores a 1.500km/h-1. Foi demonstrado que estas partculas penetram a parede e membrana celular de maneira no-letal, localizando-se aleatoriamente nas organelas celulares. Conseqentemente, o DNA dissociado das micropartculas pela ao do lquido celular, ocorrendo ou no a integrao do gene exgeno no genoma do organismo em questo. O aparelho (gene gun) que utilizamos foi projetado e construdo pelo nosso colaborador, Dr. Elibio L. Rech, do Centro Nacional de Pesquisas em Recursos Genticos e Biotecnologia da EMBRAPA, e a onda de choque necessria para deslocar a molcula de DNA gerada atravs do
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gs hlio a baixa presso. Em nosso laboratrio, temos utilizado o gene reprter que codifica para a bgalactosidase para otimizarmos o processo de imunizao gentica atravs da biobalstica. A figura 2 mostra a expresso do gene da b-galactosidase em orelhas de camundongos BALB/c aps a imunizao com o plasmdeo pCMV-bgal precipitado em micropartculas de ouro de 1,5 a 3mm de dimetro. Uma das grandes vantagens deste mtodo a utilizao de pequenas quantidades de DNA (< 1mg), mais do que cem vezes menos material biolgico quando comparado com a injeo direta no msculo (em torno de 100mg). A RESPOSTA IMUNE Diversos pesquisadores induziram a ativao da resposta imune humoral e celular em animais experimentais, utilizando os processos da biobalstica e a injeo direta no msculo. Contudo, muitos parmetros precisam ser mais bem estudados para o entendimento dos diferentes tipos de resposta imune produzidos. Dentre estes parmetros podemos citar a quantidade de DNA inoculado, as vias e mtodos de administrao e as clulas apresentadoras de antgeno envolvidas no processo. Em nosso laboratrio, temos estudado as diferentes formas de administrao das vacinas gnicas com o objetivo de otimizar os parmetros tcni-
cos, maximizando a expresso gnica e conseqentemente a resposta imune. A figura 3 mostra os nveis de IgG total produzidos contra a bgalactosidase em animais imunizados pela injeo intramuscular do plasmdeo pCMV-bgal, pelo processo da biobalstica e atravs da inoculao de DNA encapsulado em lipossomos. Como se pode observar, os nveis de anticorpos totais mais altos foram obtidos quando a biobalstica foi a metodologia utilizada em comparao com os demais sistemas. A injeo direta no msculo induziu nveis de anticorpos um pouco abaixo do nvel produzido pelos animais imunizados atravs da biobalstica, sendo que o tratamento usando lipossomos foi o menos eficiente na induo da produo de anticorpos especficos. No que refere-se ao perfil de citocinas produzido, tem sido sugerido que o processo da biobalstica induz um padro de resposta imune do tipo Th2 (IL-4, IL-5, IL-10), enquanto a injeo intramuscular induz um perfil de resposta imune do tipo Th1 (IL-2, IFNg). Contudo, esta dicotomia simplista no exclusiva, pois alguns pesquisadores tm demonstrado que a biobalstica no induz apenas respostas do tipo Th2. Nossos resultados preliminares tm demonstrado que a injeo intramuscular produz mais IgG2a, o que caracteriza um perfil do tipo Th1, enquanto a biobalstica induz a produo de IgG1 e IgG2a, o que
Figura 3. Nveis totais de IgG anti-b-galactosidase determinados por ELISA nos soros de camundongos BALB/c imunizados com os plasmdeos pCMV (grupo-controle) e pCMVbgal pelos mtodos da biobalstica, injeo direta no msculo e atravs do uso de lipossomos.
caracteriza um perfil misto do tipo Th0. Isto sugere que a polarizao de um tipo de resposta imune do padro Th1 induzido pela injeo intramuscular pode ser devida ao efeito adjuvante de grandes quantidades de DNA plasmideano injetado no animal. Nossa experincia revela que a utilizao da biobalstica como metodologia de imunizao produz resultados menos dspares, provavelmente devido ao uso de um aparelho, o que diminui a variao no processo em relao ao uso da injeo com a seringa. A injeo intramuscular resulta em contrastes mais acentuados na resposta imune obtida, que pode ser explicada tambm pelo fato de que o DNA injetado extracelularmente, onde a maioria das molculas de cidos nuclicos so degradadas rapidamente por nucleases. Em contraste, no processo da biobalstica o DNA inserido no interior da clula, evitando uma reduo inicial no nmero de plasmdeos. No que se refere ao custo, a biobalstica torna-se um procedimento mais caro devido aquisio do gene gun comparado com agulha e seringa utilizadas na injeo intramuscular. Como pode-se notar, as duas metodologias possuem vantagens e desvantagens, sendo a combinao entre ambas a melhor opo para a otimizao do processo de imunizao gentica. A induo de um padro de resposta imune do tipo Th1 pela injeo i.m. pode ser utilizada no combate direto a infeces intracelulares como a leishmaniose, tuberculose, toxoplasmose, brucelose, listeriose, e alergias; enquanto o perfil Th2, supostamente gerado pela biobalstica, pode ser direcionado para o controle da esquistossomose e outras doenas tropicais cada vez mais crescentes nos pases em desenvolvimento. Diferentemente das vacinas inativadas ou de subunidade, as vacinas gnicas resultam em uma apresentao antignica via molculas de MHC de classe I e classe II, o que mimetiza o processo resultante de uma infeco natural, ativando linfcitos T CD4+, CD8+ e a produo de anticorpos. Os diferentes tipos de resposta imune induzida pela imunizao gentica justificam a sua aplicao nos campos das doenas infecciosas, alergias e tumores, e, independente da metodologia empregada, entendemos que a vacina gnica hoje a tecnologia mais moderna para ser utilizada no controle das enfermidades do nosso mundo.
