Mdulo II

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MTODOS PARASITOLGICOS DIRETOS

FUNDAMENTO Conforme relatado anteriormente, os mtodos parasitolgicos diretos baseiam-se na pesquisa direta do parasita na amostra clnica. Eles podem ser realizados em laboratrios clnicos com condies mnimas de equipamentos, porm necessrio que o prossional tenha passado por um treinamento de reconhecimento do parasito. Nesse treinamento, o T.cruzi deve ser diferenciado de outras espcies de tripanossomas que infectam tambm o homem. Nas pginas seguintes nos deteremos em protocolos que se baseiam na demonstrao do parasito em lmina, que so procedimentos simples sendo necessrio apenas como equipamento um microscpio. importante voltar a ressaltar que os mtodos parasitolgicos diretos s apresentam alta sensibilidade na presena de parasitemia patente, sendo por isso o mtodo de escolha na suspeita de casos agudos ou de reativao da infeco. COLETA DA AMOSTRA A obteno da amostra de sangue pode ser realizada diretamente por puno digital ou venosa.

PROTOCOLOS

DISTENSO FINA (ESFREGAOS) A distenso na permite a identicao das estruturas morfolgicas da espcie alvo de reconhecimento, porm a sensibilidade do diagnstico menor que a da gota espessa. Isto ocorre em virtude da menor concentrao do sangue. Tambm proporciona a classicao morfolgica do parasita por permitir uma melhor visualizao dele. Entretanto, a gota espessa, por ter uma maior quantidade de sangue desemoglobinizado, apresenta uma maior probabilidade de se visualizar o parasito na amostra. Para a confeco da distenso na devemos utilizar uma lmina bizelada ou escantonada (vide foto a seguir) para espalhar o sangue, trabalhando em uma superfcie plana horizontal. Devemos formar um ngulo de aproximadamente 45 com a lmina bizelada e, logo aps a mesma entrar em contato com a gota de sangue, espalh-la com um rpido movimento para frente, para formar uma camada na, sem atingir o nal da lmina (Figuras 1 e 2). Mais detalhes da confeco sero fornecidos a seguir.
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A distenso na deveria permitir uma menor perda de parasitas, se comparada com a gota espessa, por ser xada e no ser submetida desemoglobinizao. As distenses nas conservam por maior tempo a colorao original e resistem mais ao atrito aps a remoo do leo de imerso.

CONFECO DAS DISTENSES (ESFREGAOS)

1a ETAPA: COLETA DA AMOSTRA E PREPARAO DAS LMINAS 1) Colocar uma pequena gota de sangue, coletada por puno digital ou venosa, na extremidade da lmina. Tocar a gota de sangue com a borda estreita da lmina sem canto (lmina extensora), formando um ngulo de 45 com a face superior da lmina; 2) Fazer com a lmina extensora um ligeiro movimento para trs, at encostar na gota de sangue. Deixar que a gota se difunda uniformemente, ao longo da borda da lmina extensora, por capilaridade; 3) Levar a lmina para frente, de forma que ela carregue a gota de sangue que se quer estender numa camada delgada e uniforme. essencial escorregar a lmina extensora de uma s vez, sem deter-se. O movimento de extenso deve ser uniforme. O sangue dever ser puxado pela lmina e no empurrado pela mesma (movimento suave). 4) Deixar secar temperatura ambiente ou em uma estufa a 28 C. A) O ngulo entre a lmina e a lmina extensora (bizelada) deve ser de 45 ; B) Aproximando as duas, a gota de sangue se distende por capilaridade imediatamente; C) O sangue carreado pela borda da lmina, que se impulsiona para frente em um movimento rpido e leve.

Fonte: Beak, W., Paulete, J. Sangue: Tcnicas de Citologia e Histologia. Figura 1: Modo de estender a gota de sangue.

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Figura 2: Seco de um esfregao. Desenho de Helosa Maria Nogueira Diniz, adaptado de: PRAT, J.G.; TRAID, M.C.; MORAIS, P.; ANDRADE, S.L. (orgs) Combatendo a Malria no Parque Nacional do Ja e Resex do Rio Unini. Barcelona: Nucli destudis per a lAmaznia de Catalunya - NeAC, 2009.

2a ETAPA: COLORAO PELO MTODO DE GIEMSA Neste tipo de colorao descrito, utilizamos o corante Giemsa. A soluo de Giemsa destina-se a ser utilizada na colorao de esfregaos do sangue ou da medula ssea in vitro, consistindo numa soluo tampo de tiazina e eosinato concebida para a colorao de elementos gurados do sangue. Esse corante poder ser utilizado em separado ou em conjunto com o corante May-Grunwald. O Giemsa, que cora especicamente os grupos de fosfato do ADN, prende-se a regies onde h alta quantidade de ligaes A-T (Adenina Timina). Em uma colorao bem feita, os ncleos celulares apresentaro diversos tons de prpura. A colorao citoplasmtica apresentar diversos tons de azul a cor de-rosa claro. As etapas esto descritas abaixo: 1) Fixar as lminas com lcool metlico livre de acetona durante 1 a 2 minutos a temperatura ambiente (pela nossa experincia 1 min o suciente); 2) Corar as distenses com soluo de Giemsa, preparada no momento da colorao na concentrao de 1 volume de Giemsa para 9 volumes de gua tamponada (pH 6,8) (preparao do corante e da gua tamponada em Preparo de Solues); 3) Colocar o corante sobre a lmina ou imergir em frasco de vidro tipo Coplin, deixando por cerca de 5 a 10 minutos; 4) Lavar a lmina em gua da torneira (uxo no); 5) Escorrer a gua e deixar secar.
Fonte: Simons, A. Technical Hematology. Philadelphia & Toronto: J.B.Lippincott Company, 1976. 476p. Observao: O exame da gota distendida deve ser empregado em caso de suspeita de infeco aguda, porm tem pouca sensibilidade no caso dos parasitos no serem abundantes. tem a vantagem de possibilitar uma boa visualizao da morfologia do parasita. conveniente fazer vrias lminas, antes de dar o caso como negativo. quanto mais antigo o esfregao maior o tempo de colorao. um esfregao novo, geralmente, requer de 10 a 15 min para se corar. (adaptado de Referncia: Beak, W, Paulete J. Sangue: Tcnicas de Citologia e Histologia. Rio de Janeiro: Editora Livros Tcnicos e Cientficos, 1 v., 1976, 306 p.).

