Intervertebral discitis caused by nontypeable Haemophilus influenzae in an adult: Case report

R. Boulton,a, A. Swayamprakasam,a and M. Razab Author information Article notes Copyright and License information Go to:

Abstract
INTRODUCTION: Haemophilus influenzae is a common cause of bacterial meningitis in children and can cause upper respiratory tract infections in adults, but has yet to be reported solely involving intervertebral discitis. PRESENTATION OF CASE: A 67year-old builder presenting with fever, myalgia and back pain is found to have intervertebral discitis (confirmed on MRI) caused by H. influenzae (identified on blood cultures). DISCUSSION: A nontypeable form of H. influenzae has not been reported causing discitis. We describe a case in a relatively fit individual who was treated successfully with antimicrobial treatment. A preceding upper respiratory tract infection is the presumed source of infection, predisposed by long-term low-dose steroid therapy. CONCLUSION: H. influenzae is a rare, but treatable cause of discitis. Keywords: Haemophilus influenzae, Intervertebral discitis, Osteomyelitis Go to:

1.

Introduction

Haemophilus influenzae is the most common cause of bacterial meningitis in children, and causes otitis media, epiglottitis and upper respiratory tract infections in older people, yet it is infrequently reported causing disease elsewhere. Vertebral osteomyelitis due to H. influenzae is uncommon, and to our knowledge, only seven other cases have been reported. None solely involve the intervertebral discs, and only one of the previous seven cases was caused by a nontypeable strain.7 We describe a case in a relatively fit individual who was treated successfully with antimicrobial treatment. A preceding upper respiratory tract infection is the presumed source of infection, predisposed by long-term low-dose steroid therapy. Go to:

2.

Presentation of case

A 67-year-old builder was admitted following a two-week history of nausea, vomiting, lethargy, fever and rigors unresponsive to Oseltamivir. In the last three days he had developed a painful right shoulder, with no history of trauma and lower backache. He had no respiratory or abdominal symptoms and no recent dental procedures. His past medical history included gastritis, hypertension, nodular prurigo requiring long-term

low-dose steroid therapy and a Hartman's procedure with subsequent reversal for ulcerative colitis in 1992. Vital signs were temperature 38.3 C, pulse rate 120/min, respirations 20 breaths/min and BP150/95 mmHg. Cardiac, respiratory, abdominal and oral examination was normal. His extremities were neurologically intact, power 5/5 bilaterally (MRC scale) and sensation intact, but his right shoulder had globally reduced range of movement with joint line tenderness. Palpation of the back revealed exquisite pinpoint tenderness at the L4/5 intervertebral disc and decreased lumbar flexion due to pain. WBC count was 28.3 109/L with 88% neutrophils, hemoglobin 15.1 g/dL, urea 17.4 mmol/L, creatinine 167 mmol/L, liver function tests normal and C-reactive protein 510 mmol/L. Aerobic and anaerobic blood cultures taken on admission identified H. influenzae bacteraemia. Subsequent serotyping proved the strain to be nontypeable, sensitive to ceftriaxone. Right shoulder septic arthritis was excluded after a negative joint aspiration (needle position confirmed under image intensifier) and normal plain radiograph (Fig. 1). Transthoracic echocardiogram did not identify any vegetation or thrombi. Magnetic resonance imaging (MRI) of his brain, shoulder and lumbar region showed inflammation of the L4/5 disc, consistent with a diagnosis of intervertebral discitis (see Figs. 2 and 3).

Fig. 1 AP radiograph showing normal anatomy of the right shoulder.

Fig. 2 Sagittal, T2-weighted MR image showing increased signal intensity in the L4/L5 disc, consistent with discitis.

Fig. 3 Transverse, post-contrast, T2-weighted MR image obtained at the level of the L4/5 intervertebral space showing enhanced tissue in the center of the disc.

His H. influenzae discitis was treated for 6 weeks with IV antibiotics (co-amoxiclav, then ceftriaxone once sensitivities were identified), then a further 6 weeks with oral antibiotics. CRP and ESR at presentation were 510 and 17 respectively, but normalized at twelve weeks with resolution of the back pain. Go to:

3.

