Leonel Enrique Rojas Alvarenga Estudiante de segundo ao 2012

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AGRADECIMIENTOS Gracias a Dios sobre todo por haber permitido culminar con xito esta capacitacin que aument en gran medida mi conocimiento, y por supuesto la experiencia adquirida. Agradecimiento a la institucin de Procafe por brindarme la oportunidad de aprender este proceso tan valioso para el crecimiento personal y para el mejoramiento de la agricultura en el pas. Agradecimiento especial al Dr. Adn Hernndez por todo el apoyo brindado en el proceso de aprendizaje del mtodo de reproduccin de hongos e2ntomopatgenos. Especial agradecimiento a la Sr. Sonia Rojas y al Sr. Elas Rojas por tomarse el tiempo y la molestia de ensearme paso a paso y con toda paciencia todo acerca de este importantsimo tema, y a Juancito, que con su sonrisa alegraba mas cada da que estuve en la Finca San Antonio. Sobre todo quiero agradecer al que hizo posible todo esto, despus de Dios, el Ing. Andrs Garca por tomarme en cuenta para llevar a cabo tan importante proyecto, por proporcionar sin esperar nada a cambio los medios necesarios para que asistiera cada da a aprender y a aumentar mi conocimiento en la Finca San Antonio.

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INDICE

INTRODUCCIN.. 4 1. AISLAMIENTO ..5 a. Preparacin de medio cultivo5 b. Recoleccin de insectos patogenicidad....6 c. Aislamiento de .7 o reactivacin de

de

cepa.

2. MULTIPLICACIN............................... ................8 a. Repique. .8 b. Preparacin de medio liquido para la inoculacin de bolsas con arroz......9 c. Inoculacin de bolsas........................................................................................ .10 3. PRODUCCIN............................................................................... ..............................10 a. Proceso de secado, almacenado..10 empacado y

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INTRODUCCION

La reproduccin de hongos entomopatgenos en laboratorio se da con la necesidad de encontrar medios alternativos para el combate el de plagas denominndose de reproduccin estos, de medios hongos biolgicos de control de plagas. En el presente trabajo se explica proceso e4entomopatgenos en general, pero sin perder de vista el objetivo principal que es la reproduccin de Beauveria brongniartii para el combate del picudo del pltano en la Escuela Nacional de Agricultura. Esta iniciativa nace de la idea de fomentar una agricultura independiente y natural u orgnica en la ENA, lo cual en coordinacin con la institucin de Procafe surge el desarrollo de una capacitacin para documentar y proporcionar un gua
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que sirva para la enseanza de los estudiantes, ya que es necesario fomentar otras tcnicas y alternativas de produccin agrcola con enfoque en la sostenibilidad y la salud; y dejar a un lado la tonta escuela del padre de la revolucin verde el Dr. Norman Borlaug.

1. AISLAMIENTO El aislamiento es el proceso mediante el cual a partir, de un insecto infestado con el hongo, generando las condiciones adecuadas, se induce al crecimiento del mismo, para obtener un inoculo apto para la reproduccin. Esta etapa del proceso consta de tres partes importantes que son la elaboracin de medios de cultivo, la reactivacin de patogenicidad y el aislamiento de sepas. a. Elaboracin de medio de cultivo P.D.A. Esta fase del proceso se lleva a cabo con el fin de generar las condiciones ideales para la reproduccin del hongo en cuanto a sostn y nutricin, para lo que se utilizan los siguientes materiales y utensilios: 40 gr de P.D.A. 1 litro de agua destilada matraces erlenmeyer Y una bascula para gramos Un agitador magntico Cajas petri Autoclave Algodn Plstico termoaislante Escuela Nacional de Agricultura Roberto QuionezPgina 5

