Ini mini-tinjauan memberikan pemahaman umum ionisasi elektrospray spektrometri massa (ESIMS) yang telah menjadi teknik yang

semakin penting dalam laboratorium klinis untuk studi struktural atau pengukuran kuantitatif metabolit dalam sampel biologis kompleks. Bagian pertama dari review menjelaskan proses ionisasi elektrospray, desain spektrometer massa dengan kemampuan pemisahan, karakteristik spektrum massa, dan pertimbangan praktis dalam analisis kuantitatif. Bagian kedua kemudian berfokus pada beberapa aplikasi klinis. Kemampuan ESItandem-MS dalam mengukur bio-molekul berbagi struktur molekul yang sama membuatnya sangat berguna dalam skrining untuk kesalahan bawaan dari asam amino, asam lemak, purin, pirimidin metabolisme dan diagnosis gangguan galaktosemia dan peroxisomal. Ionisasi elektrospray juga efisien dalam menghasilkan ion cluster untuk penjelasan struktural makromolekul. Ini telah mendorong pendekatan baru dan lebih baik (vs elektroforesis) untuk identifikasi dan kuantifikasi varian hemoglobin. Dengan pemahaman struktur glycohaemoglobin, metode referensi IFCC untuk pengujian glycohaemoglobin telah dibentuk menggunakan ESI-MS. Ini merupakan kemajuan yang signifikan untuk standardisasi HbA1c dalam pemantauan diabetes. Dengan aplikasi lainnya seperti dalam pemantauan obat terapeutik, ESI-MS akan terus mengerahkan pengaruh penting dalam pengembangan masa depan dan organisasi dari layanan laboratorium klinis.

Pergi ke: Pengantar Spektrometri massa merupakan teknik analisis yang dapat memberikan baik kualitatif (struktur) dan kuantitatif (massa molekul atau konsentrasi) informasi tentang molekul analit setelah konversi mereka untuk ion. Molekul-molekul dari bunga pertama kali diperkenalkan ke sumber ionisasi spektrometer massa, di mana mereka pertama kali terionisasi untuk memperoleh muatan positif atau negatif. Ion kemudian perjalanan melalui analisa massa dan tiba di bagian yang berbeda dari detektor sesuai dengan massa / rasio muatan mereka (m / z). Setelah ion melakukan

kontak dengan detektor, sinyal useable yang dihasilkan dan dicatat oleh sistem komputer. Komputer menampilkan sinyal grafis sebagai spektrum massa menunjukkan kelimpahan relatif dari sinyal sesuai dengan m / z rasio mereka.

Selama dekade terakhir, elektrospray ionisasi spektrometer massa (ESI-MS) telah muncul sebagai teknik yang penting dalam laboratorium klinis. Ini menyediakan alat, sensitif yang kuat, dan dapat diandalkan untuk belajar, di femto-mol jumlah dalam mikro-liter volume sampel, nonvolatile dan termal labil bio-molekul yang tidak setuju untuk analisis dengan teknik konvensional lainnya. Ditambah dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) untuk fraksionasi molekul sebelum analisis spektrometri massa, HPLC / ESI-MS telah menjadi teknik yang sangat kuat yang mampu menganalisis kedua molekul kecil dan besar polaritas berbagai sampel biologis kompleks. Dengan kemampuan pemisahan tambahan tandem spektrometri massa (MS dalam seri, biasanya dilambangkan sebagai MS / MS), sampel pemurnian yang rumit dan prosedur untuk pembentukan derivatif yang biasa digunakan dalam kromatografi gas (GC)-MS dapat lebih disederhanakan. Bersama dengan pengenalan sampel otomatis, HPLC / ESI-MS / MS adalah analisis aliran teknik untuk analisis cepat dan throughput sampel tinggi. Fokus dari produsen MS dalam beberapa tahun terakhir telah pada pengembangan analisis MS dikendalikan oleh user-friendly perangkat lunak komputer. Ahli biokimia klinis dan ilmuwan biomedis lainnya dapat mengelola teknik ini tanpa pemahaman mendalam tentang proses fisik yang rumit dan prinsip-prinsip matematika. Artikel ini bertujuan untuk memberikan pemahaman dasar dari proses ESI, analisa massa, akuisisi data, dan persyaratan khusus untuk analisis molekuler kualitatif dan kuantitatif. Metode untuk studi kesalahan metabolisme bawaan (molekul kecil) dan varian hemoglobin (makromolekul) akan diringkas untuk ilustrasi dari aplikasi klinis.

