Facultad de Bioanlisis, Veracruz

Manual de Prcticas de Hematologa

MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO

HEMOSTASIA
ELABOR:

Q.C. MARIA ESTHER DESCHAMPS LAGO

Hemostasia

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HEMOSTASIA: PRACTICA NO.1 OBTENCIN DE LA MUESTRA DE SANGRE

1. INTRODUCCIN Obtencin De Sangre Capilar Es el mtodo empleado cuando se necesita tan solo una pequea cantidad de sangre, ya que los estudios a realizar as lo requieren. El sitio ms apropiado para obtener sangre capilar es la yema del dedo. En los nios ms pequeos, es ms conveniente obtenerla del taln del dedo pulgar del pie. Los detalles relativos a los recipientes y portaobjetos que se utilizan, se indican a continuacin. VENTAJAS. d con que puede obtenerse mente til en pacientes geritricos y en nios, en particular, recin nacidos. Facilida Especial

DESVENTAJAS. Slo logra obtenerse una pequea cantidad de sangre que puede ser insuficiente. Es un mtodo por lo general tardado y que tiende a provocar hemlisis de la muestra En pacientes inmunocomprometidos puede provocar infecciones, excepto cuando se realiza la puncin despus de 8 a 10 min. de contacto con la piel con un buen antisptico. Obtencin De Sangre Venosa . Es el principal mtodo de extraccin de sangre en el laboratorio de anlisis clnicos, ya que es relativamente fcil de realizar. VENTAJAS. Nos permite hacer mltiples exmenes y en repetidas veces si se desea, con la misma muestra. Las alcuotas de plasma y suero pueden congelarse para futura referencia. DESVENTAJAS Puede provocar la coagulacin de la sangre si el procedimiento lleva mucho tiempo. Algunos componentes no son estables en sangre anticoagulada. Puede dificultarse en nios, pacientes obesos en estado de shock.

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Puede ocasionarse hemlisis de las muestras afectando ciertas determinaciones, por las siguientes causas: Por forzar el paso de la sangre al tubo Por agitar el tubo enrgicamente Por extraer sangre de un hematoma Anticoagulantes Empleados. Estas sustancias impiden la formacin de cogulos. El mecanismo por el que se evita la coagulacin, vara segn el anticoagulante; por ejemplo, EDTA, citrato y oxalato se unen con el calcio, mientras que la heparina impide la conversin de protrombina en trombina. Ejemplos de anticoagulantes son EDTA, citrato de sodio, y heparina en forma de sal de litio ,Los tubos deben invertirse varias veces para asegurar la mezcla adecuada despus e la recoleccin, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGA . El sitio ms prctico para obtener sangre venosa es la flexura anterior del brazo, de preferencia justo por arriba de alguna de las ramas venosas que all se encuentran. Las venas superficiales de la cara anterior del antebrazo son las ms comnes para la venopuncin. Las tres venas principales que se utilizan son: 1) vena ceflica, ubicada en la parte superior del antebrazo y del lado del pulgar de la mano; 2) vena baslica, ubicada en la parte inferior del antebrazo y del lado del dedo meique de la mano; y 3) vena cubital mediana, que conecta las venas baslica y ceflica en la fosa antecubital ( flexin del codo) y es la vena de eleccin.Si el paciente aprieta el puo despus de aplicar el torniquete, la vena se tornar ms prominente. El torniquete facilita la obtencin. En los nios pequeos se pueden utilizar otros sitios; si es as, es mejor que la sangre la obtenga alguna persona con experiencia. Usar una aguja puntiaguda, nunca menor de calibre 21 y una jeringa de 5 ml de 10 ml. Tanto la aguja como la jeringa debern estar limpias, secas y estriles. Con prctica se puede obtener sangre usando slo una aguja con un tubo de goma por el que se deja correr la sangre hasta los tubos en los que se recoge la muestra. Para esta tcnica se utilizan agujas de calibre 19. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Materiales de Laboratorio CANTIDAD 2 1 1 1 1 1 1 Hemostasia DESCRIPCIN Tubos de recogida de muestras con EDTA Aguja de Vacutainer Contenedor de Vacutainer Jeringa Lanceta Torundas de algodn con alcohol isoproplico Ligadura 3

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4. PROCEDIMIENTO. 4.1 Puncin Capilar 4.1.1 Indicaciones. En lactantes, se realiza en la superficie plantar interna externa del taln.En nios de ms de un ao, en la superficie palmar de la ltima falange del segundo, tercero cuarto dedo de la mano.La puncin no deber realizarse en una parte edematosa congestionada, donde la piel se encuentra fra y ciantica. 4.1.2 Identificacin del Paciente

Asegurarse de que el paciente llegue en condiciones ptimas y tranquilizarlo. Colocar al paciente adecuadamente. Checar el material para la extraccin: 4.1.3 Tcnica. 4.1.3.1 Limpiar cuidadosamente la piel en el sitio de puncin y a su alrededor con algodn mojado en algn desinfectante , como alcohol de 70%. 4.1.3.2 Secar el rea con gasa estril seca. 4.1.3.3 Puncionar con una lanceta estril aguja desechable. El movimiento debe ser rpido y la puncin suficientemente profunda para asegurar que la sangre fluya libremente.La salida de la sangre puede facilitarse ejerciendo una suave presin en la cara lateral del dedo. A corta distancia del sitio de puncin. 4.1.3.4 La sangre deber fluir libremente. Si se ejerce demasiada presin, se diluir con los lquidos tisulares, lo que la puede hacer inapropiada para estudio. 4.1.3.5 Descartar siempre la primera gota de sangre, limpindola con una gasa seca y dejar el sitio de puncin limpio y seco. 4.3.1.6 Obtener la cantidad requerida de muestra, aspirando la sangre con pipeta colocndola en un portaobjetos.

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4.2 Puncin Venosa 4.2.1 Indicaciones. Debe indicarse al paciente la posicin correcta, que puede ser sentado recostado, apoyando bien el brazo en posicin horizontal. Elegir la vena adecuada, prefirindose la cubital mediana, la vena baslica, la ceflica, las venas de la mueca, tobillo y mano, ya que resultan fciles de palpar. 4.2.2 Tcnica 1. Desinfectar la piel en el sitio de puncin con algodn mojado en un desinfectante apropiado como alcohol de 70%. 2. Preparar la jeringa y la aguja, en su defecto la aguja con el contenedor en el caso del sistema de tubos al vaco, cuidando que la tcnica sea asptica. 3. Aplicar un torniquete en el brazo ( por arriba del sitio de puncin), suficientemente apretado para que restrinja el flujo de la sangre venosa. 4. Desinfectar nuevamente el sitio de puncin, y secar la piel con algodn gasa limpios, secos y estriles. 5. Asegurarse de que el mbolo de la jeringa est hasta el fondo , es decir, que la jeringa no contenga aire. Insertar la aguja de la jeringa en una vena con un movimiento preciso. 6. Jalar lentamente el mbolo y obtener 2 a 3 ml de sangre. 7. Retirar la jeringa de la aguja y sustituirla por otra jeringa que contenga la solucin anticoagulante de citrato de sodio. O directamente introducir el tubo del sistema de vaco. 8. Obtener el volumen de sangre deseado jalando el mbolo muy despacio. 9. Soltar el torniquete y colocar una gasa seca sobre el sitio de la puncin, retirando despus la aguja con un solo movimiento. 10. Presionar ligeramente la gasa sobre el sitio de puncin durante algunos momentos y despus pedir al paciente que contine aplicando la presin durante unos minutos. 11. Cuando la sangre se obtiene empleando slo una aguja sin jeringa, se emplea el mismo procedimiento y cantidad de anticoagulante. Deben usarse tubos graduados para obtener la proporcin adecuada de anticoagulante y sangre.

Actividades: - Practicar la toma de sangre capilar. - Practicar la toma de sangre venosa.

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-Realizar esquemas de puncin capilar .

-Realizar esquemas de puncin venosa y de las principales venas empleadas.

