UNIVERSIDAD DEL CAUCA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACIN DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS PARA BIOLOGIA CELULAR

GERARDO ANDRES TORRES RODRGUEZ Magster

Popayn, Noviembre de 2002

UNIVERSIDAD DEL CAUCA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACIN DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS PARA BIOLOGA CELULAR

GERARDO ANDRS TORRES RODRGUEZ Magister

Popayn, Noviembre de 2002

INDICE

Pg.

INTRODUCCION CAPITULO I. MICROSCOPIA OPTICA Y ELECTRONICA Practica 1. Conceptos Bsicos de Microscopa Optica Practica 2. Practica Demostrativa en Procesamiento de Muestra y Conceptos Bsicos de Microscopa Electrnica Practica 3. Recuento de Leucocitos Practica 4. Observacin Microscpica de la Actina y Miosina del Msculo CAPITULO II. CULTIVO DE MICROORGANISMOS Practica 5. Cultivos de Microorganismos en Medios Slidos y Lquidos CAPITULO III. MEMBRANAS CELULARES Practica 6. Osmosis Practica 7. Solubilidad de los Lpidos de la Membrana CAPITULO IV. FRACCIONAMIENTO CELULAR Practica 8. Separacin de Clulas por Baja Velocidad Practica 9. Aislamiento de la Mitocondria Practica 10. Respiracin de la Mitocondria CAPITULO V. ESPECTROFOTOMETRIA Practica 11. Preparacin de una Curva Patrn Practica 12. Determinacin Espectrofotometrica de Protenas en Materiales Biolgicos Practica 13. Efectos de la Temperatura y el pH en la Actividad de las Enzimas CAPITULO VI. ACIDOS NUCLEICOS Y DIVISION CELULAR Practica 14. Aislamiento de DNA Practica 15. Modelamiento de Molculas Biolgicas Practica 16. Mitosis BIBLIOGRAFIA 3 6 12 16 22 24 25 30 31 33 36 37 39 41 45 47 50 53 56 56 60

INTRODUCCIN La clula, como unidad fundamental de la vida, es la gran empresa en la cual se han interesado, muchos investigadores cientficos, en especial, los que se han dedicado al estudio de las Ciencias Naturales. Debido a tales ingentes esfuerzos, se han producido grandes avances y descubrimientos que han permitido el estudio de las estructuras, funciones y mecanismos interactuantes en la unidad vital celular. Entre estos, se destacan los estudios de los tipos celulares, la bioqumica y el metabolismo celular y la estructura de las organelas. Debido a la gran avenida del conocimiento que se abri en febrero del ao 2000, cuando Craig Venter y Francis Collins de Celera Genomics y del HGP, mostraron a la comunidad cientfica y a toda la sociedad humana, el primer borrador del genoma humano con el 99.99% de su contenido secuenciado, los investigadores de todo el mundo, se afanan por conocer todas las relaciones existentes entre estas secuencias, y toda la expresin de las protenas, que conllevarn al conocimiento mas preciso del metabolismo celular. Todo lo anterior, se propone como gran final de esta notable empresa, y por supuesto a la correccin de los errores que puedan existir en algunas muestras biolgicas humanas que producen enfermedades y patologas, todo esto, como un gran presupuesto de conocimiento que ser usado para entender a otros modelos de sistemas vivientes, como son los vegetales, animales, y los microorganismos. Por esto, la Biologa Celular y la Biologa Molecular, son actualmente los bastiones de las nuevas ciencias emergidas de estos nuevos descubrimientos: La Genmica y la Protemica. En el presente Manual, los autores, se han preocupado por disean unas practicas que permitirn a los estudiantes en formacin profesional del Programa de Biologa, el conocimiento de los aspectos bsicos generales de la clula, la destreza en algunos de los anlisis bioqumicos (enzimticos), fsico-qumicos (espectrofotometra) que permiten conocer el funcionamiento celular, y los anlisis bsicos moleculares (aislamiento de ADN). Por todo lo anterior, este Manual se ha organizado por Captulos, en los cuales, se condensan diferentes Laboratorios para Microscopa ptica, Cultivo de clulas procariotas, Membranas Celulares, Espectrofotometra, Fraccionamiento Celular y ADN y la Divisin Celular, que sern de gran utilidad para el conocimiento, la motivacin, la adquisicin de destrezas en este apasionante campo de la Biologa Celular.

CAPITULO I MICROSCOPIA PTICA Y ELECTRNICA

El microscopio es una herramienta de investigacin que se usa como elemento para obtener conocimientos en diversa reas cientficas, tal es el caso de la histologa, embriologa, microbiologa, micologa, citologa, parasitologa, etc. Algunas de ellas requieren del microscopio solo de manera secundaria mientras que otras lo precisan como utensilio indispensable. Aunque prcticamente cualquier bilogo maneja un microscopio, son muy pocos los que en verdad lo saben hacer, su mal uso resta calidad a la imagen y por lo tanto la informacin que se obtiene. Los estudiantes y maestros debemos pugnar por quitar viejos vicios en el uso del microscopio (limpieza inadecuada, iluminacin deficiente, mala combinacin de objetivos y oculares) para de este modo lograr un aprovechamiento integral del viejo y siempre novedoso instrumento. Viejo instrumento porque hace ms de 300 aos fue usado por primera vez, la iluminacin segn Kohler data de la ltima dcada del siglo XIX los sistemas de iluminacin tangencial, campo oscuro, microscopa de fluorescencia y polarizacin son todos de principio del siglo XX. Pero estos viejos microscopio se han actualizado y modificado para dar lugar a nuevas generaciones de sistemas pticos, contraste de fase, microscopios de interferencia de Dyson, Jamin-Lebedef y Nomarski, los microscopios electrnicos de transmisin y de barrido. En los ltimos 20 aos la evolucin del microscopio se observa de manera vertiginosa en la microscopa de fluorescencia, microscopa confocal con la utilizacin de rayos lser y los sistemas de anlisis da imgenes. En el ao de 1931 Ernest Ruska y sus colaboradores construyeron el primer Microscopio Electrnico de transmisin este es similar en sus principios fsicos al microscopio de luz. A travs de este Poderoso instrumento se pudo determinar le ultrestructura de la clula Su poder radica en haber utilizado una fuente de iluminacin con un haz de electrones que permiti aumentar el poder de resolucin hasta 10.000 veces con relacin al microscopio ptico.

Figura No 1. Microscopio ptico de Alta Resolucin

PRACTICA 1

CONCEPTOS BSICOS DE MICROSCOPIA OPTICA

INTRODUCCIN El microscopio adems de aumentar la imagen de los objetos y mostrar que muchas veces algunas cosas que son visibles a simple vista son diferentes a como las observamos, sirve para hacer mediciones, estimar el tamao de una poblacin de microorganismos, estudiar estructuras celulares y en general para hacer estudios morfolgicos y fisiolgicos de clulas y tejidos.

OBJETIVOS Con esta prctica se pretende que el estudiante. 1 Entienda algunos conceptos bsicos de microscopa tales como poder de resolucin, poder de aumento y campo visual con relacin a las lentes utilizadas. Adquiera destreza para calcular mediciones aproximadas de clulas y otras estructuras. Conozca las unidades de medida de mayor uso en micrometra y las utilice resolviendo algunos problemas comunes en este campo.

MATERIALES Microscopios Compuestos Lmparas de bombillas u otras fuentes de luz Portaobjetos Cubreobjetos Papel limpia lentes

PROCEDIMIENTO

1. ANLISIS DE ALGUNOS CONCEPTOS BSICOS DE MICROSCOPA Iluminacin Kohler La mejor forma de ajustar el microscopio para una iluminacin correcta segn los principios de Kholer, que establece para realizar una buena iluminacin la necesidad de que est equipado el microscopio con diafragma de campo o diafragma de lmpara y un condensador de la lmpara, esta lente tambin recibe el nombre de colector adems el condensador del microscopio debe ser centrable y deslizable a lo largo del eje del microscopio.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12

Encender el microscopio, se ilumina a 6 vol. Por medio del control de luminosidad. Abrir el diafragma de campo y de apertura. Subir el condensador. Seleccionar objetivo de 10X. Enfocar la muestra con los mandos macro y micromtrico. Ajustar la distancia interpupilar (distancia entre los ojos) Ajustar dioptras (agudeza visual) con cada ocular hasta que la muestra se vea ntida Cerrar un poco el diafragma de campo luminoso Descender ligeramente el condensador, hasta ver ntido el borde del diafragma de campo. De ser necesario, centrar el condensador con la ayuda de sus dos tornillos laterales. Una vez centrado el condensador abrir el diafragma de campo hasta que apenas desaparezca del campo visual Contrastar la imagen con el diafragma de apertura del condensador. A cada cambio de objetivo: a. Enfocar con el micromtrico b. Contrastar con el diafragma de apertura.

Poder de Resolucin Es la capacidad que posee un instrumento ptico para diferenciar dos puntos que a simple vista parecen uno solo debido a la pequea distancia entre ellos. Es caracterstico de cada instrumento ptico y depende en gran parte de la calidad de las lentes utilizadas. Es as como el poder de resolucin mximo aproximado del ojo humano es 100, el del microscopio compuesto es de 0.2 y el del microscopio electrnico es de 0.001. Lo anterior significa que para que el ojo humano pueda

diferenciar claramente dos puntos, stos deben estar separados entre s por una distancia igual o mayor a 100. Podra Usted por lo tanto observar separadamente con el microscopio compuesto, dos puntos que estn a 10 entre s? Y dos puntos que estn a 0.1?. Para entender en la prctica lo que es el poder de resolucin, tome un papel delgado impreso con letras, observe una de ellas y esquematcela. Luego, usando dicho papel, prepare un montaje en fresco y enfoque la misma letra en 10X y en 43X. Haga los esquemas correspondientes y compare los resultados. A qu se deben las diferencias observadas en los tres casos?. Conserve esta preparacin para un anlisis posterior.

Poder de aumento Es la capacidad que posee un instrumento ptico para dar una imagen aumentada de un objeto y depende, entre otros factores, del tipo y calidad de las lentes utilizadas en tal instrumento. Lgicamente que una lente dada puede dar una imagen mayor o menor dependiendo de la distancia a la cual se encuentra del objeto. No obstante, hay una distancia ptima entre objeto y lente que proporciona una imagen lo ms ntida posible. Para nuestros propsitos consideraremos siempre el aumento obtenido cuando se cumple la condicin anterior. As por ejemplo, si un objeto tiene un tamao de 1 mm y una lente dada origina una imagen de 10 mm, se dice que el aumento es de 10 veces, es decir, el poder de aumento de esa lente es de 10. Ntese que el poder de aumento es en este caso la relacin entre el tamao de la imagen y el tamao del objeto. Por otra parte, una imagen a su vez tambin puede ser aumentada por una lente. Si en el caso anterior se toma la imagen obtenida de 10 mm, y por medio de otra lente, obtenemos una nueva imagen de 50 mm, tenemos que el aumento total es de 5 veces en relacin con el tamao de la primera imagen o de 50 veces en relacin con el tamao del objeto.. Se puede deducir por tanto que el aumento total producido por dos lentes es igual al aumento producido por la primera lente multiplicado por el aumento producido por la segunda lente. En este caso, el aumento total (AT) equivale a 10 x 5 = 50 veces. El microscopio que usted utiliza consta de dos lentes, ocular y objetivo, cada una de ellas con su respectivo poder de aumento. Es decir, cuando se observa un objeto a travs de l, su aumento total est dado por el producto del poder de

aumento de cada una de las lentes, o sea, aumento del objetivo (Aob) multiplicado por el aumento del ocular (Aoc).At = Aob x Aoc Siendo X el tamao del objeto, veamos algunos ejemplos:

Poder de aumento del objetivo 10X 97X

Poder de aumento del ocular 6X 10X

Aumento total 60X 970X

Segn lo anterior, cuntas veces se aumento el tamao de la imagen de la letra cuando usted utiliz el objetivo de 10X y el de 43X, si el ocular de su microscopio era de 10X?