Discussion

This case is atypical for a number of reasons. Firstly, the presentation is unusual; given the main presenting symptom was shoulder pain with systemic features of infection but no history of weight loss. Back pain only developed after admission and commencement of intravenous antibiotic therapy. Secondly, the organism isolated is an unusual form of an unlikely organism, nontypeable H. influenzae. This organism commonly causes infections in children, but is less likely in adults.3 It is a fastidious non-motile Gram-negative coccobacillus that is part of the normal respiratory tract, conjunctiva and genitourinary flora. The patient's preceding upper respiratory tract infection is the presumed source of infection leading to a bacteraemia and resultant myositis and discitis. Thirdly, the site of infection for this particular serotype of Haemophilus has never previously been described and even vertebral osteomyelitis with this organism is exceedingly rare (the authors identified only seven case reports,1,3,6,8 and only one of these was nontypeable7). In these patients, many have underlying diseases including alcoholism, cirrhosis and diabetes mellitus.1,5 It is likely, however, that the long-term steroid intake contributed to the etiology of this case. Recent dental procedures are a likely causative factor, but no association exists for the published case reports2 as with our case. Other subspecies (Haemophilus aphrophilus) have also been identified as the causative organism of vertebral osteomyelitis4 and discitis.2,5 Of the four cases of discitis caused by H. aphrophilus, two were at the L4/5 level, one at T11/12 and one at C4-7.5 Diagnosis was most commonly made through clinical history and MRI findings, as in this case, although ideally, tissue biopsy from the disc should be obtained before commencing empirical treatment to confirm the diagnosis. H. influenzae is notoriously difficult to culture from sites other than the respiratory tract, particularly after antimicrobial therapy has been initiated. The decision not to perform a vertebral disc biopsy in this case was made as the patient had already received 24 h of antibiotics, was reluctant to undergo another procedure and demonstrated a quick clinical response. H. influenzae is more virulent when encapsulated in polysaccharide, as this protects the organism from phagocytic activity. Serological typing differentiates organisms by the capsular antigens they express. Nontypeable strains are not encapsulated, but are considered more invasive and were found to be responsible in 64% of Haemophilus soft tissue infections in adults.9 Sensitivity to antibiotics differs widely for these organisms, our isolate was found to be sensitive to ceftriaxone, vancomycin and ciprofloxacin. Duration of antibiotic treatment differed in the case reports from 4 to 27 weeks, with a mean of 10 weeks.5 Our case was treated for a total of 12 weeks without recurrence or complications at 6 months. Go to:

4.

Conclusion

Nontypeable H. influenzae is a rare, but treatable cause of discitis. Diagnosis should be made from clinical history, examination findings, positive cultures and imaging using MRI where possible. Ideally, tissue biopsy from the disc should be obtained before commencing empirical treatment if the clinical situation allows. Treatment duration should be dictated by clinical and biochemical response. The authors would advocate ten to twelve weeks unless contraindicated. Go to:

Conflict of interest
The authors wish to declare there are no conflicts of interest in the production of this case report. Go to:

Funding
This work did not receive any financial support. Go to:

Ethical approval
Written informed consent was obtained from the patient for publication of this case report and accompanying images. Go to:

Authors contribution
R. Boulton, was directly involved in the treatment of the case, obtained consent for publication, obtained the relevant data and produced the report in conjunction with the second author. A. Swayamprakasam assisted in the literature review and write up. M. Raza was responsible for the overall content of the article, including review of the initial report and subsequent modifications. He also guided the other authors in relevant literature. Go to:

Acknowledgments
The authors would like to acknowledge the patient on whom this report is based for kindly giving us permission to publish this report and for Milton Keynes Foundation NHS Hospital microbiology and radiology departments for their contribution.

The authors acknowledge the support from the relevant hospital departments, but there are no individuals that specific mention as a contributor. Go to:

References
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE VETERINRIA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA VETERINRIA

Isolamento e caracterizao utilizando marcadores fenotpicos e genotpicos de resistncia e virulncia de Vibrio spp e Aeromonas spp a partir do camaro da Malsia ( Macrobrachium rosenbergii) cultivados em Silva Jardim, Rio de Janeiro.

