UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE HONDURAS

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE MICROBIOLOGA
NFASIS EN MICROBIOLOGA VETERINARIA

MANUAL DE

PRUEBAS

DIAGNSTICAS

VETERINARIAS
DRA. EKATERINA BONILLA

Stephanie Matute
2003 100 6832

Irene Andino Molina

2002 100 9245

Integrantes

Reyna Sarah Nuez

2003 100 0114

Yennyfer Saharai Daz

2004 100 9548

Joel Herrera
2005 100 9548

PRESENTACIN
Presentamos este manual como un aporte a la comunidad de cientficos microbilogos hondureos. El presente trabajo es una recopilacin de datos, procedimientos y tcnicas utilizadas a nivel internacional y nacional para el diagnostico de las enfermedades detalladas. En cada una de las secciones se encontraran introducciones, fundamentos tericos, lista de materiales, procedimientos y bibliografas. Esperamos que este manual pueda ser aprovechado por las futuras generaciones de microbilogos a nivel nacional.

Salmonella
En esta seccin se describirn los siguientes aspectos: 1. Introduccin 2. Tcnica: Prueba rpida de aglutinacin en porta

1. INTRODUCCIN (5,6)
La salmonelosis es una infeccin con una bacteria llamada Salmonella. Los grmenes de salmonella han sido conocidos por causar enfermedades a ms de 100 aos. Fueron descubiertas por un cientfico estadounidense llamado Salmon, por quien fue nombrada. Los serotipos ms comunes que causan infeccin en humanos y en animales de consumo pertenecen a la subespecie enterica. Los serotipos de las otras subespecies son frecuentes en animales poiquilotermos (de sangre fra) y en el ambiente, aunque algunos serotipos de S. arizonae y S. diarizonae se han asociado con enfermedades en pavos y en ovejas. La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y de los animales causada por microorganismos de las dos especies de Salmonella (S. enterica y S. bongori). Aunque fundamentalmente son bacterias intestinales, las salmonelas estn muy distribuidas en el ambiente y se encuentran con frecuencia en vertidos de granjas, en las aguas residuales humanas y en cualquier material con contaminacin fecal. En todos los pases existe salmonelosis, pero parece ser ms prevalente en reas de produccin animal intensiva, especialmente de aves y cerdos. La enfermedad puede afectar a todas las especies de animales domsticos, siendo ms susceptibles los ms jvenes y los animales gestantes. La manifestacin clnica ms comn es la enfermedad entrica, que a menudo se presenta como una diarrea sanguinolenta y muy acuosa acompaada de fiebre, pero se puede observar un amplio espectro de sntomas clnicos, como septicemia aguda, aborto, artritis, necrosis de las extremidades y enfermedad respiratoria. Los sntomas y las lesiones no son patognomnicos. Muchos animales, especialmente las aves y los cerdos, pueden estar infectados pero no mostrar enfermedad clnica (5). Tales animales pueden ser importantes en la diseminacin de la enfermedad entre explotaciones y ser causa de intoxicacin alimentaria humana. En el ltimo caso, esto puede suceder cuando estos animales entran en la cadena alimentaria y originan productos alimenticios contaminados (4, 5).

2. TCNICA: PRUEBA DE SEROAGLUTINACIN EN PORTA (5,6,7)

FUNDAMENTO
Es una prueba de aglutinacin que se fundamenta en la unin de un Anticuerpo a su Antgeno especfico que se encuentra en estado particulado. En proporciones ptimas, esta unin se manifiesta con la formacin de grumos. Es una prueba tamiz que se considera como negativa o positiva. A los animales se los clasifica como negativos o reaccionantes respectivamente, debiendo estos ltimos ser sometidos a pruebas complementarias para su diagnstico definitivo. Es una prueba cualitativa de aglutinacin en placa, que presenta la ventaja de ser realizada en una sola dilucin.

MATERIALES
1)

Antgeno corpuscular con 10 % de concentracin celular, suspendido en una solucin con cristal violeta al 3% a 04C hasta 6 meses. Se dispone comercialmente de productos antignicos teidos para la prueba de aglutinacin
en placa de sangre ntegra y, aunque parece que existen algunas pequeas diferencias en su sensibilidad, es improbable que grupos de aves infectadas con las variantes diferentes de S. Pullorum sean pasadas por alto.