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-Realizar esquema de los diferentes sistemas de extraccin: jeringa y sus partes; sistema vacutainer y sus partes; tipos de tubos y colores de tapones empleados en el sistema vacutainer, de acuerdo con el anticoagulante empleado .

- Reporte de resultados.____________________________________________

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HEMOSTASIA:PRCTICA No. 2 EXTENDIDOS DE SANGRE

1. INTRODUCCIN. Los extendidos de sangre se realizan dentro del estudio del hemograma completo, bien de manera aislada .En ellos se pueden estudiar los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas, y el propsito de ello es determinar las caractersticas morfolgicas de cada tipo celular y evaluar la frecuencia relativa de los distintos tipos de leucocitos. Se deben teir con una de las tinciones de Romanowsky las cuales varan en sus propiedades de tincin, y por lo tanto, es importante seleccionar una y familiarizarse con ella. La coloracin de Wright es muy confiable y sencilla, pero otras tambin lo son, tales como la de Giemsa. Leishman May-Grnwald, las cuales son igualmente satisfactorias, aunque puede variar la tincin de un lote a otro de colorante. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGA . Los frotis de sangre deben confeccionarse con lminas portaobjetos de vidrio que previamente se hayan lavado y secado de manera conveniente, con la finalidad de eliminar cualquier resto de grasa que pudiera quedar en ellos y evitar as una mala calidad en la tincin. Los frotis de sangre son esenciales para el estudio morfolgico y cuantitativo de las clulas sanguneas. Cuando un frotis se encuentra bien realizado, se podrn distinguir en l tres reas importantes: la cabeza zona de inicio, el cuerpo zona media y la cola rea final del mismo. Un frotis no deber ser ni grueso ni delgado, pues en ninguno de ellos se podrn apreciar bien las reas antes mencionadas. En un frotis bien realizado, la tincin ser de mejor calidad. 3.LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Materiales de Laboratorio

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4. PROCEDIMIENTO. Tcnica de los dos Portaobjetos. 1. Colocar a una distancia de 1.5-1.9 cm del extremo derecho de un portaobjetos, una pequea gota desangre ( del tamao de 3 cabezas de alfiler) obtenida por puncin capilar del taln, del lbulo de la oreja por extraccin venosa. 2. Si se emplea sangre venosa mezclada con anticoagulante, el frotis deber realizarse lo ms pronto posible, debido a que el contacto prolongado con ste altera la morfologa celular. 3. Aproximar el portaobjetos extensor a la gora, dejando que hagan contacto y que por capilaridad ste se extienda a lo largo del borde. 4. Se desliza el portaobjetos extensor hacia el extremo contrario, para lograr una pelcula delgada de sangre. 5. dejar secar y teir.

NMERO DESCRIPCIN 2 Tubos de recogida de muestras 1 Aguja de Vacutainer 1 Contenedor de Vacutainer 1 Jeringa 1 Torundas de algodn con alcohol isoproplico 1 Ligadura 1 Caja de portaobjetos limpios ACTIVIDADES: -Realizar 10 frotis correctamente confeccionados. -Realizar esquema que muestra las partes de un frotis .

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-Realizar esquema de tres frotis: demasiado grueso, demasiado delgado y correctamente realizado.

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- Reporte de resultados.____________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 3 TINCIN DE WRIGHT Y REACTIVOS COMUNMENTE EMPLEADOS EN HEMATOLOGIA

1. INTRODUCCIN La finalidad de la tincin de Wright es lograr que el alumno se sienta capacitado para preparar adecuadamente algunos de los reactivos y colorantes ms comnmente empleados en las reas de hematologa y microbiologa, que como qumico clnico tiene la obligacin de conocer y dominar. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGA . COLORANTES. A los colorantes de les puede clasificar en tres grupos: 1) Acidos. Son aquellos constitudos por sales cuya base es incolora y cuyo cido es coloreado. A este grupo pertenecen las eosinas. Estas soluciones se usan para la coloracin citoplasmtica coloracin de fondo. 2) Basicos. Son aquellas sales de cido incoloro y base coloreada como el clorhidrato de azul de metileno. Estos colorantes tien por lo general algunos elementos del ncleo. Hemostasia 11

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3) Neutros. Son aquellas sales con el cido y la base coloreados, por ejemplo, los eosinatos de azul y azur de metileno , los ms empleados en hematologa. El mtodo de Romanowsky, que emplea estos colorantes, ha sido la base de las coloraciones panpticas utilizadas en la actualidad ya que ha tenido un gran xito en la tincin diferencial de la mayora de las estructuras normales y anormales de la sangre. La mayor parte de estos colorantes policromos derivados del mtodo de Romanowsky, se disuelven en alcohol metlico, combinando as, la fijacin con la tincin. Los ms conocidos de todos ellos, son los de Giemsa y de Wright. Tipo de Error Tincin demasiado azul Causas Tiempo excesivo de tincin Lavado deficiente Ph muy alcalino Como se Corrige Disminuir el tiempo de tincin Lavar adecuadamente Acidificar el pH

Tincin demasiado rosa

Tiempo insuficiente de tincin Aumentar el tiempo de tincin Lavado excesivo Lavar adecuadamente pH muy cido Elevar el pH Colorante no filtrado Filtrado de colorante Secado de la laminilla durante la Procurar que siempre haya un tincin. buen menisco de colorante durante la tincin.

Precipitacin de colorante

ANTICOAGULANTES. Los 4 anticoagulantes ms usados son: mezcla de oxalato amnico y de potasio ( simplemente oxalato amnico ), citrato trisdico, sequestrene ( EDTA ), y heparina. Los 3 primeros impiden la coagulacin sustrayendo el calcio del plasma sanguneo por precipitacin fijacin en forma no ionizada. La heparina neutraliza la trombina y otras fases de la activacin de los factores de coagulacin. El citrato trisdico, el EDTA y la heparina, pueden emplearse para impedir la coagulacin de la sangre destinada a transfusiones, sin embargo, la mezcla de oxalatos, no, por ser txica. Los oxalatos pueden usarse para determinaciones como hemoglobina, hematocrito y recuentos globulares, aunque para extensiones sanguneas puede usarse tan slo en los primeros minutos, pues ms tarde pueden desarrollarse alteraciones de las clulas sanguneas como formas dentadas de los hemates, vacuolizacin en el citoplasma de los granulocitos, fagocitosis de los cristales de oxalato, artefactos en los ncleos de los linfocitos y monocitos, etc.Adems no deben emplearse para determinaciones qumicas de nitrgeno y potasio. Para investigaciones de coagulacin, es muy til el citrato trisdico. El EDTA sequestrene es tal vez el anticoagulante ms usado para el recuento de clulas sanguneas. Se le compara con el oxalato para el estudio del hematocrito y hemoglobina, pero para estudios morfolgicos, es todava mejor, pues con l, no se forman

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alteraciones ni artefactos en las clulas sanguneas, an despus de un buen tiempo de estar hecha la mezcla, si la sangre se refrigera ( 2 horas a 24 horas ). La heparina tambin puede usarse para determinaciones como hematocrito y hemoglobina, pero no de ptimos resultados en las extensiones sanguneas, ya que produce un fondo azul en aqullas que son teidas con el colorante de Wright.

3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos. NUM. 1 2 3 4 5 6 7 NOMBRE DEL REACTIVO Colorante de Wright Metanol Na2HPO4 KH2PO4 EDTA Oxalato de amonio Agua destilada CANTIDAD 0.1 g 60 ml 2.56 g 6.66 g 3g 0.8g 1.5L

3.2 Equipo de Laboratorio Balanza Granataria Balanza Analtica 3.3 Materiales de Laboratorio CANTIDAD 1 2 1 4 1 3 1 1 10 DESCRIPCIN Mortero Probetas de 100 ml Matraz Volumtrico de 100 ml Varillas de vidrio Frasco de vidrio color ambar de 1L de capacidad Frascos de vidrio color mbar de 150 ml de capacidad Jeringa sistema vacutainer para toma de muestra Ligadura Portaobjetos

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3.4 Preparacin de los reactivos 3.4.1Colorante de Wright: Colorante de Wright: Metanol: 0.1 g 60 ml

Se tritura el colorante con el alcohol en un mortero; sto se hace poco a poco. Esta operacin debe durar 30 min. hasta completar disolucin. Se deja reposar dos das y se filtra.

