Laboratorio de Microbiologa

Apartados de este ejercicio A. Finalidad de este ejercicio B. Panormica de un Laboratorio de Microbiologa C. Normas Generales D. El Puesto de Trabajo E. Equipos mas frecuentes F. Material ms utilizado G. Precauciones Bsicas en el Laboratorio de Microbiologa de los Alimentos

A. Finalidad de este ejercicio

La finalidad de este ejercicio es muy simple: Empezar a familiarizarse con el laboratorio de Microbiologa y adquirir una visin de conjunto del mismo, del equipo ms frecuente y de los materiales ms utilizados.

B. Panormica de un Laboratorio de Microbiologa

Un laboratorio de Microbiologa es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo con una buena tcnica asptica, y por tanto se requiere un ambiente limpio y ordenado. Cuando se maneja cualquier tipo de muestra se debe evitar que los microorganismos ajenos a nuestros cultivos y presentes en el ambiente se introduzcan en ellos contaminndolos, o que los microorganismos de la muestra nos contaminen a nosotros. Por ello, se debe trabajar siempre en condiciones de seguridad. En el laboratorio de Microbiologa encontraremos estas condiciones bien en las campanas de seguridad biolgica o bien en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas. Incluso aunque los microorganismos que se manipulen en un momento dado no sean supuestamente patgenos, todos los cultivos de microorganismos deben ser manejados con precaucin por su potencial patogenicidad. Algunos elementos comunes a cualquier laboratorio

Mesas de laboratorio bajas para trabajar sentado.

Mesas de laboratorio altas para trabajar de pie o apoyado en taburetes.

Fregadero y puntos de agua.

Vitrinas y armarios.

Algunos elementos ms especficos

Microscopio ptico

Estufas de cultivo

Autoclaves

Cabina de siembra

C. Normas Generales del Trabajo en Microbiologa

Todo el material empleado en el manejo de microorganismos deber estar estril.

Todas las manipulaciones debern realizarse en un radio de 10-15cm (zona asptica), alrededor de la llama del mechero, o bien en una campana de flujo laminar.

Se procurar disponer de todo el material necesario para el procesamiento de la muestra microbiolgica al alcance de la mano, para evitar desplazamientos innecesarios. Es necesario adquirir rapidez y automatismo, indispensable para una buena ejecucin de las tcnicas.

Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de cultivo para evitar el riesgo de la contaminacin. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en la piel, pelo, aire, ropa,, etc.) contaminen nuestras muestras. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.

Para deshacerse del material contaminado se deben utilizar unos recipientes adecuados para ser esterilizados posteriormente. Nunca debe tirarse nada por el fregadero o al cubo de la basura comn sin haber sido esterilizado previamente.

D. El Puesto de Trabajo en Microbiologa

1.- Debe de estar limpio 2.- Todo el material necesario para la manipulacin de microorganismos o muestras en Microbiologa debe de haber sido preparado adecuadamente (esterilizado o desinfectado o lavado ....) antes de empezar la manipulacin.

3.- Todo el material necesario debe de situarse de tal forma en el puesto de trabajo que facilite su utilizacin.

4.- La incorrecta disposicin espacial del material a emplear nos va a obligar a hacer movimientos inadecuados que pueden originar contaminacin y/o accidentes de la muestra, del puesto de trabajo, del ambiente y/o del personal. 5.- El no tener todo el material a emplear disponible nos obliga a desplazarnos durante la manipulacin de la muestra dentro del laboratorio estos desplazamientos, evitables, pueden originar una contaminacin del ambiente del laboratorio.

6.- La utilizacin de material que no haya sido tratado convenientemente para el trabajo a realizar puede originar una contaminacin de la muestra a manipular y los resultados que se obtengan no sern fiables.