2) 3) 4) 5) 6) 7)

Suero problema en perfectas condiciones (sin hemlisis ni contaminacin). Aglutinoscopio con placa de vidrio dividida en cuadrados de 4 x 4 cm. Gotero estndar de antgeno, calibrado para distribuir exactamente 0,03 ml por gota. Pipetas de Bang o automticas. Mezcladores (plstico, acrlico o vidrio). Reloj de laboratorio.

METODOLOGA
Previo a la prueba, la placa, el suero y el antgeno deben estar a temperatura ambiente (18 a 26 C) durante 40 minutos. Agitar suavemente el antgeno durante cinco minutos. Si el suero estuviera congelado, descongelarlo y mezclarlo bien, invirtiendo el tubo varias veces. Colocar la placa sobre el aglutinoscopio.

a)

b) Con una pipeta de Bang (o automtica) en posicin de 45 y apoyada sobre la placa de vidrio, depositar 0,03 ml de suero. c) Con el gotero en posicin vertical y a una altura de 3 cm dejar caer una gota de 0,03 ml de antgeno sobre el suero. d) Mezclar bien el suero con el antgeno abarcando una superficie circular de 3 cm de dimetro. e) Retirar la placa de vidrio e imprimir dos o tres movimientos en forma rotativa para homogeneizar la mezcla.

f) g)

Colocar la placa sobre el aglutinoscopio y taparlo, permaneciendo la luz apagada. Efectuar una nueva rotacin pasados los cinco minutos.

h) A los ocho minutos, rotando suavemente la placa, y con la luz encendida, proceder a la lectura

INTERPRETACIN
Las reacciones se clasifican en: POSITIVAS: Cuando se forman grumos y el sobrenadante queda transparente. NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antgeno es homognea y sin grumos

BIBLIOGRAFA
(1) POPOFF M.Y. (2001). Antigenic Formulas of the Salmonella Serovars. World Health Organization Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Pasteur Institute, Paris, France. (2) LE MINOR L. & POPOFF M.Y. (1987). Request for an opinion. Designation of Salmonella enterica sp. nov. nom. rev, as the type and only species of the genus Salmonella. Int. J. Syst. Bacteriol., 37, 465 468. (3) POPOFF M.Y., BOCKEMUHL J. & MCWHORTERMURLIN A. (1994). Supplement 1993 (No. 37) to the KauffmannWhite scheme. World Health Organization Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Unite des Enterobacteries, U389 INSERM, Institute Pasteur, Paris. Res. Microbiol., 145, 711716. (4) WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO) REGIONAL OFFICE FOR EUROPE (2000). WHO Surveillance Programme for Control of Foodborne Infections and Intoxications in Europe. Seventh Report on Surveillance of Foodborne Disease in Europe 19931998. Institute for Health Protection of Consumers and Veterinary Medicine BGVV. FAO/WHO Collaborating Centre for Training and Research in Food Hygiene and Zoonoses, P.O. Box 33 00 13, 14191 Berlin, Germany (5) SALMONELLA, Definiciones y Consideraciones Generales, Online Manual, CDC (6) SALMONELOSIS, Manual de Procedimientos y Diagnostico, OIE (7) PULOROSIS Y TIFOSIS AVIAR, Manual de Procedimientos y Diagnostico, OIE

Influenza
AVIAR
En esta seccin se describirn los siguientes aspectos: 1. Introduccin 2. Tcnica: Elisa 3. Tcnica: Inmunodifusin en Agar

1. INTRODUCCIN (1)
Es una enfermedad infecciosa de las aves causada por el virus A de la influenza. Si bien todas las aves son vulnerables a la influenza aviar, las aves acuticas migratorias, en particular los patos salvajes, constituyen el reservorio natural de los virus de la influenza aviar y esas aves son tambin las ms resistentes a la infeccin. Las aves de corral domsticas, en particular los pollos y los pavos, son especialmente vulnerables a las epidemias de influenza. Los sntomas en las aves varan desde una enfermedad leve hasta un cuadro altamente contagioso y rpidamente mortal que da lugar a epidemias. Se conocen 15 subtipos de virus de la influenza que infectan a las aves lo que representa un amplio espectro de reservorios del virus. Hasta la fecha, todos los brotes de la forma hiperpatgena han sido causados por los subtipos H5 y H7 de la cepa A.
CARACTERSTICAS DEL VIRUS DE LA INFLUENZA

