A L-asparaginase uma enzima constitutiva na maioria dos microrganismos citados, com exceo no Proteus vulgaris (Tosa et al.

., 1972) e Saccharomyces cerevisiae (Dunlop et al., 1978). Algumas destas enzimas apresentam atividade antineoplsica, embora poucas possam ser utilizadas como quimioterpicos, fato que continua estimulando a pesquisa de novos tipos desta enzima para o enriquecimento desse recurso teraputico. Algumas bactrias, como a Escherichia coli, apresentam duas protenas independentes com atividades de asparaginase. Uma delas est localizada no citoplasma, a asparaginase I, e a outra no espao periplasmtico, a asparaginase II, e somente a do tipo II apresenta atividade antineoplsica (Campbell et al., 1967. Na clula animal normal, a asparagina no um aminocido essencial para a manuteno da viabilidade celular, assim, a clula supre a falta deste aminocido atravs da ao da asparagina sintetase. A asparagina sinttica uma enzima intracelular, indutvel e responsvel pela sntese de novo da asparagina. Em nveis basais de asparagina, a sntese da asparagina sintetase no induzida (Wriston & Yellin, 1973) (Keating et al., 1993). As clulas neoplsicas no so capazes de induzir asntese da asparagina sntese , portanto, so dependentes do nvel extracelular de asparagina para realizar sua sntese protica. Como a asparagina retirada do meio plasmtico por ao da asparaginase, as clulas neoplsicas, incapazes de realizar a sntese de novo de asparagina, entram em colapso metablico e morrem.A L-asparaginase mostrou-se muito til no tratamento da leucemia linfoctica aguda, leucemia mielide aguda e linfomas. A capacidade de reduzir substancialmente o nvel plasmtico de asparagina e de mant-lo baixo por perodo de tempo prolongado a caracterstica principal, responsvel pela atividade antineoplsica da asparaginase, e foi ainda demonstrado que os nveis de aminocidos tm que cair a nveis crticos de 0,005 mM, externamente, e no pool interno de 0,05 mM, para interromper a sntese de protenas e, conseqentemente, o crescimento celular. Em 1968 foi observado que nas clulas neoplsicas asparaginase-sensveis e asparaginase-resistentes o nvel de asparagina intracelular da ordem de 0,02 mM. (Broome, 1968). Nos tratamentos com a asparaginase a taxa de regresso de tumores bastante elevada e a reduo da induo de leucemias atinge valores de 75% a 95%. Existem alguns fatores limitantes para o uso da asparaginase como quimioterpico. Um dos fatores a ser considerado a necessidade de doses dirias de injees parenterais de 10 a 200 U/kg/dia, por perodo de tempo que pode durar 21 dias. Um outro fator seria o de apresentar alguns efeitos txicos, como hiperglicemia, queda na albumina srica, nas lipoprotenas e fibrinognio, aumento de gordura no fgado e algumas disfunes cerebrais leves. O fator limitante mais importante o desenvolvimento de hipersensibilidade ao tratamento. Isto ocorre entre 5 e 50% dos pacientes tratados. Esta hipersensibilidade vai desde pequenas reaes alrgicas na rea de injeo, broncospasmos e at choque anafiltico, sugerindo que o paciente no deve ser submetido vrias vezes a tratamentos com o mesmo tipo de asparaginase. O quadro alrgico se instala ao mesmo tempo em que se processa o chamado immunoclearence plasmtico da enzima, condies em que a asparaginase rapidamente metabolizada, perdendo o seu efeito teraputico (Ohmuma et al., 1970) (Keating et al., 1993). Com o objetivo de amenizar pelo menos parte desses problemas, foram desenvolvidos experimentos de modificao estrutural e de conjugao da L asparaginase com compostos orgnicos As modificaes variam desde conjugao da molcula protica com bioplmeros, como polietilenoglicol, dextrana, albumina e heparina, ao melhoramento gentico de bactrias produtoras da enzima. Com estas modificaes, outras caractersticas foram adquiridas, como, por exemplo, o aumento do tempo de circulao, resistncia inativao por enzimas proteolticas, mudana na caracterstica da superfcie, diminuindo sua capacidade antignica, aumento na afinidade pela clula alvo e manuteno da atividade enzimtica (Ducan & Spreafico, 1994). A forma de asparaginase conjugada mais conhecida para uso clnico a do tipo II de Escherichia coli com polietilenoglicol (PEG), com a qual tm-se obtido excelentes resultados. A meia vida (t1/2) do conjugado PEG-asparaginase de mais ou menos seis dias, contra aproximadamente um dia da asparaginase nativa (Keating et al., 1993). A descoberta de novas asparaginases com atividades antineoplsicas de importncia fundamental, principalmente se elas forem imunologicamente diferentes daquelas at ento estudadas. dimetro de 0,6 a 0,7 mm e tamanho variando de 1,5 a 5 mm dependendo do meio em que cultivada. mvel, possuindo de um a trs flagelos em um ou ambos os plos (Baldani et al., 1986). Asparagina conhecido por ser um excelente agente anti-cancro. presente no estudo, o efeito combinado de pH e da temperatura sobre o rendimento de L asparaginase de purificado novel Pectobacterium carotovorum foi estudada em condies de ensaio utilizando o mtodo de superfcie de resposta.

