Biotecnologa

Mara Isabel Pividori*, Emanuela Zacco, Anabel Lermo y Salvador Alegret. Grup de Sensors i Biosensors (GSB), Departament de Qumica, Universitat Autnoma de Barcelona Mara Pilar Marco, Francisco Snchez Baeza. Grupo de Receptores Moleculares Aplicados (AMRg), Departamento de Qumica Orgnica Biolgica, IIQAB-CSIC Barcelona

El Grupo de Sensores y Biosensores de la Universitat Autnoma de Barcelona (GSB) y el Grupo de Receptores Moleculares Aplicados del CSIC (AMRg) vienen dirigiendo alguna de sus lneas de investigacin hacia el desarrollo de biosensores electroqumicos robustos, econmicos, de uso simple, y dirigidos a su aplicacin principalmente en la industria alimentaria y el control medioambiental y la salud humana. Las agencias reguladoras y los laboratorios de control de calidad podrn, en un futuro, disponer de biosensores porttiles capaces de realizar anlisis de manera ms rpida y econmica.

Los biosensores en la industria alimentaria, el control medioambiental y la salud humana

La necesidad de anlisis de diferentes componentes a tiempo real en reas cada vez ms diversas ha promovido en estos ltimos aos que los esfuerzos realizados en el desarrollo de instrumentacin analtica se dirijan hacia la construccin de dispositivos cuya utilizacin no requiera la supervisin profesional, cuyo manejo sea sencillo y cuyo coste sea menor. Como resultado de esta demanda de informacin relacionada con el anlisis de forma rpida, fiable y descentralizada se ha favorecido el desarrollo de sensores qumicos y biosensores como alternativa de anlisis a la instrumentacin analtica convencional Los sensores qumicos existen desde hace mucho tiempo. Se han estudiado en profun68 NOVIEMBRE/DICIEMBRE06

LOS SENSORES QUMICOS EXISTEN DESDE HACE MUCHO TIEMPO. SE HAN ESTUDIADO EN PROFUNDIDAD Y HAN ENCONTRADO DURANTE TODO ESTE TIEMPO UN GRAN CAMPO DE APLICACIN

didad y han encontrado durante todo este tiempo un gran campo de aplicacin. Se conocen muy bien por su uso cotidiano en

el laboratorio los electrodos redox, los electrodos selectivos a iones, especialmente el de pH, entre otros muchos. Simultneamente al avance de los sensores, y debido al gran impulso de la informtica, se viene desarrollando del mismo modo instrumentacin capaz de realizar el seguimiento continuo de procesos complejos mediante ordenador de los parmetros fsicos y/o qumicos basados en sensores qumicos. Mediante este tipo de instrumentacin es posible intervenir en el control de procesos de forma rpida y segura. Los biosensores, de aparicin ms reciente, constituyen un campo multidisciplinario de I+D y un mercado muy atractivo. Originariamente la investigacin en este campo proFARMESPAA INDUSTRIAL

FIGURA 2. Diagrama esquemtico del funcionamiento de un sensor. El elemento de reconocimiento o receptor slo reconoce un componente de la muestra. La seal proveniente del proceso de reconocimiento se convierte en una seal elctrica mediante el transductor. Esta seal es amplificada y posteriormente procesada y presentada en forma digital. El receptor puede interactuar con el analito mediante mecanismos fsicos, qumicos o biolgicos.