Todos los virus de la influenza del tipo A, incluidos los que regularmente causan epidemias estacionales en el hombre, son genticamente lbiles y estn bien adaptados para eludir las defensas del husped. Los virus de la influenza carecen de los mecanismos de correccin de pruebas y reparacin de errores que operan durante la replicacin gentica. Como resultado de esos errores no corregidos, la composicin gentica de los virus cambia conforme se van replicando en el hombre y en los animales, y la cepa original se reemplaza por una nueva variante antignica. Estos cambios constantes y por lo general pequeos de la composicin antignica de los virus A de la influenza es lo que se denomina deriva antignica. La tendencia de los virus de la influenza a experimentar cambios antignicos frecuentes y permanentes obliga a vigilar constantemente la situacin mundial de la enfermedad y a introducir cada ao ajustes en la

composicin de las vacunas. Ambas actividades son una piedra angular del Programa Mundial de la OMS contra la Influenza desde sus inicios en 1947. Los virus de la influenza presentan una segunda caracterstica de inters en salud pblica: la cepa A de influenza, incluidos los subtipos de diferentes especies, pueden intercambiar o recombinar su material gentico y fusionarse. Ese proceso de recombinacin, conocido como shift (cambio) antignico, desemboca en un nuevo subtipo distinto de los dos virus originales. Como las poblaciones carecen de inmunidad frente al nuevo subtipo, y sin vacuna alguna que confiera proteccin contra l, el cambio antignico ha dado lugar a lo largo de la historia a pandemias altamente letales. Para que ello ocurra, el nuevo subtipo ha de poseer genes de los virus de la influenza humana que le permitan transmitirse fcilmente de una persona a otra durante periodos sostenibles.

2. TCNICA: ELISA (2,3,4,5)

FUNDAMENTO
La influenza aviar (IA) es causada por una infeccin de los virus miembros de la familia Orthomyxoviridae del gnero virus de influenza A. Los virus de influenza son los ortomixovirus y es conocido que afectan a las aves; y muchas especies de aves han demostrado ser susceptibles a la infeccin con el virus de la gripe. Las aves acuticas constituyen un reservorio importante para estos virus, pero la inmensa mayora de los aislamientos han sido de baja patogenicidad para los pollos y los pavos, siendo las principales aves de importancia econmica en ser afectadas. El Anigen AIV (Virus de la gripe aviar) Ab ELISA es una enzima de inmuno-ensayo competitivo para la deteccin cualitativa de anticuerpos frente a la AIV ms comn y frecuente en el pollo, el pavo, el suero de gallina o de pato. El Kit Anigen AIV Ab ELISA se compone de una microplaca con pozos que son pre-recubiertos con el antgeno VIA en los mismos con fines diagnosticos. Las microplacas ELISA recubiertas con el antgeno (nucleoprotena) se incubaron con una mezcla a partes iguales de suero y HRP-Mab (Dilucin 1:100) durante 30 minutos a 37. Durante la primera incubacin, los anticuerpos AIV presentes en la muestra y HRP conjugado con anticuerpos monoclonales se unen competitivamente a los antgenos en el pozo. Luego a esta incubacin, todo el material no unido se elimina mediante aspiracin y lavado antes de la adicin de una solucin de sustrato. La actividad enzimtica residual encontrada en cada pozo ser inversamente proporcional a los anticuerpos anti-VIA en la muestra a analizar, y se detecta mediante la incubacin de la fase slida, con una solucin de sustrato. La reaccin se detiene, con una solucin para dicho proposito y las lecturas colorimtricas se realizan mediante el uso de un espectrofotmetro a 450 nm y 620 nm de referencia.

Los antgenos AIV especialmente seleccionados son utilizados como material de captura en la prueba, lo que permitir a la Anigen AIV Ab ELISA identificar anticuerpos al virus de la gripe aviar en las muestras con un alto grado de precisin.

MATERIALES
1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Kit Elisa Ab AIV Anigen (Todos los reactivos incluidos) Suero problema en perfectas condiciones (sin hemlisis ni contaminacin) Sueros control en perfectas condiciones Micropipeteador Puntas descartables Agua Destilada Descartador de liquidos Reloj Temporizador

RECOMENDACIONES
Previo a la prueba, la microplaca, muestras problema y reactivos deben estar a temperatura ambiente (18 a 26 C) durante 40 minutos. Deben evitarse muestras con hemolisis, fibrina, heparina, EDTA, hiperlipemia y cualquier tipo de quimico o residuo de los mismos que puede causar interferencia en la metodologa presentada a continuacin.