3.4.2 - Amortiguador Buffer de fosfatos Na2HPO4 KH2PO4 Agua destilada para aforar a 2.56 g 6.66 g 1L

Mezclar las sales con poca cantidad de agua destilada, e ir agregando poco a poco ms agua, hasta aforar a 1 L. Guardar en un frasco mbar de 1 L.

3.4.3- EDTA. EDTA Agua destilada 3g 100 ml

Mezclar el EDTA poco a poco con el agua destilada.

3.4.4 -Solucin de Oxalato de amonio. Oxalato de amonio Agua destilada 0.8 g 80 ml

Mezclar poco a poco el oxalato de amonio con el agua destilada. En ambos, se utiliza 1 gota de solucin por ml de sangre.

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Facultad de Bioanlisis, Veracruz 4.PROCEDIMIENTO. 4.1 Tcnica: Tincin de Wright.

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4.1.1. Seleccionar un portaobjetos nuevo de 25 X 75 mm para hacer extendidos, que tenga la orilla relativamente lisa. 4.1.2 Obtener una pequea cantidad de muestra de sangre perifrica. 4.1.3Colocar una pequea gota de sangre a 2 3 mm de la orilla de un portaobjetos limpio y seco. Colocar el portaobjetos para hacer extendido en un ngulo de 30 a 45 grados con respecto al portaobjetos que tiene la muestra y hacer contacto cn la gota. Esta debe extenderse rpidamente a lo largo de la orilla del portaobjetos para hacer los extendidos. Deslizar el portaobjetos de extensin sobre la superficie dispersando la muestra de sangre. El extendido de sangre debe medir aproximadamente 30 mm de largo . El portaobjetos de extensin no se despegar hasta haber extendido toda la sangre. El grueso del extendido de sangre puede regularse modificando el ngulo del portaobjetos de extensin, variando el tamao de la gota de sangre, la presin la velocidad de extensin. 4.1.4 El extendido de sangre se seca con el aire. Una vez seco, se escribe con lpiz el nombre del paciente en una orilla del portaobjetos. 4.1.5 Fijar el extendido de sangre en alcohol metlico absoluto durante 2 a 3 minutos. El color del extendido de sangre cambiar de rojo a caf claro. Esta fijacin es recomendable aunque el colorante que se vaya a emplear se encuentre diludo en alcohol metlico absoluto. 4.1.6 Cubrir el portaobjetos completamente con el colorante. Despus de 3 minutos aadir un volumen igual de amortiguador. Soplar ligeramente para mezclar uniformemente. Aparecer un brillo metlico verde. 4.1.7 Despus de 5 minutos enjuagar cuidadosamente con agua de la llave amortiguador de fosfatos, al principio con chorro delgado y suavemente y despus con el chorro fuerte para eliminar todo exceso de colorante. Limpiar el reverso del portaobjetos en posicin erecta. Cuando se haya secado, cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos rectangular y fijarlo con una gota de lquido de montaje. Se puede usar slo aceite de inmersin en una preparacin temporal. El alumno deber ensayar tiempos hasta ajustar aquellos que ms convengan para una ptima coloracin. As, con tres frotis ms deber ensayar: 2 minutos de colorante y 4 de amortiguador; 6 minutos de colorante y 6 minutos de amortiguador; 6 minutos de colorante y 11 minutos de amortiguador. 4.2 Resultados Esperados. Los resultados esperados en la tincin sern los siguientes: Hemates en color rosa. Ncleos de los leucocitos de azul prpura, con la cromatina y paracromatina netamente diferenciadas. Hemostasia 15

Facultad de Bioanlisis, Veracruz Grnulos neutrfilos del citoplasma, lila violeta Grnulos eosinfilos, rojo tirando a naranja. Grnulos basfilos, prpura tirando a azul oscuro. Plaquetas, color lila oscuro. Citoplasma de los linfocitos, azul claro. Citoplasma de los monocitos, ligero azul.

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Actividades: -Practicar la tincin de Wright con frotis de sangre perifrica. -Corregir de acuerdo al recuadro , errores encontrados en la tincin. - Reporte de resultados .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________

HEMOSTASIA:PRCTICA No. 4 EVALUACIN DE SANGRE PERIFRICA

1.INTRODUCCIN. Una vez que se ha hecho y teido un frotis satisfactorio, ste puede ser evaluado en bsqueda de anormalidades. Cada examen debera incluir anlisis con bajo poder ( 10X ), con alto poder ( 40 45 X), e inmersin ( 100X ).Un error comn consiste en comenzar el examen con el objetivo de inmersin.Ciertos problemas de la muestra y anormalidades morfolgicas significativas pueden pasarse por alto a menos que todos los objetivos sean empleados. La presencia de eritrocitos anormales en el frotis de sangre perifrica a menudo brinda importantes claves en el diagnstico diferencial de las anemias, y puede ser tambin de ayuda en el diagnstico de otras enfermedades. La morfologa de los eritrocitos puede verse alterada con cambios en el tamao, en la forma, en las propiedades tintoriales de clulas individuales por la presencia de ciertos materiales dentro de ellas.

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Incluso, la presencia de solo una nica clula con ciertos cambios, puede considerarse significativa; en otros, la anormalidad se considera importante slo si un nmero significativo de clulas se ven afectadas. Asimismo, en la serie blanca, es importante realizar el recuento diferencial, an cuando los nuevos contadores electrnicos den un resultado anticipado del mismo, ya que slo puede confirmarse ste por medio de dicha lectura. Del mismo modo, se buscarn anormalidades en las clulas blancas y stas se reportarn, as como la presencia de clulas que normalmente no se ven en sangre perifrica, sino nicamente en mdula sea, a menos que exista alguna patologa presente. Lo mismo aplica para las plaquetas, las clulas ms pequeas de sangre perifrica.Se puede hacer un recuento indirecto de las mismas cuando as se requiera, y buscar anormalidades en su forma y en su tamao. Algunas anormalidades pueden requerir que se indique le severidad del cambio. Todas estas determinaciones pueden diferir de observador a observador, conduciendo a una variacin considerable en el anlisis del mismo frotis de sangre. Los laboratorios actualmente tratan de controlar estas inconsistencias desarrollando criterios para estandarizar la evaluacin de la morfologa. As, muchos laboratorios usan un mtodo semicuantitativo de evaluacin, consistente en los trminos: leve, moderado severo. O bien un sistema " por cruces" :1+, 2+, 3+, etc. Tan importante como el que haya consistencia entre los observadores, es importante tambin la seleccin de una rea apropiada del frotis para la evaluacin. En un frotis en " cua ", en el rea "aplumada" terminal del frotis, demuestran cambios que pueden considerarse patolgicos, p.e. macrocitosis, esferocitosis, clulas en "diana ", etc. En el rea gruesa del frotis, las clulas pueden interpretarse como microcticas en forma equivocada, y la morfologa puede ser difcil de evaluar. Tambin tendern a formar apilamientos ( rouleaux ) en esta rea. Por ello, el rea ideal para examinar un frotis, es aquella que contiene aproximadamente 200-250 clulas por campo a seco fuerte. Esto corresponde a una rea en donde los eritrocitos se tocan pero no se enciman. En el verdadero Roleaux, los mrgenes individuales de las clulas son difciles de distinguir y dan una imagen como de pilas de monedas que han sido empujadas y tiradas, imagen que persiste an en las reas ms delgadas del frotis, aunque ah exista menor cantidad de clulas. La intensidad de la formacin de "rouleaux" depende de la concentracin de las protenas plasmticas, especialmente el fibringeno. En enfermedades inflamatorias, los niveles de fibringeno pueden aumentar. Tambin la elevacin de gama globulinas, como se observa en el Mieloma mltiple, provoca formacin de "rouleaux".

