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MANUAL DE TCNICAS DE LABORATORIO PARA EL ANLISIS DE ALIMENTOS

Dr. Csar Augusto Lerena Dr. Joaqun I. Lerena Dra. Adriana Pereyra Assistance Food Argentina S.A. Copyright 1998 Rev. 15.9.07

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En el presente Manual de Tcnicas de Laboratorio para el anlisis de Alimentos se describen las prcticas y metodologas ms habituales de uso en las actividades alimentarias, sin que por ello sean excluyentes, ya que existen numerosas opiniones y criterios y los laboratoristas utilizan mtodos en los que se encuentran ms seguros o que consideran ms adecuadas e internacionalmente aceptadas. En especial nos ocuparemos de: 1. Instrucciones para la preparacin del material de vidrio. 2. Instrucciones para el manejo del autoclave. 3. Instrucciones para el fraccionamiento de medios de cultivo en placas de petri (plaqueado). 4. Instructivo para la preparacin de medios de cultivo. 5. Instructivo para la siembra de muestras. 6. Instructivo para el recuento de colonias. 7. Anlisis microbiolgico de agua. 8. Anlisis microbiolgico de productos pre-elaborados. 9. Formulacin, tcnica e interpretacin de hisopados en superficies de contacto y personal. 10. Interpretacin de resultados. 1. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIN DEL MATERIAL DE VIDRIO 1.1. Limpieza y acondicionamiento de material que no requiere esterilizacin Esterilizar todo material sucio (placas y tubos sembrados, etc.) en autoclave a 1,5 atmsferas, durante 15 minutos. Lavar el material de vidrio con agua tibia (45-50 C), detergentes y cepillos. Enjuagar con agua tibia. Secar por escurrido. Almacenar protegido contra el polvo del medio ambiente. Previo a su utilizacin enjuagar el interior con agua destilada. 1.2. Limpieza y acondicionamiento de material que requiere esterilizacin 1.2.1. En general Esterilizar todo material sucio (placas y tubos sembrados, etc.) en autoclave a 1.5 atmsferas, durante 15 minutos. Lavar el material de vidrio con agua tibia (45-50 C),detergentes y cepillos.

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Enjuagar con agua tibia. Secar por escurrido. 1.2.2. Placas de Petri y tubos de ensayo, hemlisis, etc. Envolver en papel, de manera que no quede ninguna parte del material en contacto con el aire. Esterilizar en estufa a 160 C durante 1 hora. 1.2.3. Pipetas Envolver en papel, de manera que no quede ninguna parte del material en contacto con el aire. Esterilizar en autoclave en un Pipetero de Acero Inoxidable a 1 atmsfera, durante 15 minutos. Nota: Si las pipetas van a estar siempre contenidas en el pipetero, no es necesario envolver en papel. 2. INSTRUCCIONES PARA EL MANEJO DEL AUTOCLAVE Comprobar el nivel de agua que debe cubrir el fondo del autoclave sin inundar el piso del mismo. Cargar el autoclave con el material a esterilizar evitando que toque en forma directa el piso y las paredes del mismo. Verificar que el nivel de carga no obstruya el cierre del autoclave. Colocar y atornillar la tapa, ajustando por parejas diametralmente opuestas, de forma tal que la tapa encaje perfectamente sobre la arandela (muy importante para evitar prdidas de vapor por cierre incorrecto). Abrir la vlvula de vapor y encender el gas en posicin mximo. Esperar a que salga vapor de la vlvula en forma de columna durante 5 minutos. Cerrar la vlvula de vapor. Cuando el manmetro llegue a la presin deseada, bajar la llama de gas a posicin mnimo, y dejar el tiempo indicado para la esterilizacin. Cerrar la llama de gas. Esperar a que el manmetro llegue a cero. Abrir la vlvula de vapor, hasta eliminar todo el vapor sobrante. Abrir la tapa. 3. INSTRUCCIONES PARA EL FRACCIONAMIENTO DE MEDIOS DE CULTIVO EN PLACAS DE PETRI (PLAQUEADO) Debe realizarse en el rea de sembrado, con mesadas y azulejos desinfectados, elementos de laboratorio estriles y sin corrientes de aire, con mecheros de Bunsen encendidos. Fundir el medio a Bao Mara. Tener en cuenta que los medios, por su fraccin proteica son sensibles a la

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desnaturalizacin por calor, por lo tanto debe evitarse que el tiempo de exposicin sea superior al necesario para la fundicin. La temperatura del medio al momento de fraccionar no debe ser superior a los 50 C, para evitar condensacin de vapores en las Placas de Petri. Fraccionar al lado del mechero de Bunsen encendido, abriendo la placa hacia el lado de la llama, vertiendo el contenido del tubo de ensayo y/o Erlen Meyer. Antes de cerrar la placa dejar unos minutos semidestapada, para facilitar la salida de vapor excedente; el lado abierto de la placa debe estar orientado hacia la llama del mechero. Cerrar las placas y dejar solidificar a temperatura ambiente. 4. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO 4.1. MEDIO: DE PRE-ENRIQUECIMIENTO

Aplicacin: Dilucin y pre-enriquecimiento no selectivo para la preparacin de muestras. Incubacin en: vara segn el tiempo y temperatura de pre-enriquecimiento de cada marcha. Marcha: Se entiende como la serie de procesos a los que se somete una muestra (enriquecimiento, cultivo, incubacin, etc.). Para la determinacin y/o identificacin de microorganismos indicadores o patgenos. Modo de Preparacin:
COMPONENTES SLIDOS Fosfato anhidro disdico 8.66 g Fosfato anhidro monosdico 4.66 g Peptona de Carne 10.00 g AGUA DESTILADA 1000 ml. HOMOGENEIZAR 10 a Bao Mara ESTERILIZAR 15 a 1 atm. (autoclave)