Campo visual del microscopio Es el rea circular que se observa al mirar a travs del microscopio y vara segn las lentes utilizadas. Observe nuevamente la placa que contiene las letras impresas. Con cul de los dos objetivos, 10X o 43X, observa mayor rea de una de las letras? El campo visual de un microscopio es entonces mayor o menor segn se observe con mayor o menor aumento?.

2. UNIDADES UTILIZADAS EN MEDICIONES MICROSCPICAS La mayora de organismos o estructuras que se estudian al microscopio son de tamaos muy pequeos. Por lo tanto, para medirlos es necesario utilizar unidades reducidas tales como el ngstrom (A), el nanmetro (nm), la micra (), y en algunos casos el milmetro (mm). Las relaciones que existen entre ellas son: 1 mm = 1000 1 = 1000 nm 1 nm = 10A Teniendo en cuenta los datos anteriores, resuelva los ejercicios siguientes:

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1. 2.

A cuntas nm equivale un mm? Y a cuntas nm equivale 1 A? Si una clula tiene un dimetro de 1.2. Cul ser su dimetro en A y en mm? Si el microorganismo A mide 120 y el microorganismo B mide 1200 A, Cul de los dos tiene mayor tamao?.

3.

CALIBRACIN DEL MICROSCOPIO OPTICO

Para medir los campos presentes en el campo microscpico es necesario disponer de una escala apropiada en el ocular del microscopio. Ahora bien, antes de utilizar esa escala habr que calibrarla. Los micrmetros oculares son discos planos de vidrio que llevan grabada una escala lineal dividida en 50 100 pequeas divisiones. Estas divisiones tienen diferentes valores de medicin con arreglo al poder de resolucin del objetivo utilizado. El valor de medicin se calcula utilizando un micrmetro de platina provisto de una escala calibrada en divisiones de 0.1 mm y subdivisiones de 0.01 mm. Para calibrar el micrmetro ocular se procede del modo siguiente: 1. Retirar el ocular (de 10X o de otra graduacin) del microscopio y desenroscar la lente superior o inferior, segn el modelo de que se trate. Colocar la escala sobre el diafragma situado en el lado grabado contra la superficie inferior del retculo. Volver a enroscar la lente y reinsertar el ocular en el microscopio. 2. Colocar el micrmetro de platina sobre la platina del microscopio y enfocar el objetivo de menor aumento en algn segmento de la escala con el ocular de 10X. 3. Ajustar el micrmetro de platina desplazando sta de manera que la lnea cero del micrmetro ocular quede exactamente sobre la lnea cero del micrmetro de la platina. 4. Sin mover el micrmetro de la platina, encontrar otro punto en el extremo derecho en el que coincidan con exactitud otras dos lneas. Este segundo par de lneas superpuestas debe estar lo ms alejado posible de la lnea cero. La distancia depender del objetivo utilizado. Con los mayores aumentos, las lneas pueden aparecer tan gruesas que sea necesario buscar la superposicin del borde derecho o izquierdo de cada una de ellas. 5. Contar en el micrmetro ocular el nmero de divisiones entre la lnea cero y el punto de donde se superpone el segundo par de lneas. En la figura adjunta, por ejemplo, este nmero, indicado por la lnea de puntos, equivale a 33 unidades del ocular. 6. Contar luego el nmero de lneas de divisiones de 0.1 mm entre la lnea cero y el segundo par de lneas superpuestas en el micrmetro de la platina; en la figura, este nmero, indicado por la flecha, equivale a 0.22 mm. 7. Calcular la longitud representada por unidad ocular: 8. 33 unidades del ocular = 0.22 mm.

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9. 1 unidad del ocular =

0.22 mm 33

0.0066 mm = 6.6 m

10. As pues, 1 unidad del ocular = 6.6m para este objetivo. Cada objetivo del microscopio debe calibrarse por separado. 11. Una vez calibrados todos los objetivos, preparar una sencilla grfica que indique el factor de calibracin correspondiente a cada uno de ellos

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PRACTICA 2 PRACTICA DEMOSTRATIVA EN PROCESAMIENTO DE MUESTRA Y CONCEPTOS BSICOS DE MICROSCOPIA ELECTRNICA

INTRODUCCION La presente practica pretende mostrar a los estudiantes las caractersticas y particularidades que tiene el procesamiento de muestras Biolgicas en esta tcnica, de igual forma los equipos y principios bsicos de funcionamiento Igualmente se pretende mostrar a la comunidad Universitaria los potenciales y aplicaciones que tiene la microscopa Electrnica en General como la capacidad de la Unidad de Microscopa de la Universidad y su labor apoyando diversas actividades acadmicas y de investigacin

OBJETIVOS 1. Ofrecer al estudiante el conocimiento bsico en el procesamiento de muestras Biolgicas para microscopa electrnica. 2. Mostrar al estudiante las diferentes aplicaciones de la microscopa electrnica en investigacin en ciencias biolgicas. 3. Mediante esta prctica el estudiante estar en capacidad de conocer y diferenciar el Poder de resolucin del Microscopio ptico versus el electrnico y su aplicacin en los estudios de la Ultraestructura.

PROCEDIMIENTO La practica se desarrollara de manera que el tcnico de laboratorio realizara un montaje en los diferentes equipos lo que permita hacer una observacin en los siguientes aspectos

1. PREPARACIN DE LA MUESTRA

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Realizar segn figura No 2

Figura No 2 Diagrama que muestra las diferentes etapas en el proceso de muestras Biolgicas para microscopa Electrnica de Transmisin

2. DESCRIPCIN DE LAS CARACTERSTICAS Y FUNCIONAMIENTO DEL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN. El microscopio electrnico consta principalmente de una alta columna cilndrica hueca donde se confina el rayo de electrones y de una consola con un panel de botones giratorios que controlan electrnicamente las operaciones efectuadas dentro de la columna la parte superior de la columna contiene el ctodo, un filamento de tungsteno que cuando se calienta acta como fuente de electrones.

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Los electrones se desprenden del filamento y se aceleran para formar un delgado haz mediante la aplicacin de un voltaje entre el ctodo y el nodo. Antes de la operacin se extrae el aire de la columna para producir un vaco donde se desplazarn los electrones, si no se extrae el aire los electrones pueden dispersarse prematuramente por colisin con las molculas de gas. Puesto que los electrones son partculas con carga elctrica se pueden desviar de su trayectoria y poner en foco mediante un campo magntico. Las lentes de un microscopio electrnico son electroimanes potentes localizados en la pared de la columna que rodea el centro de la columna al vaco. La fuerza de los imanes est controlada por la corriente suministrada que a su vez es determinada por la posicin de los diferentes botones de la consola. Entre la fuente de electrones y la muestra se colocan lentes condensadores que se encargan de enfocar el rayo de electrones sobre la muestra, la propia muestra se sostiene sobre una pequea rejilla de metal delgado 3 mm de dimetro que se introduce con pinzas en un soporte para la rejilla, el cual se introduce en la parte media de la columna del microscopio de modo que la rejilla se mantenga perpendicular al haz de electrones. La imagen suministrada por la lente objetivo se amplifica unas 100 veces, pero a diferencia del microscopio de luz los detalles presentes en esta imagen son suficientes para amplificarlo unas 10000 veces ms lo que permite apreciar con la vista la informacin contenida. Modificando la corriente aplicada a las diferentes lentes del microscopio se puede variar la amplificacin desde casi 1000 hasta 250000 veces, el margen que el observador ve es resultado de los electrones que pasan a travs de la muestra enfocados sobre una pantalla localizada en la parte inferior de la columna. Los electrones que golpean la pantalla excitan un recubrimiento de cristales fluorescentes que emiten su propia luz visible percibida por el ojo como una imagen de la muestra. Puesto que el material insoluble de las clulas consta de tomos de nmero atmico relativamente bajo como carbono, oxigeno e hidrogeno el material biolgico posee muy poca capacidad intrnseca para dispersar electrones para lograr un buen contraste se confiere densidad atmica a la muestra fijando y tiendo el tejido con soluciones de metales pesados. Estos metales penetran en las estructuras de las clulas y forman complejos selectivamente con diferentes partes de los organelos, las partes de clulas con mayor concentracin de tomos metlicos permiten el paso de menor nmero de electrones que participaran en la formacin de la imagen bajo la accin de las lentes, cuanto menor sea el nmero de electrones enfocados sobre un punto determinado de la pantalla por unidad de tiempo ms oscura ser la pantalla en dicho punto en tanto que cuanto mayor sea el nmero de electrones ms brillante ser el punto. La imagen se puede fotografiar desplazando la pantalla hacia fuera de la trayectoria de los electrones y permitiendo que estos incidan sobre una placa fotogrfica colocada en posicin

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debajo de la pantalla. Puesto que la emulsin fotogrfica es directamente sensible a los electrones casi igual que a la luz se puede registrar sobre la pelcula una imagen de la muestra. Figura 3.

Figura No 3 Microscopio Electrnico de Transmisin 3. OBSERVACIN Y COMPARACIN DE MUESTRAS BIOLGICAS EN MICROSCOPIA PTICA DE ALTA RESOLUCIN Y MICROSCOPIA ELECTRNICA DE TRANSMISIN Se realizara el montaje de placas y rejillas con muestras Biolgicas y se proceder a realizar un anlisis de la Morfologa y Ultraestructura en tejido vegetal y animal a) Observacin de Muestras de tejido Animal Consistentes en Biopsias Renales Humanas, Tejidos Heptico y Cerebro de Ratas. En ellas se podr Observar las Diferentes Organelas y los detalles de la Ultraestructura celular.

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b) Observacin de Muestras de tejido Vegetal de plantas vasculares. Se observaran los cloroplastos, las Membranas tilacoidales y detalles de la Ultraestructura celular

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PRACTICA 3 RECUENTO DE LEUCOCITOS

INTRODUCCIN El recuento de leucocitos es un procedimiento de conteo directo de clulas que se realiza con el Hemocitmetro o cmara de NEUBAUER. Este es un instrumento que permite estimar la concentracin de clulas su principal aplicacin en la estimacin de poblaciones celulares en un cultivo por ejemplo, as mismo la cuantificacin de partculas en un volumen determinado. La siguiente practica tiene una utilidad clnica como es la determinacin de las proporciones relativas de los distintos tipos de leucocitos llamada recuento diferencial de leucocitos proporciona informacin que puede tener importancia diagnostica. Sin embargo para llegar a un diagnostico es importante saber si l numero total de leucocitos es normal Los valores para individuos normales se expresan en la tabla

CIFRA NORMAL l Al momento de nacimiento 12 horas 24 horas 1 mes 1 ao 12 aos 21 aos 18000 x mm3 promedio 22800 x mm3 promedio 18900 x mm3 promedio 10800 x mm3 promedio 11400 x mm3 promedio 8000 x mm3 promedio 7500 x mm3 promedio

OBJETIVOS 1. Conocer un mtodo de conteo de clulas a travs de la Cmara de Neubauer 2. Adquirir destreza en el manejo instrumental y estar en capacidad cuantificar clulas en un volumen determinado

MATERIALES Pipeta para recuento de glbulos blancos Microscopio ptico

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Cmara de recuento globular: Se emplea la cmara con cuadriculado perfeccionado de Neubauer. El rea del cuadriculado mide 9 mm2. El cuadro central se emplea para contar los hemates y las plaquetas, y los cuadros de los ngulos, que miden cada uno 1 mm2 para contar los leucocitos.