Pergi ke: Elektrospray Ionisasi Spektrometri Massa

Clin Biochem Rev. 2003 February; 24(1): 312. PMCID: PMC1853331

Electrospray Ionisation Mass Spectrometry: Principles and Clinical Applications

CS Ho, CWK Lam,* MHM Chan, RCK Cheung, LK Law, LCW Lit, KF Ng, MWM Suen, and HL Tai
Author information Copyright and License information

1. Proses ionisasi elektrospray

ESI menggunakan energi listrik untuk membantu transfer ion dari larutan ke dalam fase gas sebelum mereka dikenakan analisis spektrometri massa. Spesies ion dalam larutan sehingga dapat dianalisis oleh ESI-MS dengan sensitivitas meningkat. Senyawa netral juga dapat dikonversi ke bentuk ionik dalam larutan atau dalam fase gas oleh protonasi atau cationisation (cationisation logam misalnya), dan karenanya dapat dipelajari oleh ESI-MS.

Pengalihan spesies ion dari larutan ke dalam fase gas oleh ESI melibatkan tiga langkah: (1) penyebaran semprotan halus tetesan biaya, diikuti oleh (2) penguapan pelarut dan (3) ejeksi ion dari tetesan sangat dituntut (Gambar 1 ). tabung, yang dipertahankan pada tegangan tinggi (misalnya 2,5-6,0 kV) relatif terhadap dinding ruang sekitarnya. Sebuah kabut tetesan sangat dituntut dengan polaritas yang sama dengan tegangan kapiler dihasilkan. Penerapan gas nebulising (misalnya nitrogen), yang gunting di sekitar larutan sampel dielusi, meningkatkan sample rate aliran yang lebih tinggi. Tetesan dikenakan, dihasilkan di pintu keluar dari ujung elektrospray, lulus menuruni gradien tekanan dan gradien potensial terhadap wilayah analisa dari spektrometer massa. Dengan bantuan suhu ESI-sumber tinggi dan / atau lain aliran gas nitrogen pengeringan, tetesan dikenakan terus dikurangi ukurannya dengan penguapan pelarut, yang menyebabkan peningkatan kepadatan muatan permukaan dan penurunan radius tetesan.

Akhirnya, kekuatan medan listrik dalam tetesan dibebankan mencapai titik kritis di mana itu kinetis dan penuh semangat mungkin bagi ion pada permukaan tetesan yang akan dikeluarkan ke dalam fase gas. Ion-ion yang dipancarkan oleh sampel kerucut skimmer sampling dan kemudian dipercepat ke analyzer massa untuk analisis selanjutnya massa molekul dan pengukuran intensitas ion. Mekanisme ESI dijelaskan secara lebih rinci dalam review.1 baru-baru ini

Gambar 1 Mekanisme ionisasi elektrospray Untuk mendapatkan informasi struktural, ion prekursor dari bunga dapat massa dipilih dan selanjutnya terfragmentasi dalam sel tabrakan. Ion fragmen kemudian dapat secara massal dianalisis oleh sebuah analisa massa kedua sistem spektrometer massa tandem yang akan dijelaskan di bawah ini.

2. Massa Analysers

I. analyzer massa quadrupole

Ketika ion perjalanan melalui medan magnet atau listrik, gerakan mereka dipengaruhi oleh m / z rasio mereka dan ini merupakan prinsip utama memisahkan ion di MS. Dalam laboratorium klinis, penganalisis massa quadrupole yang paling sering digunakan. Dalam sistem tersebut, perakitan 4 batang logam paralel disimpan di jarak yang sama (Gambar 2). Setiap sepasang batang berlawanan terhubung elektrik. Tegangan DC yang sama tetapi berlawanan ditumpangkan dengan frekuensi radio (RF) AC tegangan diterapkan ke pasangan diagonal ditempatkan batang. Medan listrik yang dihasilkan menyebabkan ion untuk melakukan perjalanan ke depan dalam arah z dengan gerakan berosilasi dalam bidang xy. Amplitudo osilasi beruang hubungan yang

unik dengan rasio m / z dan dapat dikendalikan dengan mengubah tegangan DC dan RF secara bersamaan dalam rasio pre-fixed. Ini tegangan DC dan RF dapat diatur sehingga amplitudo osilasi untuk diinginkan m / z rasio yang "stabil" dengan ion bepergian sepanjang z-sumbu tanpa memukul batang quadrupole, dan akhirnya mencapai detektor. Di sisi lain, amplitudo osilasi ion yang tidak diinginkan besar dan "stabil", mereka memukul batang-batang besi, bisa dinetralkan, dan gagal untuk mencapai detektor. Analisis massa quadrupole yang kuat, ekonomis, fisik kecil, dan lebih mudah dihubungkan dengan berbagai macam sistem inlet bila dibandingkan dengan analisis massa konvensional seperti sektor magnetik.