 Papel aluminio Cmara de refrigeracin Cmara de flujo laminar Procedimiento Medir y pesar los ingredientes de la mezcla, cabe mencionar que esto puedo hacerse en menor cantidad teniendo en cuenta la proporcionalidad de los materiales mezclados y sabiendo que se usan 20 ml de la mezcla para una caja petri de 10 centmetros. Teniendo esto. Tener a la mano todos los instrumentos a utilizar para no retrasar el proceso. Colocar el un matraz erlenmeyer el agua destilada y el P.D.A. Poner el matraz con la mezcla en el agitador magntico; agitar y calentar a 200C hasta que comience a hervir. Sacar el matraz con cuidado y taparlo con algodn, plstico termoaislante y cubrir el tapn con papel aluminio. Colocar las cajas petri y el matraz con la mezcla en el autoclave y esterilizar con 15 lbs. de presin a 120C durante 15 minutos. (hacer ingresar la presin poco a poco para evitar que se destape el contenedor del lquido, sacar la presin de la misma manera). Retirar los utensilios esterilizados del autoclave y dejar que se enfren durante media hora. En la cmara de flujo laminar, encender dos mecheros bunsen en direccin de donde se est realizando la preparacin del medio de cultivo. Se destapa el matraz y se le agregan 3 gotas de acido lctico a la mezcla para acidificar el medio y evitar la proliferacin de bacterias. Llenar las cajas petri esterilizadas hasta la tercera parte con la mezcla, teniendo el cuidado de no abrirlas demasiado para que no se contaminen, se pone a todo el contorno de la caja petri plstico termoaislante para sellarlas. Guardarlas en cuarto frio a 10C hasta utilizarlas. b. Reactivacin de patogenicidad La reactivacin de patogenicidad es la infestacin manual o artificial del insecto con el hongo entomopatogeno para poder aislar la cepa, esto se hace cuando en el campo no se encuentran insectos infectados para el aislamiento; en este proceso simple pero importante se utiliza lo siguiente: Escuela Nacional de Agricultura Roberto QuionezPgina 6

 Insectos vivos Tubos de ensayo Beakers de 500 ml y de 200 ml Papel filtro Agua destilada Caja petri con repique del hongo o arroz inoculado con hongo Plstico termoaislante Jeringa Pinzas o pincel Colador fino Hazas

Procedimiento Cortar ruedas de papel filtro del tamao del interior de los tubos de ensayo, esto se hace tomando en tubo de ensayo y marcando el contorno de este en el papel filtro, luego introducir una de estas ruedas en cada tubo de ensayo. Poner agua destilada en los beakers, 200 ml en el de 500 ml y 100 ml en el de 200 ml. Tomar la caja petri con el repique del hongo y con una haza soltarlo todo y colocarlo en los 100 ml de agua destilada, o tomar el arroz inoculado con hongo y ponerlo en una malla fina y sumergirlo en el agua destilada para separar las esporas del hongo del arroz. Hacer pasar los insectos por los 200 ml de agua destilada para limpiarlos por un minuto, moverlos con las pinzas o con el pincel para que se mojen completamente y colarlos. Hacerlos pasar los insectos por la solucin de agua destilada y hongo por un minuto, moverlos al igual que el paso anterior. Tomar con el pincel o con las pinzas los insectos que aun estn vivos debido a que algunos mueren en el proceso, colocar uno en cada tubo de ensayo y para asegurarse de que vaya infectado con el hongo se hacen pasar por el hongo que ha quedado en el colador, esto antes de colocar el insecto dentro del tubo de ensayo. Se sella en tuvo con plstico termoaislante. Con una jeringa se le agregan dos gotas de agua destilada a cada insecto ya en los tubos de ensayo, esto debe hacerse todos los das durante 15 das o hasta que el hongo emerja del insecto. Llevarla la gradilla con los tubos de ensayo al cuarto de crecimiento durante 15 das aproximadamente.

