Vacinas de DNA

O paradigma das vacinas gnicas

acinas podem ser apresentadas em diferentes formas. O estado de imunidade pode ser induzido atravs do uso de variados tipos de vacinas, as quais encontram-se comercialmente disponveis e so baseadas em microrganismos vivos atenuados, microrganismos vivos inativados, extratos de microrganismos ou protenas recombinantes. Alm das formas j disponveis, encontram-se em estgio experimental as vacinas base de peptdios, as que utilizam microrganismos vivos recombinantes e as vacinas de DNA. A vacina de DNA a mais recente forma de apresentao que veio revolucionar o campo da vacinologia. Ela representa um novo caminho para a administrao de antgenos. O processo envolve a introduo direta do DNA plasmideano, que possui o gene codificador da protena antignica, e ser expressa no interior das clulas. Este tipo de vacinao apresenta uma grande vantagem, pois fornece para o organismo hospedeiro a informao gentica necessria para que ele fabrique o antgeno com todas as suas caractersticas importantes para gerao de uma resposta imune. Isto sem os efeitos colaterais que podem ser gerados quando so introduzidos patgenos, ou os problemas proporcionados pela produo das vacinas de subunidades em microrganismos. As vacinas de DNA, em teoria, representam uma metodologia que se aproxima da infeco natural, alcanando a induo da proteo desejada.
VANTAGENS E PROBLEMAS POTENCIAIS DAS VACINAS DE DNA

Vasco Azevedo Prof. adjunto do Departamento de Biologia Geral do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Minas Gerais UFMG. Obteve o seu grau de doutor pelo Institut National Paris-Grignon e pelo Institut National de La Recherche Agronomique de Jouy-en-Josas na Frana e fez seu psdoutorado na Universidade da Pensilvnia. vasco@icb.ufmg.br Sergio Costa Oliveira Prof. adjunto do Departamento de Bioqumica e Imunologia do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG. Obteve o seu grau de doutor pela Universidade de Wisconsin-Madison (USA), onde tambm fez o seu ps-doutorado. scozeue@icb.ufmg.br
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O uso das vacinas de DNA oferece uma srie de vantagens econmicas, tcnicas e logsticas quando compara-

do com as vacinas clssicas, especialmente se considerarmos a sua utilizao nas condies oferecidas pelos pases em desenvolvimento. Por exemplo, a produo em larga escala bem mais barata, a manuteno do controle de qualidade mais fcil, e a comercializao no necessita de uma rede de refrigerao, pois estas vacinas so estveis temperatura ambiente. Estes fatores facilitam o transporte e a distribuio, e viabilizam a transferncia desta tecnologia para estes pases. Alm disso, tcnicas de biologia molecular possibilitam a modificao de seqncias e a adio de epitopos heterlogos a uma protena antignica, usando-se somente manipulaes simples feitas diretamente no plasmdeo, que o componente das vacinas gnicas. Essas manipulaes genticas podem nos dar subsdios para entendermos as relaes entre estrutura e funo destes antgenos com a resposta imune. Como possveis desvantagens podem ser citadas a possibilidade de integrao do plasmdeo ao genoma hospedeiro de maneira danosa ou a exposio do sistema imune a nveis constitutivos de antgenos durante o perodo de expresso do gene. No primeiro caso, o DNA plasmideano pode gerar patogenias, especialmente se este se integrar em clulas somticas, gerando mutagnese por insero, que pode levar a ativao de protoncogenes ou inativar genes supressores de tumor. No segundo caso, a apresentao constitutiva de um antgeno pode ter conseqncias desastrosas, como induo de tolerncia e auto-imunidade. Nenhuma evidncia destes fenmenos foi comprovada, e testes rigorosos devem ser feitos para que se possa passar dos modelos experimentais para o homem. VETORES DE EXPRESSO PARA A

