MICROPROPAGACIN IN VITRO DE CORONAS DE BRMELIAS (Ananas comosus) Diana Milena Alzate, Sandra Liliana Cardona, Mnica Alexandra Valencia

RESUMEN En esta prctica de laboratorio se llevaron a cabo las primeras etapas de la micropropagacin de una especie vegetal como la pia (Ananas comosus), seleccionando la planta madre y extrayendo de ella los meristemos para su posterior desinfeccin y establecimiento en un medio de cultivo adecuado, el cual se preparo y esterilizo con anterioridad para dicho fin, a pesar de que se formaron varios brotes o embriones, estos en su mayora estuvieron contaminados por causas que se discutirn ms adelante. Palabras clave: micropropagacin, cultivo in vitro, material vegetal sano.

INTRODUCCIN El cultivo in vitro es Conjunto de tcnicas que permiten el cultivo en condiciones aspticas de rganos, tejidos, clulas y protoplastos, empleando medios de cultivo artificiales. Dentro de la biotecnologa es la tcnica que mayor aporte prctico ha brindado. Los orgenes del cultivo de tejidos se remonta a 1898 con los intentos realizados por Haberlandt de cultivar clulas aisladas de plantas, quien postulo el principio de la totipotencialidad celular, que es la base terica donde se

sustentar todas las tcnicas del cultivo in vitro. A partir de los avances alcanzados en la regeneracin de plantas in vitro se ha desarrollado toda industria de micro propagacin que se inicio en los pases desarrollados de Europa y Norteamrica, que en la actualidad se ha extendido al resto del mundo, incluyendo pases de Amrica Latina, Asia y frica. Esta industria est compuesta por cerca de 600 compaas en el mundo, con una produccin de ms de 500 millones de vitroplantas por ao.

Las clulas vegetales pueden cultivarse en forma aislada de las plantas intactas en los sistemas de cultivo de tejidos. Las clulas tienen las caractersticas de las clulas de callo, en lugar de otros tipos de clulas vegetales. Estas son las clulas que aparecen en las superficies de corte cuando una planta es herida y que gradualmente cubrir y sellar el rea daada. Las muestras de tejido vegetal poco a poco se dividen y crecen en una masa de clulas incoloras si se mantienen en condiciones especiales. Estos son: iniciado desde el tejido de la planta ms adecuada para la variedad de planta particular presencia de una alta concentracin de auxina y citoquinina, reguladores de crecimiento en un medio de crecimiento que contiene compuestos orgnicos e inorgnicos para mantener las clulas condiciones aspticas durante el cultivo de excluir la competencia de los microorganismos Las clulas vegetales pueden crecer sobre una superficie slida como friables, de color marrn plido bultos (llamados callo), o grupos como individuales o pequeas de clulas en un medio lquido llamado un cultivo en suspensin. Estas clulas se pueden mantener indefinidamente siempre que se subcultivan regularmente en medio de crecimiento nuevo.

Cultivos de tejidos vegetales se pueden iniciar desde casi cualquier parte de una planta. El estado fisiolgico de la planta tiene una influencia sobre su respuesta a los intentos de iniciar el cultivo de tejidos. La planta madre debe estar sana y libre de signos evidentes de enfermedad o decaimiento. La fuente, denominado explante, puede ser dictado por el motivo para llevar a cabo el cultivo de tejidos. Younger tejido que contiene una mayor proporcin de clulas que se dividen activamente y es ms sensible a un programa de iniciacin de callo. Las plantas deben estar en crecimiento activo, y no va a entrar en un perodo de latencia. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En Colombia la pia forma parte importante de la dieta de la poblacin, debido a sus propiedades organolpticas y caractersticas nutritivas acrecentando su demanda de consumo preferiblemente fresca, aunque tambin procesada en mermeladas, ensaladas, etc. Tradicionalmente ha existido un desequilibrio entre la demanda y la oferta de esta fruta. Adems, el poco rendimiento por rea, hace pensar en un inadecuado manejo del cultivo. Por tanto, existe una demanda de material vegetal que perfectamente podra ser satisfecha a nivel nacional, al disponer de suficiente volumen para siembra en

plantaciones homogneas, para lo cual, la tcnica de micropropagacin in vitro ofrece una solucin apropiada. JUSTIFICACIN

2005). Por esta situacin, la aplicacin de las tcnicas de cultivos in vitro suele ser una solucin (Mathews and Rangan, 1979). OBJETIVO

Siendo las caractersticas edafolgicas de nuestro pas las adecuadas para el desarrollo de la pina, se hace necesario contar con suficiente material vegetal sano, uniforme genticamente y de adecuada calidad. En la produccin tradicional se emplean partes como la corona (propagacin asexual), se ha comprobado que estos materiales permiten mantener las caractersticas genotpicas de la planta y del fruto. Los mtodos de propagacin tradicional tienen como limitante comn la necesidad de contar con plantaciones establecidas de pina, lo que no siempre es posible, sobre todo en nuestro pas en donde existe carencia de material para propagar; situacin que se agrava cuando se trata de introduccin de nuevas variedades. Adems, la produccin comercial por mtodos tradicionales se ve afectada por la perdida de calidad de los propgulos y las bajas tasas de multiplicacin (Bastos de Almeida et al., 2002). Por otra parte, la posibilidad de incrementar la diseminacin de enfermedades y plagas con estos mtodos es alta (Daquinta,