vena principalmente del sector clnico y biomdico. Las inversiones realizadas en el desarrollo de biosensores para la aplicacin en el campo clnico fueron compensadas en un corto plazo con la aparicin de los biosensores para la determinacin y control de glucosa en pacientes diabticos. Los biosensores demostraron as su capacidad de realizar anlisis fuera del mbito del laboratorio y por personas no entrenadas, por ejemplo, en la consulta mdica por el mismo paciente. Actualmente los biosensores no son patrimonio exclusivo de la investigacin biomdica. La industria alimentara demanda mtodos rpidos para estimar la identidad, la caducidad, el deterioro o la contaminacin de los alimentos. A la industria en general, y a la alimentaria en particular, le es necesario controlar de manera confiable los productos en matrices muy complejas. Con la consolidacin de la Unin Europea, las medidas dirigidas hacia el control de alimentos cada vez son ms estrictas y generan necesidades analticas muy variadas. La problemtica de los contaminantes en la salud humana. La seguridad alimentaria y medioambiental El concepto de seguridad alimentaria implica garantizar la produccin y comercializacin de alimentos que no supongan un riesgo potencial para la salud del consumidor. La innovacin y el desarrollo de la industria agroalimentaria pasan de forma general por
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dos ejes fundamentales: la seguridad y la calidad de los alimentos. La cada vez mayor complejidad de la cadena alimentaria exige, por otra parte, el desarrollo de eficaces sistemas de trazabilidad que aseguren la solidez de todos los eslabones. Tanto el VI Programa Marco de la Unin

ACTUALMENTE LOS BIOSENSORES NO SON PATRIMONIO EXCLUSIVO DE LA INVESTIGACIN BIOMDICA. LA INDUSTRIA ALIMENTARA DEMANDA MTODOS RPIDOS PARA ESTIMAR LA IDENTIDAD, LA CADUCIDAD, EL DETERIORO O LA CONTAMINACIN DE LOS ALIMENTOS

Europea a travs de su Prioridad temtica de Calidad y Seguridad de los alimentos, como el Plan Nacional de Ciencia y Tecnologa 2004-2007 a travs de sus programas nacionales de Biotecnologa y Recursos y Tecnologas Agroalimentarias, recogen la necesidad de desarrollar e implantar siste-