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GOTA ESPESSA um mtodo simples e ecaz de diagnstico, alm de ter baixo custo. A gota espessa tambm o mtodo ocialmente utilizado no Brasil, para o diagnstico da malria. Sua tcnica baseia-se na visualizao do parasito, atravs de microscopia tica, aps colorao pelo mtodo de Walker ou Giemsa. Permite a diferenciao especca dos parasitos a partir da anlise de sua colorao, morfologia e de seus estdios de desenvolvimento no sangue perifrico, devido a sua alta concentrao. Para a confeco da gota espessa, podemos colocar pequenas gotas de sangue nas posies relativas aos vrtices de um quadrado imaginrio e uni-las com um movimento circular utilizando um palito descartvel ou o vrtice de uma lmina comum. Como dissemos anteriormente, nos procedimentos acima descritos devemos, preferencialmente, utilizar o sangue sem anticoagulante, pois essas substncias dicultam a xao do sangue, fazendo com que o esfregao ou a gota espessa possam desprenderse durante o procedimento de colorao ou durante a lavagem posterior colorao. O material deve ser corado no mximo at 72 horas aps a confeco. No caso da gota espessa, a desemoglobinizao ca prejudicada se esse perodo for superior a 72 horas. A gura 3, a seguir, representa um esquema de um corte transversal de uma gota espessa e o que ocorre aps a desemoglobinizao. Os corantes utilizados para corar distenses sangneas ou gotas espessas so chamados de pancrmicos. uma mistura de corantes de caractersticas neutras, dependentes do pH da soluo corante, que em condies apropriadas coram os componentes nucleares e citoplasmticos dos leuccitos, com predominncia de tons vermelhos (quando cidos) e azulados diversos (quando bsicos). A soluo de colorao deve ser feita com certa antecedncia antes de ser colocada em uso. Na rotina, apenas uma pequena quantidade deve ser colocada em uso; para isso, aconselha-se transferir a mesma para um pequeno frasco com conta-gotas, o que tem como objetivo evitar a hidratao de toda a soluo estoque. O corante deve ser mantido no frasco original, bem vedado, temperatura ambiente e ao abrigo da luz solar. Sob essas condies, permanece estvel at a data de vencimento indicada no rtulo do frasco. Na prtica diria o corante utilizado sob forma de gotas. Devemos utilizar um pequeno frasco com conta-gotas, que possa ser periodicamente alimentado com o corante do frasco estoque. Alguns corantes so solues alcolicas, por isso devemos tomar os cuidados inerentes ao uso do lcool em laboratrio.

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Devemos evitar pipetar o corante com o uso da boca. A ingesto acidental do metanol (presente em alguns corantes e utilizado como xador) pode ser fatal, dependendo da quantidade absorvida. As solues corantes so para uso exclusivo in vitro. Seu manuseio deve ser cuidadoso, evitando-se o contato com pele e mucosas. Em caso de contaminao acidental, lavar a rea afetada em gua corrente. O descarte do corante utilizado dever obedecer aos critrios de biossegurana estabelecidos pelo laboratrio. Normalmente para a colorao de lminas necessitamos do seguinte material: 1. Pissetas (frascos plsticos de lavagem); 2. Uma placa de acrlico (placa cncava para colorao); 3. Frasco conta-gotas; 4. Suporte prprio para colocar as lminas na horizontal (para uma parte do processo de colorao); 5. Suporte prprio para colocar as lminas na vertical (para secar as lminas na ltima etapa da colorao); 6. Relgio marcador de tempo com alarme; 7. Proveta graduada de 100 ml; 8. Papel absorvente; 9. Soluo de azul de metileno fosfato; 10. gua tamponada; 11. Soluo do Corante. X
Figura 3: Corte trasnversal de uma gota espessa e o que ocorre aps a desemoglobinizao. Desenho de Helosa Maria Nogueira Diniz, adaptado de: PRAT, J.G.; TRAID, M.C.; MORAIS, P.; ANDRADE, S.L. (orgs) Combatendo a Malria no Parque Nacional do Ja e Resex do Rio Unini. Barcelona: Nucli destudis per a lAmaznia de Catalunya-NeAC, 2009.

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COLETA DE SANGUE 1) Separar duas lminas limpas deixando-as em superfcie plana e horizontal (Figura 36); 2) Colocar uma das lminas sobre uma superfcie plana e manuse-la pelas extremidades, evitando tocar as superfcies. De preferncia, a lmina deve estar com etiqueta autoadesiva para o registro da identicao; a opo alternativa usar lmina com extremidade esmerilhada, onde a identicao feita com lpis; 3) Calar luvas de ltex descartveis; 4) Limpar vigorosamente a pele de local de puno (parte lateral do segundo ou do terceiro dedo da mo, lbulo da orelha ou, em lactentes, o dedo grande do p ou calcanhar) com gaze ou algodo embebido em lcool a 70%; posteriormente, enxugar com gaze ou algodo secos; 5) Retirar o estilete (lanceta) do envoltrio estril segurando-o rmemente (puxar a tampa de uma s vez). Segurar o dedo a ser puncionado entre o polegar e o indicador da mo do operador e puncionar o local de maneira rme e rpida. Remover a primeira gota de sangue com gaze ou algodo secos; 6) Comprimir o dedo suavemente (como em ordenha) para obter uma outra gota de sangue esfrica sobre a pele seca. Cuidar para no tocar o ponto de sada do sangue. Segurar a lmina rmemente pelas bordas da extremidade onde se encontra a etiqueta de identicao. Aproximar a lmina ao dedo do paciente pela face onde consta a identicao, at tocar o alto da gota de sangue (evitando o contato com a pele). Se a quantidade de sangue for insuciente, pode-se colocar outra gota ao lado da primeira ou at duas. Observaes: Este o protocolo utilizado rotineiramente nos laboratrios de malria. Coletamos, em um canto da lmina, 3 pequenas gotas de sangue, uma perto da outra, e no outro canto mais 3 pequenas gotas de sangue, tambm uma perto da outra (vide gura abaixo).

Identicar corretamente com o nome, o codigo do paciente e a data

Desenho de Carlos Jos de C. Moreira. Figura 4: Gota espessa.

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GOTA ESPESSA (PROTOCOLO 1)

1a ETAPA: PREPARAO DAS LMINAS 1) Coletar o sangue por puno digital ou venosa, cujo detalhamento segue no protocolo seguinte. 2) Aplicar 4 gotas na parte central da lmina, de maneira que quem prximas umas das outras. Tais gotas so reunidas para formar uma mancha circular de um centmetro de dimetro ou quadrada; usa-se para isso a ponta de uma outra lmina (Figura 5 - a, b); 3) Conservar a lmina assim preparada em lugar abrigado, at que que inteiramente seca. Isto se obtm no mnimo aps 1 hora; 4) Uma vez seca a camada espessa de sangue, desemoglobiniz-la colocando a lmina em posio vertical e mergulhada em um frasco contendo gua destilada morna; 5) A desemoglobinizao verica-se, geralmente, aps 10 minutos. Ao retirar a lmina da gua, nota-se que o sangue perdeu sua cor, tornando-se esbranquiado.

C
Fonte: Pessoa, S B. Parasitologia Mdica. 9. A Ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1002 p. Figura 5: Confeco da gota espessa: A) Colocar 4 gotas de sangue formando um quadrado; B) Unir as gotas enchendo o quadrado e C) Esfregao e gota espessa distendidos, na mesma lmina.