Pesar en balanza digital la cantidad indicada de reactivos y agregar el agua destilada en jarra de precipitado, previamente enjuagada con agua destilada. Homogeneizar con cuchara esptula y colocar a Bao Mara el tiempo indicado (continuar el mezclado con cuchara), hasta completar el proceso. Fraccionar segn su utilizacin en: a) Frascos para dilucin de muestras: a1) Preparar frascos limpios (del tipo mermeladas) con trozos de vidrio, que harn las veces de homogeneizador y en estos envases as acondicionados verter la cantidad indicada segn la marcha de diluyente medido con probeta. a2) Tapar con la tapa propia del frasco y luego sellar esta con una tapa papel aluminio y otra de papel comn y cerrar todo con banda elstica. a3) Esterilizar en autoclave el tiempo indicado. a4) Mantener en heladera (4-8 C). b) Tubos de ensayo para preparacin de Hisopos (ver Anexo de instructivo para formulacin y tcnicas de Hisopos).

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4.2. MEDIO: PLATE COUNT Aplicacin: recuento de BACTERIAS AEROBIAS MESFILAS. Incubacin en: Estufa a 36.5 C durante 72 horas. Modo de Preparacin:
MEDIO DESHIDRATADO 4.6 g AGUA DESTILADA 200 ml. HOMOGENEIZAR 10 a Bao Mara ESTERILIZAR 15 a 1 atm.

Pesar en balanza digital la cantidad indicada de medio deshidratado y agregar el agua destilada en jarra de precipitado, previamente enjuagada con agua destilada. Homogeneizar con cuchara esptula y colocar a Bao Mara el tiempo indicado (continuar el mezclado con cuchara), hasta completar el proceso. Fraccionar con pipeta, en tubos de ensayo 10 ml de medio. Tapar con tapn de algodn y aluminio y/o tapn plstico que resista la esterilizacin. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atmsfera de presin. Colocar los tubos en gradillas, envolver en polietileno, e identificar con tinta indeleble con la sigla PC. Mantener en heladera (4-8 C). Para sembrar fundir tantos tubos, como placas sean necesarias, a bao Mara. Verter en placas de Petri estriles (siguiendo las instrucciones del fraccionamiento en placas). 4.3. MEDIO: VIOLETA ROJO BILIS DEXTROSA (VRBD) Aplicacin: recuento de ENTEROBACTERIAS. Incubacin en: Estufa a 36.5 C durante 24 horas. Modo de Preparacin:
MEDIO DESHIDRATADO 8.3 g AGUA DESTILADA 200 ml. HOMOGENEIZAR 10 Bao Mara ESTERILIZAR 30 a vapor fluente

Pesar en balanza digital la cantidad indicada de medio deshidratado y agregar el agua destilada en jarra de precipitado, previamente enjuagada con agua destilada. Homogeneizar con cuchara esptula y colocar a Bao Mara el tiempo indicado (continuar el mezclado con cuchara), hasta completar el proceso. Nota: en este medio, la homogeneizacin es un paso crtico, por la tendencia del agar a sedimentar. Fraccionar con pipeta, en tubos de ensayo 10 ml de medio. (debe hacerse en forma rpida de modo de evitar que comience a solidificar).

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Tapar con tapn de algodn y aluminio y/o tapn plstico que resista la esterilizacin. Esterilizar en Vapor fluente (en autoclave sin presin) durante 30 minutos. Colocar los tubos en gradillas, envolver en polietileno, e identificar con tinta indeleble con la sigla VRBD. Mantener en heladera (4-8 C). Para sembrar fundir tantos tubos como placas sean necesarias, a bao Mara . Verter en placas de Petri estriles (siguiendo las instrucciones del fraccionamiento en placas). 4.4. MEDIO: CALDO BRILA Aplicacin: determinacin de COLIFORMES. Incubacin en: Estufa a 36.5 C durante 48 horas (COLIFORMES TOTALES). Bao Termosttico a 45 C durante: 48hs. (COLIFORMES FECALES). Modo de Preparacin:
MEDIO DESHIDRATADO 8g AGUA DESTILADA 200 ml HOMOGENIZAR 10 a Bao Mara ESTERILIZAR 15 a 1 atm.

Pesar en balanza digital la cantidad indicada de medio deshidratado y agregar el agua destilada en jarra de precipitado, previamente enjuagada con agua destilada. Homogeneizar con cuchara esptula y colocar a Bao Mara el tiempo indicado (continuar el mezclado con cuchara),hasta completar el proceso. Colocar en cada tubo de ensayo una Campanita de Durham, el extremo abierto de la campanita debe quedar en contacto con el fondo del tubo. Fraccionar con pipeta, en tubos de ensayo 9ml de medio, luego invertir el tubo tapando con el pulgar la boca del mismo, para sacar el aire de la campanita (no debe quedar ninguna burbuja en el interior de la misma). Tapar con tapn de algodn y aluminio y/o tapn plstico que resista la esterilizacin. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atmsfera de presin. Colocar los tubos en gradillas, envolver en polietileno, e identificar con tinta indeleble con la sigla BRILA. Mantener en heladera (4-8 C). 4.5. MEDIO: AGAR EOSINA AZUL DE METILENO (EMB) Aplicacin: visualizacin de colonias sospechosas de E. COLI. Incubacin en: Estufa a 36.5C durante 24 horas.