E. Equipos mas frecuentes

Microscopio ptico Utilizan lentes pticas. TIPOS DE LENTES Ocular Objetivo AUMENTO DE LAS LENTES En la superficie de cada lente hay un nmero y un signo (X) marcado que es el aumento de la lente El aumento total del microscopio viene dado por el resultado de multiplicar el aumento del ocular por el del objetivo. Los objetivos pueden ser de (10X), (20X), (40X), (64X) y (100X). Aumento Si se utiliza un ocular de (10X) y el objetivo de (10X) 10 x 10 = 100 veces Si se utiliza un ocular de (10X) y el objetivo de (20X) 10 x 20 = 200 veces Si se utiliza un ocular de (10X) y el objetivo de (40X) 10 x 40 = 400 veces Si se utiliza un ocular de (10X) y el objetivo de (100X) 10 x 100 = 1.000 veces El maximo aumento que se puede conseguir con estas lentes, por tanto es 1.000 veces PODER DE RESOLUCION Es la capacidad de poder diferenciar y separar puntos muy cercanos.

El concepto es fcilmente comprensible con el ejemplo de los faros de un automvil. Supongamos un coche que viene por la noche desde muy lejos hacia nosotros. En la lejana slo se ve un haz luminoso, pero a medida que se acerca hay un instante que se diferencian dos haces luminosos (los dos faros) prximos pero separados. Autoclave Esterilizacin: Tratamiento que da como consecuencia la muerte de todos los organismos vivos en el objeto o producto tratado. Esterilizacin por calor hmedo Se realiza en autoclave durante 15 30 min, segn el volumen, a 115C 121C, segn la naturaleza del material que se desee esterilizar. Se utiliza para esterilizar: -Medios de cultivo -Ropa -Material de plstico resistente al calor hmedo -Objetos de metal que no se alteren con la humedad -Material de vidrio

Estufa incubadora

Estufa de incubacin: Cmara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos. Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su temperatura ptima de crecimiento. Generalmente permiten graduar la temperatura entre 1070C.

Frigorficos

Frigorfico: Cmara refrigerada. Se utiliza para conservar tanto materiales (medios de cultivo, reactivos) como microorganismos. Generalmente est a una temperatura fija de 4C por tanto la conservacin no es indefinida, aunque tambin son regulables. Los frigorficos mantienen la temperatura entre 0-10C y los congeladores por debajo de 0C, llegando a -80C los ultracongeladores.

Homogenizador de paletas o Stomacher

Homogenizador de paletas o Stomacher: Permite homogeneizar las muestras. Se utiliza para conseguir que una muestra slida en contacto con un diluyente se mezcle con este totalmente.

Centrfuga

Centrfuga: Aplica sobre los tubos fuerza centrfuga lo que permite la separacin de los distintos componentes de la muestra mediante la precipitacin en el fondo del tubo de las partculas en suspensin.

Campanas seguridad biolgica

- En las Cabinas de Seguridad de Tipo I el aire entra directamente del exterior y se filtra antes de devolverse al exterior, es un sistema adecuado para el manejo de microorganismos no patgenos. - En las Cabinas de tipo II el aire no entra directamente sino que pasa por un filtro HEPA que elimina las partculas y la mayora de los microorganismos. En ellas se trabaja con la cmara parcialmente cerrada de tal forma que existe mayor proteccin del usuario si se manipulan microorganismos patgenos. Como el aire atraviesa un filtro antes de entrar se evita la contaminacin de los medios de cultivo con microorganismos del exterior por lo que es adecuada para preparacin de medios. - Las Cabinas de Seguridad de tipo III, constan de una estructura totalmente CERRADA y HERMETICA, en cuyo interior las manipulaciones se efectan por medio de GUANTES recambiables cuyo manguito recubre todo el brazo. La cmara recibe aire que penetra a travs de un filtro HEPA y evaca a travs de dos filtros HEPA colocados en serie. Las manipulaciones en la cmara se hacen bajo presin negativa, con lo que la PROTECCION de personal, de los productos y del medio ambiente es COMPLETA. Se utiliza con toda clase de agentes biolgicos. Conviene ABSTENERSE de utilizar lquidos o gases inflamables a causa del riesgo de explosin.