BRAQUITERAPIA
MODALIDADE PARA TRATAMENTO DO CNCER DE PRSTATA LOCALIZADO
um tratamento por radioterapia, indicado para tratamento do cncer de prstata na fase inicial. A essncia do tratamento a colocao de partculas ("sementes") radioativas no interior da prstata, que eliminam as clulas tumorais. S est indicada nos casos de cncer de prstata localizados, ou seja, que ainda no disseminou (metstases). No um tratamento para a hiperplasia benigna da prstata ou aumento natural da prstata em homens. O fundamento da braquiterapia foi utilizado na dcada de 1970, nos EUA, porm sem bons resultados, porque a colocao das partculas ("sementes") no era feita adequadamente, e os mtodos de diagnstico no eram to precisos como hoje, tendo sido por isso abandonado naquela poca. Na nova modalidade de braquiterapia, as partculas so colocadas na prstata com o auxlio do ultra-som transretal, que permite uma distribuio mais homognea. Tambm os valores do PSA (antgeno prosttico especfico), um exame no sangue, e a bipsia da prstata so auxiliares em identificar os tumores nas fases iniciais. As "sementes" so introduzidas por uma srie de agulhas, atravs do perneo (regio entre o nus e o escroto). Estas partculas so de material radioativo de alta intensidade e limitado tempo de ao, ou seja, aps um determinado perodo de tempo, a radioatividade desaparece. Atualmente, os elementos iodo e paldio radioativo so empregados para esses tratamentos. Em geral, necessita de anestesia peridural, podendo ser geral em algumas vezes. O tempo de internao hospitalar bastante curto, em torno de 24 horas. No h necessidade de transfuso sangunea. Os ndices de incontinncia urinria e impotncia so discretamente melhores que os da cirurgia radical. Ainda uma forma de tratamento nova, mesmo nos EUA. O centro que executa a moderna tcnica a mais tempo, em Seattle, o faz h mais ou menos sete anos. Outros centros norte-americanos tambm utilizam a tcnica, como Boston, Nova York, Tampa e Phoenix. A cirurgia de remoo completa da prstata - prostatectomia radical - ainda o tratamento com melhores resultados no cncer em fase inicial, porque os resultados de longo prazo so conhecidos, enquanto que na braquiterapia ainda se aguarda como sero os resultados nos prximos anos. No um mtodo experimental, pois os resultados iniciais tm sido bons. Uma ressalva que se faz que uma vez escolhendo-se tratar por braquiterapia, se a doena no for totalmente eliminada, a opo de uma cirurgia depois bastante arriscada, seno contra-indicada, porque a ao da radiao prejudica bastante os resultados operatrios. H uma tendncia de no se utilizar braquiterapia em pacientes com doena localizada e idade inferior a 70 anos, pois estes pacientes poderiam obter maior benefcio atravs de uma cirurgia, em vista de os resultados de longo prazo desta ltima serem bastante conhecidos. A braquiterapia seria uma opo em pacientes mais idosos, evitando-se uma cirurgia, ou em pacientes com componentes clnicos que possam ser considerados fatores complicadores de uma
Antnio Jos Serrano Bernab Urologista Curso na Pacific Northwest Cancer Foundation Sattle - EUA Casa de Sade Santa Lcia - Rio de Janeiro bernabe@openlink.com.br Rogrio M. Mattos Urologista Fellowship na Lahey Clinic Medical Center Boston - EUA Curso na Pacific Northwest Cancer Foundation Seattle - EUA Foto cedida pelos autores.
operao, como obesidade extrema, insuficincia cardaca ou hipertenso arterial de difcil controle, diabetes tambm com controle difcil. A braquiterapia tambm no indicada em pacientes que j foram submetidos a outras formas de tratamento para hiperplasia benigna da prstata, como resseco transuretral (cirurgia endoscpica) ou adenomectmia (cirurgia aberta), pois o efeito da radiao nesses tecidos poderia promover efeitos colaterais. Tambm h necessidade de uma avaliao urolgica prvia braquiterapia, porque prstatas de tamanho muito grande no podem ser submetidas ao tratamento, pois no h como colocar as "sementes" em toda a prstata, por limitaes tcnicas. O tratamento efetuado por uma interao da equipe de urologistas com radioterapeutas. O mdico radioterapeuta efetua a anlise e o planejamento da dose e quantidade de radiao. O mdico urologista executa a colocao das partculas, com intermdio de um ultrasom transretal, que guia a distribuio das "sementes".