Gambar 2 Operasi sebuah analisa massa quadrupole. Ion (M +) perjalanan dari sumbernya, melalui pengaturan 4 batang logam dalam pola osilasi yang unik, dan mencapai detektor. II. Tandem quadrupole sistem

Dalam sistem tandem quadrupole khas ada tiga quadrupoles diatur secara linear, sering disebut "triple-quad" (Gambar 3). Ion analit bunga (biasanya disebut ion prekursor) adalah massa-dipilih oleh quadrupole pertama (Q1) dan dibiarkan bertabrakan dengan gas tabrakan (biasanya argon) dalam sel RF-satunya tabrakan kedua quadrupole (Q2), di mana ion prekursor diaktifkan oleh tabrakan dan menjalani fragmentasi lebih lanjut. Proses ini dikenal sebagai tabrakan-disosiasi diinduksi (CID). Ion putri dihasilkan dari CID yang terkait dengan struktur molekul ion dan dapat dipantau oleh sebuah analisa massa quadrupole ketiga (Q3) memberikan informasi struktural dari ion molekuler. Sistem tandem biasanya dilambangkan sebagai MS / MS dalam literatur. Ketika Q1 diatur untuk memilih hanya satu spesifik m / z rasio, itu menyaring ion molekul lain yang memiliki yang berbeda m / z rasio. Ini adalah "pemurnian" langkah dalam sistem MS,

menghilangkan prosedur sampel pemurnian yang rumit dan memakan waktu sebelum analisis MS.

Gambar 3 Skema diagram dari sistem triple quadrupole. Yang pertama (Q1) dan ketiga (Q3) adalah spektrometer massa dan pusat (Q2) adalah sel tabrakan. Modus berikut akuisisi data biasanya digunakan dalam sistem quadrupole tandem:

Produk scan (putri scan): Q1 statis memungkinkan hanya satu ion spesifik m / z rasio untuk melewati dan Q3 memindai ion produk yang berbeda CID. Mode ini dapat digunakan untuk mempelajari struktur molekul, misalnya, asam amino urutan molekul peptida. Prekursor memindai (scan induk): scan Q1 rentang ion prekursor mungkin dan Q3 statis berfokus pada satu ion produk yang unik yang dihasilkan dari CID dari kelas ion prekursor. Misalnya, m / z rasio 85 adalah ion fragmen yang sama dari semua prekursor acylcarnitines ion (C2-C18) butylated .2 Kerugian Netral: Kedua Q1 dan Q3 memindai bersama di sebuah perbedaan yang konstan dalam m / z rasio. Hal ini digunakan untuk memonitor hilangnya fragmen netral untuk kelas molekul dari CID. Misalnya, ada kerugian netral 102 dari sebagian besar acids.2 amino butylated Reaksi Monitoring multi: Kedua Q1 dan Q3 yang statis untuk sepasang ditentukan prekursor dan ion produk. Ini menganugerahkan kekhususan tertinggi dan sensitivitas dan umumnya digunakan dalam prosedur kuantifikasi ESI-MS/MS. III. Analyzer massa ion perangkap

Sistem ini, yang baru-baru ini telah menjadi tersedia, memiliki keuntungan yang lebih kecil dalam ukuran dan lebih murah, dan mampu melakukan pemantauan tandem CID. Ini terdiri dari

tiga elektroda hiperbolik: elektroda cincin, ujung elektroda masuk topi, dan ujung keluar elektroda tutup (Gambar 4). Elektroda ini membentuk rongga di mana dimungkinkan untuk menjebak (toko) dan menganalisis ion. Elektroda end topi Keduanya memiliki lubang kecil di pusat-pusat mereka melalui mana ion dapat melakukan perjalanan. Elektroda cincin terletak di tengah antara dua elektroda ujung topi. Ion yang dihasilkan dari sumber masuk perangkap melalui quadrupole dan ujung elektroda masuk topi. Berbagai tegangan yang diterapkan pada elektroda untuk ion perangkap dan eject sesuai dengan m / z mereka rasio. Elektroda cincin RF potensial, potensi AC frekuensi konstan dan variabel amplitudo, diterapkan ke elektroda cincin untuk menghasilkan medan 3-dimensi potensial quadrupolar dalam rongga perangkap. Ini akan menjebak ion dalam lintasan osilasi stabil terkurung dalam sel perangkap. Sifat dari lintasan tergantung pada potensi perangkap dan rasio m / z dari ion. Selama deteksi, potensi sistem elektroda diubah untuk menghasilkan ketidakstabilan di lintasan ion dan dengan demikian mengeluarkan ion dalam arah aksial. Ion-ion yang dikeluarkan dalam rangka meningkatkan m / z rasio, difokuskan oleh lensa keluar dan terdeteksi oleh sistem detektor ion.