Estudos de desactivao e parmetros termodinmicos desta enzima terapeuticamente importante tambm foram investigados. O pH ptimo e a temperatura do purificado L Asparaginase foram consideradas 8,49 e 39,3 C, respectivamente. A taxa de desactivao mnimo constante (Kd) e semivida mxima (t1 / 2) verificou-se que 0,041 min-1 e 16,9 h, respectivamente em pH de 8,6 e 40 C. Parmetros termodinmicos (AG, AHV, Ds, e energias de ativao) tambm foram avaliados para purificada L Asparaginase. O mecanismo provvel de desactivao purificado L asparaginase foi explicado de uma forma com base em estudos e desactivao parmetros termodinmicos. Asparaginase (L amidohidrolase Asparagina EC.3.5.1.1) uma enzima de importncia teraputica elevada tendentncia devido a Antineoplsicas(Antineoplsicos so medicamentos utilizado para destruir
neoplasmas ou clulas malignas e, tem a finalidade de evitar ou inibir o crescimento e a disseminao de tumores) atividades, e usar em certos tipos de terapias contra o cncer,principalmente na leucemia

linfoblstica aguda (LLA) .ALL um tipo de leucemia que comea a partir de clulas brancas do sangue na
medula ssea, a parte interna dos ossos. Se desenvolve a partir de clulas chamadas linfcitos, um tipo de glbulo branco central para o sistema imunolgico, ou a partir de linfoblastos, um tipo imaturo de linfcitos.)

Tambm utilizado na indstria alimentar para a produo de alimentos acrilamida livre, enzima modelo para o desenvolvimento de um novo sistema de entrega de drogas e L asparagina biosensor para a leucemia no Estudos sobre a estrutura molecular, a catlise, aspectos, determinantes genticos envolvidos na regulao e estabilizao para melhorar a meia-vida biolgica Asparaginase foram relatados No entanto,poucos estudos tm sido relatados Hemodinmicas aspectos desta enzima de estabilidade trmica estudos que ajudam a compreender a relao entre estrutura e funo de uma determinada enzima. Desativao asparaginase desempenha um papel vital no cncer terapia . Inativao rpida pode limitar a eficincia do processo teraputico. Um melhor conhecimento cintica de desactivao da enzima necessria para melhorar a viabilidade de utilizao teraputica. a desactivaoestudos iria fornecer valiosos conhecimentos fsicos em a estrutura e funo da enzima. Deactivao definida como um processo em que o secundrio, ter uma estrutura terciria ou quaternria de uma protena muda com a quebra de ligaes covalentes. A capacidade de para determinao de parmetros enzima uma medida da sua capacidade para catalisar uma reaco enquanto que a estabilidade da enzima julgado pela sua reside atividade UAL. Ambas estas propriedades so modificadas para uma grande medida pelo pH, temperatura e modificadores, tais como activadores, inibidores, etc O exame da relao navios entre propriedades de enzimas e ambientais condies desempenha um papel vital para prever, manipular e projetar a estrutura da protena. bem conhecido que a actividade e estabilidade de um enzima fortemente influenciado pelo pH e temperatura.Otimizao das variveis de processo usando uma varivel o tempo muito tedioso, trabalho intensivo e no tem como explicar os efeitos interactivos entre as variveis. Assim, no descreve os efeitos lquidos das vrias parmetros sobre a atividade enzimtica. O objectivo da comunicao estudar o com efeito combinado de pH e da temperatura na purificado asparaginase de Pectobacterium carotovorum MTCC 1428, sob condies de ensaio usando RSM, para demonstrar a cintica de desactivao purificado asparaginase, e para determinao de parmetros termodinmicos. MATERIAL E MTODOS