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Modo de Preparacin:
MEDIO DESHIDRATADO 7.2 g AGUA DESTILADA 200 ml HOMOGENEIZAR 10 a Bao Mara ESTERILIZAR 15 a 1 atm.

Pesar en balanza digital la cantidad indicada de medio deshidratado y agregar el agua destilada en jarra de precipitado, previamente enjuagada con agua destilada. Homogeneizar con cuchara esptula y colocar a Bao Mara el tiempo indicado (continuar el mezclado con cuchara), hasta completar el proceso. Fraccionar todo el volumen en Erlen Meyer. Tapar con tapn de algodn y aluminio y/o tapn plstico que resista la esterilizacin. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atmsfera de presin. Fraccionar en placas de Petri (siguiendo las recomendaciones del fraccionamiento en placas). Identificar con tinta indeleble, con la sigla EMB en la base de la placa. Envolver de a cuatro placas en papel aluminio. Mantener en heladera (4-8 C). 4.6. MEDIO: AGAR BAIRD PARKER Aplicacin: visualizacin de colonias sospechosas de STAPHYLOCOCCUS AUREUS. Incubacin en: Estufa a 36.5C durante 48 horas. Modo de Preparacin:
MEDIO DESHIDRATADO 11.6 AGUA DESTILADA 200 ml HOMOGENEIZAR 10 a Bao Mara ESTERILIZAR 15 a 1 atm.

Pesar en balanza digital la cantidad indicada de medio deshidratado y agregar el agua destilada en jarra de precipitado, previamente enjuagada con agua destilada. Homogeneizar con cuchara esptula y colocar a Bao Mara el tiempo indicado(continuar el mezclado con cuchara),hasta completar el proceso. Fraccionar todo el volumen en Erlen Meyer. Tapar con tapn de algodn y aluminio y/o tapn plstico que resista la esterilizacin. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atmsfera de presin. Al retirar el medio del autoclave enfriar hasta 50 C (en bao termosttico a 45 C)
(*)

Agregar cada 200 ml de medio 10 ml de yema de huevo Telurito, agitando en forma constante el Erlen Meyer, (*) para lograr una solucin homognea Fraccionar en placas de Petri (siguiendo recomendacin del fraccionamiento en placas).

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Identificar con tinta indeleble, con la sigla BP en la base de la placa. Envolver de a cuatro placas en papel aluminio. Mantener en heladera (4-8 C). (*) Importante: La temperatura del medio al agregar la yema de Huevo Telurito, no debe superar los 50 C, porque el huevo se desnaturaliza visualizndose como hilos; ni ser inferior a 45C, para evitar la solidificacin del agar, ya que una vez agregada la yema de huevo el medio no puede ser recalentado. En ambos casos el medio queda inutilizado. 4.7. MEDIO: AGAR MANITOL Aplicacin: identificacin de colonias sospechosas de STAPHYLOCOCCUS AUREUS. Incubacin en: Estufa a 36.5C durante 24 horas. Modo de Preparacin:
MEDIO DESHIDRATADO 21.6 AGUA DESTILADA 200 ml HOMOGENEIZAR 10 a Bao Mara ESTERILIZAR 15 a 1 atm.

Pesar en balanza digital la cantidad indicada de medio deshidratado y agregar el agua destilada en jarra de precipitado, previamente enjuagada con agua destilada. Homogeneizar con cuchara esptula y colocar a Bao Mara el tiempo indicado (continuar el mezclado con cuchara), hasta completar el proceso. Fraccionar todo el volumen en Erlen Meyer. Tapar con tapn de algodn y aluminio y/o tapn plstico que resista la esterilizacin. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atmsfera de presin. Fraccionar en placas de Petri (siguiendo las recomendaciones del fraccionamiento en placas). Identificar con tinta indeleble, con la sigla MAN en la base de la placa. Envolver de a cuatro placas en papel aluminio. Mantener en heladera (4-8 C). 4.8. MEDIO: CALDO INFUSION CEREBRO CORAZON (CICC) Aplicacin: caldo de enriquecimiento de colonias sospechosas de STAPHYLOCOCCUS AUREUS. Incubacin en: Estufa a 36.5C durante 24 horas. Modo de Preparacin:
MEDIO DESHIDRATADO 7.4 g AGUA DESTILADA 200 ml HOMOGENEIZAR 10 a Bao Mara ESTERILIZAR 15 a 1 atm.

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Pesar en balanza digital la cantidad indicada de medio deshidratado y agregar el agua destilada en jarra de precipitado, previamente enjuagada con agua destilada. Homogeneizar con cuchara esptula y colocar a Bao Mara el tiempo indicado (continuar el mezclado con cuchara), hasta completar el proceso. Fraccionar con pipeta, en tubos de ensayo 10ml de medio. Tapar con tapn de algodn y aluminio y/o tapn plstico que resista la esterilizacin. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atmsfera de presin. Colocar los tubos en gradillas, envolver en polietileno, e identificar con tinta indeleble con la sigla CICC. Mantener en heladera (4-8 C). 4.9. MEDIO: PLASMA DE CONEJO CON EDTA LIOFILIZADO Aplicacin: test de coagulasa para identificacin de STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA POSITIVO. Incubacin en: estufa de cultivo a 37C e ir observando a partir de los 30 minutos a 4 horas si coagula el plasma. Si no se produce coagulacin del plasma dejar hasta 24 horas. Modo de Preparacin:
MEDIO LIOFILIZADO AGUA DESTILADA ESTRIL Segn presentacin comercial (*) HOMOGENEIZAR Por agitacin ESTERILIZAR No