Gambar 4 Skema diagram dari sebuah analisa massa perangkap ion. Perangkap ini terdiri dari 2 elektroda ujung topi dan elektroda cincin. Di dalam perangkap, ion memutar dan berosilasi dalam lintasan berbentuk 8. Selama tandem MS, ion prekursor dipilih dalam perangkap di mana gas inert diperkenalkan untuk CID. Setelah itu, ion produk yang dikeluarkan untuk deteksi. Atau, ion produk dapat disimpan di dalam perangkap dan lain reaksi CID dapat dimulai dan reaksi ulangi CID dapat berlanjut selama beberapa kali (dilambangkan sebagai MSN di mana n adalah jumlah reaksi CID). Hal ini dapat membantu membedakan molekul dengan struktur serupa. Namun, analisis perangkap ion tidak dapat menyediakan memindai prekursor dan mode hilangnya netral akuisisi data. Untuk

kuantifikasi, analisis ion perangkap adalah 10 kali lebih sensitif bila dibandingkan dengan sistem quadrupole tandem dioperasikan dalam mode pemantauan beberapa reaksi.

3. Spektrum Massa

Spektrum massa adalah tampilan grafis dari bundance seorang kerabat sinyal ion terhadap m / z rasio. Ini adalah praktek umum bahwa sinyal tertinggi diambil sebagai kelimpahan 100% dan semua sinyal lain yang dinyatakan sebagai persentase dari ini. Fragmentasi ion molekul terprotonasi atau de-terprotonasi dihasilkan dari ESI umumnya terbatas, dan spektrum massa relatif sederhana. Namun, beberapa-protonasi protein dan peptida terjadi dalam proses ESI, dan spektrum massa ESI mungkin menjadi lebih rumit. Gambar 5 adalah spektrum massa untuk persiapan mioglobin kuda sangat murni (5 mol / L dalam asetonitril 50% mengandung asam formiat 0,2%). Sebuah protein tunggal akan menunjukkan ion cluster yang berisi beberapa karakteristik-ion bermuatan. Jumlah muatan pada molekul protein akan tergantung pada berat molekul protein dan jumlah situs dasar diakses (misalnya arginin, histidin, dan lisin). Tiga asumsi dasar yang dibuat dalam penentuan berat molekul protein tunggal. Yakni, bahwa (1) puncak yang berdekatan dalam satu rangkaian hanya berbeda oleh satu muatan, (2) pengisian hanya karena keterikatan proton dengan ion molekul, dan (3) ionisasi terjadi hanya molekul utuh. Untuk menghitung berat molekul protein, yang dapat menggunakan 2 persamaan simultan yang berasal dari 2 ion yang berdekatan. Sebagai contoh, untuk ion dengan am / z rasio = 1212, ia memiliki puncak yang berdekatan dengan rasio m / z = 1131. Puncak yang berdekatan harus memiliki biaya tambahan pada ion molekuler. Oleh karena itu, 2 persamaan simultan dapat diatur: m / z = 1212, dan m / (z +1) = 1131, pemecahan untuk z = 14 dan m = 16968 untuk molekul.

Gambar 5

Spektrum Massa dari ion cluster yang mioglobin protein kuda solusi yang sangat dimurnikan standar (5 mol / L dalam larutan asetonitril 50% mengandung asam formiat 0,2%) Situasi menjadi lebih rumit jika ada campuran protein yang berbeda hadir dalam sampel. Berbeda MS produsen menyediakan perangkat lunak mereka sendiri untuk mengubah spektrum massa rumit mentah menjadi massa molekul relatif individu. Gambar 6 (atas) menggambarkan spektrum massa campuran dimurnikan alpha-janin glycoforms protein. The MAXENT Micromass Program (Micrormass, Manchester, Inggris) deconvolutes spektrum massa ke dalam glycoforms individu (Gambar 6 - bawah). Dengan cara ini, sistem ESI-MS dirancang untuk mengukur m / z rasio dari 4000 Da / e mampu menentukan berat molekul dari molekul protein besar lebih dari 100.000 Da. ESI-MS juga dapat diterapkan untuk mempelajari makromolekul lainnya, misalnya, oligonukleotida. Keakuratan ESI-MS untuk molekul protein telah didokumentasikan untuk menjadi 0,01% bila dibandingkan dengan asam amino teoritis sequence.3