( PROJETO)

DOUGLAS MCINTOSH- ORIENTADOR Ronaldo Leo Guimares- CANDIDATO

Agosto 2012

1.0 Introduo

O ambiente marinho tem seu equilbrio estabelecido face a biota existente, onde espcies microscpicas de natureza autctone perpetuam e mantm a purificao do ecossistema. Entre os constituintes ubiquitrios, o gnero Vibrio vem sendo alvo de estudo desde o sculo passado face ao reconhecimento de que uma espcie, V. cholerae O1 representou desde a antiguidade um risco ao homem com elevados ndices de mortalidade. Na atualidade esta condio pode ser relativamente elevada, no subcontinente indiano e africano. Por outro lado, diferentes espcies vm sendo reconhecidas representando problemas na sade humana e animal. Tal fato tem como fator adicional na atualidade a necessidade de implementar a produo de alimentos, tendo em vista que a populao humana mundial vem apresentando o seu crescimento acelerado. Paralelamente, aspectos como o cultivo de alimentos de origem vegetal e animal para consumo, novas tcnicas de produo e facilidades de obteno de produtos de qualidade representam fatores altamente relevantes para a transmisso de patgenos para o homem. Entre os alimentos de origem animal, o pescado representa uma fonte protica destacando-se o papel da indstria da carcinicultura. Implantada em outros pases, entre ns e representa uma atividade relativamente nova, a qual na atualidade tem sido objeto de interesse, cuja extensa regio costeira e clima tropical representam elementos de estmulo para os produtos. No Brasil, a indstria da carcinicultura iniciou-se no ano de 1973 no Rio Grande do Norte, e hodiernamente, consolida-se como principal item da pauta de exportao desse estado. A criao de camaro em cativeiro exerce relevante papel scioeconmico, e de cidadania por gerar empregos em diversos setores: reduzir os ndices de misria, incentivar a dieta com alimentos proticos alm de minorar a explorao cada vez maior dos recursos naturais costeiros. Analisando a produo mundial de camares para consumo humano, verifica-se que 63,56% do volume bruto total

oriundo da captura e, 36,44% resultante da criao em cativeiro, contudo se espera que a produo por cultivo em viveiros supere a produo por captura (CUNHA, 2008). . 2.0 Contexto Internacional A aqicultura mundial aumentou na ltima dcada 80,4 % passando de aproximadamente 28,6 a 51,6 milhes de toneladas, sendo que a criao de camares foi o setor que mais se desenvolveu. Dados da FAO (2008) revelam que a carcinicultura em geral cresceu 244 % chegando a produzir 3,1 milhes de toneladas (ano, em 2008). Consoante dados da FAO (2008) a produo mundial de camares de gua doce vem crescendo em ritmo exponencial, aumentando de 21000 toneladas em 1990 para 400000 toneladas em 2008, representando um incremento de produo de 1800 %. Dentre as espcies dulccolas, o Macrobranchium rosenbergii merece destaque, uma vez que seu cultivo, na ltima dcada representou mais de 65 % do total de camares produzidos em cativeiro ( FAO 2007-2008). 3.0 Problemtica No obstante, desta situao aparentemente favorvel, tanto no nosso pas quanto na Argentina, a indstria da carcinicultura precisa urgentemente suplantar alguns de suas principais dificuldades, de maneira que possam ter maior competitividade no mercado globalizado. Neste sentido, a elaborao de plantas de processamento e expedio e o desenvolvimento da tecnologia apropriada visando a conservao do produto at atingir o consumidor so aspectos relevantes. A indstria da carcinicultura, de maneira geral se depara com limitaes devido a ausncia de polticas voltadas para o setor, carncia de mo-de-obra especializada e de aprimoramento nas tcnicas de manejo, procedimentos sanitrios e ambientais, financiamento e custeio da produo e falta de alternativas nutritivas para a engorda.

