TEHNICI DE IZOLARE I SORTARE CELULAR IZOLAREA I SORTAREA CELULAR Majoritatea tehnicilor de analiz biochimic presupun izolarea celulelor din

contextul lor tisular. n acelai timp, pentru o analiz cantitativ i calitativ coerent, este necesar un numr relativ mare de celule. Dac pornim investigaia de la un fragment de esut, problema ntmpinat const n faptul c acest fragment conine un numr mare de specii celulare amestecate. Este deci necesar extragerea diferitelor specii celulare urmat de o sortare n funcie de diferite criterii; dac numrul de celule este satisfctor, se poate trece la destructurarea celular n vederea analizei coninutului; dac numrul de celule este insuficient, se poate proceda la multiplicarea acestora n cadrul unor culturi celulare, din care vor fi prelevate mostre pentru o analiz ulterioar. Izolarea celular din esuturi Cele mai accesibile esuturi animale pentru izolare celular sunt cele fetale sau neonatale, n care dinamica i multiplicarea celular sunt accentuate iar stabilitatea jonciunilor intercelulare ca i cantitatea de matrice extracelular sunt reduse. Desigur, celulele izolate trebuie s-i pstreze viabilitatea fie c este vorba de o tentativ exploratorie fie c vor fi supuse cultivrii ulterioare. Primul pas n vederea izolrii celulare este reprezentat de denaturarea conexiunilor intercelulare i a liantului reprezentat de matricea extracelular. Jonciunile intercelulare sunt dependente de prezena ionilor de Ca. Astfel, un chelator (agent de ndeprtare) al calciului cum este EDTA (acid etilen-diamino-tetra-acetic) aplicat fragmentului de esut de investigat, va determina desfacerea jonciunilor menionate, cu eliberarea celulelor. Matricea extracelular (incorect denumit anterior substan fundamental) poate fi denaturat prin tratamentul fragmentului tisular cu enzime proteolitice ca tripsina sau colagenazele (al cror rol este de a digera componentele ale matricei extracelulare cum ar fi colagenul sau proteoglicanii). Dup tratarea unui fragment tisular prin tripsinizare (cu tripsin) i EDTA, de obicei este suficient o uoar agitare a eantionului pentru a disocia celulele viabile. n eprubeta de lucru se obine o mixtur celular, format din celule izolate, n suspensie. Al doilea pas este separarea i sortarea celulelor n suspensie, obinute prin izolarea din esuturi. Procedurile de separare implic metode fizice, cum ar fi centrifugarea, care va fi descris la metodele de separare a organitelor celulare, pentru care a fost iniial conceput. Alte proceduri de separare se bazeaz pe capacitatea celulelor de a adera mai mult sau mai puin la diferite tipuri de suprafee (sticl sau plastic). Una din cele mai interesante tehnici de sortare este bazat pe posibilitatea utilizrii anticorpilor specifici. Aceti anticorpi (proteine specifice sintetizate de celulele sistemului imun, ca rspuns la structuri non-self) pot fi ataai la suprafaa celulelor, n mod diferenial i pot interaciona adeziv cu diferite suporturi organice (colagen, polizaharide, microsfere de plastic. Aceste suporturi organice formeaz o suprafa de afinitate la care celulele marcate cu anticorpi vor adera. Dup aderare, celulele pot fi desprinse fie prin agitare uoar, tratament cu tripsin (tripsinizare) pentru a denatura proteinele care au mediat fenomenele de adezivitate sau tratament cu enzime care denatureaz substratul de tip matriceal (colagenul pentru care utilizm o colagenaz).