mas de control encaminados a aumentar la seguridad y la calidad de los alimentos y a mejorar los sistemas de trazabilidad, que se define como la capacidad de rastrear un alimento, desde sus orgenes hasta al consumidor, dando lugar a una identificacin fiable de sus componentes, un control sanitario y un seguimiento del alimento en toda la cadena de produccin. Para poder cumplir con estos programas preventivos, se establece como prioridad el desarrollo de mtodos de deteccin, de anlisis y diagnstico que sean rpidos, de alta sensibilidad y que permitan el anlisis automatizado de un amplio espectro de agentes que amenazan la salud humana. Los contaminantes alimentarios y medioambientales pueden agruparse de acuerdo a su origen y naturaleza. Esencialmente, se pueden clasificar en contaminantes microbiolgicos (bacterias, virus y parsitos), material exgeno, toxinas naturales, y otros compuestos qumicos tales como pesticidas, metales txicos, dogas y residuos veterinarios, entre otros muchos. Algunos contaminantes alimentarios provienen de fuentes naturales del medioambiente, mientras que otros son aditivos agregados deliberadamente. De la misma forma que la deteccin y el control de aditivos tuvieron su importancia con anterioridad, en la actualidad la mayor problemtica en salud alimentaria lo constituyen las contaminaciones microbiolgicas, seguidos de los pesticidas y los residuos de medicamentos en productos animales, as como resistencia a antimicrobianos. No son pocos los consumidores preocupados por el impacto a largo plazo del consumo crnico de aditivos qumicos (tales como pesticidas, metales txicos, residuos de drogas veterinarias, saborizantes, colorantes y conservantes), as como los efectos agudos en grupos vulnerables. Las metodologas de anlisis de contaminantes en alimentos deben ser capaces de llegar a detectar concentraciones en el orden de g/kg o inferiores. Los mtodos analticos instrumentales convencionales consisten en HPLC, cromatografa de gases y electroforesis capilar y se basan en las siguientes etapas: I) toma de muestra; II) tratamiento; III) extraccin; IV) purificacin; V) anlisis cromatogrfico y, VI) obtencin de resultados. Adems de mtodos instrumentales de anlisis, en el caso de antibiticos en leche o carne se pueden llevar a cabo ensayo microbiolgicos que se basan en la de inhibicin del crecimiento bacteriano debida a la presencia del antibitico.
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Los ensayos inmunolgicos representan una alternativa de screening rpida y fiable. En las ltimas dcadas, la deteccin inmunolgica de bacterias, clulas y esporas, virus y toxinas, y pequeas molculas orgnicas ha comenzado a ser cada vez ms sensible, especfica, y reproducible. As, cada vez se encuentran en el mercado ms kits basados en la deteccin inmunolgica. La deteccin de cido nucleicos de microorganismos patgenos es cada vez ms especfica y sensible que los mtodos inmunolgicos. El desarrollo de tcnicas de amplificacin in vitro del DNA -tal como es la PCR- ha contribuido de manera decisiva a aumentar la sensibilidad y selectividad de los ensayos basados en cidos nucleicos. Estos mtodos tienen ventajas distintivas sobre los mtodos de cultivo e inmunolgicos tales como una mayor especificidad, la sensibilidad, la rapidez y la capacidad de detectar pequeas cantidades de cido nucleico en una muestra. Adems son capaces de detectar varios patgenos simultneamente en un nico ensayo. Un problemas asociado es que el DNA puede permanecer intacto en alimentos procesados, en forma libre o presente en bacterias muertas pudiendo dar su amplificacin y posterior deteccin resultando falsos positivos. Este mtodo requiere, por tanto, un perodo de enriquecimiento que retrasa los resultados pero que asegura la sensibilidad al orden de 3 UFC por 25 g de alimento. Para certificar la seguridad alimentaria, los laboratorios de control oficiales deberan ser capaces de procesar un gran nmero de muestras en un perodo corto de tiempo. De acuerdo con estos requerimientos, es de importancia el desarrollo de nuevas tcnicas rpidas, econmicas, sensibles y capaces de realizar medidas de campo, cuyo resultado pueda ser usado como alarma para la deteccin rpida del riesgo de contaminacin. Debido a sus caractersticas, los biosensores se constituyen en los principales candidatos y herramientas de anlisis con numerosas aplicaciones en la industria agroalimentaria, control medioambiental y salud humana. Las caractersticas ms destacables de estos dispositivos que los convierten en opciones altamente atractivas son: I) su especificidad, II) alta sensibilidad, III) corto tiempo de anlisis, IV) capacidad de inclusin en sistemas integrados, V) facilidad de automatizacin, vi) capacidad de trabajar en tiempo real, VI) versatilidad, que permite el diseo de dispositivos a la carta, y su bajo coste: VII) no destructivos, lo que permite el control de
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procesos in situ, VIII) no contaminantes, amigables con el medioambiente. Sensores qumicos y biosensores Si queremos imaginar como funciona un sensor, debemos tener en cuenta que est formado por dos partes. Una de dichas partes es el denominado elemento de reconocimiento molecular o receptor que interacciona con un determinado componente de la muestra, el que se quiere determinar, de manera especfica, es decir, sin que el resto de la muestra interfiera en la medida. El otro componente, se conoce como transductor (Figura 2). Cuando el componente que se busca determinar en la muestra compleja interacciona con el receptor

LA INVESTIGACIN Y EL DESARROLLO DE LOS SENSORES QUMICOS ESTN DIRIGIDOS PRINCIPALMENTE A LA OBTENCIN DE RECEPTORES CADA VEZ MS SELECTIVOS DE MOLCULAS

del sensor, se produce un cambio que es detectado por el transductor y transformado en una seal elctrica que es medida por un instrumento. Esta configuracin tan simple de reconocimiento y transduccin es la que ha permitido el diseo de una instrumentacin con caractersticas prcticas e innovadoras en el campo del anlisis. Mediante este esquema analtico tan sencillo fue posible eliminar numerosas etapas necesarias en un proceso analtico convencional tales como el tratamiento de la muestra o la separacin del componente que se quiere determinar del resto de la muestra, que complican un procedimiento clsico de anlisis basado en equipamiento analtico tradicional. Un aspecto fundamental de este diseo es la generacin de una seal suficientemente intensa entre el componente que se desea analizar (el analito) y el receptor selectivo de ste o elemento de reconocimiento. Mientras ms simple y confiable sea el pro-