3.0 Vibrio spp Considerando particularmente a Famlia Vibrionaceae, atualmente so reconhecidas 12 espcies capazes de ocasionar doena humana e 14 em animais. Em crustceos, historicamente a vibriose passou a ser reconhecida como um problema relevante em carcinicultura, quando de sua ocorrncia na indstria mexicana, determinou grandes perdas para a indstria de camaro, tendo sido designada de

Sndrome das Gaivotas. Tal fato representou um alerta no qual houve o reconhecimento de que se faz necessrio o controle em todas as etapas da produo para prevenir o elevado ndice de mortalidade em cativeiro. Entre as espcies responsveis por infeces em camaro, a maior prevalncia est em V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. harveyi e V. alginolyticus seguidas por V. damsela, V. fluviales, V. carchariae e V. splendidus (PEREIRA, 2007). De modo semelhante em animais de vida livre capturados, que apresentaram caractersticas clnicas de morbidade, tambm foram identificadas a maioria destas espcies, levando a hiptese de que representam um risco para estes crustceos. Surtos de vibrioses so normalmente causados por um desequilbrio na populao destas bactrias. Entre as principais espcies do gnero Vibrio que causam maiores prejuzos para a carcinicultura esto o Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus e Vibrio alginolyticus. As vibrioses so classificadas como infeces secundrias e oportunistas, atacando todos os estgios de vida do camaro (larval, pslarval, juvenil e adulto). Problemas decorrentes desta enfermidade eclodem quando condies de estresse surgem no sistema de cultivo, tais como: queda na taxa de oxignio dissolvido, superpovoamento, manuseio inapropriado do estoque, leses na cutcula dos camares, subalimentao e altas concentraes de compostos nitrogenados no ambiente de cultivo. A vibriose pode ser cuticular, entrica e sistmica. Quando localizada, apresenta leses melanizadas na carapaa e abscessos no hepatopncreas. O impacto desta doena varivel, mas em alguns casos pode alcanar at 70% da populao cultivada. Na vibriose crnica, camares mortos ou morimbundos podem ser canibalizados rapidamente contaminando outros indivduos na populao. (NUNES et al., 2006). Aeromonas spp O gnero Aeromonas inclui patgenos responsveis por infeces em peixes, anfbios, crustceos e no homem. Em particular, a A. hydrophila tem recebido uma ateno crescente como um possvel agente etiolgico de diarria devido a ingesto de alimentos. (BORCHARDT et al., 2006). Sendo primariamente autctones do ambiente aqutico, so detectados em ambientes dulccolas, estuarino e raramente em reas de elevada salinidade. Algumas cepas de Aeromonas foram includas na relao de patgenos emergentes importantes para a sade pblica pela Agncia de Proteo Ambiental Americana (EPA) por causarem doena no homem veiculao atravs da gua e

alimentos (FAO, 2006). Ultimamente, tem sido apontada de uma maior importncia no diagnstico de doenas de crustceos e peixes, muitas vezes aparecendo como agente primrio causador de leses ulcerativas e septicemia hemorrgica inclusive em peixes de gua doce (GHENGHESH et al., 2009; SAHA & PAL, 2002; SOUZA & SILVASOUZA, 2001), acarretando perdas na produo e na qualidade do pescado (RADU et al., 2003; VIVEKANADHAN et al., 2002). Um aspecto importante relacionado criao intensiva de camares o uso cada vez maior de antibiticos na profilaxia e no tratamento de doenas, gerando um aumento global da resistncia bacteriana a mltiplas drogas, inclusive entre as espcies de Aeromonas (CHAUDHURY et al., 2008). A associao da mltipla resistncia a diferentes antimicrobianos com a transferncia horizontal potencial de genes de resistncia entre bactrias filogeneticamente prximas ou no, outra realidade preocupante (RHODES et al., 2006; SCHMIDT et al., 2008).