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Prezados leitores (as), Queremos agradecer as milhares de mensagens de felicitaes enviadas atravs de cartas, e-mails e telefonemas para nossa Redao. Por absoluta falta de espao, estamos publicando somente algumas poucas. Os leitores que desejarem entrar em contato com BIOTECNOLOGIA Cincia & Desenvolvimento podero enviar sua correspondncia via Internet, fax ou carta para esta seo. Nossos endereos so: Redao de BIOTECNOLOGIA Cincia & Desenvolvimento SRTV/Sul - Quadra 701 - Ed. Palcio do Rdio II, sala 215 - Cep 70340-902 - Braslia - DF - Tel.: (061) 2251512 (061) 225-0976 Fax (061) 224-2830 Home-page: http://www.biotecnologia.com.br E-mail: biotecnologia@biotecnologia.com.br
Li recentemente um artigo em BIOTECNOLOGIA Cincia & Desenvolvimento sobre a Rssia e as pesquisas que estavam sendo realizadas. Tenho imteresse particular na parte de produo de minitubrculos. Vocs possuem algum contato que possa me esclarecer sobre o assunto? Martin de Oliveira Freire CPGF - Departamento de FItotecnia - IA/ UFRRJ martin@marlin.com.br Martin, podemos ajud-lo por enquanto fornecendo-lhe o endereo da Academia de Cincias e Agricultura da Rssia: Russian Academy of Agricultural Sciences 15, Krzhizhanovsky str. - Moscow - 117218 - Russia Tel.: 124-7931 - fax.: 124-5396 - telex: 411031 "Kolos" SU *** Solicito a assinatura de minha empresa nesta excelente revista, a qual tive o prazer de folhear dias atrs. com grande alegria que vejo a cincia em nosso pas ser divulgada com tanto profissionalismo e seriedade. Emanuel Servio Coqueiro Biogene Produtos Biotecnolgicos *** Solicito informaes sobre a regulamentao da Lei 9.456/97, que trata da proteo de cultivares. Valdir Martins iaparase@lepus.pr.gov.br Atendendo a sua solicitao, informamos que a regulamentao da Lei 9.456/97 - Lei de Proteo de Cultivares - encontra-se na ntegra no encarte da 3 edio de BIOTECNOLOGIA Cincia & Desenvolvimento, bem como disponvel na home page da revista: http://www.biotecnologia.com.br *** Ao lermos BIOTECNOLOGIA Cincia &
Desenvolvimento, edio de novembro/ dezembro de 1997, muito nos interessamos pela matria Sunos - Novas Tecnologias, de autoria da professora Masaio Mizuno Ishizuka, da USP. Dado ao nosso objetivo de difundir novas tecnologias aos nossos cooperados, com vistas a melhorar tecnologicamente nossa criao animal, gostaramos, principalmente, de saber se j est no mercado o citado produto BIO-409; se est, onde podemos encontr-lo; se no est ainda, qual fornecedor ou fabricante devemos contatar a fim de sabermos mais detalhes sobre seu uso, preo comercial etc. Impossibilitados de entrar em contato com a autora via e-mail, apelamos aos senhores a fim de obter esses esclarecimentos, os quais, se possvel, poderiam ser passados via fax, aos cuidados do sr. Rommel Mota Rodriques. Aproveitamos a ocasio para parabenizarmos sua publicao pela qualidade das matrias e excelente apresentao grfica. Cooperativa Mista de Maranguape Ltda. Rua Jos Fernandes Vieira, s/n - Centro Maranguape - CE - 61940-000 Fax: (085) 341-3062 Recebemos e agradecemos seu e-mail e informamos que estamos providenciando o atendimento a seu pedido. *** O Brasil importou soja transgnica para processamento industrial. Gostaria de saber: 1 - Como assegurar que nenhum gro foi desviado para plantio? 2 - Se o Brasil o maior exportador de soja, por que a importao? Sizuo Matsuoka sizuo@dbv.cca.ufscar.br Agradecemos seu e-mail e informamos que suas perguntas podero ser respondidas pela prpria Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTMBio), rgo responsvel pelas referidas liberaes.
Solicitamos a divulgao do seguinte curso: Curso de Especializao em Biossegurana - Universidade Estcio de S Coordenadores: Slvio Valle - mdico veterinrio, especialista em Sade do Trabalhador e Ecologia Humana Marco A.F. Costa - Engenheiro qumico, mestre em Educao Informamos que sua solicitao foi atendida e j se encontra disponvel na seo de eventos da nossa home page: http:// www.biotecnologia.com.br *** Primeiramente, gostaria de parabenizar a equipe de BIOTECNOLOGIA Cincia & Desenvolvimento pela iniciativa de estimular, em nosso pas, discusses acerca de um tema toimportante, que seguramente determinar a posio do Brasil no cenrio econmico mundial num futuro prximo. Apesar de a revista estar s vsperas de completar um ano de existncia, somente este ms tomei conhecimento de sua existncia atravs de minha orientadora de iniciao cientfica. Este contato no poderia ter ocorrido em melhor hora, pois terei de preparar um texto sobre o tema Biotecnologia, Fitoterpicos e Desenvolvimento de Recursos Sustentveis, que ser publicado no caderno de Teses do XXI Encontro Nacional dos Estudantes de Farmcia. Deste modo, seria de muita ajuda o envio de textos publicados por esta revista ou de qualquer outra referncia bibliogrfica sobre o referido tema. Luis Lamberti Pinto da Silva Acadmico da Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto - SP lamberti@usp.br Informamos que nos prximos dias estaremos enviando-lhe algumas referncias bibliogrficas sobre Biotecnologia, Fitoterpicos e Desenvolvimento de Recursos Sustentveis.