Estirpe bacteriana e as condies de cultura. O bactericida estirperial, P. carotovorum MTCC 1428 utilizado na presente investigao foi obtida a partir Microbiana Tipo Coleo Cultura e Banco Gene, do Instituto de Tecnologia microbiana (IMTECH), So Paulo,ndia. A cultura pura de isolar esta microbiana foi cultivadas num meio contendo (g / l): extracto de carne de vaca 1,0,extracto de levedura 2,0, NaCl 5,0, 5,0 e agar peptona 15,0 (PH 7,0), incubado a 30 C durante 24 h. A cultura foi mantida a 4 C por sub cultura cada ms. Produo de L Asparaginase e purificao. A produo de L? asparaginase foi realizada na meio semi-sinttico contendo optimizados (g / l):glucose 5,202; 2,076 L asparaginase;? Na2HPO4 2H2O, 6,0; KH2PO4 1,772, NaCl 0,5, MgSO4 7H2O 0,373; CaCl2 2H2O 0,015; extrato de levedura e 1,0 peptom 1,0 a pH inicial de 6,5 [12]. O inculo foi preparado por adio de um ciclo completo de puro recentemente preparada cultura da slant em 80 ml de meio estril mencionado acima contendo glicose como nica de carbono fonte de um Erlenmeyer de 500 ml. O frasco de cultura foi incubado a 30 C e 180 rpm num shak orbital ing incubadora de 10-12 h. A cultura foi transferida (2% v / v, em meados? Fase logartmica (DO a 600 nm =0,6-0,8)), em que um tanque de agitao biorreator de 7 litros (SartoriusBiostat B plus, Alemanha) com um volume de trabalho de 4 L. O biorreator foi operado a 30 C, 200 rpm, e 1,5 vvm com pH no controlado. As amostras foram desenhados em intervalos regulares de tempo, e da actividade especfica foi medido em triplicado intracelular L sparaginase foi isolado a partir de P. carotovorum MTCC 1428, como descrito por Kumar etal. [13]. Neste estudo, utilizou-se o elevado grau de pureza de preparao de enzima, a qual foi obtida por precipitao de protenas com sulfato de amnio seguida por Anion? Cromatografia de troca (DEAE-celulose) e cromatografia de filtrao em gel (Sephadex G? 100)[14]. A concentrao de protena foi determinada de acordo com o mtodo descrito por Lowry et ai. [15] usando BSA como um padro. Todos experincia cromatogrfica foram monitorizados para a protena a 280 nm. Estudos de desativao. As experincias foram conduzidas para estudar a estabilidade trmica de L asparaginase. O filtrado de cultura foi incubada a combinao diferente condies de pH e temperatura. Os nveis de pH e gama de temperatura seleccionada para estudar a desactivao de L asparaginase foram 7,6, 8,6 e 9,6 e 30-50,40-60 e 30-50 C, respectivamente. O sam enzima pios foram desativados em vrias combinaes de pH e temperatura, como mencionado acima, e aliquotas de amostras foram coletadas em diferentes intervalos de tempo.O pH das amostras foi ajustado a norma As condies de ensaio e mediram a actividade residual de L asparaginase. Estimativa da taxa de desactivao permanente (kd) e a metade de tempo de vida (t1 / 2). Desde a desativao da L Asparaginase um dos principais obstculos na eficincia de terapia , uma melhor compreenso do mecanismo de desactivao muito importante. A desativao de L Asparaginase assumida de seguir em primeiro lugar Kinet ordem ics. Isso chamado de duas etapas simples teoria fase [10].O dois mecanismo de estado o seguinte: O pressuposto do mecanismo que o ativo E estado enzima converte diretamente para inativos estado Ed sem fornecer qualquer quantidade significativa de interme diates. RESULTADOS E DISCUSSO