Una din tehnicile cele mai avansate de sortare a celulelor utilizeaz cuplarea cu anticorpi urmat de marcajul fluorescent al acestora. Celulele marcate astfel (cu anticorpi marcai la rndul lor cu fluoroforul specific) sunt separate de un sistem de sortare prin activarea fluorescenei. Celulele marcate circul prin acest sistem de sortare (fig. ) n flux laminar iar fluorescena fiecrei celule este msurat precis. Un subansamblu de sonicare formeaz picturi microscopice care conin cte o celul sau nu conin de loc celule. Aceste picturi microscopice sunt ncrcate pozitiv sau negativ n momentul formrii, n funcie de pozitivitatea sau negativitatea fluorescenei. Apoi, picturile trec printr-un cmp electric care le deviaz traiectoria n funcie de ncrcarea electric. Astfel, picturile cu ncrcare pozitiv (i care conin celule marcate fluorescent) sunt depozitate ntr-un recipient fiind separate de cele ncrcate negativ. Particulele i picturile nencrcate i continu parcursul n mod gravitaional, ajungnd n recipientul de deeuri. Astfel de sisteme de sortare au o capacitate de 5000 de celule pe secund. Celulele obinute prin aceast metod de sortare pot fi supuse direct analizelor biochimice sau pot fi direcionate spre alte metode de multiplicare celular culturi tisulare i stabilizarea de linii celulare. Culturi tisulare i celulare Prin definiie, culturile tisulare reprezint totalitatea tehnicilor de meninere i n unele situaii de cretere i multiplicare in vitro a unor mici fragmente tisulare extrase de la plante sau animale. Culturile tisulare sau celulare sunt necesare pentru studiul efectelor unor substane endogene sau exogene asupra sistemelor vii. Culturile de esut sunt utilizate pentru a iniia culturi celulare. Istoric 1881 Roux a demonstrat viabilitatea celulelor de la embrionul de gin ntr-o soluie salin i n afara unui organism viu 1907 Harrison rezolv controversa doctrinei neuronale care susinea c extensiile neuronale se dezvolt prin evoluia corpului neuronal i nu prin fuziunea celulelor care nconjur aceste extensii. El a cultivat fragmente de mduv spinal de amfibian (ex. broasc) pe cheag limfatic i a demonstrat c extensiile neuronale se dezvolt pornind de la corpul neuronal i invadnd suportul nutritiv. 1913 Carrel demonstreaz c unele celule pot crete i supravieui pentru un timp n cultur dac sunt alimentate corespunztor i meninute ntr-un mediu aseptic. 1948 Earle i colab. izoleaz celule din linia L i determin formarea de clone celulare n cultur de esuturi. 1952 Gey i colab. stabilizeaz prima linie celular din carcinomul cervical uman, linie cunoscut astzi sub numele HeLa. 1961 Hayflick i Moorehead arat c numeroase fibroblaste mor dup un numr determinat de diviziuni n cultur. 1964 Littlefield introduce mediul HAT n vederea creterii selective a hibrizilor de celule somatice. Odat cu punerea la punct a tehnicilor de hibridare a celulelor a fost deschis era manipulrii genetice.

1965 Ham i colab., a definit un mediu de cultur fr ser pentru celule de la mamifere. Au fost create primele celule hibrid umane-murine (HarrisWatkins). 1975 Kohler i Milstein au produs prima dat anticorpi monoclonali din linii celulare compuse din hibridoame. 1976 Sato i colab., arat c pentru creterea celulelor n medii fr ser este necesar prezena unor factori de cretere i hormoni. Terminologie. Experimentele de cultivare pot avea loc in vitro (ad literam, pe sticl) sau in vivo, n cadrul unor organisme intacte. Exist posibilitatea unor confuzii, mai ales n sens biochimic, deoarece termenul in vitro se refer la reacii biochimice care au loc n afara celulelor iar termenul in vivo se refer la reacii care au loc n interiorul unei celule vii. Noiunea de cultur celular se refer la situaia n care fragmentul de esut este disociat n elementele celulare componente; aceste elemente celulare pot prolifera n condiii fizico-biochimice speciale prestabilite, prin aderarea la un substrat de plastic sau sticl sau n suspensie n mediul de cultur. Noiunea de cultur tisular a unor fragmente mici este sinonim cu cea de explant. Meninerea fragmentelor mici la o interfa lichid-solid prin ataarea tisular la un substrat de plastic sau de sticl permite creterea celulelor pe substrat i migrarea i proliferarea celular ulterioar; poate fi astfel generat o linie celular. Noiunea