Gambar 6 Spektrum Massa dari campuran serum alpha-janin protein dimurnikan dengan kromatografi afinitas. Spektrum atas terdiri dari data mentah menunjukkan ion kluster komposit dari glycoforms yang berbeda. Spektrum bawah adalah spektrum deconvoluted on ... 4. Analisis Kuantitatif

Dalam ESI-MS, sinyal ion sebanding dengan konsentrasi analit dan umumnya tidak tergantung dari laju alir dan volume injeksi yang digunakan untuk sampel introduction.1 Sinyal linier dari batas deteksi (biasanya pmol / L) menjadi sekitar 10 umol / L analit konsentrasi. Untuk pengukuran kuantitatif, adalah penting untuk menggabungkan standar internal dalam prosedur untuk mengkompensasi kerugian selama persiapan sampel dan sensitivitas deteksi variabel dari sistem MS. Standar internal harus memiliki struktur yang sama dengan analit dan praktek yang

ideal adalah untuk mensintesis standar internal dengan memasukkan isotop stabil pada molekul bunga. Misalnya, untuk kuantifikasi bebas karnitin (m = 162), standar internal yang mengandung 3 atom deuterium untuk menggantikan 3 atom hidrogen digunakan (m = 165) .4 Ketika sebuah standar internal yang ideal tidak tersedia, molekul dengan struktur yang sama dapat juga digunakan. Misalnya, ascomycin telah digunakan sebagai standar internal untuk analisis ESIMS/MS dari tacrolimus.5 immunosuppressant

Isu lain yang penting dalam kuantitatif ESI-MS adalah penekanan ionisasi karena gangguan matriks. Sebuah sampel biologis akan memberikan sinyal ionisasi secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan solusi standar murni dengan konsentrasi analit yang sama. Fenomena ini adalah hasil dari konsentrasi tinggi non-volatile bahan dari sampel biologis yang hadir di semprot dengan analyte.6 Kemungkinan non-volatile zat terlarut campur adalah garam dan lipid dalam sampel biologis. Untuk mengatasi gangguan matriks, proses pemurnian sampel yang luas yang diperlukan, misalnya, ekstraksi cair-cair dan ekstraksi fase padat oleh kolom pakai. Namun, prosedur yang rumit yang memakan waktu dan dapat menyebabkan pemulihan miskin. Perkembangan terbaru adalah dengan menggunakan kolom pendek LC (atau kolom penjaga) dan menerapkan pemurnian HPLC cepat (misalnya untuk 2-5 menit) sebelum MS analysis.7 The HPLC berfungsi untuk memisahkan senyawa non-volatile dari analit. Untuk sistem HPLC dengan kolom-switching kemampuan, analit dalam sampel biologis dapat dimurnikan dan berkonsentrasi pada kolom terpisah sebelum analisis MS. Seperti pemurnian sistem sampel otomatis menggunakan kromatografi afinitas yang terbaik digambarkan oleh metode kuantifikasi yang baru saja diterbitkan cepat untuk isoform transferin di serum.8

Pergi ke: Aplikasi Klinis 1. Skrining untuk Kesalahan bawaan Metabolisme

Salah satu aplikasi klinis yang paling umum dari ESI-MS dalam skrining untuk kesalahan metabolisme bawaan (IEM). Pasien dengan IEM mewarisi cacat jalur metabolisme yang mengarah ke salah satu akumulasi metabolit toksik, atau kekurangan metabolit penting untuk homeostasis. Banyak dari cacat memiliki konsekuensi klinis yang serius, termasuk ringan sampai keterbelakangan mental yang parah, cacat fisik, dan bahkan kematian. Diagnosis dini dan pengelolaan beberapa gangguan telah terbukti sangat efektif dalam mencegah konsekuensi klinis. Di antara mereka hanya sebagian kecil telah berhasil ditayangkan pada nasional program skrining neonatal, misalnya, fenilketonuria (PKU) dan hipotiroidisme neonatal. Masalah dengan metode skrining meliputi persiapan sampel melelahkan, waktu analisis yang lama, tinggi angka positifpalsu, dan spektrum penyakit sempit ditutupi oleh setiap metode. Prinsip dari ESI-MS membuat metode ini paling cocok untuk mengukur kelas yang sama dari bio-molekul berbagi struktur molekul yang sama, dan kemampuan MS / MS menyingkirkan prosedur persiapan sampel yang rumit dan membosankan. Sejak awal 1990-an, penggunaan ESI-MS/MS telah merevolusi skrining neonatal untuk IEM di countries.9 dikembangkan banyak