Produo de L Asparaginase e purificao. o nosso trabalho anterior [14], foi demonstrado que a biomassa rendimento e actividade especfica no final do cultivo em bioreactor foram encontrados para ser 0,97 0,03 g / l e 28,87 0,37 U / mg, respectivamente. GlutaminaseL livre Asparaginase foi purificado at homogeneidade aps a Sephadex G 100 cromatografia com 42,02% de rendimento. O enzima foi purificada cerca de 72? dobra com um actividade especfica de 2020,91 U / mg [14]. O ativo As fraces do passo de purificao final foram reunidas, conscentrou usando liofilizador e dialisada contra o Tampo Tris-HCl (50 mM, pH 8,6). O concentrado fraco foi armazenado a -20 C para posterior anlise de experimentos. L pureza? Asparaginase e molecular peso foi confirmada pela SDSPAGE, Nativo PAGE eo gel Cromatografia de filtrao em [14].O peso molecular do homotetramer purificada L Asparaginase e subunidades foi encontrado 144,42 e 36,10 kDa, respectivamente por MADI TOF MS [14].Otimizao de efeito combinado de pH e temperamento sobre o desempenho de L asparaginase sob ensaio condio. Os fatores mais importantes fsicos,que influenciam a taxa de reao enzimtica, so pH e a temperatura de incubao com o substrato.Cada enzima tem um pH caracterstico e temperatura optima para alm do qual a reduo da actividade foi observada. A temperatura e pH adequados para Asparagina sistema L Asparaginase foi determinado usando delineamento experimental estatstico. A fim para determinar as condies ideais, preliminares experimentos foram realizados para estudar o efeito do pH sobre a actividade da L? asparaginase (mantendo a constante temperatura). Os resultados mostraram claramente que o mximo? imum actividade foi observada quando o pH foi variado 8,0-9,0 [14]. Da mesma forma, os experimentos foram por formado para estudar o efeito da temperatura sobre a atividade de L asparaginase e descobriu que a maxima atividade me foi obtida quando a temperatura foi variou entre 35 e 45 C [14]. Ento, experimentos foram realizados em vrias combinaes de pH e temperatura. A matriz de desenho e os correspondentes resultados das respostas observados e previstos (L asparaginanase actividade) .A atividade da enzima varia 5237-6645 U / ml. A anlise de regresso tiple nos dados experimentais, o segundo? equao polinomial ordem foi encontrado para explicar a dependncia da L asparaginase actividade do pH e da temperatura de incubao em que, A B pH e temperatura.Os resultados foram analisados pela A NOVA como adequado para a concepo experimental utilizada . De acordo com a ANOVA de regresso quadrtica modelo, o modelo altamente significativo, como evidente do teste F Fisher (mdia de regresso quadrado: mdia residual quadrado 79,81), com uma probabilidade muito baixa valor (Pmodel> F 0,0001). Isto indica que o efeitos combinados de pH e de temperatura significativamente contriburam para maximizar a L actividade asparaginase. A bondade do modelo foi verificada por meio do coeficiente R2 de determinao, o que implica que a amostra variao de 95,02 para a dependncia de L asparagina o altamente significativa (P <0,0004). Contudo, a inter efeito de aco entre o pH ea temperatura mais baixa de efeito linear (P <0,0616), mas representaram sensivel ciably. Alm disso, constatou-se tambm que o coeficiente ciente para pH muito maior do que o coeficiente para temperatura. Isto sugere que qualquer alterao no pH tem grande efeito sobre a atividade enzimtica da L asparaginase de temperatura na gama estudada.O traado de contorno 2D explica o comportamento do sistema e atividade enzimtica mais independente variaveis, pH e temperatura so mostrados na Fig. 1. O

actividade da enzima mais elevada numa gama de temperatura (36-41 C) e pH moderada (8,4-8,6). Esta equao foi otimizado e resolvido por MINITAB otimizador. Os nveis ideais de temperatura e pH foram verificou-se que 39,3 C e 8,49, respectivamente. A fim de verificar as condies ideais, os experimentos foram realizada no ponto central e os nveis ideais de variaveis. Estas condies apresentaram maior enzima valor de actividade (6856 U / ml), em comparao com a utilizada presentemente para a anlise da actividade da enzima. Depois otimizao, L atividade asparaginase foi aumentado em 200 U / ml de amostra purificada.Estudos de desativao. L Asparaginase foi Desativado em vrias combinaes de pH e de temperatura como discutido na seo mtodos. A extenso a desactivao medida pela taxa de desactivao. A velocidade de desactivao proporcional enzima activa concentrao e kd (velocidade de desactivao constante) a constante proporcional. O processo de desactivao modelados como primeiro cintica de ordem e a desativao constante de velocidade foi avaliada. O valor mnimo de kd observada para L sparaginase foi 0,041 min-1 .As combinaes de pH e temperatura na qual o velocidade de desactivao acima mencionado mnimo constante foram observados em 8,6 e 40 C, respectivamente. O processo de desactivao foi encontrada para ser mais rpida a pH 7,6 do que a pH alcalino (8.6, 9.6) para L? Asparaginase. Naidu e Panda [19] observaram que o efeito semelhante do pH na velocidade de desactivao permanente como relatado nesteestudo. Esta possivelmente devido a troca de dissulfeto, que geralmente ocorre em condies quase neutras e alcalinas .Alm disso, a observao de intervio entre a estabilidade conformacional e enzima sugeriram que a actividade de enzimas que ocorrem naturalmente no se pode esperar para encontrar estabilidade a temperaturas muito acima do que a de crescimento de um organismo .Os resultados obtidos no presente estudo tambm indicam que o o pH ptimo ea temperatura lie perto da do crescimento condio.