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FEIJO TRANSGNICO
UM PRODUTO DA ENGENHARIA GENTICA
O feijoeiro A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) ocupa uma rea de 12 milhes de hectares e constitui-se na leguminosa mais importante para a alimentao de mais de 500 milhes de pessoas na Amrica Latina e frica. O Brasil o maior produtor, com uma produo anual na ordem de dois milhes de toneladas, o que equivale a cerca de 20% da produo mundial de feijo. O feijo um alimento bsico para a populao brasileira, constituindo-se em sua principal fonte de protena vegetal. O consumo anual per capta de 14 quilogramas. O teor de protena das sementes varia de 20 a 33%, sendo tambm um alimento energtico, contendo cerca de 340cal/ 100g. No Brasil, o feijo produzido basicamente por pequenos produtores. Aproximadamente 80% da produo e da rea cultivada encontram-se em propriedades menores que 100ha. O feijo produzido em todas as regies do pas. A Regio Nordeste detm a maior rea plantada (45%), seguida das regies Sul (26%) e Sudeste (21%). A Regio Nordeste detm o mais baixo ndice de produtividade, decorrente da baixa utilizao de insumos agrco-
Francisco J.L. Arago, Ph.D. Giovanni R. Vianna, MSc. Elbio L. Rech, Ph.D. elbrech@cenargen.embrapa.br CENARGEN - Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genticos e Biotecnologia. EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria. Fotos cedidas pelos autores.
las e problemas com a seca. Os maiores estados produtores so Paran, Bahia, Minas Gerais, So Paulo, Santa Catarina, Rio Grande do Sul e Gois. Em nosso pas, nas ltimas dcadas a produo e a rea ocupada com a cultura do feijoeiro aumentaram, entretanto a produtividade vem decrescendo. Vrios so os fatores que contribuem para este fato: scio-econmicos, fitossanitrios e agroecolgicos. Diante dos problemas que esta cultura possui e da sua grande importncia para as regies onde est estabelecida, h um grande interesse no desenvolvimento de tecnologias que possam acelerar o processo de melhoramento. Engenharia gentica Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, foi aberta a possibilidade de se isolar e clonar genes de bactrias, vrus, plantas e animais, introduzi-los e express-los em plantas. Desta forma, a barreira do cruzamento entre espcies e at entre diferentes reinos foi rompida. A transformao gentica de vegetais permite a introduo de genes especficos no genoma de cultivares comerciais. Esta tecnologia vem auxiliar os programas de melhora-
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Figura 2: Regio apical dos eixos embrionrios de feijo utilizados no processo de transformao, vistos ao microscpio eletrnico de varredura.
mento, permitindo o fluxo de genes para plantas, os quais seriam impossveis de serem transferidos atravs de cruzamentos sexuais ou fuso de genomas. As plantas obtidas no processo de transformao gentica devem ser introduzidas em um programa
de melhoramento para o desenvolvimento de novas cultivares. A transformao gentica de vegetais superiores tem tido avanos considerveis nas ltimas duas dcadas. Vrios mtodos de transformao foram propostos. Atualmente, os mtodos mais empregados so: o processo biobalstico, introduo de genes mediada por Agrobacterium e a eletroporao de protoplastos e tecidos. Durante a ltima dcada, numerosas tentativas foram feitas no sentido de regenerao de plantas transgnicas frteis do feijoeiro comum. Alguns pesquisadores demonstraram a possibilidade de introduo de genes exgenos para o feijoeiro atravs do sistema Agrobacterium e da eletroporao de protoplastos. No entanto, nenhuma transformao estvel, com uma prova molecular da presena dos genes introduzidos (transgenes) e uma anlise da prognie, foi demonstrada. As dificuldades para obteno de uma planta geneticamente modificada residiram na inexistncia de um processo para regenerao de plantas a partir das clulas transformadas. O processo biobalstico No final da dcada de 80, foi proposto o processo biobalstico como uma alternativa para introduo direta de material gentico no genoma nuclear de plantas superiores. Desde ento, sua universalidade de aplicaes tem sido avaliada. Valendo-se de diferentes equipamentos desenvolvidos no Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genticos e Biotecnologia ( E M B R A P A / CENARGEN), nosso grupo tem demonstrando ser um processo efetivo e simples para a introduo e expresso
de genes em bactrias, protozorios, fungos, tecidos vegetais e animais. A biobalstica utiliza microprojteis de ouro ou tungstnio acelerados a altas velocidades (superiores a 1.500km/h) para carrear e introduzir cidos nuclicos e outras molculas em clulas e tecidos in vivo. As micropartculas aceleradas penetram na parede e membrana celular de maneira no-letal, localizando-se aleatoriamente nas organelas celulares. Em seguida, o DNA dissociado das micropartculas pela ao do lquido celular, ocorrendo o processo de integrao do gene exgeno no genoma do organismo a ser modificado. Uma das vantagens do sistema de transformao atravs do processo de biobalstica que este permite a introduo e expresso gnica em qualquer tipo celular. Assim, foi aberta a possibilidade de trans-
Figura 3: Equipamento de biobalstica utilizado no processo de introduo de genes em meristemas apicais de feijo.