de cultur de organ presupune ca esutul s nu fie disociat ci meninut la interfaa lichid-solid; tehnica permite meninerea arhitecturii tisulare dar nu permite propagarea liniilor celulare n volum. Aplicaii Culturile tisulare sunt utilizate pentru: - studiul celulelor n micromedii reglate fizic i fiziologic; - caracterizarea i validarea unui stoc de celule; - minimizarea utilizrii animalelor de experien; - studii de transfecie (introducerea ADN exogen n genomul unor celule izolate i caracterizate pentru investigarea comportamentului celular i mutaiilor); - inginerie proteic studiul mecanismelor de semnalizare i de rspuns celular citotoxic sau genotoxic, mecanisme sintetice de rspuns la stimuli externi; Culturile tisulare nu reproduc cu acuratee condiiile in vivo datorit diferenelor de micromediu, absenei enzimelor hepatice specifice i dificultilor n reproducerea unui fenotip celular complet difereniat in vitro. Liniile celulare rezultate din culturi sunt genetic instabile i heterogene din punct de vedere genotipic. Clasificare Culturile pot fi clasificare grosier n: - culturi primare derivate direct din fragmente de esut sau organ; culturile rezult fie din explant (fr o etap iniial de disociere tisular) fie dup disociere enzimatic ntr-o suspensie celular. - culturi secundare (continue) - rezultate ca urmare a extraciei celulelor din cultura primar i cultivri ulterioare; se pleac de la un singur tip de celule

care se multiplic de un numr limitat de ori (de obicei 30 de ori) sau se pot multiplica la infinit. Culturile continue finite constau n celule diploide, cu un grad accentuat de difereniere (ex. fibroblaste care continu s secrete colagen) i care sufer progresiv procese de senescen. Meniune: Culturile celulare care se permanentizeaz presupun o propagare celular pe o perioad nedefinit i, de obicei, se transform n celule tumorale. Celulele tumorale sunt foarte uor de cultivat i se obin fie direct din tumori clinice fie prin inducie din celule normale prin transfecia unor oncogene virale sau prin tratamente chimice. Morfologia celulelor n cultur este variabil i denot de obicei tipul de esut din care deriv: liniile celulare derivate din snge tind s creasc n suspensii n timp ce celulele derivate din esuturi solide tind s creasc n monostrat. n funcie de tipul de substrat utilizat, culturile pot fi: - pe suport organic nutritiv - pe suport organic nenutritiv - pe suport anorganic (sticl, plastic) Particulariti i condiii Culturile de celule sunt de obicei preparate ntr-un spaiu de lucru steril, special amenajat, izolat prin ecluze de exterior. Acest spaiu include resurse de ap curent, gaz electricitate, toate n flux continuu. Necesarul de baz ntr-un laborator de culturi de celule este reprezentat de: - arie de lucru steril - sticlrie, instrumentar specific, sterilizabil sau de unic utilizare (de preferat) - sisteme de stocare i congelare - incubator, sistem de alimentare cu CO2, hot de flux laminar (n care circulaia aerului se face numai n direcie ascendent - microscop fotonic pentru controlul culturilor, agitator magnetic, sonicator, balan analitic - consumabile

Designul unui laborator de culturi de celule Este un deziderat a constitui un laborator de culturi de celule, pornind de la zero i respectnd norme precise, nefiind recomandat adaptarea unui laborator utilizat pentru alte scopuri. Este de preferat ca sistemul de lucru s fie unitar i toate manipulrile s se efectueze ntr-un singur spaiu (unitatea de procesare tisular i celular) care trebuie s fie separat de zona de primire a materialului de studiu (zon de carantin) Spaiul de lucru trebuie s fie steril, necesit o iluminare adecvat, un trafic aeric redus, suprafee de lucru uor lavabile, o hot de flux laminar i lmpi de ultraviolete pentru sterilizare. Sticlria trebuie s fie neutr, perfect transparent, fr neregulariti. Este reprezentat de sticlrie special pentru culturi i sticlrie uzual de laborator. Aparatur i instrumentar: Hot microbiologic: asigur un mediu de lucru curat pentru produsele biologice i protejeaz operatorul de aerosolii care pot conine patogeni. Hota este dotat de obicei cu filtre HEPA (high efficiency particulate air). Aerul este recirculat prin sisteme complexe de filtre care respect mediul extern. Controlul microbiologic al contaminrii