Practicar la metodologa biotecnolgica de micropropagacin para la siembra de coronas de pia (Ananas comosus), bajo las condiciones del laboratorio de cultivos in vitro de la Universidad del Quindo. METODOLOGIA Para la preparacin del medio de cultivo para la micropropagacin de la pia (Ananas comosus), se utilizaron los meristemos apical de cada corona de la pia, se iba utilizar las semillas de las cascara pero no se logro por que la fruta presentaba una madurez que no fue posible extraerlos. Desinfeccin Ananas Comosus Las coronas fueron deshojadas manualmente hasta dejar el cilindro central descubierto (figura a), se realizo la desinfeccin de los meristemos, se lavaron con unas gotas de tween, despus se lavo con abundante agua destilada, se realizo una inmersin del material en alcohol 70%, se lavo y se dejo en un beaker, se tomaron 30 frasco se esterilizaron.se dejaron enfriar y se guardaron. meristemos (Pia)

La preparacin del medio se realizo utilizando sales MS 100% y se aforo a 500ml. ESTABLECIMIENTO Sales MS 100% Cantidad Macrosales 10 ml Microsales 2.5 ml Calcio 2.5 ml KI 2.5 ml EDTA 2.5 ml Inotisol 0.0055 mg Tiamina 1 mg/L Kinetina 1 mg/L B.A.P 1 mg/L Ac.Ascorbico 0.006 mg Agar Agar 3 gr Azcar 15 gr

Figura a

Para la siembra se procedi llevar el material a la cmara estril, se realiz todo el protocolo y se efecto cortes hasta obtener el meristemo apical de un tamao adecuado (figura b) y posteriormente se procedi a la siembra en el medio de cultivo del establecimiento en las sales MS 100%, ajustado a un pH de 4.3, en 30 frascos, se llevo a unas condiciones de incubacin adecuadas.

Figura b En cuanto a las condiciones de incubacin, se mantuvieron con un fotoperiodo aproximado de 16 horas luz y 8 de oscuridad y temperaturas entre 28 30C. RESULTADOS Etapa I - Fase de establecimiento En sta fase no existen reportes estadsticamente significativos, debido al alto porcentaje de contaminacin fngica inicial, en este caso el cultivo despus de 7 das de siembra no tubo

explanes sobrevivientes, para los cuales el mtodo de desinfeccin no brind los mejores resultados. Esto se asemeja a lo expuesto por Albuquerque et al. (2000)/Cit. por Bastos de Almeida et al., (2002), quienes exponen que el empleo de meristemos apicales de pia permite incrementar la supervivencia de los explantes, que generalmente son susceptibles al ataque de hongos del genero Fusarium o Aspergillus, muy presentes en las condiciones ambientales normales de campo.

ensayo y error hasta establecer la mejor tcnica.

Figura d. explante contaminado y oxidado, contaminacin en medio de cultivo.

Figura c. explante contaminado y oxidado, contaminacin en medio de cultivo.

Los explantes seleccionados fueron desinfectados superficialmente con diferentes compuestos, sus concentraciones y el tiempo fueron en gran medida la razn por la cual no respondieron eficientemente bajo las condiciones in vitro, ya que dicha desinfeccin se debe establecer experimentalmente por las caractersticas del explante mediante

Es importante considerar que el aislamiento del tejido del resto de la planta provoca un estado de estrs que altera su metabolismo celular; un buen explante es aquel que cuyas clulas sobreviven a la descomposicin, en ste caso se observa claramente una oxidacin de los tejidos que posteriormente son colonizados por hongos del genero Aspergillus caracterizados por sus filamentos y color verdoso. Tambin se observa la contaminacin en el medio de cultivo, ya que dichos microrganismos crecen favorablemente por su composicin qumica.

contaminacin in situ de las condiciones ambientales normales de cultivo. BIBLIOGRAFA Will (2012) Cultivo de tejidos vegetales [En lnea] Consultado: [8, octubre, 2012] Disponible en http://agropecuarios.net/cultivosde-tejidos-vegetales.html J Nutr Biochem (2005) La induccin de la cultura cebolla tejido de plntulas (LHS), a travs de la proliferacin de tejido de callo en el tejido de plntulas de callos aislados en cultivo (RHS). [7, [En lnea] 2012] en Consultado Disponible hat.htm octubre,

Figura e. explante contaminado por hongo Aspergillus.

Contando con otros aspectos, las plantas que donaron los explantes (plantas madre) se recogieron en condiciones no aspticas, las cuales influyen significativamente en la contaminacin de nuestro microcultivo, adems, la extraccin de los explantes no fue la ms adecuada, ya que se hizo en un lugar abierto expuesto al medio ambiente no desinfectado. CONCLUSIONES Un buen explante es aquel cuyas clulas sobreviven, en una alta proporcin, a la descomposicin, y luego responde eficientemente a las condiciones in vitro. Al utilizar las coronas de pia que no han tenido una limpieza concienzuda, determinan el incremento de la supervivencia de los explantes iniciales, debido a la exposicin de estos a la

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Cultivo in vitro de rboles frutales.

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