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2a ETAPA: COLORAO PELO GIEMSA 1) Aps a desemoglobinizao, sem xar a preparao, empregar o mtodo comum de colorao pelo Giemsa; 2) Em 2 ml de gua destilada acrescentar 3 gotas de Giemsa (vide soluo me no item Preparao de Solues) e agitar bem. Cobrir a lmina, j desemoglobinizada, com o Giemsa diludo e deixar cerca de 15 minutos; 3) Passados os 15 minutos, lavar a lmina em gua destilada e deixar secar. OBS.: Ela permite a concentrao dos parasitos, pois, em lugar de uma nica gota de sangue, empregam-se 3 a 4 gotas, por outro lado, no possibilita uma boa visualizao das caractersticas morfolgicas do parasita, conforme j relatado. tambm conveniente fazer coletas peridicas, antes de dar o caso suspeito como negativo.

GOTA ESPESSA (PROTOCOLO 2) MTODO DE COLORAO DE WALKER

MATERIAL NECESSRIO: Alm do material anteriormente descrito necessitamos de gua tamponada de uma soluo de azul de metileno fosfatado e da soluo de Giemsa. 1a ETAPA: DESEMOGLOBINIZAO PELA SOLUO HIPOTNICA DE AZUL DE METILENO. 1) Quando a amostra de sangue em gota espessa estiver bem seca (cerca de 20 minutos ou mais ps-coleta), aplicar sobre a mesma a soluo de azul de metileno fosfatado e deixar por dois minutos. Testar este tempo antes de empreg-lo na rotina, pois s vezes ele bem menor; 2) Enxaguar com gua tamponada (sem jato forte).

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2a ETAPA: COLORAO PELA SOLUO DE GIEMSA 1) Colocar a lmina com o lado da gota voltada para a superfcie da placa de acrlico (invertida); 2) Preparar uma soluo de Giemsa na proporo de uma gota de corante para 1ml de gua tamponada. Homogeneizar; 3) Despejar a soluo recm-preparada na placa de acrlico, onde j est a lmina invertida; 4) Deixar corar por 10 minutos (testar esse tempo antes de empreg-lo na rotina); 5) Enxaguar com gua tamponada (sem jato forte); 6) Deixar secar ao calor suave (Figura 6). Observaes: I. A colorao pelo mtodo Walker consiste em primeiro lugar no tratamento da gota espessa pela soluo de azul de metileno fosfatado para ser desemoglobinizada. Em segundo lugar a colorao pelo corante de Giemsa. II. Nesse mtodo no recomendvel imergir a lmina na soluo azul de metileno (prcolorao) e na gua tamponada (lavagem) em copos, em virtude da contaminao destas solues repetidamente usadas por vrios dias, favorecendo a proliferao de bactrias e fungos. Para evitar essa desvantagem, utilizar as solues contidas em pissetas (frasco usado para lavagem atravs de jatos do lquido nele contido) para enxaguar as amostras de sangue xadas. O aumento do consumo compensado com a boa qualidade das preparaes, livre de artefatos e contatos com solues contaminadas por sangue.

Fotografias de Carlos Jos de Carvalho Moreira. Figura 6: Gota espessa: A) antes da desemoglobinizao; B) aps a desemoglobinizao e C) corada pelo Giemsa.

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OUTROS MTODOS DE COLORAO:

GIEMSA TAMPONADO (APS HIDRLISE CIDA) recomendado para amostras de sangue e de cultura. 1) Fixar com metanol durante 10 minutos (no mximo); 2) Escorrer o metanol da lmina e deix-la secar; 3) Cobrir cada lmina com HCl (cido clordrico) 5N (*) e deixar por 10 minutos. Aps, lavar bem as lminas sob um uxo delicado de gua corrente, durante aproximadamente 2 minutos (no deve car resduo de HCl). Deixar a lmina secar; 4) Cobrir cada lmina com a soluo corante preparada com 1-2 gotas de Giemsa para cada ml do tampo de colorao (vide preparo do tampo em Preparo de Solues). Corar durante 01h10min (em mdia); 5) Lavar as lminas rapidamente sob um uxo delicado de gua corrente e deixar secar. Notas importantes: a) indubitavelmente melhor corar lminas por este mtodo com esfregaos feitos no mesmo dia. Observa-se assim uma colorao bem denida, com ausncia de rastros de colorao no meio de cultura xado na lmina conjuntamente com o parasita, prejudicando o resultado da leitura; b) de extrema importncia adicionar somente HCl 5N em, no mximo, 5 lminas por vez. Se houver aplicao numa quantidade maior de lminas, durante a lavagem de cada uma a reao prosseguir acima do perodo desejado nas outras, ocasionando a digesto de estruturas-alvo do parasita. c) Ao aplicar o HCl, procurar sempre fazer um colcho no desta substncia sobre a lmina ( 1 gota por campo) Isto tambm evita a digesto excessiva do material pelo cido; d) Se possvel, corar lminas de cultura preferencialmente recm repicadas (em mdia de 4 dias de cultivo para Tripanossomas) em meio monofsico (LIT, por exemplo). Coloraes realizadas em meio envelhecido ou bifsico (como meio NNN+LIT, por exemplo) no apresentam resultados excepcionais como os feitos sob esta recomendao. aconselhvel substituir o tempo de colorao para 45 min ou por outro melhor perodo de acordo com observaes prvias.

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e) Pode-se encurtar a colorao para 1 hora, utilizando-se para isto 3 gotas de Giemsa para cada mililitro de tampo. Cobre-se toda lmina com esta soluo, tendo o cuidado com manuseio, pois manipulaes excessivas induzem a precipitao do corante, ocasionando borres de Giemsa na lmina. Observaes: (*) A passagem pelo HCl opcional sendo particularmente indicada nas situaes em que se deseja visualizar com clareza a posio relativa do ncleo e cinetoplasto. (estudo da diferenciao celular). Pode no produzir os melhores resultados em esfregaos de sangue. Nota: Esta tcnica d excelentes resultados e uma adaptao daquelas utilizadas por MHLPFORDT (1963), IKITAWA & OGURA (1964) E CARVALHO (1973), combinando a hidrlise cida a frio da reao de Feulgen e a subseqente colorao do material com Giemsa tamponado.

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COLORAO DE LMINAS DE FEZES DE TRIATOMNEOS (Usando corante Giemsa)

1a ETAPA: Coleta da amostra e preparao das lminas 1) Com o auxlio de duas pinas, coletar as fezes atravs de uma delicada compresso no abdome do inseto, sem o sacrifcio do mesmo; 2a ETAPA: Colorao 1) Misturar as fezes obtidas com uma gota de soluo de Errecart (vide preparo do tampo em Preparo de Solues) e uma ou duas gotas de plasma humano ou de outro mamfero, que se saiba isento de hemoparasitas. 2) Espalhar a mistura como um esfregao espesso de sangue, deixar secar, de preferncia durante 12-24 horas; 3) Corar pelo Giemsa, com bicarbonato de potssio, sem xar; 4) Lavar com cuidado, mergulhando a lmina em gua destilada; 5) Deixar secar e examinar.

