Futuras aplicaciones de las Cecropinas en la Biotecnoloxa Mdica

Agnese Sannino

Master de Biotecnoloxa 2011-12

Indice de contenidos
1. Teora basica de los pptidos antimicrobianos. 2. Informaciones generales sobre la familia de las Cecropinas. 3. Presentacin de los diferentes tipos de Cecropina. 4. Descripcin de la accin de las Cecropinas. 5. Estudios en curso y Futuras aplicaciones en el campo de la medicina. 6. Bibliografa .
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Pptidos antimicrobianos

Son protenas de origen natural

que tienen propiedades antibiticas. Estos pptidos han sido fabricados por la naturaleza, para actuar como medio de defensa en contra de enfermedades producidas por diversos microorganismos.

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Propriedades
Presentan actividad contra bacterias, hongos y virus. Existen una gran cantidad de pptidos antimicrobianos as como una gran variedad de fuentes. Los podemos encontrar en plantas, insectos, virus y mamiferos. Se clasifican

:
Ribosomal

Por mtodo de sntesis : Por origen :

Mamfero Anfibio Insecto Planta Virus Bacteria

No ribosomal

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Cecropinas
Familia de oligopptidos inducibles antimicrobianos. Son derivadas de insectos, anfibios y mamferos. Son activas contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Cecropinas de insectos varan en tamao desde 35 a 39 residuos y son tpicamente amidadas. Las otras , desde 31 a 39 a.a.

Se aislaron por primera vez de la comn mariposa de la seda Hyalophora cecropia:

Se producen en el interior del animal, dentro de la hemolinfa. Tienen en comn una considerable homologa en la estructura primaria. Su sntesis es de tipo ribosomal.
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Caractersticas generales
Los D-enantimeros retienen la actividad antibacteriana. Los pptidos maduros (es decir, procesados) tienen una regin NH2terminal fuertemente bsica y una regin C-terminal ms hidrfoba. Preprocecropinas en insectos son de dos tipos: dpteros y lepidpteros. Precursores de Dpteros ( ejemplificados por la Drosophila melanogaster y D. virilis ) tienen una secuencia seal de 23 residuos que termina con un motivo tetrapeptdico conservado (Gln-Ser/Thr-Glu/Gln-Ala) que es seguido inmediatamente por una secuencia de 40 residuos, que codifica el pptido maduro. Los dominios maduros de cecropina en Drosophila tpicamente: comienzan con
Gly-Trp-Leu-Lys-Lys

y terminan con un motivo conservado

(13)

Ala-Gln-Gln-Ala-Ala-Asn-Val-Ala-Ala-Thr-Ala-Arg-Gly

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Dependiendo del ambiente en el que estan, las Cecropinas pueden asumir

dos estructuras:

1)

2)
Alfa elice, que es funcional ( en la matriz

Random, que no es funcional ( agua )

celular o en ambiente hidrofbico )

El objetivo de su actividad bactericida es la membrana . Las cecropinas con frecuencia actan en sinergia.
Imgines: http://me.stanford.edu/research/centers/ahpcrc/TA2Images_contd.html
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Los diferentes tipos de Cecropina

La mariposa Hyalophora Cecropia silvestre produce 3 cecropinas diferentes, llamadas tipo A, B y D. Cecropinas A, B y D: http://homepage.mac.com/wildlifeweb/invert - Son pptidos lineales ebrate/moth/cecropia_moth/index.html - Son pptidos bsicos - Consisten en 35-37 residuos que muestran 62-65% de homologa en la secuencia principal. La importancia del estudio de estos pptidos antimicrobianos se ve reforzada por los fenmenos de resistencia a los antibiticos convencionales (que se producen con mayor frecuencia), debido al uso inadecuado de los mismos. Contra estos pptidos, de hecho, hasta ahora no ha habido fenmenos de resistencia .
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Cecropina A
Compuesta de 37 aminocidos. Mata las bacterias mediante la disipacin del gradiente inico de la membrana o induciendo cambios en la expresin gnica.