ceso de reconocimiento, ms lo ser el dispositivo resultante. Los dems aspectos asociados al proceso y al sensor, como la conversin (transduccin) de las seales, su procesamiento y transmisin son igualmente importantes pero ya poseen un tratamiento mucho ms desarrollado y efectivo gracias a los adelantos constantes y continuos de la micro y optoelectrnica. La investigacin y el desarrollo de los sensores qumicos estn dirigidos principalmente a la obtencin de receptores cada vez ms selectivos de molculas. Tambin es necesario inmovilizar los receptores sobre los transductores ms adecuados, sin que unos ni otros pierdan sus caractersticas funcionales. Hay todo un espectro de posibilidades de inmovilizacin de receptores sobre los transductores, desde inmovilizaciones simples por adsorcin, retencin del receptor en geles o membranas polimricas, o por entrecruzamiento de los receptores entre s mediante agentes bifuncionales, hasta inmovilizaciones ms complejas por unin qumica entre el receptor y el transductor. Por otro lado, existe un abanico de posibilidades en el desarrollo de nuevos transductores mediante nuevos materiales de complejidad creciente. De todas formas, los esfuerzos se dirigen hacia el diseo de nuevos materiales de reconocimiento suficientemente selectivos. Los elementos de reconocimiento o receptores de naturaleza sinttica presentan un grado de reconocimiento limitado. A pesar de esto se consiguen cada vez ms materiales adecuados para el desarrollo de sensores en aplicaciones muy concretas. Esta limitacin hizo que se consideraran como elementos de reconocimiento los receptores de naturaleza biolgica o biorreceptores, para la construccin de transductores con materiales biolgicos de reconocimiento molecular, mucho ms selectivos que los de naturaleza sinttica. Estos sensores qumicos que incorporan materiales biolgicos en su construccin se conocen como biosensores. Un biosensor es un sensor qumico cuya parte receptora est constituda por material biolgico para el reconocimiento molecular de la muestra. Receptores y transductores El componente receptor de un sensor qumico transforma selectivamente determinada informacin qumica contenida en una muestra en una forma de energa susceptible de ser medida por el transductor. El componente transductor es un elemento capaz de
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transformar la energa que codifica la informacin qumica procedente de la muestra en una seal analtica til. El componente receptor puede interaccionar con el analito mediante un mecanismo fsico sin que haya una reaccin. Es el caso en el que se detecta la interaccin mediante un cambio de absorbancia, en el ndice de refraccin, en la conductividad, en la temperatura o en la masa. Ms comn es que el receptor reconozca al analito mediante una reaccin qumica o bioqumica. Se conoce la selectividad limitada de la mayora de las reacciones utilizadas en el anlisis qumico, que obliga a tratar previamente la muestra a fin de eliminar las interfe-

FIGURA 3. La interaccin de dos hebras de ADN (constituyente principal del genoma de organismos vivos), o de un anticuerpo con su antgeno especfico (constituyente principal del sistema inmune), o de una enzima con su correspondiente sustrato (efectoras biolgicas ms importantes mediante la catlisis de reacciones bioqumicas a nivel celular) son algunos modelos de interacciones biolgicas en las que se inspiran los biosensores.

EN LA ACTUALIDAD SE ESTN UTILIZANDO ELEGANTES PROCEDIMIENTOS SINTTICOS DE ARQUITECTURA MOLECULAR PARA LA OBTENCIN DE REACTIVOS MUY INNOVADORES
FIGURA 4: Estrategia seguida por el grupo de de Receptores Moleculares Aplicados para la produccin de anticuerpos anti sulfonamida usados como biorreceptor en los biosensores electroqumico.