COLORAO DE LMINAS DE FEZES E DE TUBO DIGESTIVO DE TRIATOMNEOS (Utilizando os corantes May-Grunwald e Giemsa)

Neste tipo de colorao utilizamos 2 corantes diferentes: May-Grunwald e Giemsa. Esses dois corantes so utilizados atravs de um mtodo de colorao mais demorado, em que aps xao e a colorao pelo May-Grunwald, utilizamos uma segunda colorao com soluo de Giemsa. Obtemos, com isso, um resultado nal melhor e mais detalhado. O corante May-Grunwald, um corante neutro sendo composto pela mistura de um corante cido, a eosina, e por um corante bsico, o azul de metileno. Ambos so solveis em lcool metlico. Os elementos cidos celulares (DNA e RNA) sero corados seletivamente pelo corante bsico com a predominncia de tons vermelhos. Os elementos bsicos celulares (protenas) sero seletivamente corados pelo corante cido com a predominncia de tons azulados.

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1a ETAPA: Coleta da amostra e preparao das lminas 1) Sacricar o triatomneo com clorofrmio ou ter; 2) Com uma tesoura realizar a retirada da parte posterior do abdome; 3) Com a ajuda de pinas, retirar todo o tubo digestivo do inseto, atravs de movimentos de trao; 4) Macerar todo o contedo em duas ou trs gotas de soluo siolgica; 5) Misturar o contedo do tubo digestivo do inseto com soro humano inativado ou de outro mamfero, que se saiba isento de hemoparasitas; 6) Realizar as distenses e deixar secar as lminas overnight temperatura ambiente ou em uma estufa a 28C.

2a ETAPA: Colorao 1) Cobrir toda a lminas com May-Grunwald (soluo de eosina azul de metileno segundo May-Grunwald comercial) por 3 minutos ( testar o tempo de colorao de 1a 3 minutos em no mximo 10 lminas); 2) Adicionar a soluo NaHCO3 (Bicarbonato de Sdio) a 1%, homogeneizar e deixar durante 1 minuto (podemos utilizar a gua da torneira desde que esta tenha o pH ~7,0); 3) Remover o uido e cobrir as distenses com soluo de Giemsa (30 gotas para 10 ml de gua destilada ou da bica) durante 1 hora; 4) Desprezar o corante e lavar as lminas em gua corrente (uxo no). Observaes: 1 - Segundo Maekelt (The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v.13, n.1, p.11-15, 1964), esta tcnica de exame do tubo digestivo permite revelar um maior nmero de exemplares infectados. 2 - Em nosso Laboratrio utilizamos a gua da torneira em substituio ao Bicarbonato de Sdio, pois o pH, em nossa regio, prximo de 7.0. 3 - Vericamos que a secagem em estufa estufa a 28C, durante 2 horas, apresentou um bom resultado.
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AVALIAO DAS COLORAES:

Esfregao 1) A colorao do esfregao est na dependncia da espessura da camada de hemcias, bem como do mtodo de colorao; 2) O esfregao deve apresentar uma pelcula na e uniforme que no chega s bordas, com diminuio progressiva do sangue em direo ao nal da lmina, sem alcanar a extremidade, mas formando franjas; 3) A cor do esfregao pode variar do cinza-claro ao rosceo plido, sendo padro o seguinte: leuccitos: ncleo azul-escuro ou prpura; o citoplasma dos neutrlos, com granulaes nas e rosa; dos eosinlos rseo; plaquetas: azul ou prpura; plasmdio: cromatina nuclear vermelha ou prpura; citoplasma pode variar de azul-claro; granulaes de Schuner: rosa ou vermelha. A sua presena claramente denida, nas hemcias parasitadas pelo P.vivax ou P.ovale, um bom indicador de colorao satisfatria.

Gota Espessa 1) Quando a desemoglobinao adequada, os elementos aparecem sobre um fundo claro; 2) Na espessura perfeita, cada campo microscpio (objetiva de imerso) deve apresentar 10 a 20 leuccitos, em mdia; 3) As cores dos elementos normais devem ser comparadas na seguinte ordem: os restos das hemcias azuis; as plaquetas de rosa-vivo violeta; os ncleos de leuccitos, geralmente azul-profundo violeta;

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 os grnulos nos dos neutrlos, alguns rosa, outros azul-violeta; os grnulos grossos dos eosinlos, em vermelho-cobre profundo; o citoplasma dos linfcitos, em azul-plido; os moncitos, com no estroma cinza-azulado. No exame de gota espessa, o fundo deve estar claro, o mais limpo possvel e branco. A cromatina e o citoplasma dos plasmcitos so facilmente visualizados respectivamente nas cores vermelho-rosado e azul. O pigmento malrico, que no se cora, tambm aparece com nitidez e a cor varia do castanho ao escuro, sendo mais visvel, entretanto, nas preparaes descoradas e no sangue a fresco em tubo capilar (QBC). As preparaes supercoradas e precipitadas pelo corante Giemsa podem ser rapidamente descoradas pelo lcool metlico para exame.

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PROCEDIMENTOS BSICOS PARA EXAME DO MATERIAL CORADO Antes de iniciar o exame, limpar as superfcies superiores das lentes oculares e inferiores das objetivas, condensador e espelho com papel macio e absorvente. O p depositado na parte interna dos tubos do corpo binocular pode ser removido com jatos de ar produzidos por uma pra de borracha; Adaptar a lmina s presilhas da platina mecnica e a seguir ajustar a lmina de modo que uma rea da amostra a ser examinada coincida com o orifcio de iluminao; Regular o sistema de iluminao do microscpio, fechando um pouco o diafragma ris ou abaixando o condensador. Regular a intensidade da luz atravs do reostato ou do balo de vidro, se for o caso; Posicionar a objetiva de 10x na direo da amostra e fazer a focalizao com o boto macromtrico at que surjam os leuccitos, no caso de amostras de sangue. A seguir ajustar o foco com o boto micromtrico. Examinar at encontrar um campo com maior nmero de leuccitos; Focalizado o campo, adicionar leo de imerso no centro do mesmo e girar o revolver at a objetiva de imerso (100x). Abrir o diafragmairis e levantar o condensador; Examinar os campos microscpicos movimentando os parafusos de avano frontal e lateral do carro (charriot) com a mo direita e boto micromtrico com a esquerda. Buscar os campos que apresentem maior homogeneidade na distribuio das clulas; Terminado o exame, baixar a platina, retirar a lmina e registrar os resultados. Colocar a lmina invertida sobre um papel absorvente, para que haja absoro do leo. No usar xilol e nem tolueno para a remoo do leo de imerso. Aps absoro, acondicionar as lminas em caixas apropriadas para futura reviso; No usar tambm solvente como lcool, xilol ou tolueno para a limpeza dos componentes do equipamento. O leo mineral facilmente removido por papel absorvente, passado sobre a lente de imerso; Aps o uso, o microscpio dever ser coberto com uma capa plstica ou colocado na caixa original. A caixa dever sempre conter um saco de slica-gel para manter o ambiente interno seco. Em reas de elevada umidade, como a Amaznia, a utilizao de estufas de madeira, dotadas de uma lmpada de 25 watts constantemente acesa, mais eciente que o uso da slica. O ambiente constantemente seco ideal, pois impede o desenvolvimento de fungos no sistema de lentes; Outro cuidado importante sempre transport-lo pela estativa (brao), com apoio da mo sob a base, e nunca pelos parafusos.
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PREPARO DE SOLUES PARA A COLORAO