I. Neonatal skrining untuk gangguan asam amino dan metabolisme asam lemak

Saat ini, secara nasional program skrining neonatal di Amerika Utara, Eropa dan Australia menggunakan ESI-MS/MS otomatis untuk profiling metabolisme asam amino dan acylcarnitines dari bercak darah. State-of-the-art laboratorium dapat menyaring beberapa ratus sampel per hari. Sampling bintik-bintik darah pada kartu Guthrie, ekstraksi analit, pembentukan derivatif, analisis ESI-MS/MS, dan pengolahan data elektronik dengan komputer-peringatan dari hasil abnormal semua dapat sepenuhnya otomatis sekarang menggunakan mikro-piring bets processing.9

Profil asam amino dapat mendeteksi aminoacidopathies besar, seperti fenilketonuria (PKU), penyakit kemih sirup mapel, homocystinuria, dan galaktosemia. Di masa lalu, skrining PKU diperlukan penggunaan sampel darah dikumpulkan pada atau setelah Hari 5 lahir, sehingga fenilalanin yang cukup telah terkumpul untuk deteksi dengan uji penghambatan kualitatif sensitif Guthrie bakteri. ESI-MS/MS Memanfaatkan pengukuran fenilalanin rasio konsentrasi tirosin, skrining sekarang dapat dilakukan dengan kekhususan tinggi dan sensitivitas menggunakan Day 1 darah spots.10 skrining acylcarnitines terutama untuk cacat oksidasi asam lemak. Contoh IEM sedang diperiksa adalah: kekurangan dehidrogenase rantai menengah dan sangat-rantai panjang asil-CoA, tipe acidemia glutarat I dan II, palmitoil karnitin transferase tipe II / translokase kekurangan, defisiensi karnitin primer, acidemia isovaleric / 2-methylbutyryl-CoA dehidrogenase defisiensi, dan rantai panjang hydroxyacyl-CoA dehidrogenase / kekurangan protein trifunctional. Baru-baru ini, ini biaya-efektif metode skrining telah digunakan untuk mempelajari IEM potensi bayi mendadak death.11

II. Neonatal skrining untuk galaktosemia

Galaktosemia (kejadian, 1: 35.000 di Denmark) 12 adalah IEM yang mengancam jiwa dengan gejala berat pada periode neonatal. Hal ini paling sering disebabkan oleh defisiensi enzim galaktosa-1-fosfat uridyl transferase. Dalam gangguan ini, galaktosa berasal dari laktosa tertelan dalam produk susu dan susu terakumulasi dalam darah dan urin, menyebabkan konsentrasi intraseluler tinggi galaktosa-1-fosfat yang merupakan racun bagi beberapa jaringan, terutama hati, otak, dan tubulus ginjal. Manifestasi klinis, termasuk muntah, sakit kuning diare, dan kelesuan muncul pada neonatus lama setelah konsumsi susu, berkembang menjadi koma dan kematian akibat septikemia, hati atau gagal ginjal. Perawatan dini dengan diet galaktosa bebas menyebabkan regresi tanda dan gejala dalam waktu 1-2 minggu. Sebuah metode ESI-MS/MS baru telah dikembangkan untuk pengukuran dari total heksosa mono-fosfat pada bercak darah

sebagai penanda untuk galaktosa-1-phosphate.12 Prosedur ini sederhana dan tidak memerlukan pengolahan sampel untuk pembentukan derivatif. Sebuah studi retrospektif telah menunjukkan sensitivitas dan spesifisitas dari 100% untuk 12 pasien di antara 2.055 controls.12

III. Neonatal skrining untuk penyakit hepatobilier kolestatik

Dalam ikterus neonatal berkepanjangan, penting untuk mendiagnosis adanya penyakit hepatobilier kolestatik seperti atresia bilier ekstrahepatik, suatu kondisi yang dapat mengakibatkan morbiditas dan mortalitas yang serius. Sebuah ESI-MS sederhana dan efisien metode telah dikembangkan untuk mengukur asam empedu terkonjugasi pada bercak darah, 13 dan digunakan dalam upaya untuk mendirikan sebuah program skrining neonatal untuk diseases.14 hepatobilier kolestatik Namun, pemisahan konsentrasi asam empedu terkonjugasi antara pasien dan masyarakat umum tidak cukup untuk membuat skrining massal untuk penyakit hepatobilier kolestatik pilihan layak dengan metode ini saja. Bayi berat badan lahir rendah tanpa kondisi patologis juga bisa memiliki konsentrasi asam empedu yang cukup tinggi, sehingga mempengaruhi spesifisitas metode. Selain itu, metode skrining ini juga dipengaruhi oleh peningkatan yang signifikan terlihat pada konsentrasi asam empedu setelah makan. Oleh karena itu, waktu sampling yang akurat mungkin diperlukan untuk meningkatkan kegunaannya.