REACTIVOS Se utiliza el diluyente de turk que disuelve lisa los eritrocitos para que no interfieran en el recuento de leucocitos. cido actico glacial (3%) 2.0 mL Azul de metileno o violeta de genciana en solucin acuosa 1.0 mL Agua destilada c.s.p. 100 mL

PROCEDIMIENTO
-

La Pipeta para recuento de glbulos blancos: Tienen una porcin capilar dividida en 10 partes que miden el volumen de la muestra de sangre. La graduacin quinta y dcima estn marcadas como 0.5 y 1 respectivamente. A dems tiene un bulbo que se extiende desde la marca 1 hasta la marca11. La ampolla de mezclar tiene una bolita blanca que ayuda a la homogenizacin de la dilucin; el volumen de la ampolla es de 20 veces el del tubo hasta la marca 0.5 y 10 veces hasta la marca 1.

Se aspira con cuidado sangre hasta la marca 0.5 EXACTAMENTE. Limpiar la sangre adherida a la parte externa de la pipeta para no contaminar el diluyente.
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Aspirar lquido diluyente hasta la marca 11 EXACTAMENTE, evitando la formacin de burbujas. Sujetando la pipeta entre los dedos pulgar y medio se agita hasta llegar al agitador de pipetas donde se someten a vibracin por 3 minutos. Elimine las tres primeras gotas (contenido del capilar) ya que se va a contar las clulas de la dilucin del bulbo. Llene las dos cmaras del hemocitmetro. Enfoque con lente de 10X condensador bajo. Se cuentan los leucocitos de cada uno de los cuadrados secundarios de los cuatro ms grandes de las esquinas, (cada cuadrado grande tiene 16 cuadritos pequeos), teniendo cuidado de no repetir ninguna clula. Esta ultima recomendacin puede seguirse s se utiliza la metodologa de contar en L cada cuadrito sin olvidar que no se puede contar dos veces ninguna clulas pero que tampoco puede dejarse de contar ninguna. Por lo

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tanto slo se cuentan las clulas que toquen las lneas divididas de la izquierda y arriba, excepto en la primera fila.
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La suma de los leucocitos encontrados da el nmero de ellos por 1mm2. Por lo 3 tanto es necesario multiplicar por 10 para obtener el dato para 1mm , de sangre diluida. Luego se multiplica por la dilucin para hallar el nmero de clulas en 1mm3 de sangre sin diluir. La formula es la siguiente:
Nmero de clulas contadas x dilucin x 10 Nmero de cuadros grandes contados

Nmero de leucocitos/mm3 =

Lo anterior, rutinariamente se simplifica multiplicando por cincuenta si se ha contado una sola cmara (cuatro cuadros grandes = 64 cuadritos pequeos) multiplicando por 25 si se ha contado de corrido las dos cmara, es decir 8 cuadros grandes.

Ejemplo: Se han contado 120 clulas en una sola retcula, es decir, cuatro cuadros grandes, luego:

120x 20x10 3 6000 Leucocitos x mm 4

se han contado 240 clulas en las dos retculas, es decir, ocho cuadros grandes, luego:

120x 20x10 6000 Leucocitos x mm3 8

En general se recomienda hacer los recuentos en cuadros grandes, es decir, montar ambas retculas e da la cmara, contar por separado, realizar el clculo por separado y luego promediar los resultados. El promedio solo se acepta si la diferencia no excede de 300 clulas; si los datos son muy diferentes, se debe repetir. Si el recuento de leucocitos es inferior a 2500mm3 se debe repetir el recuento llenando con sangre la pipeta hasta 1 y luego diluimos en el reactivo hasta la marca 11, la dilucin queda 1/10 lo que debe tenerse en cuenta para hacer el clculo del recuento. (Se multiplica por 250 125n segn se halla contado 4 u 8 cuadros grandes.

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El lquido diluyente para contar glbulos blancos produce hemlisis en todos los glbulos rojos no nucleados. Los normoblastos no son destruidos y no podran distinguirse de los leucocitos en la cmara; si el nmero de clulas rojas con ncleo es elevado, como sucede en algunas anemias, se debe restar del nmero total del recuento leucocitario. Esto se hace contando el nmero de eritrocitos que existen en 100 leucocitos vistos en un extendido coloreado (recuento diferencial de leucocitos) y luego se extraen con una simple regla de tres del nmero total de leucocitos. Ejemplo: El recuento de leucocitos es de 7500 clulas /mm3 de sangre. Mientras se realiz un diferencial se observaron 7 normoblastos (esto se informa: 7 por 100 clulas blancas observadas. Se debe anotar al pie de donde se anota el diferencial, luego: Si en 100 leucocitos hay 7 normoblastos En 7500 cuantos normoblastos hay? Quiere decir que debo restar 525 clulas del recuento de leucocitos y por eso se informa: recuento de leucocitos: 6975 x mm3. El reactivo debe filtrarse inmediatamente antes de usarlo. Los recuentos leucocitarios pueden hacerse con sangre capilar o con sangre anticuagulada pero fresca.

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CAMARA DE NEUBAUER

10X

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Cuadros grandes primarios que se dividen en cuadros secundarios. (glbulos y plaquetas).

En el presente cuadrante, hay 34 leucocitos. Este es uno de solo de los cuatro cuadrantes graduados de la cmara de Neubauer.

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PRACTICA 4 OBSERVACIN MICROSCPICA DE LA ACTINA Y MIOSONA DEL MSCULO

INTRODUCCIN El Tejido muscular esta constituido por clulas muy especializadas que se caracterizan por su contractilidad y en menor grado por su conductividad. Son esenciales para el movimiento del cuerpo tanto el esqueleto como de los rganos Ultraestructuralmente se caracterizan por presentar Miofilamentos ; es decir junto a los filamentos delgados de actina se encuentras los filamentos de miosina La contraccin muscular es un fenmeno que involucra estas estructuras conformando una unidad funcional llamada sarcomera. En esta practica se pretende visualizar el fenmeno de la contraccin y la participacin de esas estructuras.

OBJETIVOS 1. El estudiante estar en condiciones de reconocer las caractersticas del msculo estriado y de las clulas Musculares. 2. Observar el fenmeno de la contraccin Muscular y la participacin de la sarcomera en la funcin muscular

MATERIALES Fibras de msculo de conejo glicerinadas ATP 5 mM en Buffer 0.01 M Tris-HCl, pH 7.6 ms KCl 0.05 M CaCl 0.001 M Placas preparadas de msculos estriados (secciones longitudinales) Microscopio de contraste de fase Portaobjetos y cubreobjetos

PROCEDIMIENTO Obtenga una placa preparada de clulas de msculo estriado. Dibuje la estructura de una clula individual y presta atencin particular a las estriaciones Mida la distancia entre las bandas sucesivas del msculo e indique esto en el dibujo.

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Compare la imagen vista en el microscpico de Luz. Tome una fibra pequea del msculo de conejo glicerinada y colquela en una placa, Ponga un cubreobjetos suavemente encima de la fibra del msculo y examine con un microscopio de contraste de fase. Mida la distancia entre las bandas y compare la distancia encontrada en la placa preparada. Suavemente retire el cubreobjetos (use una segunda fibra) y agrega una gota de ATP y una gota de CaCl. Inmediatamente observe las clulas a travs del microscopio. Una vez ms mida la distancia entre las bandas.

Optativo Para observar la contraccin muscular, cuidadosamente agregue el ATP y Ca++ al borde de la placa, que se difunda de bajo del cubreobjetos. Usted tambin puede cronometrar el proceso de la contraccin con un cronmetro. Finalmente, las variaciones en la concentracin del ion as como pueden agregarse iones alternativos a otras fibras del msculo para probar los efectos de iones en la contraccin del msculo.

CAPITULO II CULTIVO DE MICROORGANISMOS

En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando parte de poblaciones mixtas de una gran variedad de tipos diferentes. Sin embargo, el desarrollo de la Microbiologa se ha conseguido mediante el estudio de especies aisladas, crecidas en medios desprovistos de cualquier otra forma de vida contaminante. Al igual que los dems seres vivos, los microbianos necesitan nutrientes apropiados as como condiciones ambientales favorables. Se han desarrollado los medios de cultivo estos debe contener aquellos nutrientes esenciales para el crecimiento de una determinado especie microbiana Esencialmente todos los medios de cultivo se encuentran en una de estas formas: caldo medio de cultivo y medio slido. Ya que cualquier medio inmediatamente despus de su preparacin contiene microorganismos procedentes de los ingredientes, de la superficie de los utensilios y de los materiales de vidrio, debe esterilizarse es decir, tratarse por el calor u otros mtodos hasta destruir todas las clulas presentes. De lo contrario, tendramos una mezcla de microorganismos. Antes de su esterilizacin, un tubo conteniendo medio de cultivo es tapado generalmente con algodn, o cubierto holgadamente con capuchn de metal o plstico. As se evita la entrada de nuevos contaminantes, a la vez que se permite el libre intercambio de aire o gases. Las siguientes series de ejercidos pretenden familiarizase con las formas ms comunes de los medios de cultivo caldo comn y agar nutritivo y su uso en el cultivo de las bacterias. Al mismo tiempo aprender a resembrar aspticamente los cultivos microbianos, as como los mtodos de aislar cultivos puros y de contar poblaciones microbianas.

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PRACTICA 5 CULTIVO DE MICROORGANISMOS EN MEDIOS SLIDOS Y LIQUIDOS

INTRODUCCIN Las Tcnicas de cultivo son procedimientos mediante el cual se promueve el crecimiento de Microorganismos al proporcionarles las condiciones apropiadas respecto a Nutrientes pH temperatura, luz, presin Osmtica , Oxigeno y otros factores: Los microorganismos son una herramienta indispensable en los estudios de Biologa Celular a travs de ellos se ha descifrado gran parte del metabolismo de los seres vivos, por sta razn el manejo, uso y cuidada de los cultivos significa un valioso aporte en la formacin de los Bilogos.

OBJETIVOS 1. Se creara destrezas en el estudiante en el cultivo y manejo de cepas bacterianas y diferentes cultivos in vitro. 2. el estudiante aprender a reconocer los diferentes patrones de crecimiento de los microorganismos

MATERIALES Cajas de Petri Tubos de ensayo Agar Nutritivo Caldo Nutritivo Azas Bacteriolgicas Mechero

PROCEDIMIENTO Para sembrar un cultivo bacteriano en un medio estril, un cierto nmero de clulas el inculo se transfieren (se inoculan)al medio con precauciones especiales para conservar la pureza del cultivo. Como se transfiere un gran nmero de microorganismos, no es necesario sacudir el asa de cultivo.