El anlisis de la Cecropina A por RMN bidimensional confirm que costaba de dos segmentos elicoidales, ambos de fuerte caracter anfipatico, separados por un triplete ( Ala- Gly- Pro ) flexible que actua como bisagra . ( Holak et al.,1988)
KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK-NH2
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Cecropina A como agente antifugal

The figure shows the effect of three concentrations from a longer dilution series of cecropin A, against the fungi S. cerevisiae W308, D. uninucleata, G. candidum, M. anisopliae and B. bassiana. As a comparison we also show the growth inhibition against the bacterial strain E. cloacae 12.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0965174899000715

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Cecropina B
Aumenta la actividad de los betalactmicos contra bacterias gram negativas. Se ha demostrado que reduce significativamente la actividad de E. coli y los niveles plasmticos de endotoxina en un modelo de rata de shock sptico. Compuesta de 35 aminocidos. Costa de dos segmentos elicoidales, uno de los cuales mucho ms pequeo que el otro . Incluso aqu el triplete AGP separa las dos hlices. En condiciones todava no identificadas, promueve la reparacin de la membrana de la clula husped.
http://www.anaspec.com/products/product.asp?id=30701

KWKVFKKIEKMGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKAL-NH2

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Electron micrographs of negatively stained E. coli untreated and treated with cecropin B.

http://www.biochemj.org/bj/341/0501/bj3410501.htm

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Cecropina D
Cecropina D es un cecropina mas grande, de hecho su secuencia es de 36 aminocidos.

Aparece en la hemolinfa mucho ms tarde despus de la infeccin bacteriana que la cecropina A o B. Tiene una potente actividad antibacteriana sin actividad hemoltica contra los glbulos rojos humanos.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0305049199000152

WNPFKELEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAK-NH2
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 Estas tres cecropinas, A, B y D, son productos de tres diferentes genes que derivan de un ancestro comn. Cecropinas aisladas de otros insectos han recibido varios nombres ... bactericidin, sarcotoxin, etc. Todos estos pptidos estn estructuralmente relacionados. Las ms estudiadas y actualmente las ms relevantes son : Cecropina AD, Cecropina P1 y Cecropina XJ.

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Cecropina AD
-Este pptido es un hbrido de cecropina A (1-11) y D (12-37). -Esta protena hbrida es hasta 25 veces ms activa de la cecropina D contra algunas bacterias y ligeramente ms activa que la cecropina A. -Es 6 veces ms activa que cecropina A contra Bacillus subtilis (1). -Se ha notificado que esta Cecropina promueve la muerte celular por apoptosis en clulas de carcinoma nasofarngeo (2).

1)

2)

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Cecropina P1
Este pptido no es de origen mamfero, de hecho es producido por el parsito intestinal del cerdo, Ascaris suum (1) , y por el parsito humano Ascaris lumbricoides (2).

1)

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005273699002011

Es bactericida contra una amplia gama de microorganismos: Aeromonas hydrophila, Bacillus subtilis, Escherichia coli, 2) Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens,Pneumocystis carinii, Saccharomyces cerevisiae.
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Cecropina XJ
Es muy termoestable y tolera los ambientes que son muy cidos, bsicos o salados.

Tiene la capacidad de matar a el ampicilina-resistente Staphylococcus aureus (a) y a el Staphylococcus enterica (b).
Tambin es resistente a la digestin de 24 horas por el jugo gstrico

artificial.

a)

b)

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http://www.cmj.org/paper_journal/05/02/11/F050211_2.htm