1) Soluo Corante de Giemsa Corante de Giemsa em p.................. 1 g Glicerina ........................................ 66 ml lcool metlico puro ..................... 66 ml Adicionar o p do corante em um gral. A seguir, acrescentar a glicerina, aos poucos, misturando com o auxlio de um pistilo. Aquecer em uma placa a 60 C por 2 horas. Aps as 2 horas, adicionar o lcool metlico lentamente, homogeneizando a soluo. Transferir para um frasco contendo prolas de vidro que iro facilitar a dissoluo. Amadurecer a soluo, deixando em repouso por 7-14 dias. Posteriormente, ltrar em papel de ltro e transferir para um frasco mbar. Conservar em lugar fresco.
Referncia: Simons, A. Technical Hematology. Philadelphia & Toronto: J.B.Lippincott Company, 1976. 476 p.

2) Soluo de Errecart Formol comercial (40%) ..................1 ml cido Actico ................................ 0,2 ml Soluo Fisiolgica ...................... 100 ml

3) Giemsa Alcalino Adicionar uma soluo a 1 % de Bicarbonato de potssio soluo corante, na proporo de uma gota daquela para cada 10 ml do corante.
Fonte: Pessoa, S B. Parasitologia Mdica. 9.A ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1002 p.

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4) Composio da gua Tamponada Utilizada na Colorao de Giemsa (pH=6.8) Soluo A Frmula KH2PO4 (fosfato de potssio monobsico). Peso Molecular: 136.09. Preparar uma soluo estoque 0,15 M: 9,08 g, qsp 1 litro de H2O.

Soluo B Frmula: Na2HPO4 (fosfato de sdio bibsico). Peso Molecular: 141.96. Preparar uma soluo estoque 0,15 M: 9,47 g, qsp 1 litro de H2O.

Mistura para se obter 100 ml da gua tamponada pH 6,8 7,2 Soluo A 50,8 ml 28,0 ml Soluo B 49,2 ml 72,0 ml Total 100 ml 100 ml

Fonte: Simons, A. Technical Hematology. Philadelphia & Toronto: J.B.Lippincott Company, 1976. 476 p.

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5) Composio do Tampo de Colorao (pH 7,2) Solues estoque Soluo A Frmula: NaH2PO4.2H2O (fosfato de sdio monobsico ) Peso Molecular: 177,96. Preparar uma soluo estoque 0,2 M: 35,59 g qsp 1 litro de H2O.

Soluo B Frmula: Na2HPO4.12H2O. (fosfato de sdio dibsico ) Peso Molecular: 357, 96. Preparar uma soluo estoque 0,2 M: 71,59 g, qsp 1 litro de H2O.

pH 7,2

Soluo A 280 ml
OBS: Sendo necessrio ajuste o pH a 7,2 com HCl ou NaOH.

Soluo B 720 ml

Tampo de Colorao: Prepare o Tampo utilizando 100 ml da soluo estoque + 900 ml de gua destilada e estoque a 4 C.
Referncia: Sousa, M.A. Biologia e taxonomia de tripanosomatdeos. Apostila do Curso de Ps - graduao em Biologia Parasitria. Rio de Janeiro: IOC-FIOCRUZ, 2000. 57 p.

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6) Corantes e diluentes para o Mtodo de Walker 6.1) Soluo de azul de metileno fosfatado 1. Pesar as seguintes substncias: Azul de metileno (medicinal em p)....................................... 1,0g Fosfato de potssio monobsico (KH2PO4) ............................ 1,0g Fosfato de sdio bibsico (Na2HPO4) ..................................... 3,0g Misturar em gral seco. 2. Pesar 1,0g da mistura acima e dissolver em 250ml de gua destilada, de chuva ou mineral sem gs.

6.2) Mistura de sais fosfatados (gua tamponada 6.4) 1. Pesar as seguintes substncias: Fosfato de potssio monobsico ............................................ 4,0g Fosfato de sdio bibsico ........................................................ 6,0g Misturar em gral seco. 2. Pesar 1,0g da mistura acima e dissolver em 1.000ml de gua destilada, de chuva ou mineral sem gs.

6.3) Soluo Alcolica de Giemsa 1. Pesar as seguintes substncias: Giemsa em p ......................................................................... 0,75g Glicerol (P.A.) .........................................................................35 ml lcool metlico (P.A.) .............................................................65 ml

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2. Transferir o Giemsa em p para um gral; a seguir ir acrescentando muito lentamente o glicerol, sempre misturando at formar uma massa homognea. Por ltimo adicionar o lcool metlico tambm aos poucos. Assim que estiver bem dissolvido, transferir para um frasco escuro (mbar) contendo dentro algumas prolas de vidro. Inicialmente agitar vrias vezes ao dia, at obter completa homogeneizao; depois deixar em repouso alguns dias e, antes de usar, ltrar em papel de ltro.

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PROTOCOLOS DE COLETA DE AMOSTRA PARA OS EXAMES DE DETECO A FRESCO:

EXAME DE SANGUE 1) Colocar uma pequena gota de sangue, coletada por puno digital ou venosa, no meio da lmina e cobrir com uma lamnula (20x20 ou 22x22). Se for realizada a contagem de parasitos empregar a lamnula 22x22; 2) Levar ao microscpio e fazer a leitura utilizando objetiva de maior poder ampliador (ideal 40X); 3) Se negativa, recomenda-se diariamente fazer vrias lminas em coletas peridicas, antes de dar o exame como negativo. Observaes: O exame a fresco do sangue mais sensvel que o esfregao corado e deve ser o mtodo de escolha na suspeita de infeco aguda. Por outro lado, no possibilita uma boa visualizao das caractersticas morfolgicas do parasito, por isso recomenda-se em caso positivo fazer distenses coradas com objetivo de fazer um diagnstico morfolgico diferencial com o Trypanosoma rangeli, um outro tripanossoma que tambm infecta o homem e compartilha vetores comuns com o T.cruzi. No Consenso Brasileiro em Doena de Chagas, desenvolvido por especialistas brasileiros com conhecimento sobre a doena de Chagas, sugerida a seguinte conduta diagnstica: ... caso os exames diretos sejam negativos, devem ser usados os mtodos de concentrao, tais como microhematcrito, teste de Strout ou QBC (Quantative Bu y Coat). Estes mtodos apresentam 80 a 90% de sensibilidade e so recomendados quando houver suspeita de doena de Chagas aguda e o exame direto a fresco resultar negativo...