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2. PRINCIPIO Y METODOLOGA . 2.1 Anlisis con bajo poder. Este objetivo debe utilizarse para evaluar la calidad de la tincin.Las clulas blancas deberan verse fcilmente con este aumento.Si no es asi, el frotis debe ser nuevamente teido.El borde aplumado debe ser examinado para buscar cmulos de plaquetas filamentos de fibrina, indicando esto que debe realizarse una nueva toma, ya que esta evidencia de coagulacin podra interferir con muchas pruebas hematolgicas. Los extremos laterales y aplumado deben evaluarse en bsqueda de un nmero desproporcionado de leucocitos.,Las clulas ms grandes ( por ejemplo los neutrfilos y los monocitos, tienden a acumularse ms en estos lugares y si el frotis est mal hecho, se acumularn ms en estas reas, las cuales estn fuera del rea ideal de observacin.Si la mayora de las clulas se encuentran en el borde aplumado, el frotis deber descartarse y prepararse uno nuevo. 2.2 Anlisis con alto poder. Con este objetivo existen dos problemas por resolver. En primer lugar, se debe seleccionar el rea apropiada para iniciar la cuenta diferencial. Esta debe ser donde los eritrocitos se tocan pero no se sobreponen, y puede ser un rea en donde se encuentren 200 eritrocitos por campo. Si la cuenta de leucocitos es muy baja, puede ser necesario incluir reas fuera del rea ideal con el fn de encontrar suficientes clulas blancas.El segundo problema por resolver con este objetivo, ser estimar la cuenta total de leucocitos. Estando en el rea ideal, contar el nmero de clulas blancas observadas en cinco a diez campos y determinar el promedio. El promedio, multiplicado por un factor de correccin que a menudo est entre 2000 y 2,500 ( 2 a 2.5 en miles) representar la cuenta total del leucocitos. 2.3 Anlisis con objetivo de inmersin. Con este objetivo, la cuenta diferencial de leucocitos debe estimarse, la cuenta de plaquetas, tambin debe poder estimarse y los tres tipos de clulas ( leucocitos , eritrocitos y plaquetas ) deben observarse en bsqueda de anormalidades morfolgicas. La cuenta diferencial consiste en identificar cuando menos 100 leucocitos consecutivos, y reportar estos valores como un porcentaje. Es importante incluir las clulas de los mrgenes, as como las del cuerpo del frotis. As, para lograr esto, debe seguirse el patrn de observacin de la imagen siguiente:

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El nmero de plaquetas tambin puede ser estimado con este objetivo. Empleando la misma rea que para la cuenta diferencial, es decir, donde los eritrocitos se tocan pero no se sobreponen, deben contarse las plaquetas en al menos diez campos. Este nmero ser convertido en no. de plaquetas/l de sangre, como se hizo con la cuenta de leucocitos. Deber calcularse el nmero promedio de plaquetas por campo, y dicho nmero se multiplicar por un factor determinado por el propio laboratorio en base a la combinacin de los objetivos y oculares empleados en sus microscopios. Por ejemplo, cada plaqueta, observada representa 15,000 plaquetas 20,000 / l. Si se llegaron a observar un promedio de 12 plaquetas por campo, entonces, la cuenta total de plaquetas sera de 180,000/ l en el primer caso, 240,000 / l en el segundo caso. La ltima actividad a realizar con este objetivo, sera evaluar la morfologa celular. Esto puede irse haciendo a medida que se va realizando la cuenta diferencial. Cualquier anormalidad inclusin en clulas rojas y blancas, deber reportarse. Tambin es importante evaluar la forma y el tamao de los eritrocitos en esta misma rea. Las clulas suelen distorsionarse en reas muy delgadas, demasiado gruesas. Las plaquetas tambin debern evaluarse en su tamao y forma. Ms de una forma inusualmente grande de plaquetas, en cada cinco campos debern ser reportadas . 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS. 3.1 Equipo de laboratorio. Microscopio de Luz 3.2 Materiales de Laboratorio CANTIDAD 1 DESCRIPCIN Frotis de sangre perifrica teidos con colorante de Wright

4. PROCEDIMIENTO. 4.1 Anlisis con bajo poder. 4.1.1Evaluar la calidad de la tincin.

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4.1.2Examen en el borde aplumado del frotis en bsqueda de cmulos de plaquetas filamentos de fibrina. 4.1.3Evaluar extremos laterales y aplumado en bsqueda de leucocitos desproporcionados. 4.2 Anlisis con alto poder. 4.2.1Seleccionar el rea apropiada para iniciar la cuenta diferencial. 4.2.3Estimar la cuenta total de leucocitos. 4.3Anlisis con objetivo de inmersin. 4.3.1Realizar el recuento diferencial, contando cien clulas en total, y diferenciando la lnea celular a la que pertenecen. 4.3.2Realizar el recuento indirecto de plaquetas. 4.3.3Buscar anormalidades morfolgicas tanto de los leucocitos como de los eritrocitos y de las plaquetas.

ACTIVIDADES: - Reporte de resultados 1. Anlisis con bajo poder. 1.1 Calidad de la tincin:_________________________________________________ __________________________________________________________________ 1.2 Examen del borde aplumado del frotis ___________________________________ __________________________________________________________________ 1.3 Examen de los extremos laterales y aplumado del frotis.____________________________________________________________________ _________________ 2. Anlisis con alto poder. 2.1 Seleccionar el rea ideal para bsqueda de anormalidades en las clulas: (donde los eritrocitos se tocan, pero no se sobreponen, en el cuerpo del frotis )_que es la misma donde se realizar el recuento diferencial de Hemostasia 20

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leucocitos.________________________________________________________________ __________________ 3. Anlisis con objetivo de inmersin. 3.1 Recuento indirecto de plaquetas 3.2 Bsqueda de anormalidades morfolgicas de: plaquetas___________________________________________________________

HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 5 RECUENTO DIRECTO DE PLAQUETAS

1. INTRODUCCIN. El recuento de plaquetas puede hacerse de manera directa y de manera indirecta. El mtodo directo, a su vez, requiere de un contador electrnico que sea capaz de hacer el recuento de las diferentes clulas sanguneas ( leucocitos, eritrocitos y plaquetas), en su defecto, podr hacerse mediante el mtodo manual, en el que se emplear la cmara de Neubauer y la pipeta de Thoma. El mtodo indirecto es muy til cuando se tiene dudas sobre los resultados emitidos por cualquiera de los mtodos directos, y/ como modo de confirmar stos.Esto sucede por ejemplo, cuando la muestra no fue adecuadamente anticoagulada a la hora de ser tomada, cuando se tienen cifras anormalmente altas anormalmente bajas, 2. PRINCIPIO Y METODOLOGA En el recuento directo de las plaquetas mediante la cmara de Neubauer, se mezcla la sangre en la pipeta de Thoma con un diluyente que cause la hemlisis de los eritrocitos. Se llena el hemocitmetro con dicha mezcla y se recuentan las plaquetas en la cuadrcula central, de preferencia con microscopio de contraste de fases y con el objetivo de 40X. Hemostasia 21

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3. LISTA DE REQUERIMIENTOS NMERO 2 1 1 1 1 1 1 1 1 DESCRIPCIN Tubos de recogida de muestras con EDTA Aguja de Vacutainer Contenedor de Vacutainer Jeringa Torundas de algodn con alcohol isoproplico Ligadura Cmara de Neubauer Pipeta de Thoma Boquilla y manguera para aspiracin

