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Quim. Nova, Vol. 35, No.

9, 1728-1732, 2012 CIDOS FENLICOS, FLAVONOIDES E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE EM MIS DE Melipona fasciculata, M. flavolineata (Apidae, Meliponini) E Apis mellifera (Apidae, Apini) DA AMAZNIA

Artigo

Patricia Serto Oliveira, Regina Celi Sarkis Mller*, Kelly das Graas Fernandes Dantas e Claudio Nahum Alves Faculdade de Qumica, Instituto de Cincias Exatas e Naturais, Universidade Federal do Par, Rua Augusto Corra, 01, 66075-110 Belm PA, Brasil Marcus Arthur Maral de Vasconcelos e Giorgio Cristino Venturieri Embrapa Amaznia Oriental, Trav. Enias Pinheiro, s/n, 66017-970 Belm PA, Brasil Recebido em 21/11/11; aceito em 6/5/12; publicado na web em 3/8/12

PHENOLIC ACIDS, FLAVONOIDS AND ANTIOXIDANT ACTIVITY IN HONEY OF Melipona fasciculata, M. flavolineata (Apidae, Meliponini) AND Apis mellifera (Apidae, Apini) FROM THE AMAZON. Honey produced by three stingless bee species (Melipona flavolineata, M. fasciculata and Apis mellifera) from different regions of the Amazon was analyzed by separating phenolic acids and flavonoids using the HPLC technique. Data were subjected to multivariate statistical analysis (PCA, HCA and DA). Results showed the three species of honey samples could be distinguished by phenolic composition. Antioxidant activity of the honeys was determined by studying the capacity of inhibiting radicals using DPPH assay. Honeys with higher phenolic compound contents had greater antioxidant capacity and darker color. Keyword: phenolic compounds; honey; HPLC- UV/Vis.

INTRODUO Hoje, na criao de abelhas, existem duas grandes linhas de estudo: a Apicultura e a Meliponicultura. Dentro da Apicultura, o conhecimento sobre o mel j vem sendo construdo em vrias regies do Brasil, no entanto, na Meliponicultura esses estudos so mais recentes, sendo desenvolvidos com as abelhas regionais. O mel de abelha comercializado no mundo todo em sua quase totalidade oriundo de uma nica espcie, a Apis melfera.1 Contudo, nas regies tropicais e subtropicais existem mais de 400 espcies descritas de abelhas sociais que podem produzir mel. Estas outras abelhas so conhecidas como abelhas indgenas sem ferro, ou meliponneos. So abelhas dceis, de fcil manejo e necessitam de pouco investimento para a sua criao.2 Dentre todos os gneros dos meliponneos, o Melipona o mais diverso e na Amaznia que encontramos a maior diversidade.3 Alm de ser mais diverso, o gnero Melipona o que abriga as espcies mais produtivas e criadas.4 Embora produzindo mel em menor quantidade por colnia, algumas espcies possuem uma populao correspondente a 5% de uma colnia de A. melfera.5 Os meliponneos tm o importante papel de fornecer um produto que se diferencia do mel de A. mellifera, principalmente no sabor e aroma peculiares, podendo alcanar preos elevados no mercado.6 De maneira geral, o mel das espcies de meliponneos tem como principal caracterstica a diferenciao nos teores da sua composio, destacando-se o teor de gua (umidade), que o torna menos denso que o mel das abelhas africanizadas.7 A cor varia do quase transparente ao mbar escuro e o gosto e os nveis de acar dependem da espcie, poca, regio e, principalmente, da florada.8 Alm dos acares em soluo, o mel tambm contm cidos orgnicos, enzimas, vitaminas, flavonoides, minerais e uma extensa variedade de compostos orgnicos, que contribuem para sua cor, odor e sabor.9 A utilizao do mel na nutrio humana no deveria se limitar apenas sua caracterstica adoante mas, principalmente, por ser um alimento de alta qualidade, rico em energia e inmeras outras
*e-mail: reginasarkis@hotmail.com