EXAME DAS FEZES DOS TRIATOMNEOS 1) Fazer uma pequena compresso no abdome do inseto e depositar as fezes ou urina obtida sobre uma lmina que j dever conter um pequeno volume de salina, homogeneizar o material com a extremidade de uma lmina e cobrir a seguir com uma lamnula (20x20 ou 22x22); 2) Levar ao microscpio e fazer a leitura utilizando objetiva de maior poder ampliador (ideal 40X); 3) Se for positiva, recomenda-se fazer uma distenso e corar o material, com o mesmo objetivo j descrito anteriormente.
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EXAME DO TUBO DIGETIVO DOS TRIATOMNEOS 1) Sacricar o triatomneo com clorofrmio ou ter; 2) Com uma tesoura realizar a retirada da parte posterior do abdome; 3) Com a ajuda de pinas retirar todo o tubo digestivo do inseto, atravs de movimentos de trao; 4) Macerar todo o contedo em duas ou trs gotas de soluo siolgica; 5) Colocar o macerado sobre uma lmina que j dever conter um pequeno volume de salina, homogeneizar o material com a extremidade de uma outra lmina, cobrir a seguir com uma lamnula (20x20 ou 22x22); 6) Levar ao microscpio e fazer a leitura utilizando objetiva de maior poder ampliador (ideal 40X); 7) Se for positiva, recomenda-se fazer uma distenso e corar o material, com o mesmo objetivo j descrito anteriormente.

EXAME DA HEMOLINFA (DIAGNSTICO DIFERENCIAL COM Trypanosoma rangeli): 1) Sacricar o triatomneo com clorofrmio ou ter; 2) Fazer um pequeno corte em qualquer uma das patas por onde uir a hemolinfa; 3) Depositar a hemolinfa sobre a lmina e cobrir com uma lamnula; 4) Levar ao microscpio e fazer a leitura utilizando o aumento de 40 X.

EXAME DA GLNDULA SALIVAR (DIAGNSTICO DIFERENCIAL COM Trypanosoma rangeli): 1) Aps a retirada da hemolinfa, fazer a conteno do inseto, atravs do uso de uma pina e apertando-o contra uma lmina de vidro; 2) Com outra pina puxar a cabea do inseto de modo a decapit-lo e a expor as glndulas salivares; 3) Examinar as glndulas salivares entre lmina e lamnula.
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RECOMENDAES IMPORTANTES As lminas empregadas devem estar bem limpas e desengorduradas. Para desengordurar, deixar as lminas imersas em uma soluo de lcool etlico mais ter (proporo de 9:1). Nunca empregar lminas que apresentem manchas causadas pela oxidao; As lminas usadas podem ser limpas em gua com sabo em p (1 colher de sopa cheia para cada litro dgua), deixando em repouso por 48 horas. Depois devem ser muito bem enxaguadas e enxutas com uma toalha limpa; Sempre ter em mente os cuidados com biossegurana, utilizando os equipamentos de proteo individuais (EPIs), como luvas de ltex, jalecos, protetores faciais, etc; Quando empregar gua da torneira, vericar o pH, pois existem signicativas variaes de pH conforme a fonte da gua; Testar o xador e os corantes, antes do uso, pela primeira vez, ou aps um longo perodo de estocagem. Sempre utilizar produtos de qualidade e evitar produtos hidratados; Deixar as lminas secarem em local arejado e em superfcie plana. A dessecao rpida das clulas indispensvel para uma boa conservao morfolgica. Quando possvel, coloc-las em uma estufa a 28 C, principalmente em locais com alta umidade. Nunca usar aquecimento para sec-las; Em uma boa preparao a distenso deve ser delgada, isto , as clulas devem estar estendidas em uma nica camada, sem superposio e nem formao de gros ou ocos. No caso de amostra de sangue, os glbulos brancos devem apresentar colorao roscea. Sua imagem deve ser clara, ntida e uniforme, no contendo manchas de corante nem bolhas de ar ou falhas, assim como rupturas ou pontos de desagregao; As distenses, feitas a partir de sangue coletado com anticoagulante, devem ser coradas at o perodo de 30 min, para se evitarem deformaes celulares; imprescindvel que seja colocada uma etiqueta contendo a o nome do paciente e a origem (nome, n. de registro, local e a data de obteno da amostra biolgica). O rtulo deve ser escrito a lpis e colado na borda da lmina. Se a lmina tiver a borda esmerilhada, escrever na parte fosca; Sempre fazer um teste prvio para estimar o tempo de colorao ideal;

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 No protocolo da gota espessa, tanto a desemoglobinizao como as etapas de colorao e lavagem devem ser executadas muito cuidadosamente, a m de no desorganizar ou desprender a camada de sangue no xada; As lminas, aps serem coradas, devem ser guardadas em caixas apropriadas at o momento da leitura ou em papel absorvente; A amostra corada deve ser examinada ao microscpio, empregando a objetiva de imerso (100X).

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CARACTERIZAO DO Trypanosoma cruzi

Complexo T.cruzi Atravs de estudos efetuados com isolados de T.cruzi de diferentes hospedeiros e regies endmicas distintas foi vericado que esta espcie de protozorio representada por uma populao heterognea. Pode-se dizer que o T.cruzi um complexo formado por populaes, muitas vezes bastante heterogneas, presentes nos diferentes ciclos de transmisso que podem estar sobrepostos ou no (Coura JR et al., 1966). importante ter o conhecimento que empregamos o termo cepa para denominar o isolado obtido de triatomneos, mamferos naturalmente infectados ou pacientes. A cepa usualmente consiste de uma populao heterognea de parasitas. Estudos empregando diferentes marcadores moleculares demonstraram que essas populaes podem ser agrupadas em dois principais gentipos. A diversidade do T.cruzi tem sido vericada empregando-se distintos parmetros, que vo desde os morfolgicos aos moleculares. Para ns didticos, podemos dividir as diferentes metodologias utilizadas em caracterizao biolgica, caracterizao bioqumica e molecular. Os principais critrios, at a presente data, esto descritos abaixo:

1) CARACTERIZAO BIOLGICA (curva parasitmica, taxa de mortalidade, morfologia doa parasitos no sangue perifrico e estudo histopatolgico): No incio da dcada de 70, Andrade et al (1970 a, b) e Andrade, S.G. (1974) iniciaram uma srie de estudos visando caracterizao biolgica de cepas do T.cruzi e seus pers histopatolgicos em animais experimentais. A partir desses estudos foi possvel classicar as cepas em trs tipos ou biodemas: Biodema I (tipo I) - Cepas altamente virulentas, que se multiplicam rapidamente, apresentando elevada parasitemia e mortalidade em camundongos, que morrem entre o 7 e o 12 dias aps a inoculao. Apresentam o predomnio de formas delgadas e macrofagotropismo na fase inicial da infeco. Seu prottipo a cepa Y; Biodema II (tipo II) - Cepas com multiplicao relativamente lenta e picos de parasitemia irregulares entre o 12 e 20 dias aps a infeco. Apresentam a predominncia de formas largas e miocardiotropismo. Possui como prottipo a cepa So Felipe; Biodema III (tipo III) - Cepas que apresentam picos da parasitemia tardios, geralmente entre o 20 e 30 dias aps a infeco. Provocam baixas taxas de mortalidade e apresentam o predomnio de formas largas e de baixa multiplicao (~ 50 dias aps a infeco). Acometem principalmente a musculatura esqueltica. Seu prottipo a cepa Colombiana. Algumas taxas de parasitemia de cepas de biodema III esto representadas na gura 7.
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Fonte: Devera, R.; Illarramendi, X.; Montoya-Arajo, R.; Pirmez, C.; Fernandes, O.; Coura, J. R. Biodemes of Trypanosoma cruzi strains isolated from humans from three endemic areas in Minas Gerais State. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 2002, vol.35, n. 4, p. 323-330). Figura 7: Taxas de parasitemia em camundongos suos infectados por cepas do T. cruzi classificadas dentro do biodema III.

2) CARACTERIZAO BIOQUMICA-ELETROFORESE DE ISOENZIMAS: A tcnica de eletroforese de isoenzimas para a classicao do T.cruzi foi introduzida por Toy em 1974. Posteriormente, outros pesquisadores iniciaram estudos de gentica populacional do T.cruzi com cepas oriundas da Bahia e de diferentes regies do Brasil, quando caracterizaram trs grupos principais que foram denominadas zimodemas. (Miles et al. 1977, 1978, 1980). Podemos concluir que zimodemas so grupos de cepas que apresentam pers eletroforticos isoenzimticos semelhantes. Enzimaticamente foram caracterizados trs grupos do T. cruzi: a) zimodema I, associado a isolados de marsupiais e triatomneos silvestres, b) zimodema II, associado a isolados domsticos, c) zimodema III, associado ao ambiente silvestre.

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Fonte: GOMES, Yara de Miranda et al . Caracterizao de uma cepa de Trypanosoma cruzi isolada de uma zona no endmica no Nordeste do Brasil. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, So Paulo, v. 37, n. 1, 1995. Disponvel em: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0036-46651995000100014&lng=pt&nrm=iso. Acesso em: 29 Jan 2008. doi: 10.1590/S0036-46651995000100014. Figura 8: Perfis Eletroforticos de diferentes cepas do Trypanosoma cruzi. As enzimas so: A) - PGM; B) - GPI e C) - ALAT. As cepas so: PER - Peruana (tipo I); 21 SF - So Felipe e WSL - wild So Loureno (tipos II) e COL - Colombiana (tipo III).

3) CARACTERIZAO MOLECULAR UTILIZANDO DNA DO CINETOPLASTO (kDNA) - Anlise do Polimorsmo de Tamanhos dos Fragmentos de Restrio do kDNA (Restriction Fragment Lenght Polymorphism - RFLP): No nal da dcada de 70, Mattei et al. (1977) introduziram a tcnica de classicao de tripanossomos pela anlise do polimorsmo dos tamanhos dos fragmentos de restrio do k DNA (Restriction Fragment Lenght Polymorphism- RFLP). Posteriormente, Morel et al. (1980) empregaram a tcnica para a caracterizao genotpica do T. cruzi e propuzeram o termo esquizodema para denominar grupos com pers semelhantes (Figura 9).

Montagem de Carlos Jos de Carvalho Moreira. Figura 9: Comparao entre diferentes isolados de T.cruzi pelo mtodo de Anlise do polimorfismo de tamanhos dos fragmentos de restrio do k DNA.

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4) CARACTERIZAO MOLECULAR UTILIZANDO O DNA NUCLEAR: 4.1) TIPAGEM PELO GENE DE MINI-EXON O gene que transcrito d origem ao mini-exon est presente no genoma nuclear dos Kinetoplastida em aproximadamente 200 cpias repetitivas. Este gene constitudo por 3 regies: o exon, o intron e a regio intergnica. O exon uma seqncia de 39 nucleotdeos altamente conservada, sendo adicionado ps-transcricionalmente a todos os RNAs mensageiros nucleares, atuando no processo de trans-splicing do parasita. O intron moderadamente conservado entre as espcies de um mesmo gnero ou subgnero. A regio intergnica do T.cruzi pode ser amplicada por PCR, possibilitando a classicao em dois grupos principais T.cruzi I e T.cruzi II (Figura 10).

Figura adaptada por Carlos Jos de Carvalho Moreira. Figura 10A: Representao esquemtica do ensaio de PCR para tipagem de T. cruzi empregando o gene de mini-exon. A caixa preta representa o mini-exon de 39 bp, a caixa cinza representa a seqncia do intron (70 bp) e linha espessa limitado pelos traos vermelhos representa a regio intergnica (484 bp).

Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas do Trypanosoma cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Curso de Ps - Graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro. Figura 10B: Gel de agarose corado com brometo de etdio de produtos de PCR para o gene de mini-exon. As cepas so as seguintes: linhas 1 e 2, cepas de referncia Y e F (T. cruzi I e T. cruzi II , respectivamente); linhas 3-18, cepas testadas.

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4.2) DNA POLIMRFICO AMPLIFICADO ALEATORIAMENTE (Ramdomly Amplied polymorphic DNA-RAPD) Esta tcnica tem sido utilizada para estudos taxonmicos e de caracterizao de microorganismos desde a sua introduo por Welsh e McCleilland e Willians et al. em 1990. Basicamente uma reao de PCR que utiliza pequenos primers de seqncias aleatrias capazes de amplicar regies annimas do DNA nuclear, gerando um padro de mltiplas bandas que pode ser varivel at mesmo dentro de amostras de uma mesma espcie. Esta tcnica uma ferramenta utilssima para estudos, tanto em tripanossomatdeos, quanto para outros txons de protozorios parasitas. Apresenta algumas vantagens como: a - como se trata de uma tcnica simples no necessita de uma informao prvia sobre a seqncia do DNA a ser estudado; b - requer pequenas quantidades de DNA para que possa ser realizada; c- Pode ser empregado um nmero limitado de primers ou iniciadores;

Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas do Trypanosoma cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Curso de Ps-graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro. Figura 11: Perfis de RAPD de cepas de T. cruzi originais (O), aps manuteno em camundongo (C) e meio LIT (L). A. Iniciador 2. B. Iniciador 4. M, marcador de Peso Molecular, 100 bp. Cepas P23-1, Ig62, Ig523-2, Ig 520, Ig192-1, Ig539, BE-25 e B84.