Scanning electron micrographs of untreated and after treatment with cecropinXJ of bacteria. A0, B0, C0, D0: bacterial cells incubated in absence of cecropin-XJ; A1, B1, C1, D1: bacterial cells incubated in presence of cecropin-XJ for 10 minutes; A2, B2, C2, D2: bacterial cells incubated in presence of cecropin-XJ for 20 minutes. A0-A2: S. mutans; B0-B2: L. acidophilus; C0-C2: A. viscosus; D0-D2: A. naeslundii.
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Funcin de la Cecropina
El sitio de accin de la actividad antimicrobiana es la membrana celular. La Cecropina se pliega en su estructura final mientras que se adsorbe superficialmente en la superficie de la membrana. Las interacciones con regiones ms profundas y hidrfobas de la bicapa parecen ser innecesarias para plegarse bien. El colesterol no impide la disipacin de los gradientes inicos por bajas concentraciones de pptido. Slo en las vesculas, la accin de cecropina es dependiente de la concentracin, creando: - canales inicos, si hay una baja proporcin peptido/ lpido - poros, suficientemente grandes para pasar molculas sonda, si hay una mayor proporcin peptido/lpido.

Es igualmente eficaz en vesculas aninicas y neutrales, aunque vesculas aninicas vinculan ms pptido.

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La accin bactericida de las cecropinas se correlaciona con la permeabilizacin de la membrana, que es, de hecho, siempre seguida de citlisis irreversible y muerte de las bacterias.

Anlogos de estos pptidos consistentes en todos D enantimeros son activos como los naturales

La interaccin de estas molculas con algunos receptores quirales de membrana parece excluido

Estos pptidos actan directamente mediante la alteracin de la membrana de las clulas objetivo

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El pptido se une a la membrana y cuando llega a el valor crtico peptide / lipide 1:20 cambia su orientacin :

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20403332

Todos las Cecropinas causan la formacin de un poro toroidal en la bicapa fosfolipdica:

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Una excepcin: Cecropina P1, para la cual se ha sugerido un mecanismo de tipo "detergente: los monmeros anfipticos de hlice rotan y mediante la insercin de los residuos hidrofbicos en la bicapa lipdica destruyen el empaquetamiento.

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Factores para la selectividad de las Cecropinas

1) La composicin diferente de las membranas
Membranas bacterianas son ricas en fosfolpidos aninicos como fosfatidilserina y fosfatidilglicerol; esta determina entonces una interaccin electrosttica del pptido cargado positivamente con la membrana misma, que es la base del efecto posterior de perturbacin de la bicapa Membranas eucariotas ( por ejemplo los hemocitos ) se caracterizan por un elevado nmero de fosfolpidos zwitterinicos como fosfatidilcolina, esfingomielina y fosfatidiletanolamina; tambin son ricos en colesterol, ausente en las bacterias, que parece inhibir la accin de estos : pptidos

2) El valor del potencial de membrana: Un potencial ms negativo en la clula, tpico de las

clulas bacterianas (100-150 mV), facilita la interaccin de las cecropinas con la capa lipdica.
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Interaccin con :
Gram + Gram El pptido es, El pptido interacta con las probablemente, atrado molculas polianinicas por los cidos teicoicos y de lipopolisacrido de la teicuronicos y otros grupos membrana externa y es aninicos que estn entonces capaz de situados externamente a la hacerlo permeable o ser capa de peptidoglicano. recibido dentro.

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Las cecropinas inhiben la viabilidad y la proliferatin de las clulas tumorales de vejiga Background: La terapia del cncer de vejiga. Intravesical quimioterapia y la BCG- inmunoterapia se asocian con efectos secundarios significativos. La toxicidad vara desde sntomas leves de cistitis hasta la sepsis grave y tiene un impacto negativo en el cumplimiento del paciente. Por lo tanto, la identificacin de nuevos agentes intravesicales potentes es muy deseable para reducir la toxicidad y mejorar los resultados a largo plazo. Mtodos: El potencial antiproliferativo y citotxico de las cecropinas A y B se cuantific mediante ensayos en cuatro lneas de clulas de cncer de vejiga, as como en lneas celulares de fibroblastos murinos y humanos. Se emple Microscopa electrnica de barrido (SEM) para visualizar los cambios morfolgicos inducidos por cecropina A y B Resultados: -Cecropina A y B inhiben la la proliferacin celular del cncer de vejiga y la viabilidad de una manera dosis-dependiente. -Benignos fibroblastos fueron significativamente menos o nada en absoluto susceptibles a cecropina A y B.
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Conclusiones:
Cecropina A y B ejercen eficacia selectiva citotxica y antiproliferativa en clulas de cncer de vejiga sin afectar los objetivos de origen benigno de fibroblastos de ratn o humano. Ambos pptidos pueden ofrecer nuevas estrategias teraputicas para el tratamiento de cncer de vejiga con limitados efectos citotxicos en las clulas benignas.