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En el procedimiento de la inoculacin el asa de cultivo o aguja de siembra, debe calentarse al rojo sobre la llama inmediatamente antes y despus de hacer la transferencia. Este flameado destruye cualquier forma de vida sobre la superficie de la aguja o el asa. Se mantiene la aguja hacia abajo sobre la llama, para calentar la totalidad de la aguja y parte inferior del mango. Durante la siembra, se mantiene el tubo en la mano izquierda y se sostiene el tapn o capuchn entre los dedos de la mano derecha. Precaucin: no debe depositarse nunca un tapn. Mantener el tubo los ms cerca posible de la horizontal durante la siembra. Las bocas de los tubos de donde tomamos los cultivos y las de aquellos donde van a ser transferidos, deben tambin flamearse antes y despus de que la aguja sea introducida y sacada. Adems de destruir cualquier organismo del borde del tubo, el flameado tiene a crear corrientes de conveccin hacia fuera, decreciendo as el riesgo de contaminacin. Ya que la mayor parte del trabajo del bacterilogo se efecta con cultivos puros, debemos subrayar la importancia de las tcnicas utilizadas para la inoculacin y dominarlas desde el comienzo del curso. Despus de inoculado, un cultivo bacteriano es conservado o inoculado en un lugar apropiado para el crecimiento. En nuestro caso, crecimiento significa el desarrollo de una poblacin de clulas a partir de una o pocas clulas. La masa de las clulas hijas llega a ser visible a simple vista, bien como una capacidad enturbiamiento en medio lquido o como una poblacin aislada una colonia en medio slido. El aspecto del crecimiento ofrece un medio para diferenciar especies microbianas.

1. CULTIVO EN MEDIO LIQUIDO Una manera sencilla de obtener bacterias es hacerlas crecer en medio lquido, en un tubo de ensayo. Existe una gran variedad de frmulas segn la bacteria que se desee hacer crecer. Sin embargo, todos los medios lquidos deben proporcionar las condiciones ambientales fsicas y qumicas adecuadas y los nutrientes en solucin acuosa. El crecimiento en medio lquido puede manifestarse de diferentes formas: a) Enturbiamiento: una opacidad ms o menos densa. b) Formacin de velo: una pequea masa de clulas que flotan en la parte superior del cultivo. c) Sedimento: un deposito de clulas que permanece en la parte inferior del cultivo, pero que se pone nuevamente en suspensin si el tubo se sacude suavemente.

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METODO Tome cuatro tubos de caldo comn. 1. Rotule un tubo control y djele sin inocular. Este tubo no debe destaparse. 2. Destape un tubo y aada una pequea cantidad de polvo u otro material extrao. Tape el tubo nuevamente. 3. Despus de flamear el asa y el tercer tubo de caldo, se inoculan con un cultivo puro de Escherichia coli. Repita la tcnica inoculando el cuarto tubo con cultivo puro de Sarcina lutea. 4. Inocule los cuatro tubos a 30C hasta el periodo de laboratorio. OBSERVACIN Se examinaran los cultivos lquidos para determinar el crecimiento. No agitar los tubos antes de hacer las primeras observaciones para determinar si ha habido formacin de velo o de sedimento. La mayora de las bacterias crecen abundantemente en medio lquido en veinticuatro a cuarenta y ocho horas. Nota: Algunas clulas pesadas como las levaduras se sedimentan por completo dejando la parte superior del caldo estril o casi estril. Como una precaucin de rutina durante las siembras es preciso asegurarse de que el inoculo esta en suspensin. En cuanto se aprenda la tcnica correcta para resembrar cultivos debe practicarse hasta efectuarla rpidamente ya que la lentitud en el cerrado de los tubos aumenta grandemente los riesgos de contaminacin.

PREGUNTAS 1. Cundo es necesario utilizar tcnicas aspticas para inocular un tubo de medio lquido?. 2. Por qu el crecimiento de algunos microorganismos origina la formacin de un velo o pelcula? Qu factores ambientales pueden alterar la formacin de velo?.

2. CULTIVO EN MEDIO SLIDO El agar inclinado es simplemente un tubo de ensayo conteniendo un medio con agar que durante su enfriamiento se coloc inclinado. El contenido de un tubo as tratado se solidifica con una superficie inclinado que se puede inocular fcilmente con una aguja o asa. El agar inclinado constituye un medio adecuado para el

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cultivo de microorganismos, especialmente de aquellos aerbios o anaerobios facultativos. Algunas caractersticas de los cultivos, como la formacin de pigmentos, se observan ms fcilmente sobre cultivos inclinados. El mtodo de agar inclinado y otro mtodo para el cultivo de microorganismos sobre medio slido, el agar para siembra por picadura, se utilizan corrientemente para la conservacin de stocks de cultivo (ver el apartado titulado Conservacin de cultivos de laboratorio, que se encuentra al final de esta seccin del manual). El ltimo mtodo es preferible cuando se necesitan condiciones ms anaerobias.

METODO 1. Funda tres tubos de agar nutritivo ponindolos en agua hirviendo. Djelos enfriar en posicin inclinada. 2. Cuando el medio est fro y slido, inocule la superficie de uno de ellos con Escherichia coli, utilizando una aguja. Se mueve la aguja suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento serpenteante, desde el fondo hasta la parte superior, teniendo cuidado de no daar el agar. Incule un segundo tubo con Sarcina lutea. Utilice un tercer tubo sin inocular, como control. 3. Incube los tubos a 30C hasta el prximo periodo de laboratorio.

OBSERVACIN Se examinara el crecimiento que se desarrolla en superficie. Debe observarse la manera completamente diferente en que crece E. Coli sobre medio slido, comparado con el crecimiento del mismo en medio liquido, Visualmente examine las colonias individuales de bacterias y descrbalos segn las caractersticas siguientes: Tamao. pequea, media, o grande, basado en las diferencias relativas entre las colonias vistas ms grandes y ms pequeas. Forma y Mrgenes. Redondo, regular o irregular. Elevacin. Aplastada, convexa o redondeada, umbonate (plano en las mrgenes y levantado en el centro - como un huevo frito), craterlike (con centro deprimido). Consistencia. Suave o spera.

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Color. Describa el color , con la precisin mejor posible y distinga entre los tipos diferentes de gris o blanco, amarillo, y rojo. Si el pigmento parece difundirse en el medio circundante, en lugar de colorear toda la colonia, es un pigmento aguasoluble. Determine y anote la identidad de sus colonias.

PREGUNTAS 1. Por qu es importante evitar que la aguja se introduzca bajo la superficie del agar?. 2. Por qu no crecen las bacterias (especialmente las formas mviles) por todo el medio de agar que contiene 97 por 100 de agua?. 3. Cuando se utilizan cultivos inclinados para estudiar las caractersticas del cultivo, es mejor inocular con una aguja que con una asa. Por qu?.

CAPITULO III MEMBRANAS CELULARES

Puesto que el contenido de una clula esta rodeado en toda su extensin por la membrana plasmtica, toda comunicacin entre la clula y el medio extracelular debe ser a travs de esta estructura, por un lado debe retener los materiales disueltos dentro de la clula y por otro debe permitir el intercambio necesario de materiales hacia dentro y fuera de las mismas. Un electrolito debe satisfacer dos condiciones para difundir al interior de una clula a travs de la membrana plasmtica. La sustancia debe estar presente en concentracin ms elevada fuera de la clula y la membrana debe ser permeable a la sustancia. Una membrana puede ser permeable un soluto determinado: 1) porque el soluto pasa a travs de la bicapa de lpidos, 2) porque dicho soluto es capaz de a travs un poro acuoso situado en el espesor de la membrana que impide el contacto del soluto con las molculas lpidas de la bicapa. Consideraremos primero la ruta en la cual una sustancia se disuelve en la bicapa de lpidos para atravesar la membrana. El anlisis de esta ruta obliga a considerar la polaridad de un soluto. Una medida de la polaridad (o no polaridad) de una sustancia es su COEFICIENTE DE PARTICIN, o sea la proporcin entre su solubilidad en aceite y su solubilidad en agua. Las practicas correspondientes a este capitulo abarcaran los conceptos relacionados con la difusin del agua a travs de las membranas, coeficientes de penetracin y de particin y su relacin con la capacidad movilizacin de una sustancia a travs de un compuesto

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PRACTICA 6 OSMOSIS

INTRODUCCIN Las molculas de agua se desplazan con mucha mayor rapidez a travs de una membrana celular que los iones y pequeos solutos El agua se mueve rpidamente a travs de una membrana semipermeable desde una regin de baja concentracin hasta otra de alta concentracin de soluto este proceso se denomina OSMOSIS y puede demostrarse fcilmente colocando la clula en una solucin con una concentracin de soluto diferente de la presente en el interior de la propia clula

OBJETIVOS 1. Observar los fenmenos de Osmosis y difusin del agua a travs de las Membranas. de las clulas vegetales y el fenmeno de turgencia 2. Desarrollar de forma practica los Hipertnico. conceptos de Hipotnico Isotnico e

3. Observacin del os cambios de la presin osmtica intracelular y su efecto en la apertura delos estomas en las hojas

MATERIALES Hojas de Tradescantia sp Hojas de Elodea Muestra de sangre 3 mililitros Soluciones de sacarosa que van desde 0.05 M a 0.50 M Soluciones de cloruro de sodio, cloruro de potasio y nitrato de calcio que van desde 0.05 M a 0.50 M cuchillas Placas con depresin Microscopio

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PROCEDIMIENTO 1. Ponga 0.5 ml NaCl 0.050 M en el centro de una placa con depresin y agregue un pedazo pequeo de una hoja de Tradescantia sp. despoje de la hoja la capa epidermal y observe la presencia de los Estomas y sus celulas oclusoras las cuales hacen que se cierren y se abran los estomas 2. .Repita el paso anterior haciendo diferentes montajes con las soluciones de Sacarosa KCl y NaCl suministradas en las diferentes concentraciones. Observe los cambios presentados en las clulas oclusoras, Determine cual de las soluciones permite la apertura de los estomas y de explicacin del fenmeno . 3. Coloque una hoja de Elodea en una lamina porta objeto y mntela con agua del medio natural observe las paredes celulares los cloroplastos y las vacuolas 4. Repita el paso anterior haciendo diferentes montajes pero con las soluciones de NaCl y KCl suministradas en las diferentes concentraciones . Observe el fenmeno de turgencia y plasmolisis y de explicacin de l. 5. Coloque en un portaobjeto una gota de sangre cubra la muestra con una lamina cubre objeto observe los eritrocitos y su forma caracterstica 6. Repita el paso anterior pero adicione una gota de la solucin de cloruro de sodio Y KCl en las concentraciones suministradas . Observe los cambios de forma de los eritrocitos y de termine que solucin es HIPOTNICA ISOTNICA e HIPERTONICA explique el fenmeno observado

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PRACTICA 7 SOLUBILIDAD DE LOS LIPIDOS DE LA MEMBRANA

INTRODUCCIN El coeficiente de particin para un compuesto se mide disolviendo la sustancia en aceite y agua por separado mezclando luego los dos solventes inmiscibles con la sustancia disuelta. Y agitndolos, lo que permite que se separen en dos fases y se mida la concentracin del soluto en cada fase. El coeficiente de particin es la concentracin en aceite divida entre la concentracin en agua. La importancia de la liposolubilidad para la permeabilidad se muestra en el cuadro 1 donde se compara la penetracin de una serie de alcoholes con coeficiente de particin decreciente a travs de la membrana del eritrocito. Otro factor que determina la velocidad de penetracin de un compuesto a travs de una membrana es su tamao. Si dos molculas tienen coeficiente de particin aproximadamente iguales, las molculas de menor tamao tienden a penetrar en la bicapa de lpidos de una membrana con mayor rapidez en comparacin con la molcula ms grande. Molculas sin carga y muy pequeas penetran rpidamente a travs de las membranas celulares. Por consiguiente las membranas son permeables a molculas inorgnicas pequeas como O2, CO2, No y H2O, que parecen deslizarse entre fosfolpidos adyacentes. En contraste molculas polares ms grandes, como azucares, aminocidos e intermedios fosforilados, muestran poca penetrabilidad en la membrana. Por consiguiente, la bicapa de lpidos de la membrana plasmtica suministra una eficaz barrera que evita la difusin de estos metabolitos esenciales hacia el exterior de la clula. Puesto que algunas de estas molculas (P. e., azucares y aminocidos) deben entrar las clulas procedentes del torrente sanguneo, al parecer no lo hacen por simple difusin. En vez de eso deben disponer de mecanismos especiales para penetrar atraves de la membrana plasmtica. Estos mecanismos permiten a una clula controlar el movimiento de sustancias a travs de la barrera situada en su superficie.