METODOLOGA
A. PREPARACIN DE LOS REACTIVOS 1. Permitir que todos los reactivos estn a temperatura ambiente antes de su uso. 2. No diluya las muestras a determinar o los controles positivos y negativos. 3. conjugado enzimtico (100X concentrado): El concentrado de enzima conjugada se debe diluir 1 a 100 con el diluyente conjugado antes de su uso. 4. Las soluciones de lavado (10X concentrado): El concentrado de lavado debe ser diluido 1 a 10 con agua destilada / desionizada antes de ser usado.

B. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
5. Prepare suficientes pozos de prueba para dos controles negativos, dos controles positivos y para cada una de las muestras de ensayo. 6. Aadir 50 del control positivo, 50 del control negativo y las muestras de ensayo en cada uno de los pozos asignados. 7. Aadir 50 de Mab-HRP (dilucin 1:100) a cada pozo.

8. Cubrir la fila de pozos en la microplaca con sellador adhesivo y mezclar bien vibrando (el uso de un mezclador automtico es recomendable pero no indispensable). Recuerde que la mezcla es muy importante para conseguir resultados reproducibles. 9. Incubar los pozos a 37 durante 30 minutos. 10. Lave los pozos (6) veces con 350 de solucin de lavado diluida. Importante: aspire todo el lquido de los pozos. 11. Aadir 100 de sustrato a cada pozo. 12. Incubar los pozos durante 10 minutos a temperatura ambiente. 13. Se aaden 100 de solucin de parada (Stop Solution) a cada pozo. C. LECTURA 14. Lea la absorbancia de los pozos con un espectrofotmetro bicromtico a 450nm con la longitud de onda de referencia a 620nm. La lectura debe ser completada dentro de una (1) hora desde el final del montaje.

INTERPRETACIN
Calcular la absorbancia de los controles negativos, luego calcular el PI (Porcentaje de Inhibicin), valorado para cada suero, usando la formula de porcentaje de inhibicin siguiente: Valor PI= [1-(Abs Muestra Problema/Abs Control Negativo)] x 100

RESULTADOS (Contraste con la tabla):

Valor PI 40 41 ~ 50 51 Estado de Anticuerpo AI NEGATIVO SOSPECHOSO POSITIVO

BIBLIOGRAFA
(1) (2) (3) (4)
Material de Consulta de CENAVECE, http://www.cenavece.salud.gob.mx/emergencias Norma Chilena Oficial N Ch-ISO 17025.Of. 2001. Laboratory Biosafety Guidelines, Medical Research, versin vigente. Reglamento especifico para la Acreditacin de Laboratorios Anlisis/Ensayo, SAG., versin vigente. Resolucin Exenta 3114 de 29 de septiembre de 1998, modificada por la Resolucin Exenta N 2200 de 23 de abril de 1999. (5) Manual de Estndares para Pruebas Diagnsticas y Vacunas de la O.I.E., versin vigente.