Desionizador de agua La mayora de de los trabajos que se realizan en laboratorio requieren la utilizacin de agua pura con el fin de evitar cualquier tipo de interferencia. Salvo ligeras variaciones los requisitos que debe cumplir el agua para considerarla pura son: - Estar exenta de materiales en suspensin - Tener un residuo no voltil de menos de 5ppm a 105C -La conductancia especfica menor de 5 Siemens/cm a 20C - El valor de pH debe estar comprendido entre 5,0 y 7,5 - Para utilizarla en estudios clnicos y patolgicos es preciso que carezca de sustancias pirgenas y para trabajos ms especializados el contenido de iones ha de ser nulo Aunque durante aos se ha utilizado agua destilada (obtenida por evaporacin y posterior condensacin) en el laboratorio, en la actualidad los destiladores clsicos han ido abandonndose para dar paso a desionizadores que funcionan con resinas de intercambio inico. Otro mtodo de purificacin de agua es la smosis inversa que es el mtodo ms econmico para eliminar entre el 90 y el 99% de todos los tipos de contaminantes que pueda contener y que ofrece el agua de mejor calidad.

Contador de colonias

Contador de colonias: Es un aparato que mediante la iluminacin de la placa y una lupa, nos permite observar con mayor nitidez las colonias y por tanto facilita su recuento.

Balanzas

Balanzas: se utilizan para pesar, varan en funcin de la precisin que nos ofrecen. La foto de la derecha es un "balanza analtica" y la de la izquierda es un "granatario".

Baos

Baos termostticos: son recipientes que contienen agua y un sistema de regulacin de la temperatura. Se utilizan para atemperar medios de cultivo o incluso para incubar cultivos de microorganismos. En este caso son mejores los baos que llevan un sistema de agitacin orbital.

Agitador, mezclador

Agitador, mezclador: Los agitadores de tubos son muy comunes en el laboratorio. A la izquierda observamos un agitador tipo Vrtex y a la derecha un agitador horizontal que se utiliza para mezclar de forma ms suave.

Rampa de filtracin

Rampa de filtracin: Sistema unido a una bomba de vaco para la filtracin de lquidos.

F. Material ms utilizado
Placas de Petri vacias

Placas Petri vacas: Las placas Petri son recipientes para la preparacin de medios de cultivo slidos.

Placas de Petri con medio slido

Placas de Petri con medio slido

Tubos con medio lquido

Tubos con medio lquido

Tubos con medio slido

Tubos con medio slido (gar inclinado)

Mechero Bunsen

Mechero Bunsen y/o mecheros de alcohol

Pipetas de vidrio, plstico y pipeteador manual

Pipetas de vidrio, de plstico y pipeteadores. En la foto podemos observar un pipeteador automtico (a la izquierda) y uno manual (verde) que se utilizan para llenar y vaciar las pipetas de vidrio.

Pipetas automticas y puntas de pipeta Pipetas automticas (micropipetas) y puntas de pipeta. Las pipetas automticas se utilizan para pipetear pequeas cantidades de lquidos. Se utilizan con puntas donde se recoge el lquido que son de distinto tamao y color segn la micropipeta. Normalmente se fabrican en cuatro tamaos: de 0,5-2m; de 2-20 m; de 20-200 m y de 2001000 m. Las puntas son desechables, de plstico, y se colocan en cajas que pueden esterilizarse en autoclave o con luz ultravioleta. Asa de siembra

Asas de siembra: para la siembra de microorganismos se utilizan asas metlicas que se esterilizan a la llama. Las asas en punta se utilizan para la siembra por picadura.