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Coeficiente de Participacin (x10) Alcohol metlico Guicerol etil ter Propilenglicol Glicerol metil ter Etilenglicol Glicerol Eritritol 0.78 0.74 0.57 0.26 0.049 0.007 0.003

Tasa relativa 0.99 0.077 0.087 0.043 0.043 0.00074 0.000046

Cuadro No 1. Relacin entre coeficiente de participacin y tasa de penetracin de una sustancia.

OBJETIVOS 1. Deducir a travs de la observacin los conceptos de Coeficiente de penetracin y coeficiente de particin. 2. Realizar una interpretacin de la arquitectura molecular de la membrana y la reilacin con el transporte de sustancias.

MATERIALES Y REACTIVOS Cuchillas Placas de dispersin Cronmetro Remolacha fresca Alcoholes: Metanol 22M Etanol 8.5M n-Propanol 3M n-Butanol 1.1M Amylalcohol 0.38M

PROCEDIMIENTO Las clulas de la remolacha contienen una concentracin alta de anthocianina (pigmento rojo). Cuando se ponen en contacto con un compuesto que disuelve la

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membrana de la clula, las anthocianinas gotean fuera de esta y producen un color rojo. Corte rodajas delgadas de remolacha y colquelas en una placa con depresin, observe en el microscopio por el objetivo de menor aumento(4X). Mientras mira el borde del corte de remolacha agregue aproximadamente 1 ml. de cada uno de los alcoholes o mezclas de estos que estn disponibles, hasta que el corte de la remolacha se sumerja; tenga cuidado de que el alcohol no se rebose de la placa ( El alcohol isoamlico tiene un olor fuerte, molesto y los vapores irritan un poco, se requiere una adecuada ventilacin para manipularlo) Inmediatamente empiece a cronometrar la disolucin de las membranas de las clulas de remolacha, marque el tiempo en que el color rojo se observa en el alcohol circundante. Repita el anterior procedimiento utilizando diluciones de los alcoholes en agua en las siguientes proporciones: alcohol-agua (1:1) y alcohol-agua (1:4) .

Para la dilucin de cada alcohol, calcule un coeficiente de penetracin, dividiendo el tiempo de aparicin del pigmento por la concentracin molar del alcohol. Realice un grfico del coeficiente de penetracin contra la miscibilidad relativa del alcohol (conocida como el COEFICIENTE DE DISTRIBUCIN O DE PARTICIN)

Alcohol Metanol Etanol n-Propanol n-Butanol n-Amil-alcohol

Formula CH3OH C2H5OH C3H7OH C4H9OH C5H11OH

Peso Molecular 32.04 46.07 60.09 74.12 88.15

Coeficiente de Particin 0.01 0.03 0.13 0.58 2.00

CAPITULO IV FRACCIONAMIENTO CELULAR

La mayor parte de las clulas contienen gran variedad de diferentes tipos de organelos, cuando se pretende estudiar una funcin particular de las mitocondrias o aislar una enzima particular del complejo de golgi es de suma utilidad poder aislar el organelo relevante en estado puro. El aislamiento de un organelo particular en cantidad apreciable por lo general se logra mediante la tcnica de centrifugacin diferencial, que depende del principio siguiente: Si se colocan partculas materiales ms densas que el medio que las rodea en un campo de centrifugacin las de diferente tamao y forma viajan hacia el fondo del tubo de la centrfuga a diferente velocidad. Primero las clulas se rompen mediante alguna tcnica casi siempre de agitacin mecnica en solucin isotnica amortiguada, con frecuencia contiene sacarosa utilizando un homogenizador mecnico. A continuacin se somete el homogenado a una serie de centrifugaciones secuenciales. La centrifugacin a travs de un gradiente distribuye el contenido de la fraccin en varias capas segn la densidad de los componentes. Los organelos celulares aislados mediante centrifugacin diferencial retienen sus actividades normales a un nivel notablemente elevado, siempre y cuando no se expongan a condiciones desnaturalizantes durante el aislamiento. Se pueden usar organelos aislados con este procedimiento en sistemas libres de clulas para estudiar una gran variedad de actividades que ocurren dentro de la clula viviente incluyendo sntesis de protenas enlazadas a las membranas, transporte de solutos u desarrollo de gradientes inicos y fosforilacin oxidativa.

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PRACTICA 8 SEPARACION DE CELULAS POR BAJA VELOCIDAD

INTRODUCCIN La presente practica pretende involucrar a los estudiantes en el manejo de las tcnicas de separacin de fracciones celulares por mtodos muy sencillos como la centrifugacin, lo que les permitir as mismo identificar las diferentes fracciones celulares en el microscopio de contraste de fase

OBJETIVO 1. Capacitar en el manejo del equipo y las tcnicas de centrifugacin como herramienta de gran utilidad en el laboratorio.

MATERIALES Y REACTIVOS 1 pipeta Pasteur 2 tubos para centrifuga Centrfuga con rotor de ngulo fijo Microscopio de contraste de fase Sangre Total Buffer Fosfato Salino (PBS) + Suero Bovino 0.1% (w/v) Albmina (BSA)

PROCEDIMIENTO Coleccione por lo menos 5.0 ml de sangre en un tubo de centrifuga que contiene EDTA como anticoagulante. Mezcle suavemente por inversin. Centrifugue a 2,000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente, con un rotor de ngulo fijo. Lentamente disminuya la velocidad de centrifugacin (no use freno). Despus de centrifugar la sangre total debe quedar una capa compacta debajo del menisco del tubo. Esta banda (MNC) de color opalescente contiene las clulas MONONUCLEARES (LINFOCITOS Y MONOCITOS)y las plaquetas, debajo de esta banda esta el plasma, mientras los eritrocitos y las clulas polimorfonucleares formarn una banda oscura al fondo del tubo.

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Mantenga verticalmente el tubo, inserte una pipeta Pasteur en el tubo y recoja la banda MNC (clulas mononucleares). No coleccione ms de 2.5 ml en la pipeta. Transfiera el volumen de la pipeta a un tubo de centrifuga cnico de 15 ml . Enjuague la pipeta con 2.5 ml de PBS y transfiera el lavado al tubo de centrfuga cnico. Lave las clulas mononucleares en el tubo cnico agregando 5 ml de PBS que contiene 0.1% BSA para un volumen total de 10 ml y mezcle por inversin. Centrifugue a 300 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente. Resuspenda las clulas mononucleares en 5.0 ml de PBS. Haga una sola cantidad de las clulas frescas suspendidas Examine la pureza de la separacin utilizando un microscopio de contraste de fase.

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PRACTICA 9 AISLAMIENTO DE LA MITOCONDRIA

INTRODUCCIN La centrifugacin como la ultracentrifugacin son procesos de separacin de fracciones celulares de acuerdo al tamao de las partculas como al procesos llamados Velocidad de Sedimentacin. . Los valores tpicos de centrifugacin para obtener diferentes fracciones celulares son Baja velocidad 1000 veces la gravedad por 10 minutos Velocidad media 20000 veces la gravedad por 20 minutos Velocidad alta 80000 veces la gravedad por 1 hora Muy alta velocidad 150000 veces la gravedad por 3 horas

OBJETIVOS 1. Capacitar al estudiante en el manejo de las tcnicas de fraccionamiento celular y las aplicaciones en el trabajo de laboratorio 2. Permitir al estudiante la obtencin de una organela celular especifica con la cual pueda desarrollar un anlisis estructural y funcional de la misma.

MATERIALES Hgado fresco de ratn Sucrosa 0.25 M en 10 mm de Buffer HEPES pH 7.5 (Buffer de Homogenizacin) Sucrosa 0.25 M en 10 mm HEPES pH 7.5 + 1 mm EDTA (Buffer de Suspensin) Homogenizador de Tefln Centrfuga refrigerada Verde Janus B Hemocytometro y microscopio

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PROCEDIMIENTO Sacrifique un ratn que no se ha alimentado por lo menos 24 horas antes del laboratorio, Retire el hgado y pselo. Agregue el hgado en un beaker, por cada gramo de hgado, agregue 9.0 ml de sacarosa 0.25 M en 10 mm Buffer HEPES, pH 7.5. Esto producir una mezcla al 10%. Agregue la mezcla en tubos de centrifuga y centrifugue a 4,500 xg durante 10 minutos a 4 C. Decante el sobrenadante en los tubos de centrfuga limpios y deseche el pellet (botn). Recentrifugue el sobrenadante a 16,000 xg durante 25 minutos a 4 C. Decante y deseche el sobrenadante. Resuspenda el pellet mitocondrial en 20 ml de sucrosa 0.25 M en 10 mm HEPES. Salte al punto 10. Optativo: si se desean mitocondrias ms limpias, resuspenda en 20 ml de sucrosa 0.25 M en 10 mm HEPES + 1 mm EDTA y realice los pasos 8y9. Recentrifugue el pellet suspendido a 16,000 xg durante 25 minutos a 4 C. Decntese y deseche el sobrenadante. Resuspenda el pellet y lave en 20 ml de sucrosa fresca sin EDTA y ponga la suspensin en el bao de un hielo hasta que se requiera su uso extenso. La suspensin permanecer activa durante aproximadamente 4-6 horas si se guarda en fri. Mezcle solucin con unas gotas de Verde Janus con 0.1 ml de suspensin del mitocondrial. Ponga una gota de esta mezcla en un hemocitometro y determine el nmero de mitocondrias ml. Si hay demasiados mitocondria para contar, haga diluciones seriadas de 1/10 a 1/1000 y recuente. Deben contarse rpidamente las mitocondrias. Ellos no son estables y se descomponen en pocos minutos despus de la dilucin. Anote el nmero de mitocondrias/ml ___________

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PRACTICA 10 RESPIRACION DE LA MITOCONDRIA