se realizeaz cu ajutorul unor plci speciale de agar care se amplaseaz n interiorul hotei pentru cel puin 4 ore. Dac pe suprafaa acestor plci nu cultiv nici bacterii nici fungi, nseamn c mediul de lucru este propice din punct de vedere microbiologic. n funcie de tipul de cultur intenionat, se iau masuri specifice de asepsie, inclusiv mpotriva unei eventuale contaminri virale. Centrifuge: centrifugele sunt utilizate pentru tehnicile de rutin pentru subculturi pentru izolarea liniilor celulare sau pentru crioprezervarea celulelor izolate. Centrifugele produc n mod normal aerosoli; de aceea trebuie folosite tuburi de centrifugare sigilate, cu capac transparent care permite examinarea strii coninutului nainte de desigilare. Se va verifica permanent echilibrarea centrifugii nainte de amorsare i starea de coroziune; centrifuga va fi amplasat ntr-un loc accesibil. Incubatoare: culturile celulare au nevoie de locaii speciale pentru supravieuire. Incubatoarele uzuale asigur condiii de cretere constante, de temperatur, grad de umiditate i nivele de CO2 atent controlate. Temperaturile de lucru variaz ntre 28C (celule de la insecte) - 37C (celule de la mamifere), iar nivelul de CO2 variaz ntre 510%. La ora actual exist incubatoare cu nivele controlate de CO2 i cu interior de Cu, care inhib dezvoltarea germenilor. Totui, singura msur care trebuie aplicat constant este igienizarea suprafeelor i volumelor de lucru. Suprafaa de lucru i podelele: toate suprafeele de lucru, podelele i pereii trebuie s fie netede i uor de curat, rezistente la ap i la diferii reactivi (soluii alcaline, acide, dezifectani). n zonele de congelare n azot lichid, podeaua trebuie s reziste la spargere iar geamurile trebuie s se nchid ermetic. Instrumentar: bisturie, lame sterile, pense fine foarfeci chirurgicali. Dispozitivele de curare i sterilizare includ: autoclave, un cuptor de sterilizare i spltor de pipete. Totui, un laborator modern i dotat financiar folosete materiale de lucru de unic utilizare, pentru reducerea la minim a posibilitilor de contaminare. Condiii de cultur Celulele de origine animal sunt destul de dificil de cultivat n raport cu cele bacteriene (excepie fac celulele embrionare sau tumorale, care cultiv uor). Pentru a

permite supravieuirea n condiii de pseudonormalitate a celulelor sau fragmentelor de esut recoltate sunt necesare cteva condiii eseniale: - temperatura de 37C pentru celulele mamifere - pH 7,2-7,4 i o trie ionic adecvat - acces la nutrieni care s simuleze ct mai precis mediul intern al organismului din care a fost extras fragmentul de esut De obicei, celulele sau fragmentele de esut extrase sunt amplasate n vase speciale de cultur cu un mediu de cultur specific. Culturile sunt meninute n incubatoare cu condiiile menionate mai sus i controlate electronic. Asepsia este una din condiiile eseniale pentru realizarea unei culturi tisulare sau celulare. Regulile care guverneaz un spaiu aseptic sunt: - acces limitat la camera de culturi celulare, de obicei prin zon ecluz - suprafeele de lucru se decontamineaz nainte i dup utilizare - manipularea probelor biologice se face numai cu instrumentar steril, eventual de unic utilizare i semiautomatizat sau complet automatizat - experimentatorul va purta echipament special i masc de protecie - sterilitatea permanent controlat a spaiului de lucru Mediile de cultur Mediile de cultur trebuie s asigure: - echilibrul ionic obinut cu ajutorul soluiilor izotone (meninerea presiunii osmotice); - pH optim (7,2-7,4); - temperatur optim, coninutul de O2 i CO2 favorabile; - elemente nutritive indispensabile metabolismului; - evitarea contaminrii cu germeni patogeni se realizeaz prin adugarea de antibiotic la mediul de cultur; Clasificarea mediilor de cultur: n funcie de: - consisten: o lichide o semilichide (mediu nutritiv + agar sau coagulat de plasm sangvin) - compoziie: o naturale o semisintetice o sintetice - dup valoarea nutritiv: o medii de cretere (permit o proliferare celular abundent) o medii de meninere (care nu ncurajeaz proliferarea dar menin viabilitatea celular Compoziia mediilor de cultur: - serul este un amestec complex de albumine, factori de cretere i inhibitori ai acestora. Este un element esenial al mediilor de cultur pe baz de ser. Cel mai folosit este serul fetal de viel - sruri anorganice: sunt necesare pentru meninerea echilibrului osmotic i reglarea potenialului de membran