FIGURA 7. Representacin esquemtica de la estrategia de deteccin electroqumica de sulfonamidas basada en un magneto sensor. (A) Luego de la reaccin inmunolgica, las partculas magnticas modificadas con el anticuerpo especfico son captadas por el sensor magntico (I). El sensor se polariza a _0.150 V (II) y se detecta electroqumicamente la seal luego de la adicin de los reactivos necesarios (III). Aspecto macroscpico del sensor con las partculas magnticas en la superficie (IV). (B) Aspecto microscpico de la superficie del sensor con las esferas magnticas, obtenidas mediante microscopa electrnica de barrido tomada a una resolucin de 0.5 (mm) (I) y 100 _m (II a IV). (C) Imagen del prototipo desarrollado para medidas en el laboratorio.

rencias. Este hecho ha ocasionado que slo un nmero reducido de reacciones qumicas sean aprovechadas como sistemas receptores en los sensores qumicos, ya que stos se disean para funcionar en determinaciones directas sin tratamiento de la muestra. En la actualidad se estn utilizando elegantes procedimientos sintticos de arquitectura molecular para la obtencin de reactivos muy innovadores, formadores selectivos de complejos receptor-analito (host-guest), cuando las especies implicadas se complementan en forma y dimensiones (geometra) y en grupos enlazantes (energa). Por otro lado, se sabe que el reconocimiento molecular es la base de la vida celular, de su organizacin y mantenimiento. La comunicacin qumica entre clulas mediante sistemas moleculares complementarios es un proceso de vital importancia, responsable de la organizacin y la proteccin de organismos y de la regulacin de su metabolismo. Este tipo de reconocimiento, optimizado por la evolucin biolgica, es el que se ha estado utilizando para el desarrollo de los biosensores.
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Efectivamente, las interacciones entre enzimas y sustratos o inhibidores, entre anticuerpos y antgenos o haptenos, entre diversos receptores y hormonas, frmacos y neurotransmisores y entre fragmentos de ADN han servido de modelo a variados sistemas biosensores, algunos ya comercializados (Figura 3). El Grupo de Receptores Moleculares Aplicados ha producido anticuerpos policlonales anti sulfonamidas de clase, as como anti atrazina, luego del diseo y sntesis de los haptenos inmungenos, preservando la geometra, la conformacin, y la distribucin electrnica del analito (Figura 4). Estas molculas son receptores especficos ideales para biosensores. Metodologas y tecnologas La determinacin de componentes en medios complejos mediante sensores y biosensores se ha promovido extensamente debido a su simplicidad. En algunos casos son los mismos laboratorios quienes construyen sus propios sensores para aplicaciones muy particulares. Los sensores y biosensores son ideales para ser utilizados en mediciones directas, es decir, sin un tratamiento preliminar de la muestra. Son particularmente adecuados en los procesos industriales, sin necesidad de tomar muestras, in situ. Por ser porttiles y robustos, los sensores qumicos tambin son apropiados en mediciones de procesos, junto a reactores industriales o en circunstancias especiales. Los sensores pueden conectarse de algn modo con el proceso a seguir o controlar muestras en forma continua. Es