(*) Las presentaciones contienen un volumen de liofilizado para hidratar en 2 ml. La hidratacin del Plasma debe realizarse en el rea de sembrado, con mesadas y azulejos desinfectadas, elementos de laboratorio estriles y sin corrientes de aire, con mecheros de Bunsen encendidos. Luego, en las mismas condiciones ambientales de la hidratacin, fraccionar con pipeta estril, en tubos de hemlisis, 0.5 ml. de plasma. Tapar con tapn de algodn y aluminio plsticos estriles. Mantener a 20 C. Descongelar a Temperatura ambiente para la inoculacin. 4.10. MEDIO: HONGOS Y LEVADURAS Aplicacin: recuento de HONGOS Y LEVADURAS Incubacin en: Estufa a 37 C durante 5 das. Modo de Preparacin:
MEDIO DESHIDRATADO AGUA DESTILADA Segn presentacin comercial HOMOGENEIZAR 10 a Bao Mara ESTERILIZAR 15 a 1 atm.

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Preparacin del Antibitico Clortetraciclina Diluir 0.01 g de antibitico en 5ml de agua destilada estril. Pesar en balanza digital la cantidad indicada de medio deshidratado y agregar el agua destilada en jarra de precipitado, previamente enjuagada con agua destilada. Homogeneizar con cuchara esptula y colocar a Bao Mara el tiempo indicado (continuar el mezclado con cuchara), hasta completar el proceso. Fraccionar todo el volumen en Erlen Meyer. Tapar con tapn de algodn y aluminio y/o tapn plstico que resista la esterilizacin. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atmsfera de presin. Al retirar el medio del autoclave dejar enfriar hasta 50C (en bao termosttico a 45C) . Agregar cada 200 ml de medio 0.5 ml de antibitico clortetraciclina agitando en forma constante el Erlen Meyer, (*) para lograr una solucin homognea . Fraccionar en placas de Petri (siguiendo las recomendacin del fraccionamiento en placas). Identificar con tinta indeleble, con la sigla HL en la base de la placa. Envolver de a cuatro placas en papel aluminio. Mantener en heladera (4-8 C). (*) Importante: La temperatura del medio al agregar el Antibitico no debe superar los 50 C; ni ser inferior a 45 C, para evitar la solidificacin del agar, ya que una vez agregada el antibitico el medio no puede ser recalentado. En ambos casos el medio queda inutilizado. 5. INSTRUCTIVO PARA LA SIEMBRA DE MUESTRAS 5.1. EN GENERAL a) El rea de sembrado, debe ser un sector aislado y cerrado, sin corrientes de aire. b) Las mesadas y azulejos deben estar desinfectadas, (lavar con detergentes, enjuagar y tratar con desinfectantes c) Los elementos de laboratorio limpios y/o estriles (ver instrucciones de preparacin de material de laboratorio). d) Los mecheros de Bunsen encendidos. e) Antes de comenzar la siembra el tcnico debe constatar que tiene todos los elementos necesarios preparados, (para esto se recomienda leer los instructivos de la marcha que va a realizar). Elementos bsicos para todas las marchas: Pipetas estriles de distintos calibres. Pipetas Pasteur acondicionadas en un recipiente con alcohol.
(*)

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Tijeras, pinzas y cucharas esptulas acondicionadas en un recipiente con alcohol. Frasco con agua destilada estril. Cucharas esptulas estriles. Ansas de punta y punta redonda. Algodn. Alcohol. Placas de Petri estriles, desenvueltas e identificadas con la sigla del medio en que se va a sembrar y con el nmero de muestra correspondiente. Gradillas con los medios en tubos identificados con el nmero de muestra y la dilucin correspondiente. Recipientes vacos para ir colocando las pipetas o utensilios de laboratorio que ya han sido utilizados. 5.2. TRATAMIENTO DE LA MUESTRA a) Si el envase de la muestra tiene tapa, destapar y quitar con una cuchara esptula estril la capa superficial. b) Si la muestra se encuentra en bolsas de polietileno desinfectar con alcohol, la superficie, luego flamear pinza y tijera (que se encontraban en el frasco con alcohol), enfriar en agua destilada estril y abrir la bolsa sosteniendo con la pinza y cortando con la tijera. c) Una vez abierta la muestra quitar con una cuchara esptula estril la capa superficial. d) Tarar una placa de Petri estril en una balanza digital, y colocar en sta los gramos necesarios de la muestra, segn la marcha: Realizar la operacin con cuchara esptula estril, abriendo y cerrando la placa al ir incorporando la muestra hasta conseguir el peso deseado, siempre al lado del Mechero de Bunsen encendido (la placa de Petri debe permanecer cerrada y la parte interna de la tapa no debe contactar con el exterior). Esta maniobra debe realizarse sin que los utensilios toquen ningn elemento ajeno a la muestra y al lado del Mechero de Bunsen encendido e) Luego colocar la muestra en el frasco con diluyente: Primero se debe aflojar la tapa del frasco, sin quitarla. Luego se quita la tapa de la placa de Petri, sin apartarla del Mechero. Tomar la muestra con cuchara estril con una mano y destapar el frasco de manera que la parte interna de la tapa no contacte con el exterior con la otra mano. Cerrar el frasco y homogeneizar agitando suavemente de manera que el lquido no contacte con la tapa del mismo 5.3. TCNICAS DE SEMBRADO A efectos de este instructivo se describirn slo alguna de las tcnicas a aplicarse: a) Sembrado en Superficie Se denomina a la siembra realizada con Ansa de punta redonda o pipeta Pasteur donde la solucin a sembrar se esparce sobre el medio ya solidificado, cubriendo la superficie del mismo sin perforarlo. b) Sembrado en Profundidad