4.0. Justificativa A investigao microbiolgica dos alimentos pode contribuir para definir o risco de exposio a patgenos potenciais e para enfocar a importncia relativa de diferentes produtos como veiculadores destes. Doenas de origem alimentar so causadas por organismos que entram no corpo humano atravs da ingesto de alimento contaminado. O pescado pode veicular uma variedade de microrganismos patognicos para o homem aumentando a preocupao com a qualidade sanitria do pescado e suas preparaes devido a globalizao do consumo de crustceos, entre outros. As doenas transmitidas pelo pescado representam uma contnua ameaa para todos os segmentos da sociedade, independentemente de idade, sexo, estilo de vida, etnis e nvel scio-econmico( CDC-2007). A presena de bactrias pertencentes as famlias Vibrionaceae e Aeromonadaceae no camaro, de suma importncia no s para a carcinicultura, por poderem causar srias doenas em seus hospedeiros e provocar grandes perdas econmicas, como tambm para a sade pblica, uma vez que estes podem se tornar fatores de risco ao homem que se alimenta destes animais, estando geralmente associados a quadros gastrentricos. Entre as espcies de importncia em sude pblica, isoladas a partir de camares destacam-se o V. parahemolyticus e A. hydrophila. Embora a pesquisa de Aeromonas em alimento no seja preconizada pela legislao brasileira, considerado um patgeno emergente, que vem sendo, cada vez mais, relacionado a doenas transmitidas pelo pescado. A veiculao de cepas bacterianas que variam muito no potencial de virulncia, resistncia, e no aspecto epidemiolgico deve ser constantemente monitorada em ambientes voltados a produo animal, de maneira a prevenir sua disseminao, bem como as fontes de contaminao e os mecanismos de transmisso. Os aspectos acima mencionados, aliados ao discreto respaldo da literatura nacional sobre o tema, justificam, do ponto de vista de sade pblica, estudos que avaliem a

qualidade sanitria do camaro considerando a magnitude de espcies potencialmente patognicas para o homem.

5.0. Objetivos

- Isolar e identificar espcies de Vibrio spp e Aeromonas spp a partir de camares coletados em fazendas de carcinicultura em Silva Jardim. -Avaliar por meio de mtodos tradicionais, o fentipo de resistncia aos agentes antimicrobianos dos isolados de espcies potencialmente patognicas para humanos e animais. - Avaliar a qualidade microbiolgica e fsico-qumica da gua utilizada nos tanques de cultivo dos camares bem como sua relao como causadores de estresse e doenas. - Contribuir para a preservao da biodiversidade e da biossegurana com base no biomonitoramento dos sistemas de produo.

6.0. Metodologia 6.1 Pontos de Coleta

O ponto de coleta ser estabelecido no municpio de Silva Jardim, localizado no Estado do Rio de Janeiro. As coletas de camaro da Malsia sero realizadas em fazendas de carcinicultura, no perodo de setembro de 2012 a setembro de 2012. Neste mesmo ponto, sero coletadas amostras da gua da fazenda de carcinicultura para anlise microbiolgica e fsico-qumica.

6.2 Anlise Microbiolgica dos Camares 6.2.1 Amostragem Os camares da Malsia, pertencentes a espcie Macrobrachium

rosenbergii, sero coletados mensalmente. Em cada coleta, sero extrados 2 lotes de 25 indivduos adultos. Em seguida, estes organismos sero acondicionados em sacos de polietileno dentro de caixa de isopor contendo gelo e transportados imediatamente ao Laboratrio do Centro de Biologia Experimental Oceanus Ltda, para realizao da anlise bacteriolgica. O transporte dos camares sob resfriamento ter como objetivo evitar a morte da maioria dos animais e o conseqente crescimento de sua microbiota.

6.2.3 Processamento das amostras Os lotes sero separados, adotando-se o mesmo procedimento para cada uma. Os camares sero lavados individualmente com auxlio de escova, sob gua corrente potvel, para a retirada de sujidades. Em capela de fluxo laminar os camares triturados a fim de promover homogeneizao do material. Para a pesquisa de Vibrio spp. e Aeromonas spp. sero pesados 25g da amostra e adicionados a 225 mL de gua peptonada alcalina (APA) com 1% de NaCl. A partir desta diluio (10-1), de cada amostra, ser tomada uma alquota de 1mL e acrescentada em tubo contendo 9 mL de APA com 1% de NaCl (diluio 10-2), e a outro com 9 mL de APA com 3% de NaCl (diluio 10-2), sendo usados como meios de enriquecimento. A pesquisa de Enterobactrias seguir basicamente a mesma metodologia utilizada para Vibrio spp. diferenciando-se apenas na no utilizao de NaCl em APA (FDA, 1995).