sisteme tampon, care sunt necesare pentru meninerea pH-ului (tampon fosfat, tampon bicarbonat de sodiu i CO2 uor de obinut ntr-un incubator cu CO2, ieftin i netoxic); n mediu exist i un indicator al pH-ului (rou fenol care vireaz de la galben la rou aprins i apoi la violaceu); - carbohidrai: reprezint sursa principal de energie pentru celule. Se utilizeaz n special medii cu glucoz, galactoz dar i cele cu maltoz sau fructoz; - vitamine: sunt prezente fie n ser (pentru mediile pe baz de ser) sau sunt adugate n mediile artificiale. Cele mai importante vitamine pentru culturi celulare sunt cele din grupul B, necesare pentru cretere i proliferare, riboflavina, tiamina i biotina; - proteinele i peptidele sunt importante n mediile artificiale; includ albumina, transferina, fibronectina; - lipide i acizi grai: importante pentru mediile artificiale, includ colesterolul i steroizii; - microelemente: Zn, Cu Se (pentru detoxifiere i ndeprtarea radicalilor liberi), acizi tricarboxilici i intermediari Culturile celulare pot fi conservate la temperaturi sczute (-135C), dup o condiionare prealabil i tratare cu ageni de crioprotecie. Congelarea se face progresiv cu o rat de (-1) (-3)C pe minut. Principii de lucru Vom meniona aici principiile de urmat i de evitat n efectuarea i manipularea unor culturi celulare: Principii de urmat: - se folosete ntotdeauna echipament individual de protecie (halat, mnui, ochelari); opional se pot folosi mnui termoizolante, vizier i or special pentru manipularea azotului lichid; - bonete speciale care s acopere prul strns; - echipament special pentru camera de culturi; - ordinea i curenia pe suprafaa de lucru - marcarea corect a recipienilor, mediilor, eprubetelor cu coninutul i data preparrii; - manipularea unei singure linii celulare o dat. Nu se trece cu un vas pe deasupra altora; - ntre operaiuni, se cur masa cu alcool 70% i se las circa 15 minute ntre manipularea succesiv a 2 linii celulare diferite; - utilizarea de recipiente separate cu medii pentru diferitele linii celulare; - examinarea zilnic a culturilor pentru posibile contaminri bacteriene sau fungice; - controlul de calitate al mediilor i reactivilor nainte de utilizare (data expirrii, pH, contaminare) - evitarea ambalrii n carton a instrumentarului sau culturilor; - aseptizarea hotei, filtrelor, incubatoarelor, microscoapelor; - testarea celulelor pentru contaminarea cu Mycoplasma.

De evitat: - utilizarea de antibiotice n mod continuu, deoarece se ajunge la selectarea unor rezistene care fac liniile celulare inutilizabile din punct de vedere comercial; - acumularea deeurilor la nivelul zonei de lucru; - aglomerarea personalului n laborator; - manipularea celulelor din surse incerte n sistemul principal de lucru; acestea se menin n carantin pn la efectuarea tuturor testelor specifice; - meninerea liniilor celulare n cultur continu, fr recongelare; - permiterea conflurii complete a culturilor; de obicei gradul de confluare este menionat n protocolul de utilizare al culturii; - expirarea mediului de cultur; de obicei mediul rezist 6 sptmni la 4C dup adugarea glutaminei i serului; - murdrirea bilor de ap; - decalibrarea echipamentului. Controlul de calitate Se vor urmri: - calitatea reactivilor i materialelor o serul fetal bovin nu trebuie s fie infectat cu virusul diareei bovine o tripsina porcin este surs de Myocoplasma o toate materialele trebuie s aib certificate de calitate la zi; nu se accept furnizori neautorizai; - proveniena i integritatea liniilor celulare o liniile celulare s nu fie contaminate o originea liniilor i profilul ADN complete o instruciuni de utilizare detaliate - evitarea contaminrii microbiene sunt posibile 3 tipuri de contaminri: o bacterian i fungic: vizibile prin creterea brusc a turbiditii mediului, modificri de culoare i pH. Este necesar examinarea microscopic zilnic o cu Mycoplasme (procariote autoreplicative), sub form de coci sau filamente; efectele contaminrii cu Mycoplasma sunt mai insidioase: reducerea ratei de cretere a celulelor modificri morfologice aberaii cromosomiale alterri ale metabolismului acizilor nucleici i aminoacizilor o viral: n special pentru serul bovin