substncias benficas ao equilbrio dos processos biolgicos do nosso corpo. Alm de sua qualidade como alimento, esse produto nico dotado de inmeras propriedades teraputicas, sendo utilizado pela medicina popular sob diversas formas e associaes como fitoterpicos.10 Pesquisas relacionadas identificao de compostos fenlicos em mel, tendo em vista a atividade antioxidante e possvel origem botnica, aumentaram consideravelmente aps a aplicao de metodologias usando HPLC.11-13 Muitos compostos fenlicos tm propriedades captadoras de radicais livres, o que confere a atividade antioxidante. Os radicais livres tm sido considerados como agentes causadores de isquemias cerebral e cardaca, doenas de Parkinson, distrbios gastrointestinais, envelhecimento, entre outros. As clulas vivas possuem capacidade limitada para anular a atividade destes radicais livres, mas se acredita que a ingesto de antioxidantes pode melhorar a proteo das clulas e, portanto, a sua funo fisiolgica. Estes antioxidantes so geralmente obtidos a partir da alimentao e incluem vitaminas C e E, b-caroteno e uma variedade de compostos fenlicos, incluindo cidos fenlicos e flavonoides.14 Estes compostos fenlicos tambm apresentam atividade antiviral, antibacteriana e anti-inflamatria.15-17 Este trabalho objetivou identificar o perfil cromatogrfico de cidos fenlicos e flavonoides utilizando a extrao em fase slida (SPE) e cromatografia lquida de fase reversa (RP-HPLC) e realizar estudo da atividade antioxidante nos mis de trs diferentes espcies de abelhas: A. mellifera (africanizada) espcie extica, Melipona flavolineata (uruu-amarela) e M. fasciculata (uruu-cinzenta) espcies nativas. As amostras de mel foram obtidas de quatro municpios do Estado do Par. PARTE EXPERIMENTAL Reagentes e solues analticas Como padres, com grau de pureza superior a 99%, foram utilizados os cidos glico, cafeico, ferulico, o-cumrico, m-cumrico, p-cumrico, o-metoxicinmico, trans-cinmico, vanlico e os flavonoides quercetina e miricetina (Sigma, St. Louis, USA), dos quais

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foram preparadas solues metanlicas (Metanol, Merck, Darmstadt, Germany), com as concentraes de 4,0 mg mL-1. Todas as solues foram armazenadas a 6 oC ( 1 oC). As fases mveis foram preparadas pela mistura de metanol e acetonitrila e gua ultrapura acidificada (Milli-Q, Millipore). Extrao em SPE

(Tracuateua), do Salgado (So Joo de Pirabas e Vigia) e Guam (So Miguel do Guam). As amostras foram coletadas de colmias racionais, conforme modelo recomendado por Venturieri.20 Este sistema de criao em caixas racionais facilitou a coleta do mel, tornando-a mais rpida, higinica e causando poucos distrbios colnia.21 As anlises em cada amostra de mel foram realizadas em triplicata. Mtodos de anlise multivariada