6.3 Pesquisa de Microrganismos com Potencial Patognico

6.3.1 Pesquisa de Vibrio spp. e Aeromonas spp. As amostras que apresentarem crescimento em APA com 1% e 3% de NaCl sero isoladas em Agar Tiossulfato Citrato Sais Biliares Sacarose (TCBS-Oxoid) acrescidas de 1%, 2% e 3% de NaCl, em duplicata e Agar Seletivo para PseudomonasAeromonas (GSP-Micromed) acrescido de 1% de NaCl, em duplicata. Todas as placas sero incubadas 37oC por 24 horas. As crescentes concentraes de NaCl em Agar TCBS tem como objetivo tornar este meio mais seletivo, favorecendo crescimento de bactrias com diferentes graus de halofilia (FDA, 1995). Aps a identificao presuntiva das colnias, estas sero submetidas ao mtodo de Gram e a prova do KOH a 3%, onde a formao de gel viscoso indicar resultado positivo (KONEMAN et al., 2008). Sero transferidas at 10 colnias isoladas de cada placa de TCBS, apresentando colorao amarela (sacarose positivo) ou verde (sacarose negativo) e colnias amarelas (amido positivo) isoladas do gar GSP para tubos contendo Agar Nutriente (Micromed), LIA (gar Lisina Ferro-Micromed) e Agar Kligler (Micromed), todos acrescidos de 1% de NaCl e submetidos a incubao 37oC por 24 horas para diferenciao presuntiva entre muitos Vibrio spp., Aeromonas spp, Pseudomonas spp. e enterobactrias.

Posteriormente, a diferenciao entre Vibrio e Aeromonas de Enterobactrias ser realizada atravs da enzima citocromo oxidase, onde Vibrio spp. e Aeromonas spp. so oxidase positivos, enquanto que os membros de Enterobacteriaceae so negativos. A prova da oxidase ser realizada a partir do crescimento dos isolados em gar nutriente contendo 1% de NaCl. Ser retirada uma alquota com emprego da ala de platina e foram feitos esfregaos em fitas PROBAC impregnadas com cloridrato de tetrametil-pfenilenodiamina. O teste ser considerado positivo quando do aparecimento de uma colorao azul arroxeado em 10 segundos (FDA, 1995; OLIVER; KAPER, 1997; KONEMAN et al., 2008).

6.3.1.1 Identificao fenotpica dos isolados

6.4.1.2 Prova de fermentao de acares A fermentao de acares ser testada utilizando-se APA acrescida de 1% de NaCl, 1% do acar em questo e 1% do Indicador de Andrade. A produo de cido, indicado pela diminuio do pH e conseqente mudana de cor, ser avaliada atravs da colorao rosa aps 24 horas de incubao na temperatura de 37C. Os acares avaliados sero: glicose, manitol, lactose, sacarose, arabinose, celobiose, maltose e manose (Micromed). Nos tubos de ensaio contendo a soluo de glicose sero inseridos tubos de Durham para a observao da produo de gs, a qual caracteriza esta prova como positiva (KONEMAN et al., 2008). 5.4.1.3 Prova de descarboxilao de lisina e ornitina e dehidrolizao de arginina Para a realizao das provas de descarboxilao de lisina e ornitina e dehidrolizao de arginina, sero utilizada uma base contendo peptona, extrato de levedura, dextrose e prpura de bromocresol, acrescida de 1% de NaCl, com a qual foram preparadas as solues de lisina, arginina e ornitina (Micromed). As solues sero distribudas em tubos aos quais foi adicionada uma fina camada de leo mineral superfcie do lquido, a fim de promover ambiente microaerfilo. Como controle, utilizou-se a soluo base pura tambm acrescida de leo mineral (KONEMAN et al., 2008). Aps a inoculao dos isolados e incubao 37oC por at 7 dias, a leitura destas provas ser interpretada como negativa quando a colorao do meio apresentavase amarela indicando acidez em ocasio da fermentao da glicose. Na reao positiva, ocorre fermentao do meio para ativao das enzimas de descarboxilao e posteriormente o meio vira para colorao violeta, indicando basicidade do meio em funo da descarboxilao ou dehidrolisao do aminocido. A base usada como controle deve sempre apresentar resultado negativo (KONEMAN et al., 2008).