3.1 Reactivos NUMERO 1 NOMBRE DEL REACTIVO Oxalato de amonio CONCENTRACIN 1% CANTIDAD 1 ml

3.2 Equipo de Laboratorio 3.2.1 Centrfuga 3.2.2 Agitador elctrico 3.2.3 Microscopio de luz

3.3 Materiales de Laboratorio

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4.PROCEDIMIENTO. 4.1 Tcnica 4.1.1 Si se obtiene la muestra por puncin digital, el sitio debe estar limpio y la sangre debe fluir libremente. Limpia la primera gota. Si la muestra es de sangre venosa debe obtenerse con una jeringa de plstico seca ( de vidrio siliconizado ) con aguja corta, de calibre no menor al 21.Retirar la aguja antes de poner la sangre en un tubo de plstico con EDTA. La sangre y el anticoagulante deben mezclarse inmediata y cuidadosamente, para evitar la formacin de espuma. 4.1.2 El mezclado de la sangre con anticoagulante debe realizarse suavemente y durante unos cinco minutos. 4.1.3 Con la pipeta de Thoma, aspirar sangre hasta la marca de 1.0 y se diluye hasta la marca de 101 con el oxalato de amonio ( dil.1:100).Hacer por duplicado. 4.1.4 Colocar las pipetas en el agitador de 10 a 15 minutos. 4.1.5 Llenar la cmara de Neubauer con el contenido de las pipetas debidamente mezclado, desechando las primeras 4-6 gotas. 4.1.6 Cubrir la cmara con una caja de Petri de 10 a 20 min, para permitir que las plaquetas se sedimenten. Colocar un pedazo de algodn de papel filtro mojados dentro de la caja para evitar la evaporacin. 4.1.7 Empleando el microscopio de contraste de fases, contar las plaquetas en la cuadrcula central destinada a la cuenta de glbulos rojos ( 25 cuadros centrales )calculando la cifra de plaquetas como sigue: No. De plaquetas /l= No de plaquetas contadas X factor de dilucin( 100) X factor de correccin de volumen ( 10)= No de plaquetas contadas X 1000.

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Cuadrculas ( L ) para recuento de glbulos blancos

El recuento de plaquetas se realiza en los 25 cuadros del cuadrante central.

Factores de Error en las Cuentas Celulares. 4.2.1 Cuando se use sangre capilar se requiera una gota que fluya libremente. 4.2.2 Las muestras de sangre anticoagulada se deben mezclar cuidadosamente invirtiendo el tubo de sangre por lo menos 20 veces. No se debe agitar el tubo pues se forma espuma que impide medir cantidades exactas. Inclinar el tubo bien mezclado a un ngulo de 45, ligeramente mayor, y pipetear del borde superior del tubo siguiendo las mismas indicaciones que para sangre capilar. 4.2.3 Las pipetas deben estar limpias y secas. 4.2.4 Tomar las muestras con la pipeta en forma rpida y precisa. Si se rebasa la lnea del volumen deseado ligeramente, ajustar tocando un papel absorbente con la punta de la pipeta, 4.2 Hemostasia 24

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4.2.5 Limpiar el exterior de la pipeta antes de introducirla en la solucin disolvente. 4.2.6 La cmara se llena por accin capilar, regulando el flujo del lquido de la pipeta, para que fluya suave y rpidamente, Llenar la cmara completamente, sin permitir que el lquido rebase los lmites. Esperar de 10 a 20 minutos a que las clulas se asienten en el rea de conteo. Proseguir con el conteo. 4.2.7 La cmara del hemocitmetro y el cubreobjetos deben estar limpios y secos antes de usarse. Esto evita errores graves que se producen por las huellas digitales y las superficies aceitosas. ACTIVIDADES. Reportar resultados

1.

- Reporte de resultados .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________

2. Enumerar todos los casos en que pueda haber aumento disminucin de plaquetas.

HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 6

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TIEMPO DE COAGULACIN

1. INTRODUCCIN. El tiempo de coagulacin es un estudio creado en 1939. Nos da un indicio aproximado de la eficacia global del mecanismo intrnseco de la coagulacin. La prueba carece de valor para las insuficiencias ligeras de distintos factores, porque basta con una pequea cantidad de trombina para producir un cogulo fibrina. Todava es menos til para las anomalas de las ltimas etapas de la coagulacin. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGA El tiempo de coagulacin mide el intervalo de tiempo necesario para que una muestra de sangre completa recin obtenida coagule in vitro a 37C y evale en forma general el mecanismo de coagulacin intrnseco. Dos son las finalidades ms relevantes de este mtodo: 1. Evaluar la funcin del sistema intrnseco de la coagulacin sangunea. 2. Vigilar la eficiencia de la administracin de heparina. 3 .LISTA DE REQUERIMIENTOS. 3.1Equipo de laboratorio. 3.1.1Bao Mara a 37C 3.1.2Cronmetro 3.2Material de Laboratorio. CANTIDAD 3 1 DESCRIPCIN Tubos de vidrio de 12X75 gradilla

4.PROCEDIMIENTO.

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Facultad de Bioanlisis, Veracruz 4.1 Mtodo de Lee-White

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1. Se extrae sangre venosa con una jeringa de 5 ml, y una aguja gruesa ( del No.18 19 ). La puncin venosa debe ser perfecta, pues la contaminacin con linfa puede modificar los resultados. 2. Preparar el bao Mara a 37C, colocando una gradilla dentro de l, con 3 tubos de 12 X 75. 3. Se le realiza al paciente una puncin de 3 ml poniendo en marcha el cronmetro en el momento en que entra la sangre a la jeringa. 4. Terminada la puncin, se deposita 1ml de sangre en cada tuboy se vigilan cada 30 seg., inclinndolos suavemente y anotando el tiempo en que coagula cada uno de ellos. 5. Se suman los tres tiempos, y se calcula el promedio, obteniendo as el resultado. 6. Durante el proceso, evitar la agitacin, que podra retardar el tiempo de coagulacin. 4.2 Valores de Referencia: 4-10 minutos ACTIVIDADES. Realizar la toma se muestra sangunea como se indica y continuar con los dems pasos de la tcnica. Realizar clculos y obtener resultados. - Reporte de resultados .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________ Anotar observaciones.

HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 7 OBSERVACIN DEL COGULO

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1. INTRODUCCIN. La observacin del cogulo formado en un tubo de ensayo proporciona informacin sobre: a) La concentracin del fibringeno,b) el nmero y funcin de las plaquetas y c) la actividad del sistema fibrinoltico. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGA. 2.1 2.2 Aproximadamente el 30% del volumen total de sangre en el tubo debe coagularse En casos de trombocitopenia de disfuncin plaquetaria muy anormal, como en la trombastenia, se forma un cogulo grande de estructura dbil. Asimismo, en casos de paraproteinemia ( mieloma macroglobulinemia de Waldenstrom), la retraccin del cogulo puede estar muy trastornada. Un cogulo pequeo de forma regular ocurre cuando la concentracin del fibringeno es baja. Un cogulo pequeo de forma irregular se observa cuando el incremento en la actividad fibrinoltica lo digiere, como ocurre en la coagulacin intravascular diseminada ( CID ). No se observa formacin de cogulo alguno.

2.3 2.4 2.5

1 2.6 Causas de error

Tubos de ensayo sucios Contaminacin de sangre con anticoagulante

3. LISTA DE REQUERIMIENTOS.

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Facultad de Bioanlisis, Veracruz 3.1Equipo de Laboratorio. Bao Mara a 37C 3.2Material de Laboratorio CANTIDAD 2 1 1 1 1 1 1

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DESCRIPCIN Tubos de vidrio de 13 X 100 de fondo redondo Gancho de alambre Aplicador de madera Caja Petri con papel filtro dentro de ella Jeringa de 5 ml Sistema Vacutainer Ligadura Torunda con alcohol isoproplico

4. PROCEDIMIENTO 4.1 Tomar una muestra de sangre y depositar la muestra en un tubo de vidrio de 13 X 100 4.2 Colocar el tubo con la muestra de sangre en el bao Mara a 37C durante 3 horas. 4.3 Observar despus de transcurrido este tiempo, la forma del cogulo, rodeado de suero 4.4 .Ayudarse con el gancho de alambre para vaciar el contenido del tubo lentamente a la caja de Petri con un papel filtro dentro de ella. 4.5 Observar y buscar un cogulo pequeo en caso de que en el tubo no se haya apreciado un cogulo grande. ACTIVIDADES Reportar resultados mediante la descripcin del cogulo formado, reportar la ausencia de ste. - Reporte de resultados .________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ___________________________

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HEMOSTASIA: PRCTICA NO 8 TIEMPO DE SANGRADO