CONSTRUO DE VACINAS DE DNA Nas ltimas duas dcadas foram desenvolvidos diferentes tipos de vetores de expresso. A expresso de protenas heterlogas em clulas de mamferos tornou-se uma tcnica essencial para ajudar a elucidar os mecanismos dos processos celulares e da transferncia gnica. Os vetores usados rotineiramente para a transferncia gnica so os retrovrus, vrus vaccinia ou adenovrus, que necessitam de uma etapa de empacotamento do DNA. O sistema de vacinas de DNA contrasta com os sistemas de expresso acima citados, pois no necessita desses vetores complexos. O princpio das vacinas de DNA se baseia na clonagem do gene desejado em plasmdeos, o qual dever ser expresso dentro das clulas do hospedeiro sem posteriores manipulaes. Os plasmdeos, fragmentos de DNA extracromossmico circulares presentes nas bactrias, foram inicialmente isolados espontaneamente da natureza. A partir destes, alguns pesquisadores comearam a construir plasmdeos quimricos reunindo os elementos importantes de cada um. Hoje chegamos terceira gerao de plasmdeos, com alta performance e maior complexidade, dos quais derivam a atual famlia de vetores de expresso em clulas de mamferos. ELEMENTOS QUE INFLUENCIAM NA EXPRESSO GNICA EM CLULAS DE MAMFEROS Os vetores de expresso usados em vacinas de DNA em geral possuem uma regio promotora e acentuadora forte, um ntron quimrico otimizado e um sinal de poliadenilao (figura 1). Esses trs elementos combinados so essenciais para uma expresso alta e constitutiva nas clulas de mamferos. Possuem tambm um elemento adicional, como os stios nicos de clonagem especialmente desenhados para no comprometer a expresso das seqncias clonadas. Ressaltamos outro elemento adicional que no tem ligao com a expresso, mas de extrema importncia para a produo de vacinas de DNA: a origem de replicao do plasmdeo ColE1 da Escherichia coli.

doadores crpticos. Estes, se presentes, podem ser utilizados na exciso da molcula supracitada, o que resulta em uma diminuio ou na ausncia de expresso. Experimentos de transfeco com os genes reprteres CAT e luciferase demonstraram que a presena deste ntron flanqueando os insertos de cDNA aumenta o nvel de expresso, variando de acordo com o tipo de cDNA. No caso do CAT houve um aumento de 20 vezes na expresso gnica, e no caso da luciferase, um incremento de apenas trs vezes. Sinal de poliadenilao O sinal de poliadenilao possui a funo de adicionar a cauda poli (A) e de ser reconhecido no trmino da transcrio pela RNA polimerase II. A poliadenilao aumenta a estabilidade e traduo da molcula de RNA. Como pode ser observado na figura 1, ele colocado imediatamente aps a enzima Not I dos stios nicos de clonagem. Elementos adicionais Na literatura, foi demonstrado in vitro e in vivo que grandes estruturas de "grampo" na extremidade 5' notraduzida do RNA mensageiro reduzem o nvel de traduo em eucariotos superiores. Os stios nicos de clonagem dos vetores de expresso so desenhados atravs de predies para que no se adicionem estas estruturas aos RNAs transcritos. A origem de replicao de procariotos que geralmente utilizada em plasmdeos de expresso a ColE1. A manuteno do alto nmero de cpias est diretamente ligada a eventos que ocorrem no incio da replicao e so controlados pela origem ColE1. Ele o mais bem caracterizado sistema de nmero de cpias, sendo capaz de manter mais de 20 plasmdeos por clula de Escherichia coli, o que resulta em uma alta produo de DNA plasmideano em bactria. PRINCIPAIS VIAS DE ADMINISTRAO As vacinas gnicas podem ser administradas atravs da injeo direta de DNA diludo em soluo salina no msculo do animal; ou atravs do processo da biobalstica, utilizando-se o gene gun (arma de genes), aparelho que promove a acelerao e introduo de
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Figura 1. Plasmdeo pCMV-bgal. Elementos que influenciam na expresso gnica

Discutiremos abaixo a importncia de todos estes elementos: Regio acentuadora e promotora Esta a regio que controla a expresso do gene clonado. Geralmente obtida do citomegalovrus humano (CMV), contudo, outros promotores podem ser usados. A caracterstica intrnseca importante a capacidade de conduzir uma expresso forte em vrios tipos de clulas. A sua natureza promscua foi comprovada quando um plasmdeo contendo o gene codificador para a cloranfenicol acetiltransferase (CAT) regulado pelo CMV (acentuador/promotor) foi transfectado em clulas de camundongos. A atividade desta enzima foi encontrada em 24 de 28 tecidos analisados. ntron quimrico Logo em seguida regio acentuadora/promotora, os vetores possuem um ntron quimrico. A composio deste ntron feita com o stio doador do primeiro ntron do gene da betaglobulina humana e o stio aceptor da regio varivel da cadeia pesada do gene da imunoglobulina. Sua localizao na regio 5' anterior (no caso do inserto ter sido clonado a partir de cDNA) impede a utilizao de stios