6.3.1.4 Avaliao da halofilia Utilizando-se agulha bacteriolgica os isolados sero inoculados em tubos com gua peptonada alcalina com diferentes concentraes de NaCl (0%, 3%, 6%, 8% e 10%) e incubados a 37C por 24 horas. A turvao observada no tubo indicar o crescimento bacteriano, caracterizando o grau de halofilia do isolado testado (FDA, 1995).

6.3.1.5 Sensibilidade ao vibriosttico O/129 Para este procedimento, os isolados sero inoculados em APA com 1% NaCl, incubados durante 18 horas a 37C e diludas na concentrao do tubo 0,5 da escala de McFarland, equivalente a 1,5 x 106 clulas/mL. Uma suspenso bacteriana (0,5mL) ser distribuda por toda a superfcie das placas contendo meio slido gar Meller Hinton (MH - Micromed) com 1% de NaCl com o auxlio da ala de Drigalski. Em cada placa semeada, ser depositado um disco de 6 mm de dimetro impregnado com O/129 na dosagem de 10g e outro na dosagem de 150g, distantes entre si aproximadamente 4 cm, sendo todas as placas incubadas a 37oC por 12 a 24 horas. A leitura ser realizada atravs da observao do halo de sensibilidade ou crescimento bacteriano ao redor do disco de O/129, considerando o isolado como sensvel ou resistente, respectivamente (JANDA et al., 1998 ).

6.4.1.6 Prova de ONPG (orto-nitrofenil beta galactosidase) Este teste ser utilizado para deteco da enzima galactosidase, utilizando-se discos de diferenciao de ONPG (Bacto), recomendados para a deteco da presena desta enzima, objetivando a identificao de microrganismos fermentadores tardios de lactose. A partir do crescimento em gar Kliger contendo 1% de NaCl, ser retirada uma alada de cada cultura e suspensa em 0,2 mL de soluo salina (0,85% de NaCl) em tubo de ensaio. Cada tubo receber um disco de ONPG e aps incubao 37oC por 24 horas ser realizada a leitura. A reao positiva ser caracterizada pela colorao amarela na soluo salina, oriunda da hidrlise do ONPG, pela liberao de ortonitrofenol (KONEMAN et al., 2008).

6.4.1.7 Provas de motilidade e produo de indol Para as provas de motilidade e produo do indol, utilizar Agar sulfeto indol motilidade (SIM - Vetec) acrescido de 1% de NaCl. Aps inoculao em picada com auxlio de ala moldada em agulha, os isolados sero incubados a 35 por 24 a 48 horas. A interpretao do teste de motilidade ser realizada atravs da observao do tubo contra a luz sendo possvel visualizar o tipo de crescimento da colnia, sendo considerado motilidade negativo o microrganismo crescido apenas na linha inoculada e positivo o que ultrapassou a mesma. A leitura da produo de indol, resultada da

degradao metablica do aminocido triptofano, ser realizada adicionando-se gotas de reativo de Kovacs (para-dimetilaminobenzaldedo em lcool) no tubo. A mudana de colorao do reativo de amarela para vermelha indica a presena de indol, sendo a prova considerada positiva (KONEMAN et al., 2008).