INTRODUCCIN La mitocondria es el organelo celular donde se desarrolla la respiracin celular. Estos organelos pueden ser de diferentes formas pero su estructura bsicamente consiste de una membrana interna plegada que contiene la matriz mitocondrial y una membrana externa separada de la membrana interna por el espacio intermembranal. Dentro de la mitocondria se realiza la oxidacin de los cidos grasos y el ciclo de Krebs entre otras vas metablicas importantes. en su membrana Interna se encuentra los componentes de la cadena respiratoria en donde se lleva acabo reacciones de oxido reduccin acopladas al sistema de ATPasas la cual genera la energa necesaria para el funcionamiento celular Esta practica permitir comprender y observar en un sistema in vitro el funcionamiento de la mitocondria

OBJETIVO 1. Comprender las reacciones de oxido reduccin que se llevan a cabo en la respiracin mitocondrial conducentes a la generacin del ATP

MATERIALES Respirmetro Gilson (o Warburg)a 37 C Suspensin de Mitocondria del Ejercicio 8.4 Ringers Krebs Fosfato (KPR) Glucosa 10% (w/v) Acido de Sodio 0.39% (w/v) Dinitrophenol (DNP) 18.4 mg %(w/v) Malonato de Sodio 6.64% (w/v) KOH 10% (w/v)

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PROCEDIMIENTO Cuando usted entra en el laboratorio, cheque que las cmaras de referencia del respirmetro Gilson estn llenas con la solucin apropiada (normalmente formaldehdo). Enciende el instrumento y equilibre la temperatura. Utilice catorce tubos de reaccin y asegrese que estn limpios, que no estn partidos, con tapones y aberturas de ventilacin. Use una micropipeta y agregue cuidadosamente 0.2 ml de KOH 10% en el centro de cada uno. Es sumamente importante que el KOH no chispee en el tubo de la reaccin principal porque este destruye la Mitocndria. Ponga 2.0 ml de KPR en el vaso principal de frascos #1 y #2. Ponga 0.5 ml de KPR en el vaso principal de frascos #3 y #4. Ponga 0.2 ml de KPR en el vaso principal de frascos #5 hasta el #12. Ponga 0.1 ml de KPR en el vaso principal de frascos #13 y #14. Ponga 1.0 ml de suspensin del mitocondrias en los vasos principales de frascos #3 hasta el #14. Agregue 0.5 ml de glucosa al brazo lateral de frascos #3 hasta el #12. Finalmente, agregue lo siguiente a los vasos principales de los frascos indicados:

Tubos #5 y #6 #7 y #8 #9 y #10 #11 y #12 0.3 ml de glucosa 0.3 ml de cido de sodio 0.3 ml de DNP 0.3 ml de malonateo de sodio

Corte catorce cuadros de 2 cm de papel del filtro y haga pequeos abanicos de cada uno. Ponga bien los pedazos en el centro. Haciendo esto aumentarn el rea de la superficie disponible para la absorcin de CO2 por el KOH.

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Cuidadosamente coloque un retenedor de brazo lateral (o un tubo de abertura cerrada) a los frascos. Coloque los frascos al manmetro y asegure bien. Baje los frascos en el bao de agua. Deje todos los frascos de la reaccin 5 minutos a la temperatura de equilibrio. Durante este tiempo, ponga todos los micrmetros a una lectura de 500. Adicione a los volmenes del brazo lateral a los vasos principales, ensamble e el manmetro dentro del bao de agua e incline los frasco suavemente. TENGA cuidado para no DERRAMAR NINGN VOLUMEN POR FUERA DEL CENTRO. Ponga todos los frascos en el bao de agua y cierre todas las vlvulas del respirmetro. ste es el punto cero para sus datos - registre el tiempo. Encienda el motor y ajuste la velocidad para obtener un remolino suave de los volmenes del frasco. Despus de 10 minutos, ajuste el fluido del manmetro en la lnea de arranque original volvindose al micrmetro apropiado. Anote las lecturas del micrmetro para cada uno de los catorce frascos. Repita las lecturas del micrmetro a pequeos 10 intervalos hasta obtener una pendiente estable para el respirmetro. Esto generalmente estar dentro de 40-60 minutos del punto cero. Anote todas las lecturas. Para cada lectura, substraiga el valor original de 500. Promedie las lecturas obtenidas en los frascos #1 y #2 y substraiga este promedio de los promedios de #3/#4, #5/#6, #7/#8, #9/#10, #11/#12 y #13/#14. Grafique el cambio en volumen de gas (el consumo de oxgeno) para cada una de las condiciones de la replica.

Nota: Los tubos 1 y 2 son termobarmetros. Cualquier cambio en el volumen de gas dentro de estos tubos refleja cambios en la temperatura y/o la presin baromtrica. Los tubos 3/4 y 5/6 representan todas las condiciones para la Fosforilacin Oxidativa (respiracin). Los tubos 7/8 son inhibidos por el cido en el sistema de transporte del electrn. Los tubos 9/10 son inhibidos por la presencia de DNP que efecta transporte de glucosa as como la entrada del substrato en el sistema de transporte del electrn. El malonato de sodio en los tubos 11/12 es un inhibidor competitivo de la succin deshidrogenasa en el ciclo de Krebs. ETS no detendr las reacciones, y las reducir slo si la concentracin de glucosa es ms baja que el

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malonato. Finalmente, los tubos 13/14 representan cualquier reaccin endgena de la mitocondria en el aislamiento de sucrosa. Tcnicamente, la glucosa no es metabolizada por la mitocondria. Debe ser alterada por enzimas del citoplasma para formar piruvato antes de entrar en la mitocondria. El procedimiento de aislamiento usado en la preparacin de las mitocondria es importante. Si las mitocondrias son "purificadas" las medidas no trabajarn. Usando un homogenizador la sucrosa mantendrn bastantes enzimas para que ocurra la gliclisis . El experimento podra ser alterado usando cido pirvico en lugar de la glucosa. En el experimento tradicional se utiliza glucosa. Anote las catorce lecturas del manmetro cada 10 minutos durante por lo menos una hora. Promedie cada par de lecturas y substraiga la lectura para 13/14 de cada uno de los promedios para 3/4, 5/6, 7/8, 9/10 y 11/12. Promedie los valores corregidos contra el tiempo, usando para cada uno un promedio de la regresin lineal.

# Tubo/Tiempo

10

20

30

40

50

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

CAPITULO V ESPECTROFOTOMETRIA

La espectroscopa es el estudio de la interaccin de la radiacin electromagntica con la materia. Las tcnicas espectroscpicas han sido ampliamente utilizadas en investigaciones sobre la naturaleza, estructura y reacciones de diversos compuestos. Entre las ventajas de estas tcnicas se encuentran el que no degradan las molculas bajo estudio, adems de poder detectar y probar cantidades muy pequeas de material, la espectrofotometra es una rama de espectroscopa y como tcnica de experimentacin es usada principalmente para medir la cantidad de luz visible o de luz ultravioleta de varias longitudes de onda absorbidas por una sustancia. En la investigacin biolgica la espectrofotometra es comnmente usada para determinar la concentracin de una sustancia en solucin as como tambin para obtener su espectro de absorcin.

Fotocolorimetra Cuando se hace pasar un haz de luz a travs de un medio lquido, la luz que sale despus de atravesarlo es menos intensa que la luz que incidi, sta disminucin en intensidad se encuentra directamente relacionada con el nmero de partculas en suspensin o solucin dentro del sistema, por lo que es posible determinar indirectamente su concentracin en una muestra. La luz blanca es una mezcla de diferentes colores longitudes de onda, cuando un haz de luz blanca incide sobre una muestra puede suceder: a. Que la muestra absorba de igual modo todas las longitudes de onda, disminuyendo la intensidad de la luz sin afectar la distribucin de color. b. Que la muestra colorida absorba solo ciertas longitudes de onda permitiendo el paso de las otras, en este caso el resultado ser una disminucin de la intensidad luminosa y un cambio en la distribucin del color. En ambos casos los fundamentos del anlisis del colorimtrico son los mismos ya que para cualquier muestra dada un cambio en la intensidad de la luz transmitida ser directamente relacionada con un cambio en la concentracin de las partculas en la solucin o suspensin.

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En medio lquido o solvente donde las partculas estn dispersas tambin absorbe la luz de manera caracterstica por lo que es necesario conocer este dato para hacer los ajustes pertinentes durante las mediciones. El grado de transmitancia (T) de una muestra se puede determinar midiendo la intensidad del haz luminoso antes (Io) y despus de atravesarla (I) donde: I: Es la luz transmitida, y la luz incidente es Io T= I/Io Es conveniente expresar el valor de la tranmitancia en forma logartmica y este valor recibe el nombre de absorbancia (A) o densidad ptica (DO) A= D.O= log 10 1/T En los reportes e A= D.O= log 10 1/T En los reportes experimentales es ms comn encontrar el trmino de absorbancia que el de densidad ptica.

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PRACTICA 11 PREPARACIN DE UNA CURVA PATRON

INTRODUCCIN Para determinar fotomtricamente la concentracin de una sustancia de naturaleza qumica conocida es necesario contar con una curva patrn que es la representacin grfica de la relacin que existe entre la absorbancia de diferentes diluciones en la misma sustancia a una longitud de onda determinada correspondiente a su mximo de absorcin. La curva patrn se obtiene midiendo la absorbancia de una serie de alicuotas de concentracin conocida de una determinada sustancia a una longitud de onda fija. Una vez que los datos se han graficado es posible determinar la concentracin de una muestra de la misma sustancia midiendo solamente su absorbancia.

OBJETIVOS 1. Capacitar al estudiante en le Manejo del espectrofotometro y sus aplicaciones en el trabajo de laboratorio. 2. Proporcionar a los estudiantes los conceptos fsicos y qumicos que permiten a la espectrofotometria ser una herramienta de anlisis en el laboratorio.

MATERIALES Solucin madre KMnO4 Tubos de ensayo Gradillas PROCEDIMIENTO Empiece preparando una solucin Patrn manganeso as: 250 ml KMnO4 100 mg/Lt 100 ppm (100mg/Lt) 1g / 1000 de KMnO4 que tenga 100 ppm de

0,250 Lt = mg Mn =25 mg Mn

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A partir de esta solucin madre de 100 ppm de Mn y utilizando agua destilada prepare cuatro soluciones de 2, 4, 8, 10 ppm en un volumen de 25 ml utilice balones aforados y mantenga las soluciones en la oscuridad.

Que formula aplica para encontrar las concentraciones a preparar? Utilice la tabla siguiente

Concentracin 2 4 8 10 Muestra problema

Vol. de la solucin Vol. Final madre

Absorbancia

Encienda el Espectrofotmetro y ponga una longitud de onda de 526 nm. Use el tubo #1 de las diluciones anteriores como un blanco y ajuste el Espectrofotmetro para 0 y 100% T. Lea la Absorbancia (o convierta y lea la trasmitanca) de cada uno de las soluciones de los tubos 2-8 y complete la tabla siguiente:

Trace que un diagrama del valor de la absorbancia contra la concentracin de KMno4 concentracin conocida de KMnO4 debe ser el eje de x, mientras los absorbancia deben ser el eje de y. Trace la pendiente computada e intercepte la regresin lineal como una lnea recta que recubre su grfico. La ecuacin para una lnea recta es y = mx + b, donde m es la pendiente y b el intercepto. Nota: La densidad ptica de Mn a 526 nm es directamente proporcional a la intensidad de formacin de color en solucin (La ley de Beer-Lambert).