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En este caso se vierte en placa de Petri vaca y estril una determinada cantidad de solucin a sembrar y luego se agrega el medio fundido (plaqueado). A continuacin se realiza la homogeneizacin del medio y la solucin a sembrar con movimientos en forma de ocho sobre la mesada de trabajo con la placa de Petri perfectamente cerrada. Luego se deja solidificar, para incubar en estufa. c) Sembrado en Estras Se denomina a la siembra realizada con Ansa de punta, donde la solucin a sembrar se esparce sobre el medio ya solidificado, cubriendo la superficie del mismo, introduciendo la punta del Ansa de manera que perfora el medio sin atravesarlo (Se dibuja una vbora o una onda). 6. INSTRUCTIVO PARA EL RECUENTO DE COLONIAS EN PLACAS DE PETRI a) Las colonias bacterianas pueden tener distintas formas, a efectos de este instructivo, haremos referencia a las frecuentemente observadas en los medios de recuentos totales (Por ej.: Plate Count, VRBD), aqu se observan colonias de forma circular y del tamao de la cabeza de un alfiler (pueden ser ms pequeas). b) Las colonias caractersticas de un determinado gnero se describen en la marcha correspondiente (vase Staph. Aureus Coagulasa (+), E. Coli, por ej.) c) Se toma la placa de Petri, sin destaparla y se coloca en el contador de colonias (aparato dotado de luz y aumento que permite visualizar con mayor nitidez las colonias). Si no se contara con un contador se toma la placa de Petri a trasluz, de manera que se visualicen claramente las colonias. d) Con una fibra de tinta indeleble, se marcan y se cuentan mentalmente todas las colonias separadas entre s por lo menos por una distancia equivalente al radio de una colonia, considerando cada una de stas como una unidad. e) Luego se multiplica el nmero absoluto de colonias contadas por la dilucin de la siembra, obtenindose as, la cantidad de unidades formadoras de colonias por gramo. (Por Ej.: si se contaron 20 colonias de una dilucin 1, se multiplica por 10, es decir: 200 ufc/g). 7. ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUA a) Recuento de Bacterias Aerobias Mesfilas: Sembrar 1 ml de agua de la muestra en Plate Count, en Profundidad. Incubar en estufa 48 horas a 37C. Contar todas las colonias (ver instructivo para Recuento de colonias ) b) Determinacin de Coliformes Totales: Sembrar en 3 tubos de caldo Mc Conkey doble concentracin, 10 ml de agua. Sembrar en 3 tubos de caldo Mc Conkey simple concentracin, 1 ml de agua. Sembrar en 3 tubos de caldo Mc Conkey simple concentracin, 0,1 ml de agua. Incubar los tubos sembrados en estufa a 37 C durante 48 horas, luego observar en los tubos la formacin de gas

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en campana de Durham (se observa una burbuja que ocupa un tercio de la campana) este resultado se interpreta como positivo; en los que no se observa formacin de gas se interpreta como negativo. Con los resultados, se lee en tabla de Hoskins el Numero ms Probable (NMP) de Coliformes Totales. c) Determinacin de Coliformes Fecales: Los tubos que resultaron positivos para Coliformes Totales son repicados en caldo Mc Conkey de simple concentracin e incubados en Bao Termosttico a 45 C durante 48 horas, luego observar en los tubos la formacin de gas en campana de Durham (se observa una burbuja que ocupa un tercio de la campana) este resultado se interpreta como positivo; en los que no se observa formacin de gas se interpreta como negativo. Con los resultados, se lee en tabla de Hoskins el Numero ms Probable (NMP) de Coliformes Fecales. d) Determinacin de Escherichia Coli: Los tubos que resultaron positivos para Coliformes Fecales son sembrados en superficie en Agar Eosina Azul de Metileno (E.M.B.), tomando una gota del tubo con Ansa de Punta redonda y siguiendo las instrucciones para siembra . Incubar en estufa a 37 C durante 24 horas y observar en las Placas el crecimiento de colonias puntiformes con brillo metlico, este resultado se interpreta como bacterias del Gnero de E. Coli. El diagnstico debe confirmarse con pruebas Bioqumicas. e) Determinacin de Pseudomona Auriginosa: Sembrar 1 ml de agua en 10 ml de Caldo Cerebro Corazn e incubar en estufa 24 hs. A 37 C, la formacin de turbidez en el medio se considera positivo, si el medio permanece lmpido se considera negativo. El tubo positivo es sembrado en medio Plate Count en profundidad, y se incuba 24 horas a temperatura ambiente, la presencia de Colonias verdosas se considera positivo. 8. ANLISIS MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS PRE-ELABORADOS Se toman 20 g de la muestra, (ver instructivo de Siembra) y se colocan en un frasco con 180 ml. de Diluyente para Salmonella. Homogeneizar agitando suavemente sin que el lquido contacte con la tapa. Incubar en estufa 10 minutos a 37 C. NOTA: A efectos de este instructivo, de aqu en adelante, llamaremos solucin a la muestra diluida, homogeneizada e incubada en Medio de Pre-enriquecimiento. a) Recuento de Bacterias Aerobias Mesfilos: Colocar 1ml de la solucin en Placa estril rotulada con la sigla PC en la base, y sembrar en profundidad. Incubar en estufa 48 horas a 37 C. Contar todas las colonias (ver instructivo para recuento de colonias )