formao in situ de clulas diferenciadas sem necessidade de regenerao de novo. Desta forma, vislumbrou-se a possibilidade de obteno de plantas transgnicas atravs da transformao de clulas-me do meristema apical. A transformao destas clulas meristemticas atravs do processo biobalstico tem-se mostrado bastante eficiente. As micropartculas podem atingir as clulas das trs camadas do meristema apical. A freqncia de transformao, no entanto, pode ser significativamente aumentada atravs da induo de organognese na regio do meristema apical, isto , atravs da induo de uma multibrotao. Um sistema de multibrotao a partir do meristema apical de embries de feijoeiro foi desenvolvido atravs de seu cultivo em meio de cultura contendo benzilaminopurina (BAP). A BAP um regulador de crescimento vegetal sinttico (uma citocinina) que, entre outros efeitos, induz a diviso celular, gerando, no pice de eixos embrionrios, novas regies meristemticas e,
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conseqentemente, vrios brotos a partir de um nico meristema
preexistente. Baseado no bombardeamento de clulas do meristema apical e da induo de multibrotao em eixos embrionrios de feijo, foi desenvolvido na EMBRAPA/CENARGEN um sistema de transformao de cultivares elite, com uma eficincia de 1%. Esta freqncia
de transformao considerada muito alta se comparada a outros sistemas de transformao baseados na introduo de genes em meristemas apicais de outras espcies (0,007 a 0,03%). As plantas transformadas foram submetidas a anlises de prognie, bioqumicas e moleculares. A maioria das plantas apresentou um padro de segregao obedecendo primeira lei de Mendel e um baixo nmero de cpias do transgene, integradas em locus nico. Em se tratando da introduo de genes de interesse agronmico, esta a condio ideal para a introduo destas plantas transgnicas nos programas de melhoramento. Genes de interesse agronmico A transferncia de genes para plantas uma etapa-chave para a engenha-
ria gentica de vegetais. O desenvolvimento desta metodologia de transformao do feijoeiro foi fundamental para os demais estudos de integrao, expresso e estabilidade de genes que conferem caractersticas agronmicas. Uma das doenas de maior impacto na cultura do feijoeiro o mosaico-dourado, causado por um geminivrus, o vrus do mosaico-dourado do feijoeiro (BGMV). Esta doena est hoje disseminada por todas as reas produtoras de feijo do Brasil e em outros pases da Amrica Latina. No Brasil, em condies de campo, as perdas ficam em torno de 40 a 85%, podendo chegar a 100%, dependendo da cultivar, do estgio das plantas quando infectadas e do isolado do vrus. Experimentos foram conduzidos em conjunto com o grupo do Dr. Josias Faria, do Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijo
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(EMBRAPA/CNPAF), e o nosso grupo na EMBRAPA/CENARGEN, com o objetivo de se obter plantas resistentes geneticamente modificadas. Seqncias do BGMV (AC1, AC2, AC3 e BC1) foram clonadas e posicionadas em antisenso e ento utilizadas para obteno de plantas transgnicas de feijoeiro. O objetivo da estratgia de anti-senso a expresso pela planta de RNAs complementares aos do vrus. Assim, estes RNAs anti-senso podem-se ligar aos RNAs virais, permitindo que este RNA hbrido possa ser inativado, interrompendo o ciclo de vida do vrus. As plantas transgnicas obtidas, contendo as seqncia do BGMV, foram autofecundadas durante cinco geraes
e ento desafiadas contra o vrus. A inoculao do vrus foi feita atravs de moscas-brancas virulferas (vetor responsvel pela transmisso do vrus na natureza). Algumas linhagens transgnicas no apresentaram qualquer diferena significativa nos sintomas, em relao s plantas notransgnicas. Entretanto, duas linhagens mostraram um retardamento no aparecimento dos sintomas, e estes foram mais fracos que aqueles normalmente apresentados pelas plantas-controle. Alm disso, uma quantificao atravs de anlises de Southern blot nas plantas inoculadas mostrou que havia uma quantidade inferior de DNA viral nas plantas transgnicas. As plan-
tas transgnicas tolerantes ao vrus esto sendo incorporadas ao programa de melhoramento da EMBRAPA/CNPAF com objetivo de introduo desta caracterstica em diferentes cultivares e avaliao no campo. Outro objetivo do melhoramento gentico de feijoeiro tem sido o aumento da qualidade nutricional, principalmente em relao ao teor de metionina e triptofano nos gros, uma vez que esta planta importante para a alimentao humana e extremamente deficiente nestes aminocidos essenciais. Embora tenha sido mostrada a possibilidade de se aumentar o teor de metionina atravs da seleo em populaes com grande variabilidade, pouco tem sido conseguido no sentido de se obter plantas com nveis desejveis deste aminocido. Desta forma, juntamente com o grupo do Dr. Eugen Gander (EMBRAPA/CENARGEN), numa tentativa de se obter gros de feijo contendo maiores teores de metionina, plantas transgnicas foram obtidas expressando o gene da albumina 2S de castanha-do-par. Esta protena possui um alto teor de metionina (18%). A albumina 2S foi corretamente processada em sementes transgnicas de feijo. Sementes das plantas transgnicas foram analisadas durante o perodo de desenvolvimento at a maturao para deteco do produto gnico. O padro de aminocidos foi analisado para se determinar a aplicabilidade da expresso heterloga de um gene de uma protena rica em metionina no melhoramento nutricional. Embora as sementes tenham apresentado altos nveis do aminocido metionina antes da maturao fisiolgica, obteve-se um aumento da ordem de 25% do teor de metionina em sementes maduras. Finalmente, estudos do comportamento das plantas transgnicas de feijoeiro em condies de campo sero conduzidos em breve. Nestes estudos, sero avaliadas as interaes das plantas transgnicas com outras plantas do ambiente agrcola, e tambm a estabilidade da expresso dos genes introduzidos. Alm disso, h a necessidade do estudo do comportamento destes genes, no que diz respeito a fatores relacionados interao destes e a complexa fisiologia destas plantas submetidas ao estresse natural, nas condies agroclimticas tropicais.