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PRACTICA 12 DETERMINACIN ESPECTROFOTOMETRICA DE PROTEINAS EN MATERIALES BIOLGICOS

INTRODUCCIN Se han reportado varios mtodos para cuantificar protenas por mtodos espectrofotomtricos: El Mtodo de Biuret se basa en que los enlaces peptdicos en la protena forman con el Cu+2 en medio alcalino una coloracin entre azul y prpura. El mtodo es bastante especfico pero no es muy sensible, se requieren cantidades entre 1 mg a 10 mg de protena, en la muestra para dar una lectura. Pero es conveniente por su sencillez para muestras cuya concentracin protica est en el rango de sensibilidad del mtodo. El Mtodo de Lowry se basa como el anterior, en la formacin de complejos cpricos pero la coloracin es intensificada con el reactivo de Foln - ciocalteau que a dems reacciona con residuos de tirosina y triptfano presentes en la protena. La coloracin resultante es entonces ms intensa por lo cual la sensibilidad del mtodo es incrementada. La sensibilidad entre 10 mg y 200 mg de protena. El mtodo de Warburg Christian est basado en la absorvancia relativa de protenas y cidos nuclicos a 280nm y 260nm. Los dos primeros mtodos son los ms usados.

OBJETIVO 1. Preparar una curva patrn de calibracin para protenas y determinar la concentracin de una muestra problema por el mtodo de Biuret.

MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de ensayo Gradillas Espectrofotmetro

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Patrn de protenas. Seroalbmina bovina 3.0mg/mL (fraccin de sigma) Reactivo de Biuret. (250mL). Heparina Muestra de Suero sanguneo

Preparacin de Albmina Agregue 0.9g de albmina (a 300mL de H2O. Agite suavemente y deje varias horas o toda la noche a 4C, luego mezcle suavemente por inversin y almacene a 4C (Solucin 1).

Preparacin de reactivo de Biuret Disuelva 6.0g. de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado en 500mL de H 2O. Aada 1.5g. de CuSO4 5 H2O. Agregue lentamente con agitacin 300mL de NaOH al 10% (libre de CO2) diluya a 1 litro con H2O. El reactivo es estable y puede guardarse para experimentos sucesivos. Descrtelo cuando aparezca un precipitado rojo o negro. Prepare l a solucin 0.3 mg/mL de protena a partir de la solucin 1. Disponga 8 tubos de 18 x 150 mm como se muestra en la tabla siguiente.

REACTIVO

TUBO NMERO

ML Albmina 3mg/mL (mls) H2O (mL) Reactivo de Biuret (mL)

2 0.2

3 0.4 2.6 3.0

4 0.7 2.3 3.0

5 1.0 2.0 3.0

6 2.0 1.0 3.0

7 3. 0 3.0

3.0 3.0

2.8 3.0

2.0 3.0

Agite para conseguir un buen mezclado y Deje los tubos a temperatura ambiente por 30 minutos luego mida la absorbancia a 540 nm. Calibre el instrumento con agua. El color es estable por cerca de dos horas pero luego disminuye lentamente con el tiempo. Corrija las absorbancias de los tubos 2 - 7 con la del blanco (tubo No 1).

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Obtenga el Suero sanguneo a partir de una muestra de sangre de uno de sus compaeros previamente Heparinizada (Muestra Problema Tubo No 8) Realice diluciones de la muestra Problema y obtenga la concentracin por extrapolacin.

1. Qu ventajas presenta cada mtodo y cuales son las limitantes principales? 2. Anote los complejos formados entre los grupos peptdicos y el reactivo de Biuret. 3. Podra determinar la concentracin de aminocidos en una muestra por la reaccin de Biuret?. Explique. 4. Qu importancia prctica tiene la determinacin de protenas en tejidos biolgicos?

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PRACTICA 13 EFECTOS DE LA TEMPERATURA Y El pH EN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS

INTRODUCCIN Las enzimas son catalizadores notablemente eficaces. Los catalizadores empleados por los qumicos en el laboratorio como calor han sido platino y magnesio metlico por lo general aceleran la reaccin 100 a 1000 veces en relacin con la velocidad no catalizada. Por lo contrario las enzimas incrementan tpicamente la velocidad de una reaccin 1 milln a 1 trilln de veces 1012. Todava ms notable es que esto se logra a temperaturas y pH sumamente bajos presentes en la clula, adems a diferencia de los catalizadores inorgnicos empleados por los qumicos la mayor parte de las enzimas son muy especficas en relacin con los reactantes a los que pueden unirse y la reaccin que catalizan. Existen factores que influyen fuertemente en la cintica enzimtica son pH y temperatura del medio de incubacin. Los cambios de temperatura modifican la actividad de las enzimas a temperaturas ms bajas la velocidad de una reaccin se eleva con los incrementos de temperatura debido al aumento de energa de los reactantes. a temperaturas ms altas este aspecto positivo se contrarresta por la desnaturalizacin de la enzima.

OBJETIVOS 1. Promover en los estudiantes la destreza en el uso de los equipos y capacidad de anlisis en las practicas a realizar 2. Mostrar a los estudiantes el efecto de la temperatura y el pH en la cintica enzimatica

MATERIALES Extracto de la enzima DOPA 8 mM a pH 6.6 Incubadoras o bao de Bao Maria ajustados a 10, 15, 20, 25, 30, 35 y 40 C Espectrofotmetro con tubos Cronmetro Tubos de ensayo

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DOPA 8 mm en buffer citrate ajustado a valores de pH de 3.6, 4.2, 4.8, 5.4, 6.0, 6.6, 7.2, 7.8.

1. EFECTOS DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS PROCEDIMIENTO Prepare una serie de tubos de ensayo, cada uno conteniendo 2.5 ml de Buffer DOPA 8 mM a pH = 6.6. coloque el tubo sobre hielo o ajuste el bao mara a las siguientes temperaturas: 10, 15, 20, 25, 30, 35 y 40 C, Agregue 0.5 ml de un extracto de la enzima apropiadamente diluida (para producir 10 micromoles de dopachrome en 3-5 minutos) a cada uno de una segunda serie de tubos. Ponga a cada uno en los baos a la temperatura correspondiente. Deje todos los tubos 5 minutos en las diferentes temperaturas. No mezcle los tubos. Ajuste el espectrofotmetro a 475 nm. Tome el tubo que contiene la enzima, vierta la enzima (0.5 ml a 10 C) en el tubo que contiene el DOPA ( 2.5 ml a 10 C) y empiece cronometrando la reaccin, mezcle completamente. Anote el tiempo que la reaccin alcanza el punto final equivalente a la conversin de 10 micromoles de substrato. Repita el paso 3 para cada uno de las temperaturas de la lista, complete la siguiente tabla y anote los datos.

Temperatura C

tiempo (minutos)

Micromoles de dopachrome

velocidad (micromoles/minuto)

10 15 20 25 30 35 40

10 10 10 10 10 10 10

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2. EFECTOS DEL PH EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES PROCEDIMIENTO Prepare una serie de tubos de ensayo cada uno conteniendo 2.5 ml de DOPA 8 mm, ajustados a los valores de pH siguientes: 3.6, 4.2, 4.8, 5.4, 6.0, 6.6, 7.2, y 7.8 Empiece con el tubo que contiene DOPA @ pH 3.6, agregue 0.5 ml del extracto de la enzima diluido como el que convertir 10 micromoles de DOPA en 3-5 minutos como en el Ejercicio 5.3. Comience cronometrando la reaccin, mezcle por inversin y mida en el spectrophotometro. Anote el tiempo para la conversin de 10 micromoles de DOPA. Repita Paso 2 para cada uno de los valores del pH indicados. Complete la tabla siguiente:

pH

Tiempo(Minutos)

Micromoles de Dopacrome

Velocidad (Micromoles /min)

3.6 4.2 4.8 5.4 6.0 6.6 7.2 7.8

Grafique pH (Eje X ) versus Velocidad (Eje Y)

CAPITULO VI ACIDOS NUCLEICOS Y DIVISIN CELULAR PRACTICA 13 AISLAMIENTO DE DNA

INTRODUCCION Durante las practicas de la Biologa Celular, es interesante, conocer una de las fascinantes molculas biolgicas, en la cual esta escrita toda la historia, el origen y el mecanismo de accin del material gentico de cualquier organismo viviente: El ADN. Esta llamada, la molcula de la vida tiene encriptada una gran cantidad de informacin que de manera jerrquica, direcciona todo el ambiente celular. El ADN, tiene entonces la responsabilidad de dirigir la replicacin, la transcripcin, la traduccin, la recombinacin y la posibilidad de la variabilidad gentica. As mismo, tiene la informacin para que la clula se divida, interactue con otras clulas de su entorno, y hasta para su desaparicin, ya que tambin lleva encriptado un mecanismo de apoptosis (muerte celular programada). En la presente practica, se pretende que el estudiante aprenda mediante un protocolo sencillo, el aislamiento de esta molecula, y conozca algunas propiedades quimicas de la misma.

OBJETIVOS 1. Se reforzara en el estudiante los conocimientos acerca de la molecula de la vida: el ADN. 2. Se entrenara al estudiante al aislamiento del ADN 3. Se crearan destrezas en el estudiante para la manipulacion del ADN, de los reactivos y equipos utilizados en el procedimiento de aislamiento

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MATERIALES Y REACTIVOS Agua desionizada MgCl2 (5 mM) Tris-HCl (pH 7.5, 10 mM) Sucrosa Triton X-100 Na-EDTA (1M) NaCl (6M) NaOH Perclorato de sodio SDS (20%) Isopropanol Buffer TE (pH 7.5)

Material Fungible: Tips adaptables Tubos eppendorff nuevos y estriles de 1.5 mls. Pipetas pasteur Jeringas esteriles Tubos para toma de muestra de sangre con EDTA (Becton Dickson/Tapa morada) de 10 mls Tubos para centrifuga Corning de 15 mls nuevos y estriles

Para la preparacin de los Buffer I y II: Frascos estriles de vidrio de capacidad de 100 ml y 500, ml. Pipetas de vidrio de 10 ml, 5 y 1 ml. Probetas de vidrio de 1000 ml, 500 ml, 100 ml

Equipos: Microcentrifuga Centrifuga (Hasta 4000 RPM a temperatura ambiente) Vortex Incubadora a 37 C

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PROCEDIMIENTO Lea primero cuidadosamente la guia, y elabore un diagrama de flujo, el cual deber entregar al final del Laboratorio. Se tomaran muestras de sangre con las jeringas estriles de los estudiantes para que por grupos aslen una muestra de ADN. El estudiante proceder al aislamiento del ADN, siguiendo los siguientes pasos: a) Tomar 0.5 ml (500 ul) de sangre y se deposita en un tubo eppendorff nuevo. b) Nota: Si la sangre no se va a aislar inmediatamente, es mejor gurdarla en los tubos con EDTA de tapa morada. c) Se adiciona a este tubo, 1000 ul de Buffer de Lisis I, y se mezcla suavemente el tubo dando pequeos golpes con el dedo. d) Se centrifuga a 3.500 RPM a temperatura ambiente en una microcentrifuga por 6 minutos. e) Descartar el sobrenadante, por inversion rapida del tubo. f) Resuspender en 60 ul de Buffer de Lisis II, 30 ul de perclorato de sodio y 2 ul de SDS (20%). Mezclar suavemente con micropipeta. g) Dar un pulso de vortex durante 10 segundos. h) Adicionar 30 ul de NaCl (6M) i) Repita el pulso de vortex durante 15 segundos. j) Centrifugar a 2800 RPM durante 6 minutos. k) Traspasar el sobrenadante a otro tubo eppenforff limpio y nuevo. Adicionar a este, 100 ul de isopropanol. l) Mezclar por inversion, suave. Observe lo que pasa. Debe observarse un hilo de apariencia gruesa y viscosa. m) Recoja el ADN con una punta nueva. Lave un poco el ADN con etanol. Para este proceso, adicione 1 ml de etanol con mucho cuidado. n) Gurdelo en 200 ul de Buffer TE (pH 7.5) precalentado a 70 C. o) Diluir y guardar a 4 C.