A extrao dos cidos fenlicos foi realizada de acordo com o mtodo descrito por Michalkiewiczs e colaboradores. 18 Aproximadamente 20 g de mel foram diludas em 50 mL de gua ultrapura acidificada (pH ajustado para 2,0) com HCl 12 mol L-1 e filtrada em algodo a fim de eliminar partculas em suspenso. O filtrado foi adicionado ao cartucho de SPE (Stracta-X, Phenomenex, Torrance, CA, USA) para a separao da frao fenlica que foi adsorvida com 50 mL de metanol. Aps a obteno do extrato metanlico, este foi concentrado em rota-vapor at volume de 5 mL a 40 C. O concentrado foi filtrado em membrana 0,45 m (Millipore, Bedford, MA, USA) e condicionado em frascos de polietileno (2 mL) temperatura de 5 oC ( 1 oC) at a anlise. Condies cromatogrficas A separao cromatogrfica foi realizada usando cromatgrafo lquido de alta eficincia modelo Pro Star (Varian, Mulgrave, Austrlia), acoplado a um detector UV-Vis. (Varian, Mulgrave, Austrlia) trabalhando no comprimento de onda de 290 nm. Para as anlises foi utilizada coluna RP-C-18 (Kromasil 100-5 250 x 4,6 mm) e sistema manual de injeo com volume fixo de 20 L. A massa para os padres utilizados foi de 2 mg. As fases mveis usadas foram gua: cido actico (99:1, fase A) e metanol:acetonitrila:cido actico (59:40:1, fase B). Os padres cromatogrficos foram avaliados individualmente e tambm em misturas. O tempo de eluio, o fluxo da fase mvel e o gradiente de eluio foram otimizados. A melhor separao cromatogrfica dos padres foi obtida usando um fluxo de 0,5 mL min-1 e um gradiente de eluio de 0 min - 22% B; 15 min - 30% B; 17 min - 40% B; 30 min - 60% B; 38 min - 30% B; 50 min -22% B e, eluio isocrtica com 22% B at 60 min. Os cromatogramas dos padres e amostras obtidos por UV foram registrados usando o software do equipamento. O monitoramento dos perfis cromatogrficos foi realizado a 290 nm, visto que a maioria dos cidos fenlicos e flavonoides encontrados nos mis mostra suas absores mximas no UV, prximo a esse comprimento de onda.19 Todas as amostras foram analisadas em triplicata. Identificao dos cidos fenlicos e flavonoides A identificao dos cidos fenlicos e flavonoides nos cromatogramas dos mis foi feita por comparao direta dos tempos de reteno, coinjeo e anlises das curvas de absoro no UV, obtidas em espectrofotmetro Varian, com as curvas de absoro dos padres. Amostras de mel Foram analisadas 36 amostras de mel, sendo 12 de cada espcie de M. flavolineata (uruu-amarela), M. fasciculata (uruu-cinzenta) e A. mellifera (africanizada), colhidas no perodo de baixo ndice pluviomtrico que ocorre de setembro a fevereiro, possibilitando a explorao dos produtos produzidos pelas abelhas nativas da regio. As amostras foram provenientes de quatro municpios da mesorregio do nordeste paraense, que apresenta grande diversidade de solo e espcies botnicas. Os municpios envolvidos neste estudo foram os do nordeste paraense, localizados nas microrregies Bragantina

Empregou-se, inicialmente, o mtodo de anlise de discriminante, cujo principal objetivo determinar funes discriminantes usando as medidas variveis que separam os grupos. A anlise discriminante (DA) um procedimento de classificao que maximiza a varincia entre as categorias e miniminiza a varincia dentro das categorias. Este mtodo torna um nmero de funes discriminantes ortogonais igual ao nmero de categorias menos um.22 Em seguida, utilizou-se o mtodo de anlise de cluster ou agrupamento hierrquico (HCA), com o intuito de reunir os parmetros e observaes semelhantes e separar os mais distantes. Este mtodo unifica os parmetros em classes ou grupos, cuja variao das observaes semelhante. Como medida de similaridade foi utilizada a distncia euclidiana mdia e como mtodo hierrquico aglomerativo, o mtodo de Ligao Completa. Com base nos clculos, foi estabelecido o dendrograma, o qual permite verificar o grau de similaridade entre os gentipos e grupos similares, ou entre dois grupos distintos. Por fim, foi realizada a anlise de componentes principais (PCA),23 que uma tcnica de anlise multivariada cujo objetivo reduzir a dimenso de problemas multivariados e detectar os parmetros mais significativos que descrevam o conjunto de dados com a mnima perda dos dados originais. As anlises de agrupamento, discriminante e por componentes principais foram realizadas utilizando-se o conjunto de dados autoescalonado com o programa MINITAB R14.24 Cor A classificao de cor dos mis foi realizada em espectrofotmetro (Shimadzu modelo UV-160a) a 560 nm em clula de 1 cm e usando-se como branco, glicerina pura. Os dados obtidos no espectrofotmetro foram transformados em cor usando-se a Escala de Cores de Pfund.25 Atividade antioxidante A determinao da atividade antioxidante foi conduzida usando soluo metanlica 0,3 mM de DPPH (2,2difenilpicril-hidrazila). Na presena de um antioxidante, a colorao prpura do DPPH decai e a mudana de absorbncia pode ser lida atravs da espectrometria. As solues estoque dos mis (100 mg mL-1) e dos padres (vitamina C e Trolox) foram preparadas em metanol, que foram diludas em diversas concentraes e transferidas para cubetas, juntamente com a soluo metanlica de DPPH. Aps 30 min de repouso no escuro, a determinao foi realizada usando um espectrofotmetro UV-Vis. no comprimento de onda de 517 nm. Dois ensaios independentes foram realizados e todos em triplicata. A atividade antioxidante foi expressa em valores de concentrao efetiva em 50% do total do efeito (CE50), atravs do grfico que relaciona o percentual de atividade com a concentrao da substncia ensaiada. RESULTADOS E DISCUSSO As condies cromatogrficas foram otimizadas para o sistema com ajuste de fluxo de 0,5 mL min.-1 Para as fases mveis foram testadas concentraes decrescentes de cido actico e metanol e