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TRANSFORMAO DE CLOROPLASTOS
QUAIS AS VANTAGENS EM SE MODIFICAR ESTA ORGANELA?
Cloroplastos so organelas intracelulares presentes em algas e plantas, responsveis pelo processo fotossinttico, desde a captao da energia luminosa at a formao de compostos orgnicos, participando tambm da assimilao do nitrognio, na sntese e armazenamento de amido e na biossntese de aminocidos e lipdios. A estrutura desse centro fotossintetizador est representada na figura 1, onde se pode observar a presena da membrana dupla, a qual caracterstica da organela que se originou atravs do processo endossimbitico de integrao de uma diviso celular, quando somente um nucleide transferido para a clulafilha. O DNA encontrado em trs compartimentos numa clula: no ncleo, nos cloroplastos e na mitocndria. O ncleo o local mais comum para estudos de engenharia gentica de plantas com o objetivo de introduzir caractersticas agronmicas desejveis. Modificao no genoma de cloroplasto j uma realidade enquanto que a mitocndria de plantas permanece sem uma tecnologia de transformao. Entretanto, modificaes genticas nas mitocndrias da alga Chlamydomonas e da levedura S.
Helaine Carrer Pesquisadora do Centro de Biotecnologia Agrcola (CEBTEC) Professora doutora do Departamento de Qumica, ESALQ/USP
Foto cedida pelos autores.
seqenciado por Sugiura et al. em 1986 (EMBO J. 5: 2043-2049). Atualmente esse genoma tambm foi seqenciado em outras espcies vegetais: arroz, milho, Arabidopsis, Pinus e as algas fotossintetizantes Chlamydomonas e Euglena. O seqenciamento do genoma tem importncia fundamental para o conhecimento dos genes que participam dos caminhos metablicos, no estudo da interao dos genes nucleares que se expressam nos cloroplastos e apresenta fundamentos para anlise do sistema evolutivo da organela nos vegetais. Em plantas superiores, como o tabaco, o
cianobactria em uma clula eucarionte, dando origem ao cloroplasto (Gray, 1993. Curr. Opinion Genet Dev. 3: 884-890). H tambm membranas dos tilacides e grana, e regies denominadas nucleides que se localizam no estroma e onde se encontram as cpias do genoma do cloroplasto (ptDNA). Esta regio no delimitada por uma membrana, existindo a presena de protenas que mantm algumas cpias do genoma agregadas. De certa forma, a presena de cpias do genoma nos nucleides facilita o processo de transformao do cloroplasto durante a desdiferenciao celular na
cerevisae j foram obtidas, acreditandose que num futuro prximo, esta organela tambm ser alvo de transformao gentica em plantas superiores. Estrutura do genoma de cloroplastos O genoma do cloroplasto circular, o tamanho varia entre 120 a 180kb, apresentando uma regio duplicada com orientao invertida na maioria das espcies vegetais. A figura 2 mostra o genoma de cloroplasto de tabaco (Nicotiana tabacum), o qual possui 155.884 pares de bases e foi totalmente
genoma codifica em torno de 120 genes, um nmero pequeno quando comparado com o genoma da cianobactria. Existem pelo menos de 500 a 1.000 genes nucleares que se expressam nos cloroplastos aps sntese pr-protica nos ribossomos do citoplasma. Dos genes codificados no plastdio, em torno de 50 esto envolvidos na transcrio dos genes plastidiais como: rRNA, tRNAs, genes de protenas ribossomais e gene da RNA polimerase. Os genes relacionados com o metabolismo vegetal so aproximadamente 40 e formam complexos com genes nucleares, codificando compo-
nentes do sistema fotossinttico, os quais compreendem os genes da enzima Rubisco (ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxidase), que a principal protena do cloroplasto; genes participantes do complexo do fotossistema I e II; do citocromo b/f e da enzima ATP sintase e NADH desidrogenase. Nas dicotiledneas, o gene accD codifica uma subunidade da acetil-CoA carboxilase, enzima participante da biossntese de lipdios, porm no est presente nas monocotiledneas seqenciadas at o momento. Este genoma tambm possui genes que codificam tRNA envolvidos na biossntese de clorofilas, processo metablico especfico para cloroplastos e cianobactrias. Alm destes genes com funes conhecidas, existem seqncias de quadros de leitura (ORFs) com potencial para serem genes cujas funes ainda no foram identificadas. Embora as cpias do
organela. O sucesso obtido com a transformao de cloroplastos exigiu: 1) desenvolvimento de um mtodo de introduo dos transgenes (DNA transformante) atravs da membrana dupla do cloroplasto; 2) disponibilidade de genes marcadores seletivos com expresso na organela e 3) eficiente escolha do local de integrao do transgene para no interferir com a funo normal dos genes no genoma. Essa transformao foi obtida primeiramente em Chlamydomonas reinhardtii, uma alga unicelular, por Boyton et al., 1988 (Science 240: 1534-1538), e em plantas superiores a transformao foi obtida em tabaco (Nicotiana tabacum) por Svab et al. 1990 (PNAS 87: 8526-8530). Sistema de liberao do transgene no cloroplasto: Atravs do sistema de biolstica (biologia + balstica) desenvolvido por Klein et al., 1987 (Nature 327: 70-73) foi possvel introduzir transgenes no interior dos