Figura 2. Avaliao histoqumica da expresso do gene que codifica a bgalactosidase em orelhas de camundongos BALB/c que foram vacinados pelo processo da biobalstica, utilizando-se o plasmdeo pCMV-bgal. A b-galactosidase hidrolisa o substrato X-Gal, gerando uma colorao azulada que detectada nas clulas e tecidos transfectados.

gentica e terapia gnica. Atravs do uso destas metodologias, pode-se induzir uma resposta imune longeva mesmo com apenas uma dose da vacina gnica, ativando linfcitos T citotxicos e linfcitos B para a produo de anticorpos. Injeo direta de DNA no msculo A possibilidade da transferncia de genes sem a utilizao de um vetor viral estimulou o desenvolvimento de uma nova tcnica de imunizao que

micropartculas de ouro encobertas com o DNA de interesse na derme do animal. Em menor escala, podemos tambm mencionar o uso de DNA encapsulado em lipossomos como mecanismo utilizado na imunizao

uma simplificao radical na metodologia de vacinao. Para obterse uma resposta imune desejvel basta introduzir o DNA plasmideano contendo o gene que codifica uma protena antignica, a qual ser expressa dentro de clulas do organismo hospedeiro. O sistema de imunizao gnica mais comumente utilizado baseia-se na injeo intramuscular (i.m.), geralmente nos msculos femural ou quadrceps de camundongos, utilizando-se uma seringa usada para insulina com agulha de dimetro em torno de 27. Inoculase em torno de 50 microlitros (ml) do plasmdeo em uma concentrao de 1mg/ml em cada perna do animal a ser imunizado. Nveis satisfatrios da expresso de genes reprteres j foram detectados mesmo depois de um ano e meio aps uma nica injeo de DNA no msculo. Em nosso laboratrio, utilizamos uma administrao de cardiotoxina a 10mM cinco dias antes da injeo com o DNA de interesse, para induzir um ciclo de necrose e reparo muscular com o objetivo de aumentar os nveis de expresso gnica. A biobalstica O processo da biobalstica uma metodologia simples e efetiva para a introduo e expresso de genes em diferentes organismos, incluindo clulas e tecidos animais. Em 1992, o grupo do Dr. Stephen Johnston, da Universidade do Texas (Southwestern Medical Center, TX), foi o primeiro a utilizar esta tecnologia para induzir uma resposta imune contra a luciferase atravs do bombardeamento de DNA na derme de camundongos BALB/c. A biobalstica utiliza microprojteis em alta velocidade para introduzir cidos nuclicos em clulas e tecidos in vivo. Foram desenvolvidos e construdos diferentes sistemas capazes de acelerar micropartculas (0,2 a 4mm de dimetro) encobertas com cidos nuclicos a velocidades superiores a 1.500km/h-1. Foi demonstrado que estas partculas penetram a parede e membrana celular de maneira no-letal, localizando-se aleatoriamente nas organelas celulares. Conseqentemente, o DNA dissociado das micropartculas pela ao do lquido celular, ocorrendo ou no a integrao do gene exgeno no genoma do organismo em questo. O aparelho (gene gun) que utilizamos foi projetado e construdo pelo nosso colaborador, Dr. Elibio L. Rech, do Centro Nacional de Pesquisas em Recursos Genticos e Biotecnologia da EMBRAPA, e a onda de choque necessria para deslocar a molcula de DNA gerada atravs do

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gs hlio a baixa presso. Em nosso laboratrio, temos utilizado o gene reprter que codifica para a bgalactosidase para otimizarmos o processo de imunizao gentica atravs da biobalstica. A figura 2 mostra a expresso do gene da b-galactosidase em orelhas de camundongos BALB/c aps a imunizao com o plasmdeo pCMV-bgal precipitado em micropartculas de ouro de 1,5 a 3mm de dimetro. Uma das grandes vantagens deste mtodo a utilizao de pequenas quantidades de DNA (< 1mg), mais do que cem vezes menos material biolgico quando comparado com a injeo direta no msculo (em torno de 100mg). A RESPOSTA IMUNE Diversos pesquisadores induziram a ativao da resposta imune humoral e celular em animais experimentais, utilizando os processos da biobalstica e a injeo direta no msculo. Contudo, muitos parmetros precisam ser mais bem estudados para o entendimento dos diferentes tipos de resposta imune produzidos. Dentre estes parmetros podemos citar a quantidade de DNA inoculado, as vias e mtodos de administrao e as clulas apresentadoras de antgeno envolvidas no processo. Em nosso laboratrio, temos estudado as diferentes formas de administrao das vacinas gnicas com o objetivo de otimizar os parmetros tcni-