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a estas adicionada acetonitrila (1%) para se obter um aumento da polaridade. Nestas condies foi obtida a melhor separao entre os compostos fenlicos, apresentados na Figura 1. Os compostos fenlicos analisados foram preparados na concentrao de 4 mg mL-1, utilizando como solvente o metanol em grau HPLC. No mtodo foi mantido o comprimento de onda de 290 nm, volume de injeo de 20 L e tempo total de corrida de 60 min.

e trans-cinmico obtiveram valores que correspondem a 5,7; 5,3; 2,8 e 0,6%, respectivamente. Perfis fenlicos em mis de M. flavolineata Os cromatogramas obtidos para os mis coletados no municpio de Tracuateua mostraram que a quercetina representa 67,8% do total de compostos fenlicos presente nas amostras, seguido pelos cidos o-cumrico e glico como componentes secundrios com 16,5 e 13,9%, respectivamente. Os demais, cido m-cumrico e o-cumrico, so encontrados em pequenas quantidades. Em relao aos mis de A. mellifera coletados nesta mesma regio, foi observada uma diferena na composio do perfil fenlico, onde o cido glico foi o composto fenlico dominante. Isto ocorre, devido possvel preferncia destas espcies por origens botnicas diferentes. O perfil de compostos fenlicos de mis da regio de So Joo de Pirabas dominado pelos compostos fenlicos quercetina, cidos glico e o-cumrico. Este perfil fenlico foi semelhante ao encontrado em mis da espcie A. mellifera da mesma regio, nos quais a quercetina representa 31,3%, enquanto os cidos glico e o-cumrico compem 23,8 e 23,6% do total de compostos fenlicos, respectivamente. Os cidos fenlico desconhecido Ph2, p-cumrico, ferlico e trans-cinmico tambm esto presentes, porm, em baixos teores, representando 21,3% do total de fenlicos. No municpio de Vigia, os mis coletados apresentaram perfis cromatogrficos contendo cido glico como cido fenlico principal com 34,2% e a quercetina com 30,4%. Os cidos fenlicos desconhecidos (Ph2 e Ph3), o-cumrico e p-cumrico apresentaram valores inferiores de 13,2; 5,8 e 3,6%, respectivamente. As espcies A. mellifera e M. flavolineata desta regio diferenciam-se em relao espcie botnica visitada, devido diferena significativa na quantidade de compostos fenlicos presentes no perfil cromatogrfico dos mis analisados. Perfis fenlicos em mis de M. fasciculata

Figura 1. Perfil cromatogrfico por CLAE da mistura dos padres de cidos fenlicos e flavonoides a 290 nm. Os compostos fenlicos so: (AG) cido glico, (AC) cido cafeico, (AV) cido vanlico, (APC) cido p-cumrico, (MRC) mircetina, (AF) cido ferulico, (AMC) cido m-cumrico, (AOC) cido o-cumrico, (QRC) Quercetina, (ATC) cido trans-cinmico e (AOMC) cido o-metoxinmico