bombardeadas, as clulas so mantidas em meio de crescimento sem agente seletivo por dois dias para restabelecimento da diviso celular, sendo em seguida cortadas em pequenos segmentos e transferidas para meio de cultura contendo o agente seletivo. Aps 5 a 6 semanas observam-se as brotaes de novas plantas regeneradas a partir de uma nica clula que possivelmente recebeu o transgene no cloroplasto. Esta planta colocada em meio de enraizamento e analisada atravs de tcnicas de biologia celular, como PCR (Polymerase Chain Reaction) ou anlise de Southern para verificar a integrao do transgene no genoma do cloroplasto. Para que as plantas transformadas sejam geneticamente estveis, necessrio que todas as cpias do genoma sejam uniformemente transformadas. Uma planta primria (primeira brotao) em geral encontra-se na fase heteroplsmica, quan-
genoma sejam idnticas dentro de uma espcie, o nmero de cloroplastos e do ptDNA dependente do tipo de clula vegetal. Nas clulas meristemticas encontra-se a forma indiferenciada chamada proplastdio, em nmero de 10 a 15, possuindo no mximo 50 cpias do ptDNA. Por sua vez, a clula foliar possui os proplastdios diferenciados em cloroplastos, os quais so fotossinteticamente ativos encontrados em nmero de aproximadamente 100, sendo que h em mdia 100 cpias do ptDNA, determina-se um total de aproximadamente 10.000 cpias do genoma por clula (Maliga et al. 1993. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 341, 449-454). Transformao de cloroplastos Atravs do desenvolvimento da tecnologia de manipulao de genes de cloroplastos in vivo criou-se uma nova ferramenta para estudar os aspectos da biologia celular e molecular desta
cloroplastos. Outro mtodo que demonstrou resultados positivos foi descrito por Golds et al., 1994 (Biotechnology 11: 9597) e O'Neill et al., 1993 ( Plant J. 3: 729738), utilizando tratamento com PEG (polietileno glicol), mas a eficincia de transformao menor comparando-se com o mtodo de biolstica. A utilizao de Agrobacterium vem sendo objeto de estudo em muitos laboratrios sem resultado satisfatrio at o momento. O protocolo de transformao de cloroplasto de tabaco est apresentado na figura 3. A metodologia consiste em introduzir o transgene no interior dos cloroplastos atravs de biolstica. Cpias do transgene ficam aderidas s partculas de ouro ou tungstnio de aproximadamente 1mm em tamanho, elas so aceleradas pelo gs de hlio em alta presso em cmara de vcuo, so introduzidas no cloroplasto onde liberam o DNA. Inicialmente, somente uma ou poucas cpias do genoma so alteradas entre as 10.000 cpias presentes nas clulas do mesfilo foliar. Aps serem
do as cpias do ptDNA no se apresentam uniformemente modificadas. Para que se torne uma planta transgnica homoplsmica, a qual possui todas as cpias do ptDNA uniformemente transformadas, so necessrias 3 a 4 subculturas transferindo pequenas sees da folha da planta primria em meio seletivo. Durante a subcultura, as clulas que no possurem os transgenes no se dividem, e se tornam clorticas. As que possuem o transgene se dividem e voltam ao estado desdiferenciado, o qual possui somente um nucleide com 2 a 10 ptDNA. A partir do sistema de recombinao obtm-se a uniformidade das cpias do ptDNAs, monitorando-se atravs de PCR. Seleo dos transformantes: O primeiro gene marcador seletivo expresso em cloroplasto de Chlamydomonas e tabaco foi um gene plastidial alelo ribossomal mutante do gene 16S rRNA. Mutaes de algumas bases na seqncia desse gene resultam na resistncia a inibidores da sntese de protena de procariotos, como
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os antibiticos espectinomicina, estreptomicina e lincomicina. Entretanto, a freqncia de transformao de cloroplastos utilizando este gene marcador seletivo foi muito baixa, em mdia entre 0.5 a 2 transformantes para cada 100 bombardeamentos (Svab e Maliga, 1991. Mol. Gen. Gen. 228: 316319; Staub e Maliga, 1993. EMBO J. 12: 601-606). Existe sempre a necessidade de identificao de genes marcadores seletivos para facilitar a introduo dos transgenes com alta eficincia de seleo. Os genes bacterianos: aadA (Svab e Maliga, 1993. PNAS 90: 913-917) e nptII (Carrer et al., 1993. Mol Gen Gen 241: 4956) conferem resistncia aos antibiticos espectinomicina e canamicina, respectivamente. Estes genes utilizados como marcadores seletivos apresentaram melhores resultados na eficincia de transformao, em torno de 2 a 10 transformantes por bombardeamento, sendo que o gene nptII apresentou menor freqncia de transformao e tambm expresso nuclear. O gene de planta que confere resistncia aos herbicidas inibidores da enzima acetolactato sintase (ALS) foi testado para utilizao como marcador seletivo (Carrer e Maliga, resultados no publicados). Recombinao homloga: A integrao de um transgene no genoma de cloroplasto ocorre atravs de recombinao homloga, como demonstrado na figura 4. Para tanto, na construo de um vetor de transformao, seqncias do ptDNA devem flanquear o gene de interesse, indo desta forma o transgene para o local de insero no genoma. Quando o local