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b) Recuento de Enterobacterias: Colocar 1ml de la solucin en Placa estril rotulada con la sigla VRBD en la base, y sembrar en profundidad. Incubar en estufa 24 horas a 37 C. Contar todas las colonias (ver instructivo para recuento de colonias ) c) Determinacin de Coliformes Totales: Colocar 1 ml. de solucin en Caldo Brila. Incubar los tubos sembrados en estufa a 37 C durante 48 horas, luego observar en los tubos la formacin de gas en campana de Durham (se observa una burbuja que ocupa un tercio de la campana) este resultado se interpreta como positivo; en los que no se observa formacin de gas se interpreta como negativo. Con los resultados, se lee en tabla de Hoskins el Numero ms Probable (NMP) de Coliformes Totales. d) Determinacin de Coliformes Fecales: Los tubos que resultaron positivos para Coliformes Totales son repicados en caldo Brila e incubados en Bao Termosttico a 45 C durante 48 horas, luego observar en los tubos la formacin de gas en campana de Durham (se observa una burbuja que ocupa un tercio de la campana) este resultado se interpreta como positivo; en los que no se observa formacin de gas se interpreta como negativo. Con los resultados, se lee en tabla de Hoskins el Numero ms Probable (NMP) de Coliformes Fecales. e) Determinacin de Escherichia Coli: Los tubos que resultaron positivos para Coliformes Fecales son sembrados en superficie en Agar Eosina Azul de Metileno (E.M.B.), tomando una gota del tubo con Ansa de Punta redonda y siguiendo las instrucciones para siembra. Incubar en estufa a 37 C durante 24 horas y observar en las Placas el crecimiento de colonias puntiformes con brillo metlico, este resultado se interpreta como bacterias del Gnero de E. Coli. El diagnstico debe confirmarse con pruebas Bioqumicas. f) Determinacin de Staphilococcus Aureus Coagulasa Positivo: Sembrar 0.1 ml de solucin en Medio Baird Parker y esparcir en superficie con Pipeta Pasteur, hasta que el medio absorba la solucin. Incubar en estufa 48 horas a 37 C. Observar la formacin de colonias caractersticas puntiformes con un halo transparente que la rodea. Contar las colonias con estas caractersticas, y registrar el N como: Staphilococcus Aureus sp. Luego a estas colonias se les realiza la PRUEBA DE LA CATALASA: a) Colocar en un portaobjetos una gota de Perxido de hidrgeno (agua oxigenada), b) Tomar con una ansa de punta una muestra de una colonia, tambin puede picarse de varias colonias pequeas, testeando un pool. c) Luego colocar la punta del ansa sobre el portaobjeto de manera que contacte con la gota de perxido de Hidrgeno y observar la formacin de Burbujas, si esto se observa se registra como Catalasa positivo (+). Si no se forman burbujas se considera Catalasa negativo (-).

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Las colonias Catalasa (+) se siembran por mtodo de estras en agar manitol salado y se incuban en estufa 24 horas a 37 C. Se observa el viraje de color del rea sembrada de rojo a amarillo (esta reaccin se registra como manitol positivo (+), si no vira de color se registra como manito negativo (-). Las colonias Manitol (+), se toman de la placa de Agar Manitol, con ansa de punta redonda y se siembran en caldo infusin cerebro corazn (CICC), incubndose en estufa 24 horas a 37 C. Luego de la incubacin se toman 0.2 ml de CICC sembrado y se colocan en 0.3 ml de plasma de conejo. Se mantiene a temperatura ambiente y se observa a la media hora (30) si el plasma coagul, inclinando suavemente el tubo; el cogulo debe permanecer inmvil. (Importante: el movimiento del tubo debe ser suave para no romper la fibrina que puede estar en formacin). Si no hubiera coagulado en los primeros 30, dejar 4 horas (observando cada 30) y si an no hubiera coagulado dejar 24 horas en estufa a 37 C. Si el plasma permanece inmvil se registra como coagulasa positivo (+) y se anota el tiempo que demor en coagular (30, 60 o 24 horas, etc.). Si el plasma no coagul se registra como coagulasa negativo (-). f) Determinacin de Presencia de Salmonella: La muestra con diluyente de Salmonella se incuba en estufa 24 horas a 37 C. Luego de la incubacin se siembra 1 ml en Caldo Tetrationato, al que previamente a sembrar se le agreg 0.2 ml de Ioduro de Potasio (KI). Incubar en Caldo Tetrationato , durante 24 hs. en Bao termosttico a 44.5 C. Tomar una gota del caldo incubado con ansa de punta redonda y sembrar en Rambach Agar en superficie. Incubar en estufa durante 24 horas a 37 C. Observar la formacin de colonias puntiformes Fucsias, este resultado se interpreta como bacterias del Gnero de Salmonella. El diagnstico debe confirmarse con pruebas Bioqumicas. g) Recuento de Hongos y levaduras: Colocar 1ml de la solucin en Placa estril rotulada con la sigla HL en la base, y sembrar en profundidad. Incubar en estufa 5 das a 37 C. Contar todas las colonias (ver instructivo para recuento de colonias ). 9. FORMULACIN, TCNICA E INTERPRETACIN DE HISOPADOS EN SUPERFICIES DE CONTACTO Y PERSONAL 9.1. formulacin y preparacin del medio de pre-enriquecimiento Se utilizar como medio de preenriquecimiento el siguiente: Na2 HPO4 Na H2PO4 Peptona de carne 1,73g 0,93g 2,00g