IV. Skrining untuk gangguan peroxisomal

Para peroksisom adalah organel intraseluler bertanggung jawab untuk oksidasi -rantai yang sangat panjang dan asam lemak rantai bercabang. Gangguan peroxisomal adalah kelompok heterogen IEM ditandai dengan gangguan, peroksisom berkurang atau sama sekali tidak ada. Contoh-contoh termasuk sindrom Zellweger, X-linked adrenoleukodystrophy, asil-CoA defisiensi oksidase, defisiensi protein bifunctional dan thiolase peroxisomal deficiency.15 Pasien yang

menderita gangguan ini mungkin memiliki peningkatan abnormal pada asam lemak rantai sangat panjang (VLCFA), pristanic atau phytanic asam dalam serum. Membosankan GC / MS metode telah digunakan untuk diagnosis kondisi ini. Sebuah metode ESI-MS/MS cepat dilaporkan untuk skrining peroxisomal disorders.16 VLCFA (C20: 0 eicosanoic, C22: 0 docosanoic, C24: 0 tetracosanoic dan C26: 0 asam hexacosanoic) di tempat darah atau serum harus dikonversi ke dimetilaminoetil ester. Pemurnian sampel, dan prosedur pembentukan derivatif relatif sederhana dibandingkan dengan tradisional GC / MS metode. Karena langkah terakhir dalam biosintesis asam empedu berlangsung di peroksisom, metode lain HPLC / ESI-MS / MS untuk plasma C27 dan C29 asam empedu terkonjugasi juga telah diusulkan, untuk menyaring peroxisomal disorders.17 Metode ini tidak memerlukan pengolahan sampel untuk pembentukan derivatif, dan mirip dengan metode yang dijelaskan above.14

V. Skrining untuk gangguan di purin dan metabolisme pirimidin

Kesalahan bawaan dari purin dan metabolisme pirimidin memiliki berbagai presentasi klinis, misalnya, gout, anemia, imunodefisiensi, batu ginjal, kejang-kejang, keterbelakangan autisme, mental dan pertumbuhan retardation.18 Diagnosa didasarkan pada adanya metabolit abnormal atau tidak adanya metabolit normal dalam sel darah serum, urin atau merah. Sebuah metode skrining HPLC / ESI-MS / MS telah dikembangkan untuk kuantifikasi dari 17 purin dan pirimidin dalam urin atau air seni-direndam strip kertas saring dengan turn-kali-dari 15 menit per sample.19

2. Identifikasi dan Kuantifikasi Varian Hemoglobin

Sejak laporan pertama pada pengukuran keberhasilan besar bio-molekul dengan ESI-MS, telah terjadi revolusi dalam identifikasi molekul protein dalam penelitian biokimia. Dalam

laboratorium klinis, kuantifikasi glycohaemoglobin (GHB) menyediakan alat yang berguna untuk pemantauan kontrol glikemik pada pasien diabetes. ESI-MS telah menjadi teknologi yang diakui untuk pengembangan metode referensi. Selain itu, hemoglobin (Hb) varian perlu diidentifikasi untuk penyelidikan anemia hemolitik, methaemoglobinamea, penyakit sel sabit dan talasemia. Kadang-kadang, varian ini terdeteksi kebetulan karena mereka mengganggu pengukuran GHB. ESI-MS juga menjadi teknik yang lebih disukai untuk pendekatan sistematis yang cepat untuk karakterisasi definitif Hb variants.20

I. Kuantifikasi glycohaemoglobin

GHB adalah produk dari ireversibel non-enzimatik glycation Hb. Persentase GHB merupakan integrasi plasma rata konsentrasi glukosa pasien selama masa hidup / nya eritrosit (2-3 bulan). Ini telah digunakan untuk memantau kontrol diabetes selama bertahun-tahun. Sebuah tinjauan barubaru ini menegaskan bahwa perbaikan kontrol glikemik pada pasien diabetes sangat terkait dengan perkembangan menurun dan / atau perkembangan complications.21 HbA1c adalah spesies dominan GHB dan diukur dalam laboratorium klinis baik menggunakan HPLC dengan pertukaran ion atau kolom afinitas, atau otomatis immunoassays. Sebagian besar dari metode ini memiliki presisi analitis diterima dan efisiensi. Namun, mereka menderita gangguan oleh varian Hb, memberikan hasil palsu tinggi atau rendah. Kebingungan yang cukup besar pada keakuratan metode telah dilaporkan karena kurangnya standardisasi internasional. Isu mendasar telah kurangnya pemahaman tentang sifat spesifik HbA1c. Penggunaan ESI-MS menghilangkan masalah ini.