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c. Aislamiento de cepas El aislamiento de cepas, se hace a partir de una fraccin del hongo propiamente o como es ms comn de un insecto parasitado con el hongo, esto con el objetivo de obtener un inoculo adecuado para reproducirlo a mayor escala en una base de arroz, en este proceso se utilizan los siguientes materiales y utensilios: Alcohol 90 Agua destilada y esterilizada Cajas petri con medio de P.D.A. Cmara de flujo laminar Hazas Mecheros Plstico termoaislante Insectos infectados con el hongo Un cronometro Procedimiento Colocar todos los insectos en una caja petri y llevarlos a la cmara de flujo laminar. En la cmara de flujo laminar, encender dos mecheros en direccin de donde vamos a trabajar y colocar tambin tres tapaderas de caja petri, una con agua destilada y esterilizada, una con alcohol, otra con agua destilada y esterilizada, y un trozo de papel toalla para secar los insectos; debe ser precisamente en este orden. Pasar los insectos, uno por uno, en el agua destilada-esterilizada durante un minuto exacto, mover con las hazas para que se moje completamente; luego por el alcohol medio minuto exactamente, mover con las hazas para mojarlo bien; despus por la otra agua destiladaesterilizada un minuto exactamente, mover con las hazas para mojarlo bien y por ultimo poner un minuto en el papel toalla para secarlo y moverlo para que se seque completamente. Cuando falten 15 segundos para que se termine el minuto de secado, quitarle el plstico a la caja petri y flamearla. Tomar el insecto con las pinzas cuidando de no aplastarlo y colocarlo en el centro de la caja petri. Cerrarla, flamearla y sellarla con plstico termoaislante. Llevar los aislamientos al cuarto de crecimiento.

2. MULTIPLICACIN Escuela Nacional de Agricultura Roberto QuionezPgina 8

La multiplicacin es el proceso de reproduccin de hongos entomopatogenos de forma masiva como produccin comercial. Esta parte del proceso de produccin lleva consigo tres etapas que son: el repique, la preparacin de medio lquido de papa para la inoculacin de las bolsas con arroz y la inoculacin de las bolsas. a. Repique El repique no es ms que tomar una parte del hongo obtenido en una caja petri a travs de un aislamiento y colocarlo en una nueva caja petri con medio de cultivo para que este se reproduzca y crezca para poder tener un inoculo puro del hongo entomopatogeno, para este proceso se necesita: Cmara de flujo laminar Caja petri con el hongo (aislamiento) Cajas petri o tubos de ensayo con medio de cultivo Hazas Mecheros Plstico termoaislante Algodn Procedimiento En la cmara de flujo laminar, encender los mecheros en direccin de donde se va a trabajar. Abrir la caja petri del aislamiento y flamearla. Con las hazas raspar el hongo sin tomar medio de cultivo, tomar aproximadamente un gramo de este y colocarlo en una caja petri o tubo de ensayo que solo contenga en medio de cultivo, procurando que la porcin de hongo quede en el centro del utensilio. Flamear la caja petri y sellarla con plstico termoaislante. En caso de que sea tubo de ensayo de colocarse el tapn de algodn y poner alrededor de este, no sobre este, plstico termoaislante.

b. Preparacin de medio liquido para inoculacin de bolsas con arroz La preparacin de este medio de cultivo lquido es parte importante del proceso de multiplicacin del hongo entomopatogeno, se hace con el fin de obtener una inoculacin uniforme de las bolsas que contienen el arroz que posteriormente se va a comercializar. En este proceso se utiliza lo siguiente:

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 Preparacin

Una papa pequea 5 gr de azcar Cocina o estufa Agua destilada Autoclave Erlenmeyer Caja petri con repique del hongo Agitador magntico Hazas Colador Olla Cmara de flujo laminar Acido lctico