Os tempos de reteno (tR) obtidos para os padres de cido glico (AG), cido cafeico (AC), cido vanlico (AV), cido p-cumrico (APC), miricetina(MRC), cido ferulico (AF), cido m-cumrico (AMC), cido o-cumrico (AOC), quercetina (QRC), cido trans-cinmico (ATC), cido o-metoxicinmico (AOMC) foram 4,75; 6,70; 16,82; 23,26; 25,24; 26,51; 28,86; 31,99; 34,38; 39,31 e 42,03 min, respectivamente. Perfis fenlicos em mis de A. mellifera A anlise dos cidos fenlicos e flavonoides por HPLC nos mis coletados na regio de Tracuateua mostrou maior representatividade de cido glico (35% do total da quantidade de cidos fenlicos). Os cidos ferrlico, desconhecido (Ph1), p-cumrico e quercetina so considerados compostos secundrios e encontraram-se presentes na matriz numa proporo de 15,7; 15,5; 11,2 e 11,1%, respectivamente. Os demais cidos fenlicos presentes nos mis analisados obtiveram porcentagem baixa em relao proporo total de cidos fenlicos, com valores de 8% para cido vanlico e 0,98% para cido m-cumrico. O perfil cromatogrfico obtido para os mis da regio de So Joo de Pirabas apresentou como compostos fenlicos principais a quercetina e os cidos glico e o-cumrico. A quercetina representa 33,4%, enquanto os cidos o-cumrico e glico representam 29,8 e 24,5% do total de cidos fenlicos, respectivamente. O cido ferrlico, o cido fenlico desconhecido Ph2 e o cido trans-cinmico esto presentes em baixos nveis. Estes trs compostos fenlicos majoritrios representam 87,7% do total de fenlicos presentes no mel. Os mis da regio de So Miguel do Guam mostraram a partir do cromatograma obtido que o principal cido fenlico em sua composio foi o cido glico, com 69,7%. O cido fenlico desconhecido (Ph1) e o cido p-cumrico apresentaram 10,3 e 4,1%, respectivamente. No municpio de Vigia, os perfis cromatogrficos obtidos para os mis coletados mostraram como cido fenlico principal o cido glico, com 79,6%. A quercetina e os cidos p-cumrico, o-cumrico

Os cromatogramas obtidos para os mis coletados na regio de Tracuateua mostraram um teor de 80,7% de cido glico. O cido vanlico e a quercetina obtiveram teores inferiores em relao proporo total de compostos fenlicos presentes com valores de 12% para quercetina e 6,3% para cido vanlico. O perfil cromatogrfico encontrado nas amostras indica a presena de apenas trs compostos fenlicos, sendo o cido glico predominante. A espcie A. mellifera desta regio tambm apresenta como composto fenlico principal o cido glico. Apenas a espcie M. flavolineata possui caracterstica diferenciada, sendo o cido glico o componente secundrio. Os perfis fenlicos observados nos mis da regio de So Joo de Pirabas apresentaram como compostos fenlicos principais o cido glico e a quercetina. O cido glico representa 39,2%, enquanto a quercetina apresenta teor de 26,7% do total de compostos fenlicos. Os cidos o-cumrico, p-cumrico, fenlico desconhecido Ph2 e ferrlico esto presentes em baixas quantidades 16,9; 14,8; 12,3 e 1,1%, respectivamente. As espcies A. mellifera e M. flavolineata desta regio apresentam caractersticas semelhantes, diferenciando-se apenas no percentual individual dos compostos fenlicos predominantes. O perfil cromatogrfico obtido para os mis da regio de So Miguel do Guam apresentou como composto fenlico identificado apenas o cido glico, com 2% do total de compostos fenlicos. O composto fenlico principal foi o cido desconhecido (Ph1) com 97, 8%. Os mis da espcie A. mellifera apresentaram maior variedade de compostos, tendo como principal componente o cido glico com 69,7%.