6.4.1.8 Prova de Voges-Proskauer (VP) e Vermelho de Metila (VM) O caldo MR-VP acrescido de 1% de NaCl apresenta na sua composio glicose, peptona, gua e fosfato e ser utilizado para a leitura da reao de VM-VP. A utilizao da glicose, apresentando a produo de acetilmetilcarbinol, indicada pela colorao rosa na prova do VP aps a adio de 0,2 mL de -naftol a 5% e 0,6 mL de KOH (40%) no caldo contendo o inculo incubado por 24 a 48 horas a 35C. A prova do VM utilizada para a deteco de cidos mistos. detectado atravs da viragem da colorao do caldo para vermelho aps a adio do reativo vermelho de metila (KONEMAN et al., 2008).

6.4.1.9 Prova de reduo de nitrato Para avaliao da reduo de nitrato, ser utilizado caldo contendo nitrato de potssio (KNO3). A leitura da reduo do nitrato a nitrito ser realizada adicionando-se em uma lmina, uma gota do caldo inoculado aps 24 horas a 35C e, uma gota de cido sulfanlico e outra de cido-naftilamina, reativos A e B de Griess Ilosway. A colorao rsea avermelhada indica presena de nitrito no caldo e, conseqentemente prova de reduo positiva (KONEMAN et al., 2008).

7.0 Pesquisa de Aeromonas As diversas espcies de Aeromonas apresentam bom crescimento em Agar GSP( Agar seletivo para Pseudomonas-Aeromonas ) no qual crescem sob a forma de colnias amarelas circundadas por um halo de hidrlise de amido. As provas bioqumicas so baseadas na prova da oxidase e resistncia ao agente vibriosttico O/129. Geralmente, esses microrganismos so sensveis aos seguintes agentes microbianos: cloranfenicol, colistina, gentamicina, tetraciclina e sulfometaxozal-trimetoprim. De um modo geral so resistentes a ampicilina , carbenicilina, cefazolim e ticarcilina. Essa resistncia aos antibiticos tem interesse tanto para o controle de doenas em animais quanto em seres humanos, uma vez que o uso indiscriminado destas drogas tem incrementado a resistncia desses microrganismos( Kelly et al.., 2003);

8.0Teste de Suscetibilidade a antimicrobianos Amostras de cepa padro sero utilizadas como controle para cada isolado testado. Os testes de difuso em disco sero efetuados para as amostras identidicadas segundo a metodologia recomendada pelo Clinical and Laboratory Standards Institute ( CLSI, 2011). 9.0 Ensaios para deteco de genes de resistncia e virulncia Ensaios de Reao em Cadeia de Polimerase ( PCR) sero executados de acordo com os protocolos descritos na literatura para cada gene de eleio. 10. Anlise estatstica As anlises estatsticas de mdia, desvio padro, varincia e significncia considerando p 0,05 sero efetuadas utilizando o programa Microsoft Excel. O Teste de Qui-quadrado ser utilizado para avaliar a sensibilidade, a especificidade e o valor preditivo e uma anlise multivariada para buscar a correlao entre deteco gentica e produo fenotpica de fatores de virulncia e da resistncia antimicrobiana.

11. Referncias Bibliogrficas

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11.. Etapas e Cronograma de execuo

Etapas Out 1a Etapa 2a Etapa 3a Etapa 4a Etapa 5a Etapa 6a Etapa 7a Etapa x x x

2012 Nov Dez x x x x x x x Jan x x x x Fev X X X X Mar x x x x Abr x x x x

2013 Mai x x x x Jun Jul x x x x x x x x x Ago x x x x x x Set Out x x x x x x x x x x

1a Etapa: Visitas s fazendas de carcinicultura. Coleta das amostras; 2a Etapa: Isolamento e identificao das bactrias provenientes de camares atravs de mtodos tradicionais; 3a Etapa: Avaliao microbiolgica e fsico-qumica da gua de cultivo; 4a Etapa: Retorno s propriedades com os laudos de identificao; 5a Etapa: Tabulao dos resultados para fins de publicao de trabalhos cientficos; 6a Etapa: Gerao de trabalhos cientficos; 7a Etapa: Confeco de Relatrio para anlise do projeto.

16. Infraestrutura existente para execuo do projeto

O projeto ser desenvolvido na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro e no Centro de Biologia Experimental Oceanus.