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Agua destilada

200 ml

Calentar el agua destilada a bao Mara durante dos (2) minutos, luego agregar 1 x 1 los componentes slidos de la frmula agitando con cuchara esptula constantemente. Dejar homogeneizar a bao Mara diez (10) minutos agitando de vez en cuando. 9.2. Fraccionamiento del medio de pre-enriquecimiento Colocar cinco (5) ml de la solucin en tubos de ensayo sin rosca. 9.3. Preparacin del hisopo Al hisopo se le agrega en su nivel medio una porcin de algodn formando un tapn, colocando el tapn-hisopo en el tubo el que se cierra hermticamente (se sella) con papel aluminio. Al colocar el tapn hisopo debe tenerse la precaucin de no contar con el mismo el medio de pre-enriquecimiento (el hisopo debe permanecer seco). 9.4. Esterilizacin en autoclave Una vez finalizada la operacin anterior se introduce en el autoclave para su esterilizacin adecuada (15 minutos a 1 atmsfera). 9.5. Preparacin de la muestra (dilucin, homogeneizacin, e incubacin) En el caso de los hisopos la dilucin se realiza en el momento de la toma de la muestra. Sumergir sucesivamente el hisopo (4 veces, sin sacarlo del tubo), generando una agitacin del diluyente para obtener una distribucin homognea de la muestra. Incubar en estufa a 37 C durante 10 minutos. Sumergir el hisopo en el medio de preenriquecimiento antes de sembrar en los distintos medios de cultivo. 9.6. Siembra de la muestra: 9.6.1. Recuento de Bacterias Aerobias Mesfilos: Sembrar en superficie en Plate Count(PC)(ver instrucciones de siembra) Incubar en estufa 48 hs. A 37 C. Contar todas las colonias (ver instructivo para Recuento de colonias) 9.6.2. Recuento de Enterobacterias: Sembrar en superficie en Violeta Rojo Bilis Dextrosa (VRBD)(ver instrucciones de siembra) Incubar en estufa 24 hs. a 37 C. Contar todas las colonias (ver instructivo para Recuento de colonias) 9.6.3. Determinacin de Coliformes Totales: Colocar 1 ml del caldo de Pre-enriquecimiento sembrado, en Caldo Brila. Incubar los tubos sembrados en estufa a 37 C durante 48 hs., luego observar en los tubos la formacin de gas en campana de Durham (se observa una burbuja que ocupa un tercio de la campana) este resultado se interpreta

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como positivo; en los que no se observa formacin de gas se interpreta como negativo . Con los resultados, se lee en tabla de Hoskins el Numero ms Probable (NMP) de Coliformes Totales. 9.6.4. Determinacin de Coliformes Fecales: Los tubos que resultaron positivos para Coliformes Totales son repicados en caldo Brila e incubados en Bao Termosttico a 45 C durante 48 hs., luego observar en los tubos la formacin de gas en campana de Durham (se observa una burbuja que ocupa un tercio de la campana) este resultado se interpreta como positivo; en los que no se observa formacin de gas se interpreta como negativo . Con los resultados, se lee en tabla de Hoskins el Numero ms Probable (N.M.P.) de Coliformes Fecales. 9.6.5. Determinacin de Escherichia Coli: Los tubos que resultaron positivos para Coliformes Fecales son sembrados en superficie en Agar Eosina Azul de metileno (E.M.B.), tomando una gota del tubo con Ansa de Punta redonda y siguiendo las instrucciones para siembra. Incubar en estufa a 37 C durante 24 hs. y observar en las Placas el crecimiento de colonias puntiformes con brillo metlico ,este resultado se interpreta como bacterias del Gnero de E. Coli el diagnstico debe confirmarse con pruebas Bioqumicas. 9.6.6. Determinacin de Staphilococcus Aureus Coagulasa Positivo: a) Sembrar en superficie en Medio Baird Parker. b) Incubar en estufa 48 hs. a 37 C. c) Observar la formacin de colonias caractersticas puntiformes con un halo transparente que la rodea. d) Contar las colonias con estas caractersticas, y registrar el N como: Staphilococcus Aureus sp. e) Luego a estas colonias se las somete a: e1) Prueba de la Catalasa: -Colocar en un portaobjetos una gota de Perxido de hidrgeno (agua oxigenada). -Tomar con una ansa de punta una muestra de una colonia, tambin puede picarse de varias colonias pequeas, evaluando un pool. -Luego colocar la punta del ansa sobre el portaobjeto de manera que contacte con la gota de perxido de Hidrgeno y observar la formacin de Burbujas, si esto se observa se registra como Catalasa positivo (+). Si no se forman burbujas se considera Catalasa negativo (-). e2) Identificacin de Manitol Positivo (+): Las colonias Catalasa (+) se siembran por mtodo de estras en Agar manitol salado y se incuban en estufa 24 hs. a 37 C. Se observa el viraje de color del rea sembrada de rojo a amarillo esta reaccin se registra como manitol positivo (+), si no vira de color se registra como manitol negativo (-). e3) Enriquecimiento selectivo: Las colonias Manitol (+) se toman de la placa de Agar Manitol, con ansa de punta redonda y se siembran en caldo