de insero a regio duplicada invertida do cloroplasto, existe a necessidade de "correo" da segunda cpia, podendo, ento, ocorrer a correo para a forma original ou transformada. O transgene expresso no cloroplasto sob controle de um promotor procaritico, o qual possui os sinais de expresso na organela. Aplicaes da tecnologia de transformao At o momento, o tabaco tem sido a nica planta superior a ter o cloroplasto transformado, sendo utilizada como planta-modelo. Existe vrias vantagens em se expressar os transgenes nessa organela do que no genoma nuclear. Herana materna: Anlise de plantas variegadas revelou que os cloroplastos no apresentam segregao mendeliana, apresentando herana maternal dos genes devido ao fato de no serem transmitidos pelo plen. Isto observado na maioria das espcies de plantas cultiva-
das, como milho, arroz, trigo, algodo, feijo e outras. A figura 5 mostra sementes de tabaco de plantas transgnicas (transplastmicas) contendo o gene nptII germinadas em meio de seleo em presena de canamicina (200mg/ml). As sementes de planta autopolinizada (Self) e de F1, planta transgnica (feminino) fertilizada pelo plen da planta-controle (masculino), apresentam-se todas resistentes canamicina, enquanto as sementes provindas de retrocruzamento (RF), em que a planta-controle (feminino) fertilizada pelo plen da planta transformada (masculino), apresentavam-se totalmente sensveis ao antibitico. Utilizando esta caracterstica, quando um gene de resistncia a herbicida, por exemplo, for introduzido no cloroplasto de uma planta de interesse comercial, podese garantir que no vai ocorrer disseminao deste gene de resistncia para as espcies relacionadas no campo. Temse, assim, a possibilidade de controle da disseminao de transgenes no ambiente. Alta expresso de protenas: Sendo o sistema gentico de cloroplastos altamente poliplide, os transgenes so amplificados para um grande nmero de cpias. A introduo do transgene sob corretos sinais de controle da traduo leva a protena a ser expressa em alta concentrao. Este potencial de alta expresso de protena em cloroplastos foi demonstrado por McBride et al., 1995 (Biotechnology 13: 362-365). Os autores introduziram um gene modificado do Bacillus thuringiensis em cloroplastos via biolstica e verificaram o acmulo da protoxina com ao inseticida ao nvel de 3 a 5% da protena solvel total. Tal nvel de expresso no poderia ser conseguido utilizando-se o mesmo gene no ncleo. A figura 6 apresenta o resultado do efeito txico da protoxina nas folhas de tabaco transformadas para as larvas do inseto Spodoptera exigua. Efeito de local de integrao do gene: Na transformao nuclear um mesmo transgene poder apresentar diferentes nveis de expresso, dependendo do local de integrao no genoma. Em contraste, a integrao do transgene no genoma de cloroplasto ocorre em local especfico, produzindo somente um nico evento de integrao, devido transformao no cloroplasto ocorrer atravs de recombinao homloga. Desta forma, fica eliminada a necessidade de se caracterizar um grande nmero de plantas transformadas independentemente. Utilizando esta particularidade, genes de cloroplastos podem ser trocados pelo mesmo gene mutado in vitro para estudo da funo destes genes. O gene ycf3
(hypothetical chloroplast reading frame N3) est relacionado ao fotossistema I, o que auxiliou nas elucidaes de questes fundamentais da biologia de cloroplastos, incluindo tambm os mecanismo de regulao dos genes (Ruf et al., 1997, J. Cell Biol 139, 95-102). Ausncia de co-supresso: Integrao de vrias cpias de um gene ou de um segmento do gene pode resultar em co-supresso, termo que se refere inativao no-intencional do gene nuclear, devido interferncia entre os transgenes ou entre um transgene e um gene nativo. Como o sistema gentico dos cloroplastos naturalmente poliplide, ocorre a falta de um mecanismo de inativao do gene. Integrao de transgene sem marcador seletivo: Atravs de cotransformao foi estudada a integrao de dois transgenes independentes sem haver seleo para um deles. Atravs da anlise de Southern foi observada a presena do gene sem seleo em aproximadamente 20% dos eventos de transformao (Carrer e Maliga, 1995. Biotechnology 13: 791-794). Alta taxa de cotransformao demonstra a facilidade em integrar mais de um gene no ptDNA, no havendo a necessidade de estarem fisicamente ligados a um gene marcador seletivo. Estes resultados apontam para uma metodologia importante na manipulao de genes fotossintticos, na qual o marcador seletivo poderia influenciar no funcionamento dos genes. Apesar de a tecnologia de transformao de cloroplastos ter apresentado resultados reprodutivos em plantas de tabaco, acreditamos ser de total importncia a transferncia desta tecnologia para outras espcies cultivadas. Isto vem sendo objetivo de estudo em vrios laboratrios de pesquisa de universidades e empresas privadas como Monsanto e outras. O nosso laboratrio mantm colaborao com o Dr. Pal Maliga, Waksman Institute, Rutgers University, EUA e Dr. Ralph Bock, University of Freiburg, Alemanha.
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