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4.3) TIPAGEM ATRAVS DAS REGIES INTERGNICAS (IRTs) DOS GENES RIBOSSMICOS (RFLP - ITS - rDNA) Os genes que codicam o RNA ribossmico so altamente conservados tendo potencial para a anlise logentica. So encontrados como seqncias repetitivas que codicam para uma subunidade maior e para outra menor separadas por regies que no so transcritas, denominadas de espaadores no transcritos (NTS -non transcribed spacer). Tambm apresentam regies codicantes denominadas de espaadores internos transcritos (ITSinternal transcribed spacers) que so pequenas seqncias de grande variabilidade, anqueados por segmentos altamente conservados, o que torna possvel a confeco de primers para PCR que anelam nessas regies.

Esquema adaptado de Cupolillo, E. et al., 1995. por Carlos Jos de Carvalho Moreira. Figura 12A: Locus de um rDNA de Tripanossomatdeo - IR1 e IR2 so os iniciadores de PCR que anelam-se nas regies codificadoras para as subunidades menor (SSU) e maior (LSU); ITS representa o espaador interno transcrito e NTS espaador no transcrito.

Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas do Trypanosoma cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Curso de Ps - Graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro. Figura 12B: Eletroforese em gel de agarose 0,8 % mostrando os produtos de PCR corados com brometo de etidio e visualizados sob luz UV. Os produtos correspondem as regies ITS1 + 5.8S + ITS2 do rDNA do T. cruzi. Linha 1: marcador de peso molecular, 1kb. Linhas 2-13: 12 das cepas testadas (Linhas 2-P23orig, 3-P23L,4-P23cam, 5-Ig523orig, 6-Ig523L, 7-Ig523cam, 8-Ig62orig, 9-Ig62L, 10-Ig62cam, 11-B84orig, 12-B84L, 13-B84cam.

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4.4) TIPAGEM POR MICROSSATLITES Os microssatlites so uma classe de DNA repetitivo, em geral em torno de 1 a 6 pares de bases (bp), que esto presentes de forma dispersa no genoma dos eucariotos. Baseados no tamanho da repetio podem ser denominados mono, di, tri, tetra, penta e hexanucleotdeos. O elevado polimorsmo dos microssatlites resultado da variao no nmero de repeties, em tandem, de um alelo para o outro. Experimentalmente tem-se determinado que a taxa de mutao dos loci de microssatlites que pode variar de 10 -6 a 10 -2. Essa taxa varia segundo o tamanho da repetio. Desta maneira, os microssatlites so considerados marcadores de eleio com aplicaes em reas biomdicas como ecologia, gentica de populaes e reconstruo logentica A metodologia consiste na amplicao pela PCR, usando um par de iniciadores especcos que anqueiam o segmento contendo as repeties, analisando-se posteriormente, o tamanho dos fragmentos gerados. Em T. cruzi a anlise dos microssatlites foi introduzida inicialmente para estudar a estrutura da populao do parasita, tentando averiguar se uma determinada cepa era policlonal A tcnica tambm mostrou utilidade como marcador para reconstruo logentica As cepas que apresentam um ou dois picos (um ou dois alelos, correspondendo a diploidia) so consideradas monoclonais. O aparecimento de mais de dois picos nos diferentes loci indicativo da presena de mais de uma populao (policlonalidade).

Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas do Trypanosoma cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Curso de Ps - Graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro. Figura 13: Exemplos de possveis resultados obtidos num teste de microssatlites para T. cruzi. As figuras representam eletrofluorogramas dos produtos da PCR de cepas hipotticas do T. cruzi para um determinado locus de microssatlite. A) Perfil mostrando a amplificao de um (cepa monoclonal homozigota) ou dois picos (cepa monoclonal heterozigota). B) Amplificao de trs ou quatro picos de cepa multiclonal.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS EMPREGADAS NA ELABORAO DO MATERIAL DIDTICO DOS MDULOS I E II, SUGERIDAS PARA CONSULTA

ADL, S.M.; SIMPSON, A.G.B.; FARMER, M.A.; ANDERSEN, R.A.; ANDERSON, O.R.; BARTA,J.R.; BOWSER, S.S.; BRUGEROLLE,G.; FENSOME, R.A.; FREDERICQ,S.; JAMES, T.Y.;KARPOV, S.; KRUGENS, P.; KRUG, J.; LANE, C.E.; LEWIS, L.A.; LODGE, J.; LYNN, D.H.; MANN, D.G.; MCCOURT, R.M.; MENDOZA, L.; MOESTRUP, O.; MOZLEYSTANDRIDGE, S.E.;NERAD, T.A.; SHEARER, C.A.; SMIRNOV, A.V.; SPIEGEL, F.W. AND TAYLOR, M.F.J.R. The New Higher Level Classication of Eukaryotes with Emphasis on the Taxonomy of Protists. The Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 52, n. 5, p.399 451, 2005. AGUILAR, H. M,; ABAD-FRANCH, F.; DIAS, J.C.P.; JUNQUEIRA, A.C.V.; COURA, J.R. Chagas disease in the Amazon Region. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 102 (suppl. 1), p. 47-56, 2007. AMATO NETO, V.; MATSUBARA, L.; LANURA, P.N.B. Avaliao do sistema quantitative bu y coat (QBC) no diagnstico laboratorial da infeco pelo Trypanosoma cruzi: estudo em modelo experimental murino. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.29, p.59-61, 1996. AMATO NETO, V.; NAGASSE T.K.; MOREIRA A.A.B.; GOMES A.E.C.; CAMPOS R. Utilizao, em politransfundidos, da pesquisa de anticorpos IgM anti-Trypanosoma cruzi e anti-Toxoplasma gondii para detectar infeces ps-transfusionais recentes. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, v.26, n.2, p.83-86, 1984. AMATO NETO, V.; SANTOS, R.R.; GIOIA, I. Estudo experimental sobre o congelamento do plasma e implicaes referentes transmisso da doena de Chagas em servios de hemoterapia. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.9, n.3, p.129-132, 1975. ANDRADE, S.G. Caracterizao de cepas do Trypanosoma cruzi isoladas no Recncavo Baiano. Revista Patologia Tropical, v. 3, p.: 165-121 1974. ANDRADE, S.G.; CARVALHO, M.L.; FIGUEIRA, R.M.; ANDRADE, Z.A. Recuperao e caracterizao de tripanossomas inoculadosem animais imunes (Reinoculao com diferentes cepas do T.cruzi). Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, v. 12, p. 395-402, 1970 a. ANDRADE, S.G.; CARVALHO, M.L.; FIGUEIRA, R.M. Caracterizao morfobiolgica e histopatolgica de diferentes cepas do Trypanosoma cruzi. Gazeta Mdica da Bahia, v.70, p. 32-42, 1970b.

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