BAGIAN DARI PLASMID PET-41a(+)

Oleh Albert Santoso, Ines Hariyani, Linarty, dan Putra Perwira Pratama

TEKNOLOGI BIOPROSES UNIVERSITAS INDONESIA 2012

Ori dari pBR322.

Ori adalah sebuah sekuens DNA di mana replikasi dimulai. Ori menentukan jumlah kopian vektor yang biasanya berjumlah antara 25-50 kopian per sel jika vektor yang digunakan berasal dari plasmid dengan kemampuan pengkopian yang rendah seperti pBR322 atau antara 150-200 kopian per sel jika vektor yang digunakan berasal dari plasmid dengan kemampuan pengkopian yang tinggi seperti pUC. Ori juga menentukan kompatibilitas plasmid yaitu kemampuan vektor untuk bereplikasi saat sedang bekonjungasi dengan plasmid lain di dalam sel bakteri yang sama. Plasmid biasa mempunyai genetik marker yang sedikit, padahal plasmid tersebut memiliki banyak situs yang bisa dipotong oleh banyak enzim, akibatnya banyak bagian DNA yang terpotong (tidak selektif). Oleh karena itu dibutuhkan pBR322 origin agar pemotongan lebih selektif. Kelebihan pBR322 origin adalah telah ter-sequence sehingga bisa dikenali dengan GAATTC, serta bisa dimodifikasi dengan insersi basa CG pada posisi 526 agar ukuran plasmid dapat mengakomodasi DNA. Selain itu, pBR322 origin juga dapat menggukur panjang fragmen DNA.
Tabel 1. Ori yang Sering Digunakan

Sumber : http://wolfson.huji.ac.il/expression/vector/origin.html#comp

MCS(Multiple Cloning Site)

Disebut juga poli-linker. Dia muncul sebagai penyederhanaan dari modifikasi terhadap plasmid. Modifikasi yang dilakukan berupa insersi dari situs restriksi dan marker. MCS adalah sekuen DNA uang pendek 2,8 kb umumnya, yang membawa situs dari berbagai enzim restriksi endonuklease yang berbeda-beda. MCS akan meningkatkan jumlah strategi kloning yang potensial, sebab ia dapat menambah jumlah variasi enzim yang dapat digunakan untuk menghasilkan fragmen restriksi yang cocok. Kelebihan, jika suatu plasmid ditambah MCS dapat terpotong secara langsung tanpa merusak vektornya. MCS ini dimasukkan dimasukkan

ke dalam sekuen LacZ, sehingga menghasilkan promotor dan -peptida dari galaktosidase-. Tujuannya, supaya rekombinan ini lebih mudah dideteksi dengan screening biru-putih.

LacI coding sequence

LacI adl bentuk mutan dari gen represor lac yang menyebabkan peningkatan level represor dan memungkinkan kontrol yg lebih besar terhadap gen lacZ. Hal ini penting untuk replikasi dengan jumlah yang sangat tinggi, dimana tanpa lacI represor mungkin tertitrasi dan menyebabkan transkripsi yang tidak dapat dikontrol.

Kan coding sequence

Kan coding sequence merupakan salah satu tempat di dalam plasmid dimana enzim restriksi endonuklease akan memotong bagian tersebut untuk kemudia disisipi fragmen DNA yang disambung menggunakan enzim ligase. Bakteri yang disisipi oleh DNA ini akan resisten dengan antibiotik bernama kanamycin.

Gambar 1 Sruktur Kanamycin Sumber : chemistry.about.com

F1 origin

F1 origin adalah daerah origin untuk memasukan DNAberbentuk filamen (DNA single strand). Alasan penggunaan DNA single strand: 1. Dapat dipurifikasi serupa dengan double strand dan dapat dimanipulasi seperti plasmid secara in vitro. 2. Bisa membuat host mengeluarkan suatu plaque. 3. Tidak ada packaging constrain.

Cara melakukannya DNA diinsersi di bagian ori secara blunt end dengan menhubungi lac regulatory -peptida dengan -galakto.Hal ini bertujuan mempermudah deteksi rekombinan. T7 Promoter dan Terminator

Karena persaingan terjadi di antara situs promotor yang berbeda pada template dan karena situs-situs tersebut dapat berbeda secara fungsional, perubahan kecil dalam kondisi reaksi atau dalam struktur RNA polimerase dapat menyebabkan perubahan signifikan dalam tingkat pemanfaatan situs promotor yang berbeda bahkan ketika promotor tersebut situs berbagi elemen umum. Promotor dan terminator T7 dimanfaatkan secara efisien oleh seperti berbagai polimerase RNA karena masing-masing promotor T7 beberapa memiliki sifat unik yang mengatur penggunaannya oleh polimerase RNA.

N Terminal GST Tag

Glutathione S-Transferase (GST) bertujuan untuk pemurnian, terutama untuk assay aktivitas biokimia dari rekombinan. Cara assay biasanya menggunakan plate piringan dengan open reading frame. Biasa dikontrol menggunakan CUP1 promoter. Plasmid ditambahkan dengan glutathione yang diimobilisasi kemudian dipurifikasi, diperoleh GST yang menempel pada glutathione. Untuk melepasnya digunakan protease sehingga diperoleh plasmid murni.

C Terminal His Tag

Tag adalah daerah yang bisa ditambahkan suatu sequence asam amino dengan tujuan mempermudah pemurnian dan assay (analisis). Pemurnian menggunakan kromatografi berbasis afinitas/kesukaan untuk membentuk ikatan. His taq adalah taq untuk polihistidin, biasanya terdapat 6 residu histidin yang dimasukan ke dalam situs proteolik taq. Ketika plasmid ditambahkan dengan histidin kemudian dipurifikasi, polihistidin akan menempel dengan bivalen nikel yang imobilisasi. Untuk melepasnya digunakan entrokinase yang

berfungsi untuk memotong taq sehingga plasmid terlepas dan diperoleh plamid murni.

S Tag

S-tag merupakan fusion-peptide tag yang dapat digunakan untuk analisis protein berdasarkan rekonstruksi dari aktivitas ribonukleotida. Ptotein yang ditagged bisa diikat di matriks S-tag. S-tag dikomposisi oleh empat kation, tiga kation, tiga molekul polar yang tidak bermuatan, lima ion residu yang non polar. Komposisi diatas membuat S-tag bersifat soluble.