CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

I.- INTRODUCCIN: La facilidad de usar la tcnica de cultivo de tejidos vegetales para la multiplicacin masiva produce material vegetal in vitro por la iniciacin de brotes adventicios, bulbos, tubrculos, embriones asexuales o por crecimiento de brotes de yemas axilares y produccin masiva de plntulas a partir de meristemos. Los propagadores comerciales ya tienen estandarizado el mtodo de mantenimiento de un lote comercial de material madre in vitro, en donde, adems de tener la ventaja de mantener este material, se considera el gran nmero que se puede mantener en un espacio reducido con las condiciones ambientales requeridas y la calidad y sanidad deseables. Esto es debido al potencial morfogentico que tienen los meristemos y otros tejidos de la planta en la produccin de brotes. Existen muchos gneros vegetales que se propagan por cultivo de tejidos para la obtencin de grandes cantidades de plantas de importancia comercial, como son Anturium andreanum, Dieffenbachia amoena Snow, D. picta Perfection, Philodendron oxycurdium, Scindapsus aureus, Syngonium podophyllum, Chrysanthemum morifolium, Gerbera jamesonni, Begonia spp, Saxifraga sarmontosa Tricolo, etc.

II.-CONCEPTOS: Micropropagacin: Micropropagar es el proceso de multiplicar pantas in vitro. A travs de la micropropagacin, a partir de un fragmento (explanto) de una planta madre, se obtiene una descedencia uniforme en condiciones de asepsia. Este proceso incluye varias fases: Explante Con el trmino explante se describe un fragmento cortado de un tejido o de un rgano utilizado para iniciar un cultivo. Como explante puede ser utilizado casi cualquier rgano o tejido, pero para la micropropagacin es ms conveniente partir de una yema o pice meristemtico que garantize la estabilidad gentica de sus clulas.

III.- METODOLOGIA: FASES DE LA MICROPROPAGACIN La seleccin de la planta madre es muy importante, ya que las plantas que van a obtener son idnticas al progenitor (propagacin asexual). Si la planta madre se encuentra enferma, sera deseable conocer el virus especifico presente, pues as las condiciones de cultivo varan, aplicndose termoterapia o simplemente cultivo de meristemos. El tamao del inculo tambin es importante, pues se tienen meristemos que miden de 0.01 a 0.1 mm de dimetro, y pices de tallo que miden de 0.1 a 0.3 mm de dimetro; generalmente el nmero de plntulas libres de virus producidas es inversamente proporcional al tamao del meristemo o pice cultivado (Walkey, 1978). Por ltimo, es importante sealar que el medio de cultivo es un factor esencial, ya que en l juegan un papel vital los requerimientos nutricionales, hormonales y ambientales, especficos de la especie que estemos cultivando; stos deben de ser semejantes a los que se tienen en condiciones naturales. El proceso de cultivo in vitro incluye varias etapas, que son: Etapa 0 Etapa I. Etapa II Etapa III. Etapa IV : : : : : Eleccin de la planta madre. Introduccin Micropropagacin. Enraizamiento. Aclimatacin.

PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO El medio MS, o de Murashige y Skoog (1962), es muy usado, particularmente si el objetivo es regenerar plantas; existen numerosas variaciones comerciales de este medio. El medio B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios derivados, ha sido de un gran valor en el cultivo de clulas y protoplastos, y tambin es utilizado eficazmente en regeneracin de plantas. La diferencia principal entre los medios MS y B5 es la menor concentracin de nitratos en B5. El medio WPM (1980) de baja concentracin de sales est especialmente indicado para especies leosas. Los requerimientos nutritivos para un crecimiento in vitro ptimo varan con la especie, e incluso son especficos de acuerdo a la parte de la planta que se est cultivando y a la respuesta que se desea obtener. Debido a estas necesidades especficas se han desarrollado muchas formulaciones diferentes para los medios de cultivo.