Cecropin B effect on cell membranes of bladder cancer cells

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18315881

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El pptido hbrido Cecropina-Melitina ejerce una accin leishmaniasicida.

http://it.wikipedia.org/wiki/Leishmaniosi_umana

Enfermedad causada por parsitos protozoarios que pertenecen al gnero Leishmania y es transmitida por la picadura de ciertas especies de mosca de la arena. El hbrido Cecropina Melitina causa: El dao de la bolsa flagelar de los parsitos, que despus del tratamiento est desprovisto de los microtbulos. Aumento de la permeabilidad de mebrana: provoca la acumulacin de prolina que afecta el gradiente de pH y el potencial de membrana, los dos componentes implicados en el mantenimiento de la capacidad energtica por la translocacin de protones. La accin del pptido en leishmaniasis es muy rpida
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1223672/ Master de Biotecnoloxa 2011-12 27

Se ha demostrado una actividad especfica de tumoricida tanto de cecropina A como B de mamferos contra la leucmia en mamferos, linfoma y el carcinoma de colon, as como el cncer de pulmn y cncer gstrico. En vivo, la cecropina B mejora la supervivencia de ratones portadores de adenocarcinomas de colon .

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CONCLUSIONES Las cecropinas son especialmente prometedores candidatos para la terapia contra el cncer en los seres humanos porque demuestran varias caractersticas nicas:

1) Su selectividad para las clulas malignas y su actividad ltica potencialmente pronunciada contra las clulas tumorales de alto grado permite una terapia ptima in vivo con bajas concentraciones teraputicas y efectos secundarios limitados.
2) Existe la hiptesis que el efecto anti-tumoral de las Cecropinas no puede ser alterado por el fenotipo MDR ( resistencia a mltiples frmacos ) observado en muchos tipos de cncer. 3) Agentes clasicos quimioteraputicos tales como mitomicina que son ampliamente usados para instilacin intravesical son altamente inestables en la orina. Por el contrario, las Cecropinas son en gran parte resistentes contra la protelisis del suero y de la orina a causa de sus estructuras bioqumicas especficas, hacindolas candidatas ideales para la terpia de los tumores.
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Bibliografia
J.P.N.Pathak , Insect immunity. 1999. Pag. 79- 93 Andreas Vilcinskas, Insect Biotechnology. Pag 143- 159 Paul T. Brey. Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects. 2006. Pag 87- 142. Hultmark, D., Engstrm, A., Bennich, H., Kapur, R., Boman, H.G. Insect immunity. Isolation and structure of cecropin D and four minor antibacterial components from Cecropia pupae. Eur J Biochem 1982; 127: 207-217. Alarcn, T., Lpez-Hernndez, S., Rivas, L., Andreu, D., LpezBrea, M. In vitro activity of CA(1-8)M(1-48), a synthetic cecropin Amelitin hybrid peptide ; pag 137- 154 Christensen, B., Fink, J., Merrifield, R.B., Mauzerall, D. Channelforming properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes. Proc Nat Acad Sci USA 1988; 85: 5072-5076 . Nos-Barber, S., Portols, M., Aprilla, A., Ubach, J., Andreu, D., Paterson, C.A. Effect of hybrid peptides of cecropin A and melitin in an experimental model of bacterial keratitis. Cornea 1997; 16: pag. 101-106.
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