1.INTRODUCCIN. El tiempo de sangrado es una medida de Integridad vascular y plaquetaria. Las plaquetas se adhieren a la colgena expuesta ( subendotelial) y despus entre ellas, para formar un agregado que obtura la herida. Para la agregacin plaquetaria, tambin es necesario un factor del plasma: el factor de Von Willebrand. 2.PRINCIPIO Y METODOLOGA El tiempo de sangrado se mide determinando el tiempo necesario para que dejen de sangrar los pequeos vasos subcutneos que han sido lesionados por una Incisin estandarizada. Uno de los mayores problemas que confronta la medicin del tiempo de sangrado es la reproducibilidad. Por esta razn se han desarrollado tres generaciones de pruebas, cada una con aumento en la estandarizacin de la herida en profundidad y longitud. El mtodo ms antiguo es el de Duke, que consiste en hacer una puncin del lbulo de la oreja con una lanceta estril. La desventaja de este mtodo es que es muy difcil estandarizar la profundidad de la incisin. Adems, si el paciente tiene un serio problema hemorrgico, el sangrado en el tejido celular blando del lbulo de la oreja puede causar un hematoma grande. El mtodo de Ivy est mejor estandarizado que el de Duke. Se utiliza una lanceta estilete para producir una incisin en la cara anterior del antebrazo. La navaja tiene un tope que "mita la profundidad de la Incisin. Adems, como la cara anterior del antebrazo es suficientemente larga para permitir varias incisiones, pueden hacerse dos tres de ellas y promediar sus resultados. Adicionalmente, en este mtodo est mejor estandarizada la presin del sistema vascular, ya que un esfingomanmetro que se coloca en el brazo (40 mmHg), mantiene la presin venosa dentro de lmites reducidos.

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3.LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Equipo de Laboratorio Esfingomanmetro Cronmetro. 3.2Material de Laboratorio CANTIDAD 1 1 1 4.PROCEDIMIENTO 4.1 Tcnica: Mtodo de Duke. 1. Limpiar perfectamente el lbulo de la oreja o la yema de un dedo con una torunda con alcohol. Dejar secar . 2. Puncionar el sitio elegido con la lanceta, echando a andar al mismo tiempo, el cronmetro. La puncin debe hacerse en un solo movimiento, introduciendo la lanceta hasta el fondo y sin hacer movimientos laterales de sta para no rasgar la piel o hacer ms amplia la puncin. 3. Sin tocar la piel, con una t'ra de papel filtro, secar la gota de sangre que salga por el sitio de pund6n cada 30 segundos, hasta que ea papel flltro ya no absorba sangre. 4. Anotar el tiempo en que deje de sangrar . Ventajas: es muy sencillo de realizar . Desventajas: Las condiciones de la prueba no son constantes, por lo tanto los resultados son imprecisos. 4.2 Tcnica: Mtodo de Ivy. 1. Colocar el brazalete del esfingomanmetro en el brazo del paciente. limpiar la cara anterior del antebrazo con una torunda de algodn mojada en alcohol y dejar secar . 2. Inflar el brazalete a 40 mmHg y esperar 30 segundos para permitir que el llenado capilar se equilibre. 3. Hacer tres incisiones en la cara anterior del antebrazo, de preferencia donde no existe vello y evitando las venas superficiales. DESCRIPCIN Lancetas desechables estriles Tiras de papel filtro Torundas de algodn con alcohol

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4. Poner a andar un cronmetro para cada herida en el momento en que comience el sangrado, lo que ocurre, generalmente, de 15 a 30 segundos despus. 5. Si el sangrado no se inicia antes de 30 segundos de efectuada la incisin, oprimir suavemente la herida entre dos dedos ( esto no modifica el resultado final). 6. Absorber la sangre con el papel filtro circular cada 15 segundos. Debe evitarse el contacto directo entre el papel filtro y la herida. 7. El tiempo de Sangrado corresponde al momento en que la sangre ya no mancha el papel filtro. Registrar el tiempo en el que esto ocurre para cada incisin . 8. Sacar el promedio del tiempo de las tres heridas. 9. Limpiar los sitios de incisin y cubrirlos con vendas adhesivas estriles. Ventajas: Las condiciones de prueba son constantes, por lo que tiene mayor reproducibilidad. Desventajas: Es un poco ms laboriosa para realizar. 4.3 Valores de Referencia. Mtodo de Duke: 1 a 4 minutos Mtodo de Ivy: de 2 a 6 minutos

- Reporte de resultados .________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________

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HEMOSTASIA: PRCTICA No.9 VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN GLOBULAR

1. INTRODUCCIN. La Velocidad de Sedimentacin Globular ( VSG ) es til para monitorizar la evolucin de una enfermedad inflamatoria diferenciar enfermedades similares. la VSG es normal en los pacientes con artrosis, pero est elevada en los que presentan fiebre reumtica, artritis reumatoidea o artritis pigena. Esta elevada en las fases iniciales de la enfermedad inflamatoria pelviana aguda o de un embarazo ectpico roto, pero es normal en las primeras horas de una apendicitis aguda. Puede usarse para indicar tuberculosis pulmonar activa. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGA Cuando Se deja sangre anticoagulada en reposo un tiempo a temperatura ambiente, los eritrocitos sedimentan hacia el fondo del tubo. La VSG es la cantidad de milmetros que los eritrocitos sedimentan en 1 hora, y es afectada por los eritrocitos, el plasma y factores mecnicos y tcnicos. Los eritrocitos tienen una carga superficial neta negativa, por consiguiente tienden a repelerse entre s. Las fuerzas repulsivas se neutralizan en forma parcial total si hay aumento de la cantidad. de protenas plasmticas con carga positiva; los eritrocitos sedimentan con mayor rapidez debido a la formacin de agregados de eritrocitos o "rodillos". Los ejemplos de macromolculas que pueden producir esta reaccin son: fibringeno, beta globulinas e inmunoglobulinas patolgicas. Los eritrocitos normales tienen una masa relativamente pequea y sedimentan despacio. Algunas enfermedades como el mieloma mltiple, pueden causar la formacin de "rodillos" debido a la alteracin del fibringeno y las globulinas plasmticas. Esta alteracin cambia la superficie del eritrocito, lo que genera su aglutinacin, aumento de su masa, y una VSG ms rpida. esta ltima es directamente proporcional a la masa del eritrocito e inversamente proporcional a la viscosidad del plasma. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Material de Laboratorio CANTIDAD 1 1 1 1 DESCRIPCIN Tubio de Wintrobe graduado Pipeta Pasteur Gradilla para tubos de Wintrobe Tubo con sangre anticoagulada

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4.PROCEDIMIENTO. 4.1 Tcnica 1. Llenar la pipeta de Wintrobe graduada hasta la marca cero con sangre anticoagulada con EDTA. 2. colocar la pipeta en el soporte y dejar sedimentar sin tocar 60 min 3. registrar la cantidad de milmetros que descendieron los eritrocitos. La capa leucocitaria no debe incluirse en la Lectura. 4. La VSG se informa como 1 hora= _________mm 4.2 Valores de Referencia. Edad Nios Hombres <50 aos >50 aos Mujeres <50 aos >50 aos ACTIVIDADES Reportar los resultados obtenidos. - Reporte de resultados .______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ VSG (mm/hr) 0 a 10 0 a 15 0 a 20 0 a 20 0 a 30