Una vez escogida la formulacin del medio de cultivo, se procede a su preparacin. Se podran pesar las cantidades necesarias de todos y cada uno de los componentes del medio. Ello, no obstante, sera una operacin larga y tediosa, adems de muy imprecisa puesto que obligara a pesar algunas cantidades muy pequeas. Por todas esas razones, acostumbra a ser una prctica habitual en todos los laboratorios preparar soluciones stock concentradas de los distintos componentes, agrupados de forma que no se produzcan fenmenos de precipitacin. Es habitual trabajar con una solucin stock de macronutrientes, una de micronutrientes, una de hierro con un agente quelante, otra de vitaminas y mio-inositol, as como con soluciones especficas para los dems componentes del medio (reguladores, ...). Proceder de esa forma simplifica la preparacin del medio: un medio como el MS, que contiene un total de 20 substancias diferentes, requerira otras tantas pesadas, mientras que a partir de soluciones stock su preparacin se reducira a cuatro medidas de volumen y una pesada (sacarosa). Las soluciones stock pueden mantenerse durante un cierto tiempo en la nevera o en el congelador. Una vez obtenido el volumen de medio deseado se procede a ajustar su pH al valor prefijado mediante la adicin de OHNa y/o HCl 0.1-1 N. A continuacin, dependiendo de que se vaya a preparar un medio slido o lquido, se aadir en el primer caso el agente solidificante, se fundir por calentamiento breve para, finalmente, ser dosificado en los contenedores adecuados. En el caso de tratarse de un medio lquido se proceder a dosificar directamente en los contenedores escogidos. Tanto si es un medio slido como lquido se proceder a continuacin a autoclavar los contenedores con el medio (generalmente a 121 0C durante 20 minutos). Conviene tener en cuenta que algunos de los componentes del medio de cultivo pueden ser termolbiles (algunas vitaminas, algunos reguladores,...). En este caso, la esterilizacin de la solucin que contienen la substancia termolbil debe hacerse por filtracin y aadirse una vez esterilizada al medio de cultivo previamente esterilizado y parcialmente (en medios slidos) o totalmente (en medios lquidos) enfriado.

Diagrama de flujo del proceso de preparacin de un medio de cultivo a partir de soluciones stock.

Necesidades nutricionales y hormonales de los cultivos de rganos y tejidos vegetales Agua Macro Micro Sustancias orgnicas elementos Fe Zn Azcares N B Aminocidos P Mn Auxinas K Cu Citoquininas Ca Ni Giberelinas Mg Co Acido abcsico S Al Mo I Mezclas de sustancias poco definidas: Extracto de levadura Leche de coco Extractos vegetales Hidrolizados de casena Peptona y triptona

Fig. 1y 2 Preparacin de medio de cultivo

Fig. 3 y 4 Preparacin de medio de cultivo

FASE 0: ELECCION DE LA PLANTA MADRE Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre un perodo de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias ptimas y con un control de la nutricin, del fotoperodo y de la irradiancia recibida.

Fig 5 La violeta africana (Saintpaulina ionantha) FASE I: INTRODUCCION Una vez escogida la planta madre, se extraern los fragmentos a partir de los cuales se obtendrn los explantos. Antes de extraer los explantos se har una desinfeccin de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.

Se debe realizar un previo desinfectado con fungicida a 1000 PPM. Lavar en agua. Luego lavar con alcohol 70 de 3 a 5 minutos. enjuagar con agua. Luego colocar en leja al 20% por 10 a 15 minutos. Enjuagar con agua destilada estril.

Fig 6, 7 y 8 Realizando la desinfeccin.

FASE II: MICROPROPAGACION Durante esta fase se espera que los explantos que sobrevivieron de la FASE I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios entrenudos. Peridicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cmara de flujo laminar.

Fig. 6 Etapa de Micropropagacin

Fig. 9 y 10 Propagando

Fig. 11 y 12 Propagando

Fig. 13 y 14 Medios con tomillo.