3. INMUNODIFUSIN EN GEL DE AGAR (1, 2, 3)

FUNDAMENTO
Todos los virus de la gripe poseen una nucleocpsida y antgenos de la matriz similares antignicamente. Este hecho permite detectar la presencia o ausencia de anticuerpos frente a cualquier virus de la gripe mediante ensayos IGDA. Las preparaciones concentradas de virus, como se describi anteriormente, contienen antgenos de la matriz y la nucleocpsida; el antgeno de la matriz difunde ms rpidamente que el antgeno de la nucleocpsida. Los ensayos IGDA se han empleado extensa y rutinariamente para detectar anticuerpos especficos en rebaos de pollos o pavos como un indicador de la existencia de infeccin. Generalmente, estos ensayos han utilizado preparaciones enriquecidas de nucleocpsida obtenidas a partir de las membranas corioalantoideas de embriones de pollo (6) que han sido infectados a los 10 das de edad, se han homogenizado, congelado y descongelado tres veces, y centrifugado a 1.000 g. Los fluidos sobrenadantes se inactivan mediante la adicin de formalina al 0,1% o betapropiolactona al 1%, se centrifugan de nuevo y se utilizan como antgeno. No todas las especies de aves pueden producir anticuerpos precipitantes despus de la infeccin con el virus de la gripe. Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con el antgeno correspondiente, se forman complejos antgeno-anticuerpo que se insolubilizan en su mayor parte, dando lugar a una reaccin de precipitacin. Empleando soportes adecuados es posible que los antgenos y anticuerpos migren con diferentes velocidades, de modo que al encontrarse interreaccionen y precipiten. Los geles utilizados como soporte tienen como base pectina, alginatos, poliacrilamida e incluso pueden utilizarse tiras de acetato de celulosa gelatinizado. Los precipitados que se originan se visualizan como bandas, que permanecern estables mientras un mayor flujo de molculas de alguno de los reactivos empleados no provoque su redisolucin. Se utiliza normalmente el mtodo de Oucherlony o de doble difusin. Consiste en enfrentar en pequeas perforaciones efectuadas en el agar, las soluciones de antgeno y anticuerpo. Al difundir y ponerse en contacto, producirn una banda de precipitacin slo si se encuentran en concentraciones ptimas. Si sta concentracin es la que corresponde a la zona de equivalencia de la banda de precipitacin estar situada aproximadamente en la distancia media que separa los reservorios. Cuando hay exceso de antgeno o anticuerpo, la banda estar ms prxima al pocillo del anticuerpo o del antgeno, respectivamente.

MATERIALES
a. Agar: Buffer Tris 0,05 M PH 8, NaCl 8,5%, Agar Noble 0,85%. b. Antgeno y antisuero control. c. Sueros problema. d. Otros: Portaobjetos Pipetas Cmara hmeda.

CONSIDERACIONES
Normalmente, los ensayos se realizan empleando geles de agarosa al 1% (p/v) o agar purificado con un 8% (p/v) de NaCl en tampn fosfato 0,1M, pH 7,2, que se vierten en placas de Petri o en portaobjetos hasta obtener un grosor de 2-3 mm. Se cortan pocillos en el agar de aproximadamente 5 mm de dimetro y separados 2-5 mm empleando un molde y un cter.

MTODO
PREPARACIN DEL AGAR: Disolver a Bao Mara hasta que se vea transparente. Colocar 3,5 ml sobre un portaobjeto limpio y desengrasado. Dejar enfriar en un ambiente libre de polvo o tapado hasta que solidifique bien. Una vez solidificado conservar tapado y a 4C hasta su uso. Perforar usando el sacabocado convencional que indique el kit, de 7 bocas (una central y 6 perifricas). Extraer el agar de los pocillos con bomba de vaco. SIEMBRA:
1.

Colocar el suero positivo de referencia en 3 de los pocillos perifricos en forma alternada. Colocar luego los sueros problema en los orificios restantes. Llenar los pocillos hasta la superficie, sin dejar menisco (aproximadamente 75 ul.). Colocar el antgeno en el pocillo central de la misma manera. Incubar a temperatura ambiente (20 - 25), en cmara hmeda durante 48 horas.

2. 3.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Usar una fuente de iluminacin que provea y que incida en forma oblicua al plano inferior de la placa.
A. NEGATIVO (REACCION DE NO IDENTIDAD): La lnea control contina hasta el pocillo del suero

problema.
B. POSITIVO (REACCIN DE IDENTIDAD): La lnea control se une en forma continua con la lnea producida

por el suero problema.

C. D. INESPECFICO: La lnea del suero problema se cruza con la lnea control. POSITIVO O DBIL: La lnea control se curva ligeramente pero no alcanza a formar una lnea completa

entre el suero problema y el antgeno.

Las lneas de precipitina pueden detectarse despus de aproximadamente 24-48 horas, aunque esto puede depender de las concentraciones de anticuerpo y antgeno. Estas lneas se observan mejor frente a un fondo oscuro iluminando por detrs. Se considera un resultado especfico positivo cuando la lnea de precipitina entre el pocillo del control positivo es continua con la lnea entre el antgeno y el pocillo problema. Las lneas cruzadas se interpretan como debidas a un suero problema que carece de identidad con los anticuerpos del pocillo del control positivo.

BIBLIOGRAFIA
1. 2. 3. Morilla, A., Bautista, C., 1986. Manual de Inmunologa pag. 51 - 62. Alonso et al. 1992. Manual dediagnstico de la boratorio de las enfermedades vesiculares. O.I.E. 1991. Manual of recommended diagnostic techniques and requirements for biological products.