BUFFER DE LISIS I: Adicione a 800 ml de agua desionizada, contenida en una probeta de 1000 ml (tambien puede adicionarse agua miliqure o grado molecular), 5 ml de MgCl2 (5 mM), 10 ml de Tris-HCl (pH 7.5, 10 mM), 102,59 gr de sucrosa y mezcle cuidadosamente todos estos reactivos por resuspension con pipeta. Adicione 10 ml de Triton X-100 al 1% y posteriormente, se lleva hasta a 1 Litro.

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Alicuote en volmenes pequeos Rotule cada frasco con el nombre de la persona que preparo la solucin, la fecha de preparacin, enumere cada frasco (esto con el fin de saber la cantidad disponible para cada grupo de trabajo) Almacenar en frasco oscuro y a 4 C.

BUFFER DE LISIS II: Adicione 800 ml de agua desionizada, contenida en una probeta de 1000 ml (tambien puede adicionarse agua miliqure o grado molecular), 24 ml de Na-EDTA (1M) y 12.4 ml de NaCl (6M). Calibrar la solucin a un pH de 8.0 con NaOH. Para este procedimiento, caliente la solucin a 50oC. Lleve el volumen hasta 1 Litro. Alicuote en volmenes pequeos. Rotule cada frasco con el nombre de la persona que preparo la solucin, la fecha de preparacin, enumere cada frasco (esto con el fin de saber la cantidad disponible para cada grupo de trabajo) Almacenar a temperatura ambiente

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PRACTICA 15 MODELAMIENTO DE MOLECULAS BIOLGICAS

INTRODUCCION Durante las ultimas dcadas, los investigadores de todo el mundo, se han dedicado a la tarea ardua del entendimiento de los mecanismos biolgicos que determinan todas las actividades de los seres vivientes. En este proceso, se han dilucidado interesantes interrogantes acerca de la Replicacin, la transcripcin, la traduccin, y la regulacin de los genes, entre todos los muchos procesos, adems de las estructuras de los genes eucariotes y procariotes. Para el abordaje del entendimiento de estos mecanismos, se han usado diversas estrategias tales como el cultivo In vitro, la tecnologa del DNA-recombinante, la PCR (amplificacin de gene), la secuencia y la clonacin gentica, entre otros. Para su entendimiento, se han realizado adems diferentes tipos de modelamientos, desde los de figuras tridimensionales hasta los virtuales hechos en computadores. Todos ellos han propiciado un mayor entendimiento de las propiedades que subyacen en las molculas de DNA, y sus interacciones con protenas, cofactores, iones y otras sustancias interactuantes. Esto tambin ha permitido el entendimiento de los procesos anormales que suceden cuando el DNA es alterado y conlleva a estados patolgicos o enfermedades.

OBJETIVOS 1. Reforzar en el estudiante la estructura del DNA y los procesos biolgicos funcionales encriptados en ella. 2. Motivar al estudiante al modelamiento de los mecanismos moleculares y estructurales del DNA 3. Estimular al estudiante la creatividad para elaborar modelos biolgicos. 4. Estimular el pensamiento espacial del estudiante y la visin tridimensional de las estructuras y los procesos biolgicos.

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MATERIALES El estudiante podr usar cualquier tipo de material que le permita el modelo estructural y funcional que le corresponda. Podr usar materiales como: Alambre Madera Plstico Icopor Maquinarias elctricas pequeas Cables Cordeles Bistur Pegantes Colores o colorantes, etc.

PROCEDIMIENTO El estudiante elegir uno de los 5 temas propuestos: a) b) c) d) e) Replicacin del DNA Transcripcin del DNA Traduccin del DNA Gen Procariota Gen Eucariota

El estudiante conformara un grupo de 5 personas para elaborar su modelo Los estudiantes presentaran un informe escrito detallado de la elaboracin de su modelo: Materiales usados, modo de identificacin de los componentes de las estructuras, Los estudiantes presentaran una sustentacin de su modelo para su evaluacin ante el profesor de la materia.

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PRACTICA 16 MITOSIS

INTRODUCCION

El ciclo celular es uno de los fascinantes procesos que llevan a la divisin celular y a la generacin de dos nuevas clulas, nuevos organismos genticamente idnticos a su progenitor. Se produce en cualquier tipo de clula eucariote, ya sea diploide o haploide Algunas clulas no realizan mitosis y permanecen en un estado interfsico pero otras la realizan frecuentemente (clulas embrionarias, clulas de zona de crecimiento y clulas de tejido sujetas a desgaste). Estas, que integran la mayor parte de los tejidos de un organismo sufren un proceso de renovacin debido a la continua multiplicacin y muerte celular. La divisin celular se observa en un proceso llamado MITOSIS, durante el cual, la clula madre se divide en dos. Este proceso consiste en la duplicacin de los cromosomas y la distribucin equitativo de este material gentico en las clulas hijas. Este proceso de divisin celular se lleva a cabo mediante mecanismos precisos, los cuales ocurren dentro de una fases llamadas fase G1, S, G2 y M (Mitosis). En cada fase suceden de manera general los siguientes acontecimientos: Fase G1: En esta fase, se sensan los factores nutricionales y ambientales para seguir el curso del ciclo celular. Fase S: La clula duplica su DNA Fase G2: En esta fase se sensa nuevamente el ciclo celular, en esta se sensa si los cromosomas tienen el tamao adecuado, si el huso mittico esta listo, y si los factores nutricionales y ambientales siguen favorables para continuar con la siguiente etapa del ciclo celular. Fase de Mitosis: En esta fase la clula pasan por diferentes etapas: Profase, Metafase, Anafase, Telofase, en donde los cromosomas se condensan con sus homlogos, se alinean en el plano ecuatorial, se separan y se dirigen hacia los polos celulares para formar dos nuevos ncleos y luego dividir el citoplasma en una etapa final muy brve llamada citocinesis.

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Profase: En esta, la cromatina se condensa para formar los cromosomas y los dos centriolos migran a polos opuestos organizando un sistema de microtubulos (Aparato Mitotico), para permitir la migracin de los cromosomas. El Aparato Mitotico esta constituido por: Centriolos: Estn rodeados por el centrosoma. A medida que cada centriolo migra produce otro y cuando llega al polo se ven dos. Asteres: Conjunto de microtubulos cortos que se extienden desde cada centriolo. Huso Acromatico: Tiene forma ovoide y formado por muchos microtubulos sin ramificaciones.

Cada cromosoma esta constituido por dos cromatidas unidas por el centromero. L a envoltura nuclear se desorganiza y sus fragmentos no se distinguen del retculo endoplasmatico. Desaparece el nucleolo. Prometafase: Los cromosomas Los cromosomas condensados migran hacia la placa ecuatorial del huso acromatico. Metafase: Los cromosomas se alinean en el plano ecuatorial, y cada uno esta unido por su centromero a una fibra del huso acromatico. Anafase: Las dos cromatidas de cada cromosoma se separan por fisin del centromero y se dirigen hacia polos opuestos. El movimiento de los cromosomas hijos hacia los polos se debe a un acortamiento de las fibras cromosomicas y se alargan las fibras interzonales. Telofase: El huso mitotico y los asteres se desorganizan. Alrededor de cada grupo cromosomico se organiza una envoltura nuclear a partir del retculo endoplasmatico y de la envoltura original. Los cromosomas se dispersan y retoman el aspecto de cromatina que tenan antes de inciciarse la divisin. Los nucleolos reaparecen a partir de sus organizadores nucleolares.

OBJETIVOS 1. Enfatizar en el estudiante los conceptos de los mecanismos de la divisin celular. 2. Distinguir las diferentes etapas de la fase M del ciclo celular. 3. Adquirir destreza en el montaje de tejidos vegetales meristematicos que se encuentran en divisin celular.

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MATERIALES Microscopio Cuchillas Papel absorbente Palillos de madera Porta y cubre objetos Mechero de alcohol Crisol Bulbo de cebolla (Allium cepa) Colorante acetorceina (orceina acetica) al 20%

PROCEDIMIENTO Coloque a un bulbo de cebolla fresco a germinar en un recipiente plstico, de manera tal que la parte radical quede inmersa en el agua para permitir que se formen nuevas races. Deje durante tres das en un sitio fresco. Observe el montaje del grafico.

Corte con una cuchilla, varias races que hayan germinado y tengan una longitud de tres milmetros desde el pice (zona que incluye el meristemo), y se colocan en un vidrio de reloj que contiene el colorante acetorceina al 20%.

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Con unas pinzas espatuladas se toma el vidrio de reloj que contiene la orceina y las races sumergidos, y se somete a calentamiento usando un mechero de alcohol hasta que se produce la salida de vapores. Se deja enfriar un poco (durante 1 minuto aproximadamente). Se repite dos veces ms el calentamiento y enfriamiento anterior.

Se extrae cada raz colocndola con unas pinzas en un portaobjetos, se coloca en un porta y se le pone una gota de orceina. Se cubre con un cubreobjetos.

Mediante la punta de un palillo de dientes, se presiona suavemente sobre el cubreobjetos en la zona donde se encuentra el meristemo y mediante golpes repetidos se va extendiendo el material radical.

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Despus del barrido hecho, se monta la muestra al microscopio y se observa con un aumento de 40X las diferentes fases mitticas. Los anlisis de los resultados se realizaran de acuerdo a los siguientes: A. Realice el conteo de 10 campos y use el siguiente cuadro para cada uno de sus anlisis:

Fases / Campos Interfase Profase Metafase Anafase Telofase TOTAL

10

B. Determine para cada campo. Grafique 1.

# clulas en divin # clulas totales # clulas en cada fase # clulas totales # clulas en cada fase # clulas divisin

2.

4.

C. Determine para todo el anlisis hecho (todos los campos):

# total de clulas en divisin # total de clulas (todos los campos)

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BIBLIOGRAFIA Smith y Wood. Biologa Molecular y Biotecnologa. Editorial Addison-Wesley Iberoamericana, 1988. Maniatis L. et al. Molecular Cloning I & II, Academic Press. 1999. Lewin, B. Genes VI, Oxford University Press. Oxford, New York, 1997 Kendrew, J, The Encyplopedia of Molecular Biology. Blackwell Science, Oxford, 1995 Watson, J.D. La Doble Helice. Biblioteca Cientifica. Salvat, Barcelona, 1987 Ridley, M. 2001. Genoma. Punto de Lectura. Grupo Santillana de Ediciones S.A., 2001 Geneser, Finn. Histologia. Editorial Panamericana. Buenos Aires 1997. 101-122. Junqueira, L.C. y Carneiro, J. Histologia Basica. Salvat Editores. 1998 Gerald, Karp. Biologia Celular. Editorial Sinclair. 1997

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