Figura 15. Cmara de cultivo tipo cubculo FASE III: ENRAIZAMIENTO Para enraizar los explantos se utilizan principalmente dos mtodos:

ENRAIZAMIENTO IN VITRO Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicacin a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operacin se realiza en la cmara de flujo laminar. Este mtodo permite ser mas flexible a la hora de escoger los brotes, ya que stos obtienen del medio la fuente de energa para enraizar, y por tanto no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosntesis.

ENRAIZAMIENTO EX VITRO Los explantos se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Con este mtodo es necesario que el medio de enraizamiento est libre de organismos patgenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosntesis para que la planta tenga una fuente de energa para enraizar y desarrollarse. Los explantos deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plstico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar

en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un rea sombreada con "fog-system" o "mist-system".

FASE IV: ACLIMATACIN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS Los explantos recin enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el xito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatacin.

Tanto si los explantos fueron enraizados in vitro como ex vitro, en el momento en que se extraen los explantos de los recipientes de enraizamiento estn poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantos han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas perezosos para responder al descenso de la humedad relativa, demasiado lentos para para evitar la desecacin del explanto. Por otra parte crecer en ambientes tan hmedos tambin suele implicar la falta de una cutcula crea bien desarrollada, la barrera para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.

Los explantos deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz.

LA CMARA DE FLUJO LAMINAR Buena parte de las manipulaciones propias del cultivo in vitro deben realizarse en condiciones de esterilidad total para evitar la contaminacin de los cultivos. Para disponer de una superficie de trabajo estril que no ponga en peligro la esterilidad de los cultivos se usan las cmaras de flujo laminar. Una cmara de flujo laminar es un receptculo en forma generalmente prismtica con una nica cara libre (la frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la superficie de trabajo. La esterilidad de la zona de trabajo se consigue porque se hace circular a travs del interior de la cmara una corriente de aire que previamente ha sido microfiltrada para eliminar toda partcula extraa. Para evitar que el aire del exterior pueda entrar en la cmara de flujo sin pasar previamente por los filtros se procura que la presin interior sea ligeramente superior a la presion exterior, con lo cual el aire siempre circula de dentro hacia fuera y nunca al revs. Segn el grado de sofisticacin de la cmara, puede disponer de elementos accesorios como son: fuente de luz, lampara de esterilizacin por U.V., pilotos indicadores de funcionamiento diversos, contador de horas de funcionamiento, indicador de presin interior, etc.

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Existen dos tipos de cmaras de flujo laminar segn sea la forma en la que se hace circular el aire: cmaras de flujo horizontal y cmaras de flujo vertical. En las primeras el flujo se produce desde el fondo de la cmara hasta el frente, de forma que las partculas se mueven horizontalmente a la superficie de trabajo. En las segundas, el flujo se produce desde el techo hacia la superficie de trabajo de forma que las partculas se mueven perpendicularmente a ella. EJEMPLO. MICROPROPGACIN DE VIOLETAS AFRICANAS VERSUS PROPAGACIN POR ESQUEJE. La violeta africana (Saintpaulina ionantha) fue descubierta por el barn Walter von Saint Paul St Claire en las montaas de Usambara, en la provincia del Cabo (Surfrica), a finales de siglo pasado. Cultivada por primera vez como planta de interior har unos cincuenta aos, hoy es una de las plantas de flor de interior ms populares. Inicialmente se reproduca por semilla o, sobre todo, por esqueje foliar. Hoy la forma ms habitual de reproducirla es el cultivo in vitro de secciones de peciolo. ESQUEMA DEL TRABAJO

CONCLUSIONES: Se pudo realizar cultivos vegetales. Se logr apreciar todas las etapas de la micropropagacin. BIBLIOGRAFA: HURTADO M. Daniel V / MERINO M. Mara Eugenia. Editorial Trillas. Tercera Edicin. Agosto de 1994. Mxico. Pp. 233. Pg. 136 148. http://www.monografias.com/trabajos12/aplicult/aplicult.shtml http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtua l/Micropropa/Micvegetal.htm

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