bles, es decir, de usar y tirar. Por lo tanto, la investigacin y desarrollo de los sensores qumicos y biosensores va tambin dirigida hacia diseos compatibles con tecnologas que posibiliten una gran produccin de dispositivos a bajo coste. En este sentido tiene una gran importancia el hecho de que los sensores se puedan desarrollan con tecnologas planas, de capas delgadas microlitogrficas, como las que se utilizan en la fabricacin de dispositivos microelectrnicas y en circuitos impresos. Eventualmente pueden construirse sensores de capas gruesas que no requieren inversiones muy elevadas, como los producidos con tcnicas serigrficas Biosensores electroqumicos para el anlisis rpido de residuos de antibiticos, pesticidas y bacterias patgenas en muestras agroalimentarias y medioambientales El Grupo de Sensores y Biosensores, en colaboracin con el Grupo de de Receptores Moleculares Aplicados, ha diseado un sistema electroqumico para la deteccin de sulfonamidas en leche, basados en una reaccin inmunolgica competitiva. Para tal fin, los anticuerpos especficos de clase anti-sulfonamidas se inmovilizaron covalentemente en partculas magnticas modificadas con grupos tosil. El ensayo inmunolgico competitivo se bas en la competencia entre el antibitico en la muestra y un conjugado enzimtico, diseado y sintetizado por el Grupo de Receptores Moleculares Aplicados. Finalmente, la cantidad de antibitico se detecta mediante una estrategia electroqumica de manera muy sensible, en un esquema que se muestra en la Figura 7. El uso de las partculas, sumado a las propiedades electroqumicas mejoradas del biosensor y al diseo apropiado del receptor molecular, hacen posible la deteccin del antibitico en concentraciones 100 veces por debajo de los lmites requeridos por UE (100 ppbs), en leche entera. Por otro lado, el hecho de utilizar partculas magnticas permite eliminar el efecto matriz mediante la simple dilucin de la leche 4 veces en una solucin amortiguada de fosfato, tratamiento muy fcil de realizar. Los primeros prototipos han demostrado tener una excelente sensibilidad (1 ppbs), y unas excelentes caractersticas para la determinacin de antibiticos fuera del mbito del laboratorio, por ser de uso simple, capaces de ser operados por personal no entrenado, y de bajo coste.

Un ensayo similar se realiz para la deteccin de atrazina en zumo de naranja y aguas superficiales y embotelladas, que demostra-

LAS PERSPECTIVAS FUTURAS SE DIRIGEN AL DISEO DE ESTRATEGIAS BASADOS EN BIOSENSORES ELECTROQUMICOS ENFOCADOS AL DIAGNSTICO DE PATOLOGAS EN HUMANOS Y DIAGNSTICO GENTICO

LOS SENSORES Y BIOSENSORES PRETENDEN SER DISPOSITIVOS CUYA FABRICACIN SE REALICE DE FORMA MASIVA A MUY BAJO COSTE

decir, el sensor est acompaado de un sistema de toma de muestra automatizado. Los sensores y biosensores pretenden ser dispositivos cuya fabricacin se realice de forma masiva a muy bajo coste. As, con una fabricacin econmica, estos dispositivos podran ser de uso personal y desechaFARMESPAA INDUSTRIAL

ron excelentes lmites de deteccin, 6ng L1, en zumo de naranja, muy por debajo del lmite establecido por la Unin Esuropea (0.1 g L-1) con un sistema electroqumico basados en una reaccin inmunolgica competitiva. Para tal fin, los anticuerpos especficos de clase anti-atrazina se inmovilizaron covalentemente en partculas magnticas modificadas con grupos tosil. El ensayo inmunolgico competitivo se bas en la competencia entre el pesticida en la muestra y el conjugado enzimtico, diseado y sintetizado por el Grupo de Receptores Moleculares Aplicados. Finalmente, la cantidad de pesticida se detecta mediante una estrategia similar a la que se muestra en la Figura 7. En el caso del zumo de naranja el tratamiento tambin es muy sencillo y consiste en la filtracin y en la dilucin. Asimismo, se han diseado estrategias de deteccin rpida de bacterias patgenas, tales como Salmonella y E coli, basado en su material gentico y con deteccin electroqumica. Se han diseado unos metodologas de amplificacin del material gentico usando primers magnticos, que podran ser integrados a termocicladores para la deteccin electroqumica de la amplificacin a tiempo real. Las perspectivas futuras se dirigen al diseo de estrategias basados en biosensores electroqumicos enfocados al diagnstico de patologas en humanos y diagnstico gentico, investigacin que se realizar en el GSB con el apoyo de la empresa ADF Tecnogen/Circagen.
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