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Tratamento estatstico Anlise discriminante (AD) A anlise discriminante foi realizada para determinar previamente as variveis (compostos fenlicos) mais significantes na separao das espcies estudadas. Optou-se pelo mtodo de anlise discriminante passo a passo (stepwise discriminant analysis), o qual adiciona ou remove variveis do modelo. Desta forma, obtiveram-se 6 variveis mais significantes entre as 13 investigadas: AG, AOC, PH3, QRC, AV e AC. As funes discriminantes so dadas abaixo: Grupo A: -14.08 -9,55 AG -27,33 AOC +27,30 PH3 +54,35 QRC +6,04 AV -7,96 AC Grupo B: -14.59 +9,55 AG +33,49 AOC +18,25 PH3 -50,59 QRC -7,77 AV +0,32 AC Grupo C: -6,32 -3,51 AG -16,48 AOC -69,15 PH3 +28,34 QRC +4,82 AV +3,05 AC onde Grupo A refere-se espcie A. mellifera, Grupo B M. flavolineata e Grupo C M. fasciculata. A matriz de classificao obtida aplicando-se o mtodo de anlise discriminante linear mostrou que as porcentagens de acerto do modelo foram de 100%. Portanto, as variveis AG, AOC, PH3, QRC, AV e AC so capazes de distinguir as trs espcies estudadas, com 100% de acerto. Estas representam os compostos fenlicos majoritrios nas amostras de mel estudadas. Anlise de agrupamento hierrquico (HCA) A anlise de clusters (AC) foi aplicada para os dados autoescalonados, empregando-se a distncia euclidiana para calcular as similaridades das amostras e foi utilizado um procedimento de agrupamento hierrquico para estabelecer os clusters. Os resultados obtidos podem ser observados no dendograma da Figura 2, onde ocorrem cinco agrupamentos distintos (A, B. C, D e E) com similaridade de aproximadamente 41%. Da esquerda para a direita, o agrupamento A formado com similaridade de 42,42% constitui-se das espcies A. mellifera (AT), M. flavolineata, popularmente conhecida como uruu-amarela (UA-T) e M. fasciculata, tambm conhecida como uruu-cinzenta

(UC-T), sendo as amostras pertencentes regio de Tracuateua (T); o agrupamento B, com similaridade de 56,73%, contm as amostras de mel das espcies de abelha nativa sem ferro (UA-P e UC-P), correspondentes regio de So Joo de Pirabas (P); o agrupamento C, com similaridade de 12,86%, formado pelas amostras de mel da espcie A. mellifera (AP) da regio de So Joo de Pirabas; o agrupamento D, com similaridade de 56,42%, corresponde s amostras de A. mellifera (ASM e AV) das regies de So Miguel do Guam (SM) e Vigia (V) e M. fasciculata de So Miguel do Guam; por fim, o agrupamento E, com similaridade de 34,37%, formado pelas amostras produzidas pela espcie M. flavolineata (UA-V) da regio de Vigia. Anlise de componente principal A anlise de componentes principais obteve resultado semelhante aos encontrados na anlise de cluster. Empregando dados autoescalonados observou-se a formao de 5 grupos bem definidos, caracterizando uma diferena entre as espcies de abelhas com e sem ferro e suas respectivas regies de coleta. A projeo das duas primeiras componentes apresentada na Figura 3.

Figura 3. Anlise de componentes principais das amostras de mel

As duas primeiras componentes principais conseguem juntas explicar 54% do total da varincia e podem ser consideradas suficientes para descrever os dados. Baseado nos resultados obtidos das anlises de HCA e PCA conclui-se que as porcentagens de cido glico (AG), cido o-cumrico (AOC), cido desconhecido (PH3), quercetina (QRC), cido vanlico (AV) e cido cafeico (AC) so capazes de separar as amostras de mel das diferentes espcies de abelha de diferentes regies do nordeste paraense. Cor As amostras analisadas esto dentro dos padres exigidos pela Legislao Brasileira, que classifica o mel do incolor ao mbar escuro (Tabela 1).