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HEMOSTASIA: PRCTICA No.10 MEDICIN DEL SISTEMA EXTRNSECO TIEMPO DE PROTROMBINA ( TP } EN UNA ETAPA
1. INTRODUCCIN. El anlisis de tiempo de Protrombina es sensible a las deficiencias del sistema extrnseco de la coagulacin ( factores I, II, V, VII X ). El TP se utiliza como exploraci6n prequirrgica para detectar posibles problemas hemorrgicos. Un TP prolongado Generalmente es indicativo de un nivel bajo en uno o ms de los factores del sistema de coagulacin extrnseco comn, cuya causa pueden ser trastornos hereditarios de la coagulacin, una deficiencia de vitamina K, problemas hepticos ingestin de frmacos. El TP es el anlisis de laboratorio ms corriente empleado para monitorizar la terapia anticoagulante oral, puesto que es sensible a los factores VII y X. No es sensible a las deficiencias del sistema intrnseco ( factores VIII. IX. XI y XII ) a las disfunciones plaquetarias. No puede utilizarse para la monitorizacin de la terapia de heparina, para la cual est recomendada la determinacin del Tiempo de activacin Parcial de Tromboplastina ( ATTP) 2. PRINCIPIO Y METODOLOGA El TP es el tiempo requerido para que se coagule el plasma despus de agregarle tromboplastina tisular v una cantidad ptima de cloruro de calcio, reponiendo el calcio que fue inactivado con el anticoagulante y agregando una tromboplastina completa para activar la va extrnseca. El mtodo de referencia de la Prueba del TP en una etapa es el recomendado por el Consejo Internacional de Estandarizacin en Hematologa/Consejo Internacional de Trombosis y Hemostasia (CIEH/CITH). Los resultados obtenidos dependen de numerosos factores como la temperatura, la calidad del agua, el pH, la fuerza inica, el mtodo de ensayo utilizado, la recogida y conservacin de las muestras, y la poblacin de pacientes en consideracin. Los rangos normales de muestras deben ser establecidos para cada laboratorio. Para cada nuevo lote de tromboplastina ( preparada en el laboratorio comercial ), se deben establecer valores normales en muestras de plasma, de aproximadamente 20 hombres mujeres que no estn tomando anticonceptivos. Para ello, no es necesario que todas las pruebas se efecten el mismo da. Es preferible hacerlas en das distintos pues as se consigue agregar la variabilidad de da a da. La media y la desviacin estndar se calculan a partir de los resultados.

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El resultado de la prueba en segundos se convierte a Porcentaje de Actividad normal por medio de una curva de referencia. El ndice de tiempo de Protrombina se calcula dividiendo el TP por el TP medio Del rango normal del laboratorio, representado por una muestra testigo normal. Para emplearse en el control de la medicacin anticoagulante, el ndice de Protrombina debe designarse en los informes de laboratorio de manera estndar como Tasa Normalizada Internacional de Protrombina INR del ingls International Normalizad Ratio. SE SUGIERE PUES, REPORTAR DE LA SIGUIENTE MANERA: TIEMPO DE PROTROMBINA: Testigo del dia ..X segundos Plasma Problema .... X segundos Porcentaje de actividad .% INR X 3.LISTA DE REQUERIMIENTOS. 3.1 Reactivos NUM NOMBRE DEL REACTIVO 1 Reactivo de Tromboplastina.* 2 Diluyente** 3 Anticoagulante Citrato de sodio CONC 3.2 a3.8% CANTIDAD 200l 10 ml 1gota/ml de sangre

*Reactivo de Tromboplastina: Tromboplastina tisular procedente de cerebro de conejo, iones de Caldo V estabilizador . **Diluyente. Estabilizadores y Conservantes. Contiene azida sdica al 0.05% como conservante. 3.2 Equipo de Laboratorio - Bao Mara con termostato a 37 C - Cronometro.

3.3 Material de Laboratorio CANTIDAD DESCRIPCIN 1 Micropipeta con punta desechable 1 Tubos de recogida al vaco con citrato de sodio al 3.2% 3.8%. 1 Gradilla. 3 Tubos de ensayo de fondo redondo que quepan en la Gradilla. 1 Gancho de alambre metlico,

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4.PROCEDIMIENTO 4.1Tcnica.. 4.1.1 Calentar previamente un volumen suficiente del reactivo de tromboplastina reconstituido a 37C .Tomar las precauciones necesarias para Impedir la evaporacin y no mantener a 37C sin tapn durante ms de 60 minutos antes del uso. 4.1.2. Etiquetar un tubo de ensayo para cada muestra ( paciente y control) del anlisis. 4.1.3. Agregar 0.1 ml de muestra al tubo apropiado. 4.1.4 Incubar cada muestra y control a 37C de 3 a 10 min. 4.1.5 Con fuerza, agregar 0.2 ml del reactivo de tromboplastina precalentado, y al mismo tiempo, iniciar el cronometraje de deteccin de coagulacin. 4.1.6 Anotar el tiempo en segundos requerido para detectar la coagulacin. 4.2 Preparacin de la Muestra y del Reactivo. 4.2.1Muestra: No es necesario que el paciente est en ayunas ni se someta a otra preparacin especial. Se recomienda plasma con anticoagulante de citrato de sodio al 3.2% en una proporcin de nueve partes de sangre por una de anticoagulante. 4.2.2Reactivo: El reactivo se prepara de la siguiente manera: Reconstituir un vial de reactivo de tromboplastina con un vial de diluyente. Los dos componentes deben ser del mismo lote del kit. Volver a tapar el vial e invertirlo suavemente varias veces para garantizar una rehidratacin completa. Dejar reposar durante 30 min. A temperatura ambiente. Invertir suavemente antes de su uso para garantizar homogeneidad .El reactivo permanece estable durante cuatro das si se mantiene en el vial original, tapado hermticamente y se almacena a 2-8C, y registrar la fecha de la reconstitucin en la etiqueta del vial. ACTIVIDADES: - Realizar la determinacin del TP problema y del TP del testigo normal y reportar en segundos. TIEMPO DE PROTROMBINA: Testigo del dia ..segundos Plasma Problema .... segundos Porcentaje de actividad .% INR Hemostasia 37

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- Realizar un esquema ( dibujado) de la va de la reaccin de la coagulacin de TP en la que se agrega reactivo de tromboplastina, que incluye factor tisular, fosfolpido y Ca++. - Explicar, en base al esquema, un TP prolongado, para deficiencias de qu factores es ms sensible y para cules es menos sensible.

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HEMOSTASIA: PRACTICA NO.11 "CURVA DE CALIBRACIN PARA TIEMPO DE PROTROMBINA"

1. INTRODUCCIN. El resultado de la prueba de TP ( en segundos) se convierte a porcentaje de actividad normal por medio de una curva de calibracin. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGA. La Curva de Calibracin se prepara mediante el anlisis de diluciones de una mezcla de plasmas citratados normales o material de referencia. 3.LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos NUM NOMBRE DEL REACTIVO 1 Reactivo de Tromboplastina.* 2 Diluyente** 3 Anticoagulante Citrato de sodio 4 Solucin Salina Fisiolgica CONC 3.2 a3.8% CANTIDAD 200l 10 ml 1gota/ml de sangre 10 ml

*Reactivo de Tromboplastina: Tromboplastina tisular procedente de cerebro de conejo, iones de Caldo V estabilizador . **Diluyente. Estabilizadores y Conservantes. Contiene azida sdica al 0.05% como conservante. 3.2 Equipo de Laboratorio - Bao Mara con termostato a 37 C - Cronometro.