Asa de Drigalski o varilla de vidrio acodada

Asa de Drigalski o varilla de vidrio acodada: Estas asas se utilizan para la extensin de microorganismos sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. Se esterilizan sumergindolas en alcohol que luego se quema a la llama.

Jarra de anaerobios

Jarra de anaerobios: Jarra adecuada para conseguir una atmsfera libre de oxgeno para el cultivo de microorganismos anaerobios.

Portas y cubres

Portas y cubres para las observaciones al microscopio.

Vasos de precipitados, matraces erlenmeyer, matraces aforados

Vasos de precipitados, matraces Erlenmeyer, matraces aforados

Cuchara, esptula

Cucharas y esptulas: Se utilizan para pesar muestras o medios de cultivo. Si es necesario se esterilizan envueltos en papel de aluminio en autoclave o estufa.

G. Precauciones Bsicas en el Laboratorio de Microbiologa

Los productos infecciosos o txicos son siempre potencialmente patgenos y deben tratarse con la debida responsabilidad y cuidado. El uso inadecuado de tales materiales en el laboratorio puede ser peligroso, no slo para la persona que comete la falta sino tambin para otras que trabajen en su proximidad o aun alejadas, en los casos en que los mecanismos de difusin, tales como las conducciones de aire, pueden diseminar los microorganismos patgenos o sus toxinas. Es evidente que el anlisis de los alimentos para poner de manifiesto microorganismos patgenos o sus toxinas lleva consigo tales riesgos de contaminacin, tanto a partir de los propios alimentos como de los cultivos y de los concentrados txicos de ellos derivados. La experiencia indica que tales riesgos se reducen al mnimo con la comprensin inteligente de los peligros potenciales y con la aplicacin de prcticas de laboratorio correctas. La mejor proteccin frente a los riesgos o peligros que lleva consigo el trabajo en un laboratorio microbiolgico es ejercitar el sentido comn en la prctica de Buenas Prcticas de Laboratorio. La lista de reglas que damos a continuacin comprende una serie de faltas o defectos que se sabe han sido la causa de infeccin del personal de laboratorio. 1. No comer, no beber ni fumar en el laboratorio 2. Llevar siempre bata de laboratorio. 3. Las mesas de trabajo deben tener superficie lisas que puedan ser limpiadas y desinfectadas con facilidad. Adquirir el hbito de mantener las manos alejadas de la boca, de la nariz, de los ojos y de la cara.. 4. Cubrir las zonas de trabajo de la mesa con papel absorbente, si es posible recubierto de polietileno por una de sus superficies (la que va a contactar con la mesa), siempre que exista el riesgo de que pueda derramarse material peligroso. 5. No pipetear con la boca sustancias infecciosas o txicas. Poner tapones de algodn en la parte superior de las pipetas, antes de su esterilizacin. 6. Introducir las pipetas usadas inmediatamente en un desinfectante. Pasar las pipetas desinfectadas a un recipiente parcialmente lleno de agua jabonosa y esterilizar en autoclave; llevar guantes impermeables para realizar estas operaciones. 7. Colocar todo el material contaminado en un recipiente adecuado para esterilizarlo en autoclave. No dejar olvidado este recipiente. 8. En caso de que se derrame material infeccioso, cubrir inmediatamente la zona con un desinfectante adecuado. Si este material contiene toxinas botulnicas, cubrir el rea con una solucin saturada de carbonato sdico. 9. No humedecer nunca las etiquetas con la lengua. Puede evitarse utilizando etiquetas que se adhieran por presin. 10. Despus de cada fase de trabajo, humedecer la mesa con un desinfectante y lavarse las manos. 11. Utilizar nicamente jeringas hipodrmicas en las que la aguja se adapte de modo adecuado para evitar la salida de producto. 12. Los cultivos lquidos de microorganismos muy infecciosos precisan cuidado especial, ya que todo lo que mueva la superficie del lquido producir aerosoles. Los homogenizadores elctricos producen potentes aerosoles.