Lavar y picar la papa en cuadros pequeos. Cocer la papa en la estufa, en una olla pequea con agua destilada suficiente para cubrir la papa. Cuando estn blandita se debe colar, luego triturar la papa hasta hacer un pur fino, y luego colar el pur utilizando la misma agua en la que se cocieron las papas, esto hasta mezclar el pur con el agua, agregar la azcar y hacer llegar la mezcla a 250 ml con agua destilada si es que falta. Colocar la mescla en un erlenmeyer, ponerle tapn de algodn, plstico termoaislante y papel aluminio y llevar al autoclave por 15 minutos a 120C y 15 lbs. de presin. Dejar que enfri totalmente. En la cmara de flujo laminar agregarle una gota de acido lctico. Colocar la mezcla en el agitador magntico a 200 RPM siempre en la cmara de flujo laminar y con el haza separar un cuarto del hongo de la caja petri y agregarlo a la mezcla. Llevar la preparacin al cuarto de crecimiento y colocarlo en el agitador magntico durante dos das. Esto es muy importante, la mezcla debe pasar dos das en constante agitacin en el cuarto de crecimiento. Despus de los dos das mirar por el microscopio una muestra de la mezcla y observar si esta tiene esporas de hongo o solo micelio, si no muestra esporas no sirve para la inoculacin igual si se ven otro tipo de esporas o de micelio que no son las del hongo en reproduccin esta mezcla no sirve y se debe votar. c. Inoculacin de bolsas

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La inoculacin de las bolsas es el proceso final de la multiplicacin, es en este paso que se prepara el arroz que posteriormente se va a comercializar, para esto se utiliza lo siguiente: Arroz blanco no precocido Bolsas de polipropileno Medio liquido de papa para la inoculacin Engrapadora Autoclave Dispensador Agua destilada y esterilizada Preparacin Llenar las bolsas de polipropileno con 300 gr de arroz. Agregar 90 ml de agua a las bolsas y moverlo hasta mezclar bien el agua con el arroz. Hacer tres dobleces en la parte superior de la bolsa y poner dos grapas una en el centro y la otra en un extremo, el otro extremo debe quedar libre para inocular posteriormente. Llevar las bolsas al autoclave durante 15 minutos a 120C con 15 lbs. de presin. Sacar las bolsas del autoclave y dejarlas enfriar totalmente. Colocar la mezcla liquida de papa para inoculacin en el dispensador En la cmara de flujo laminar, con el dispensador colocar 20 ml de la mezcla en cada bolsa y sellar el extremo que estaba abierto con una grapa. Mover el arroz para mezclarlo uniformemente con el inoculo. Llevar al cuarto de crecimiento y dejar reposar las bolsas durante 10 das sin moverlas. El arroz dentro de las bolsas debe de quedar extendido y no compactado.

3. PRODUCCIN La produccin es el proceso final de la produccin de hongos entomopatogenos en la que se cosecha el hongo, se seca y se empaca. a. Proceso de secado, empacado y almacenado En este proceso se prepara el arroz para su comercializacin y para esto se utiliza lo siguiente: Zarandas Recipiente para embolsar Bascula de gramos Escuela Nacional de Agricultura Roberto QuionezPgina 11

 Procedimiento

Bolsas de empaque termoaislante

Sacar las bolsas con arroz del cuarto de crecimiento despus de los 10 das, solo si en estas el hongo se ha reproducido totalmente es decir el arroz debe estar cubierto de hongo. Sacar el arroz de las bolsas y colocarlo en las zarandas en un cuarto de secado con aireacin natural o aire acondicionado. Dejar el arroz secando durante 10 das Sacarlo de la zaranda y con el recipiente tomar un poco, colocarlo en la bscula y medir 1000 gr de arroz o una libra o la cantidad que se quiera colocar en cada bolsa. Empacarlo, sellarlo ya sea con una selladora al vacio, o con tres dobleces en la parte superior y tres grapas. Llevar las bolsas empacadas al cuarto de almacenamiento y guardarlo ah hasta su comercializacin o utilizacin.

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ANEXOS

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