3.3 Material de Laboratorio CANTIDAD DESCRIPCIN 1 Micropipeta con punta desechable 1 Tubos de recogida al vaco con citrato de sodio al 3.2% 3.8%. 1 Gradilla. 3 Tubos de ensayo de fondo redondo que quepan en la Gradilla. 1 Gancho de alambre metlico, 1 Pool de 5 6 plasmas citratados de pacientes normales. Hemostasia 39

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4.PROCEDIMIENTO 4.1 Tcnica 4.1.1Preparar las diluciones en solucin salina fisiolgica segn el siguiente esquema. Porcentaje de actividad Dilucin Plasma Solucin salina 100% Sin diluir 0.5ml 0.0ml 50% 1:2 0.5ml 0.5ml 25% 1:4 0.5ml 1.5ml 12.5% 1:8 0.5ml 3.5ml

4.1.2 Se toma 0.1 ml de cada una de las diluciones y se procede a determinar el tiempo de protrombina por duplicado de cada una de ellas. 4.1.3 Con los datos obtenidos, se traza una curva en papel milimtrico, poniendo el tiempo en segundos en el eje de las ordenadas y la concentracin en porcentaje en el eje de las abcisas. 4.2 Resultados. Porcentaje de actividad 100% 50% 25% 12% ACTIVIDADES: Realizar las diluciones como se Indica en la tabla y seguir el procedimiento para las determinaciones de Tp a cada una de ellas. Transferir los datos en papel milimtrico como se indica arriba trazando la curva correspondiente. Efectuar lo mismo en la tabla que se presenta abajo. Tiempo de protrombina en segundos

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HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 12 CONTROL DE LA TERAPUTICA ANTICOAGULANTE: CLCULO DE LA TASA NORMALIZADA INTERNACIONAL TNI INR
1.INTRODUCCIN. El control de la medicacin anticoagulante oral se basa en el tiempo de protrombina en una etapa ( TP ) con tromboplastina. El TP debe expresarse como la relacin del TP del enfermo con la del plasma normal control. Para controlar de manera confiable la teraputica anticoagulante, el laboratorista y el mdico deben estar capacitados para comparar sus resultados con los de otros laboratorios y tambin con los de su propio laboratorio, empleando diversos lotes de tromboplastina. Para este propsito, la OMS recomienda que todas las tromboplastinas deban calibrarse comparndolas con un ndice Internacional de Sensibilidad IIS. La OMS ha establecido un estndar primario internacional de referencia de cerebro humano, y posteriormente, estndares de referencia de tromboplastinas humanas, de res y de conejo. Estas preparaciones han sido calibradas en relacin con el estndar primario original al que se le adjudic un IIS de 1.0 Debido al riesgo biolgico implicado, el cerebro humano no debe utilizarse como fuente de tromboplastina. 2.PRINCIPIO Y METODOLOGA. 2.1 Interpretacin. La TNI o INR de los pacientes que estn bajo tratamiento con anticoagulantes orales, tales romo la warfarina, debe mantenerse dentro de los lmites teraputicos, ajustando la dosis ron determinaciones peridicas de TP, habitualmente cada 2 a 3 semanas. Se recomiendan los siguientes lmites: Condicin -Profilaxis preoperatorio de trombosis venosa profunda -Profilaxis para ciruga de cadera para operar un fmur fracturado -Tratamiento de trombosis venosas profundas de embolia pulmonar -Episodios Transitorios de Isquemia -Trombosis venosas recurrentes profundas de embolia pulmonar -Infarto del miocardio -Injertos arteriales -Prtesis valvulares cardiacas e injertos TNI o INR 2.0- 2.5 2.0- 3.0 2.0 -3.0 2.0 -3.0 3.0 -4.5 3.0 -4.5 3.0 -4.5 3.0 -4.5

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Si se prolonga la TNI INR, ( > 5.0 },es probable que ocurran hemorragias espontneas. Cuando el paciente informa alguna hemorragia, la TNI INR debe determinarse de inmediato. Tambin debe efectuarse un seguimiento cuidadoso de la TNI INR en los pacientes que se encuentran recibiendo otros medicamentos, particularmente aquellos que se sabe aumentan 6 disminuyen el efecto de los anticoagulantes, como se muestra en la tabla de abajo. Los anticoagulantes orales pueden lesionar al feto. Deben interrumpirse al primer signo de embarazo y sustituirse por heparina. A diferencia de la teraputica anticoagulante por va oral, la anticoagulacin con heparina, sin embargo, no est bien estandarizada. INCREMENTAN SU EFECTO CIRCUNSTANCIAS CLNICAS Trastornos hepticos Desnutricin Esteatorrea Diarrea Carcinoma en Vsceras fiebre e Infeccin Insuficiencia cardaca Insuficiencia renal Tirotoxicosis Radioterapia Alcoholismo DISMINUYEN SU EFECTO Anticidos Barbitricos Colestiramina Corticosteroides Diurticos Estrgenos Anticonceptivos orales Fenitona Rifampicina 2.2 Clculos. El TNI INR ( por sus siglas en ingls Internacional Normalizad Ratio ) se calcula por medio del ndice Internacional de Sensibilidad IIS y el ndice de Protrombina de la siguiente manera:
ISI

MEDICAMENTOS Acido acetilsaliclico Alopurinol Ampicilina Esteroides anablicos Aspirina Cloramfenicol Clofibrato Medicamentos citotxicos Neomicina Fenilbutazona Sulfonamidas Antidepresivos tricclicos

ndice de TP = Tasa Normalizada Internacional o INR = (ndice de TP)

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Para cada lote de reactivo de tromboplastina, se determina su valor de IIS mediante su calibracin relativa a un Preparado de Referencia Internacional, y se suministra en el cuadro de valores de INR del reactivo. ACTIVIDADES. Efectuar el clculo del INR a partir de las determinaciones del TP realizadas a las muestras problema.

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HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 13 MEDICIN DEL SISTEMA INTRNSECO TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA ( TTPa )
1. INTRODUCCIN Esta prueba mide la actividad procoagulante intrnseca del plasma. Esta prueba es sensible a todos los factores que intervienen en el sistema intrnseco, y no mide la actividad de los factores VIl y XIII. 2.PRINCIPIO Y METODOLOGA. 2.1 Principio. La tromboplastina parcial es un sustituto del factor plaquetario 3 ( fosfolpidos de cerebro de conejo). La activacin por contacto se estandariza aadiendo un activador como caoln, celita cido elgico al reactivo. 2.2 Metodologa : Preparacin de las Muestras. En un tubo limpio, conteniendo una parte de sol. Anticoagulante , aadir 9 partes de sangre recin obtenida. Mezclar con suavidad. Conservar el tubo en refrigerador en hielo picado. Antes de realizar la prueba, centrifugar y separar el plasma. Las pruebas deben complementarse dentro de las 4 horas siguientes a la obtencin de la muestra. 3.LISTA DE REQUERIMIENTOS. 3.1 Reactivos NUM NOMBRE DEL REACTIVO 1 Reactivo de Tromboplastina Parcial* 2 Cloruro de calcio CONC 0.025 M CANTIDAD 200l 10 ml

*Fosfolpidos de cerebro de conejo adicionado de partculas de slice micronizada que actan como activador ( superficie de contacto) y tampn cido.

3.2 Equipo de Laboratorio - Bao Mara con termostato a 37 C - Cronometro.

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Facultad de Bioanlisis, Veracruz

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3.3 Material de Laboratorio CANTIDAD DESCRIPCIN 1 Micropipeta con punta desechable 1 Tubos de recogida al vaco con citrato de sodio al 3.2% 3.8%. 1 Gradilla. 3 Tubos de ensayo de 12 X 75 1 Gancho de alambre metlico,

3. PROCEDIMIENTO 3.1TCNICA. ( mtodo manual) . 3.1.1. Calentar previamente a 37C un volumen suficiente de solucin de cloruro de Calcio 0.025M. 3.1.2. Identificar un tubo de ensayo para cada muestra a analizar ( pacientes y controles). Se aconseja hacer las pruebas por duplicado. 3.1.3 Dispensar 0.1 ml de plasma a su tubo correspondiente. Aadir 0.1 ml del reactivo de tromboplastina parcial a cada tubo. 3.1.4. Incubar a 37C durante 5 minutos exactos ( tiempo de activacin). 3.1.5. Inmediatamente aadir 0.1 ml de solucin de Ca 0.025M. Simultneamente poner el cronmetro en marcha y determinar la formacin del cogulo. 3.1.6. Anotar el tiempo en segundos, transcurridos hasta la formacin del cogulo. ACTIVIDADES - Efectuar la prueba de TTPa en el plasma problema y anotar el resultado en segundos. - Realizar un esquema ( dibujado) de la va de la reaccin de la coagulacin de TTPa en la que se agrega reactivo de tromboplastina parcial, sustituto de factor plaquetario 3. - Explicar, en base al esquema, un TPT prolongado, para deficiencias de qu factores es ms sensible y para cules es menos sensible. - Anexar esquemas en donde se conjunten las posibles interpretaciones de los tiempo de TP y TTPa realizados a un mismo paciente.

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