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infusin cerebro corazn (CICC), incubndose en estufa 24 Hs. a 37C. e4) Prueba de la Coagulasa: -Luego de la incubacin se toman 0.2 ml de CICC sembrado y se colocan en 0.3 ml de plasma de conejo. -Se mantiene a temperatura ambiente y se observa a la media hora (30`) si el plasma coagul, inclinando suavemente el tubo; el cogulo debe permanecer inmvil, IMPORTANTE: el movimiento del tubo debe ser suave para no romper la fibrina que puede estar en formacin. -Si no hubiera coagulado en los primeros 30`, dejar 4 horas (observando cada 30), y si an no hubiera coagulado dejar 24 horas en estufa a 37 C. -Si el plasma permanece inmvil se registra como Coagulasa positivo (+) y se anota el tiempo que demor en coagular (30,60 o 24 hs., etc.). -Si el plasma no coagul se registra como coagulasa negativo (-). 10. INTERPRETACIN DE RESULTADOS
(1)

La presencia de microorganismos en los alimentos no significa necesariamente un peligro para el consumidor o una calidad inferior de estos productos. En realidad si se excepta el reducido nmero de alimentos esterilizados, cada bocado de alimento contiene levaduras inocuas, hongos, bacterias y otros microorganismos. Si los alimentos han estado sometidos a condiciones que pudiesen haber permitido la llegada y/o multiplicacin de agentes infecciosos o toxignicos, pueden constituirse en vehculos de transmisin de Enfermedades de Transmisin alimentaria (E.T.A.). La puesta en evidencia de estos riesgos se basa en examen de muestras de alimentos, en busca de los propios agentes causales o de indicadores de contaminaciones de distinto origen. Debido a la complejidad para realizar la identificacin de la numerosa serie de Microorganismos patgenos y sus toxinas, se ha determinado la utilizacin de grupos o especies de microorganismos, cuya enumeracin o recuento es de mayor practicidad y facilidad, de manera que a concentraciones X en los alimentos, indican que los productos estuvieron en condiciones de haber introducido organismos peligrosos y/o favorecido la multiplicacin de especies infecciosas o toxignicas. A tales grupos se los denomina MICROORGANISMOS INDICADORES, y sirven para evaluar tanto la seguridad que ofrecen los alimentos, como su calidad microbiolgica. 10.1. recuento en placa de bacterias aerobias mesfilas La mayora de los alimentos industrializados (excepto los fermentados) deben considerarse como inadecuados cuando contienen un gran nmero de microorganismos, an cuando stos no sean conocidos como patgenos o no hayan alterado los caracteres organolpticos de los alimentos; debido a: a) Recuentos altos en alimentos estables indican materias primas contaminadas o tratamiento sanitario inadecuado, mientras que en los productos perecederos pueden indicar, adems, condiciones inadecuadas de almacenamiento (tiempo/temperatura). b) Todas las bacterias patgenas transmitidas por los alimentos son mesfilas. Interpretacin: El fabricante de alimentos puede utilizar tales recuentos para evaluar la eficacia de la sanitizacin a lo largo del proceso de industrializacin.

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10.2. bacterias entricas indicadoras Familia Enterobacteriaceae (Enterobacterias) En los alimentos que han recibido un tratamiento para garantizar su sanidad, la presencia de niveles considerables de Enterobacteriaceae o de coliformes indica: a) Tratamiento inadecuado y/o contaminacin posterior al tratamiento, a travs de materias primas, equipos sucios o manejo no higinico. b) Multiplicacin bacteriana que pudo haber permitido el crecimiento de toda la serie de microorganismos patgenos y toxignicos. La presencia de E. Coli en un alimento no constituye una connotacin directa de la presencia de un patgeno, sino que implica nicamente un cierto riesgo de que pudiera estar presente. En otras palabras la presencia de E. Coli en los alimentos no guarda siempre una estrecha correlacin con la presencia de salmonelas o de otros microorganismos patgenos. Una prctica comn es utilizar las pruebas para coliformes, que incluyen E. Coli, en los ensayos screenig o preliminares. Si de estas pruebas iniciales se deduce la posibilidad de contaminacin fecal, los coliformes u otras Enterobacteriaceae se someten a posteriores estudios para determinar si entre ellos est presente E. Coli. El trmino habitual de coliformes comprende E. Coli y diversas especies pertenecientes a otros gneros de la familia Enterobacteriaceae. En la prctica los coliformes son los microorganismos que se detectan en las pruebas para coliformes. El trmino coliformes fecales ha surgido como un intento de encontrar mtodos rpidos y confiables para establecer la presencia de E. Coli y variantes estrechamente relacionados, sin necesidad de purificar los cultivos obtenidos en las pruebas para coliformes o de aplicar las relativamente costosas pruebas confirmatorias (APHA y col., 1976). Los coliformes fecales comprenden un grupo de microorganismos seleccionados por incubacin de los inculos procedentes de un caldo de enriquecimiento de coliformes a temperaturas superiores a las normales (44/45,5C dependiendo del mtodo).
(1) ICMSF Microorganismos de los alimentos I Tcnicas de Anlisis Microbiolgicos, Ed. Acribia Segunda Edicin.
Dr. Csar Augusto Lerena Dr. Joaqun I. Lerena Dra. Adriana Pereyra Assistance Food Argentina S.A. Copyright 1998 Rev. 15.9.07

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