Figura 2. Dendrograma obtido com as seis variveis selecionadas por AD

Tabela 1. Valores de cor, teores totais de fenis PT (mg de cido glico 100 g-1 de mel) e CE50 (mg 100 g-1) obtidos para os mis de A de A. mellifera, Melipona flavolineata e M. fasciculata Localidades Tracuateua So Joo de Pirabas So Miguel do Guam Vigia A. mellifera Cor* A A A AC PT 68,25 138,25 154,28 36,68 CE50 29,31 9,13 8,87 41,76 Cor* AC A EAC M. flavolineata PT 26,39 236,71 56,78 CE50 48,92 6,85 32,03 Cor* EAC A AC M. fasciculata PT 25,53 88,81 59,78 CE
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54,43 15,58 31,04 -

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Atividade antioxidante Os melhores resultados obtidos para atividade antioxidante foram para os mis que apresentaram os teores mais elevados de polifenis totais e colorao mais escura (Tabela 1). Os compostos majoritrios identificados por cromatografia lquida nestas amostras foram, respectivamente, os cidos glico, o-cumrico e p-cumrico e a quercetina. Os mis da espcie A. mellifera das regies de So Joo de Pirabas e So Miguel do Guam mostraram melhor inibio do radical DPPH, tendo atividade antioxidante significativa em relao s demais espcies, exceto para mis de M. flavolineata da regio de So Joo de Pirabas que obtiveram o melhor percentual de inibio, com mdia de 6,85%. Para mis de meliponneos apenas as amostras coletadas no municpio de So Joo de Pirabas apresentaram melhores atividades antioxidantes. Os mis das espcies M. flavolineata e M. fasciculata das regies de So Miguel do Guam e Vigia, apesar dos altos teores de polifenis totais, tiveram os resultados menos significativos de CE50. Os polifenis presentes em menor concentrao tambm tiveram menor influncia na atividade antioxidante dos mis, bem como a colorao variando do mbar claro ao extra-mbar claro. A correlao entre a CE50 e o contedo de fenlicos totais foi estatisticamente significativa, sendo obtido um coeficiente de correlao de 0,87. Estevinho12 encontrou para CE50 27,24 mg 100 mL-1 em mis escuros e 68,17 mg 100 g-1 em mis claros. Estes valores foram semelhantes aos encontrados neste estudo, onde os mis mais escuros possuem melhores atividades antioxidantes. Mis analisados no Rio de Janeiro apresentaram concentrao efetiva em 50% do total do efeito (CE50) variando de 4,82 a 77,05%. Lianda13 obteve para mis de A. mellifera de regies do Rio de Janeiro valores de CE50 variando de 10,81 a 52,84 mg 100 g-1. Os valores obtidos de CE50 para mis multiflorais de diversas regies da frica do Sul variaram de 1,63 a 29,13 mg mL-1.14 CONCLUSO O mtodo HPLC em conjunto com o mtodo SPE de extrao foi sensvel na separao dos compostos fenlicos presentes nas amostras. Das 36 amostras de mel analisadas foram observados a presena de 13 compostos fenlicos, sendo 3 no identificados (Ph1, Ph2 e Ph3). Para a maioria dos mis analisados foram identificados como compostos majoritrios o cido glico e a quercetina. A aplicao da tcnica de AD permitiu a elaborao de um modelo com porcentagem de predio de 100% na classificao das espcies. Os mtodos AC e ACP foram capazes de distinguir as espcies estudadas atravs da composio fenlica dos mis analisados, fator que indica possvel seletividade das espcies em relao origem botnica dos mis. De modo geral, os mis analisados apresentaram uma significativa atividade antioxidante, principalmente os mis mais escuros que possuram tambm teores mais elevados de polifenis totais. MATERIAL SUPLEMENTAR Os cromatogramas de cidos fenlicos e flavonoides encontrados nos mis das espcies do estudo esto disponveis gratuitamente em http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo PDF, com acesso livre. AGRADECIMENTOS Fundao de Apoio Pesquisa do Estado do Par (FAPESPA) pela bolsa de mestrado de P. S. Oliveira e apoio financeiro (Projeto FAPESPA UNIVERSAL 101).

REFERNCIAS
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