Kelompok kerja IFCC tentang standardisasi internasional mendefinisikan HbA1c sebagai Hb yang ireversibel terglikasi pada satu atau kedua N-terminal valines dari globin chains.22 Berdasarkan definisi ini, metode referensi calon dikembangkan menggunakan HPLC/ESI-MS.23

Ini membutuhkan endoproteinase semalam Glu-C pencernaan, diikuti oleh pemisahan HPLC dari peptida. Intensitas sinyal ESI dari N-terminal spesifik hexa-peptida dari Hb0 dan HbA1c digunakan untuk menghitung persentase HbA1c dalam sampel. Metode ini kemudian diadopsi sebagai method.24 nilai IFCC referensi referensi awal dilaporkan oleh IFCC, 3,36 0,48% (ratarata 2 SD), secara signifikan lebih rendah daripada yang dikembangkan oleh metode lain.

Selanjutnya, metode ini referensi yang dimodifikasi untuk adaptasi di laboratorium klinis. Pemisahan peptida dengan Reverse-fase metode HPLC mengambil 24 menit. Hal ini ditingkatkan dengan menggunakan fase gradien yang berbeda mobile dan waktu analisis dikurangi menjadi 8 minutes.25 Untuk memperbaiki kekhususan pengukuran, pemantauan beberapa reaksi akuisisi sinyal digunakan. Presisi metode ini juga ditingkatkan dengan menggunakan intensitas sinyal dari kedua tunggal dan ganda-bermuatan peptida ions.26 Untuk mengurangi biaya menjalankan metode, sebuah endoproteinase amobil Glu-C persiapan juga diperkenalkan. Telah terbukti bahwa metode referensi dapat mengatasi gangguan oleh Hb variants.27 Meskipun perbaikan berbagai metode referensi IFCC, itu masih terlalu menuntut untuk aplikasi rutin.

Sebuah ESI-MS metode alternatif untuk GHB telah developed.28 Dalam metode ini sampel darah seluruh diencerkan 500 kali lipat sebelum dianalisis dengan ESI-MS untuk rantai globin Hb utuh. Gambar 7 (atas) menunjukkan massa spektrum ESI khas Hb normal. Ion klaster telah deconvoluted ke berat molekul yang benar oleh software komputer (Gambar 7 - bawah). Yang normal rantai globin dan memiliki berat molekul dari 15.126,4 15.867,2 dan masing-masing. Peningkatan massa 162 Da diberikan karena penambahan glukosa (massa, 180 Da) dan penghapusan air (-18 Da). Keuntungan dari metode ini ESI-MS adalah bahwa itu adalah sederhana dan cepat, dengan waktu analisis 3 menit per sampel, dan dapat dengan mudah otomatis. Selain itu, tidak terpengaruh oleh varian Hb sebagai rantai globin varian dan spesies terglikasi mereka juga dapat diukur dengan mudah. Metode yang diusulkan juga telah diuji untuk

jangka panjang performance.29 Selama periode 4-bulan operasi rutin, ketidakakuratan antaraassay adalah 1,6-5,0%, dengan hasil yang berkorelasi baik dengan metode pertukaran ion HPLC, dan persentase -terglikasi Hb setuju erat dengan mengacu didirikan values.29

Gambar 7 Spektrum Massa dari hemoglobin normal. Spektrum atas terdiri dari data mentah menunjukkan ion cluster dari globins baik dan . Spektrum bawah adalah spektrum deconvoluted pada skala massal benar setelah transformasi software. II. Identifikasi varian hemoglobin

Elektroforesis dan otomatis HPLC saat ini metode utama yang digunakan di laboratorium klinis untuk identifikasi varian Hb. Namun, metode ini tidak memberikan karakterisasi definitif dari varian, terutama mereka dengan substitusi asam amino tidak menghasilkan perubahan apapun pada biaya keseluruhan pada molekul Hb. Dalam karakterisasi, masa lalu definitif varian Hb melibatkan prosedur analitis membosankan dan memakan waktu membutuhkan hari dan bahkan berbulan-bulan untuk menyelesaikan.a