cos, maximizando a expresso gnica e conseqentemente a resposta imune. A figura 3 mostra os nveis de IgG total produzidos contra a bgalactosidase em animais imunizados pela injeo intramuscular do plasmdeo pCMV-bgal, pelo processo da biobalstica e atravs da inoculao de DNA encapsulado em lipossomos. Como se pode observar, os nveis de anticorpos totais mais altos foram obtidos quando a biobalstica foi a metodologia utilizada em comparao com os demais sistemas. A injeo direta no msculo induziu nveis de anticorpos um pouco abaixo do nvel produzido pelos animais imunizados atravs da biobalstica, sendo que o tratamento usando lipossomos foi o menos eficiente na induo da produo de anticorpos especficos. No que refere-se ao perfil de citocinas produzido, tem sido sugerido que o processo da biobalstica induz um padro de resposta imune do tipo Th2 (IL-4, IL-5, IL-10), enquanto a injeo intramuscular induz um perfil de resposta imune do tipo Th1 (IL-2, IFNg). Contudo, esta dicotomia simplista no exclusiva, pois alguns pesquisadores tm demonstrado que a biobalstica no induz apenas respostas do tipo Th2. Nossos resultados preliminares tm demonstrado que a injeo intramuscular produz mais IgG2a, o que caracteriza um perfil do tipo Th1, enquanto a biobalstica induz a produo de IgG1 e IgG2a, o que

Figura 3. Nveis totais de IgG anti-b-galactosidase determinados por ELISA nos soros de camundongos BALB/c imunizados com os plasmdeos pCMV (grupo-controle) e pCMVbgal pelos mtodos da biobalstica, injeo direta no msculo e atravs do uso de lipossomos.

caracteriza um perfil misto do tipo Th0. Isto sugere que a polarizao de um tipo de resposta imune do padro Th1 induzido pela injeo intramuscular pode ser devida ao efeito adjuvante de grandes quantidades de DNA plasmideano injetado no animal. Nossa experincia revela que a utilizao da biobalstica como metodologia de imunizao produz resultados menos dspares, provavelmente devido ao uso de um aparelho, o que diminui a variao no processo em relao ao uso da injeo com a seringa. A injeo intramuscular resulta em contrastes mais acentuados na resposta imune obtida, que pode ser explicada tambm pelo fato de que o DNA injetado extracelularmente, onde a maioria das molculas de cidos nuclicos so degradadas rapidamente por nucleases. Em contraste, no processo da biobalstica o DNA inserido no interior da clula, evitando uma reduo inicial no nmero de plasmdeos. No que se refere ao custo, a biobalstica torna-se um procedimento mais caro devido aquisio do gene gun comparado com agulha e seringa utilizadas na injeo intramuscular. Como pode-se notar, as duas metodologias possuem vantagens e desvantagens, sendo a combinao entre ambas a melhor opo para a otimizao do processo de imunizao gentica. A induo de um padro de resposta imune do tipo Th1 pela injeo i.m. pode ser utilizada no combate direto a infeces intracelulares como a leishmaniose, tuberculose, toxoplasmose, brucelose, listeriose, e alergias; enquanto o perfil Th2, supostamente gerado pela biobalstica, pode ser direcionado para o controle da esquistossomose e outras doenas tropicais cada vez mais crescentes nos pases em desenvolvimento. Diferentemente das vacinas inativadas ou de subunidade, as vacinas gnicas resultam em uma apresentao antignica via molculas de MHC de classe I e classe II, o que mimetiza o processo resultante de uma infeco natural, ativando linfcitos T CD4+, CD8+ e a produo de anticorpos. Os diferentes tipos de resposta imune induzida pela imunizao gentica justificam a sua aplicao nos campos das doenas infecciosas, alergias e tumores, e, independente da metodologia empregada, entendemos que a vacina gnica hoje a tecnologia mais moderna para ser utilizada no controle das enfermidades do nosso mundo.
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