Facolt di PSICOLOGIA Corso di laurea in SCIENZE PSICOLOGICHE

Corso di Biologia applicata Lezione 8 - Duplicazione DNA. Organizzazione del DNA nella cellula. Regolazione dellespressione genica

Prof. Alfredo Grilli

rev. 1.0 del 09/2006

www.unidav.it

Duplicazione DNA. Organizzazione del DNA nella cellula. Regolazione dellespressione genica

Duplicazione del DNA. Per potersi replicare, ogni organismo vivente deve fornire alla generazione successiva un assetto genico proprio della sua specie ma deve anche mantenere per se quella informazione genica, per continuare a vivere e riprodursi. per questo motivo ogni evento di riproduzione deve essere preceduto dalla duplicazione del materiale genetico (DNA) ogni nuova molecola deve essere identica alla molecola di DNA che funge da stampo. Per dare inizio alla replicazione i due filamenti stampo devono perdere la conformazione a doppia elica e disporsi separati ed allungati all'azione della DNA polimerasi. Osservazioni al hanno confermato quanto era

microscopio

elettronico

prevedibile sulla base della replicazione semiconservativa del DNA, e cio la formazione di una forcella di replicazione nel punto dove avanza la replicazione del DNA, nella transizione fra il DNA a doppia elica ed il DNA aperto nei suoi due filamenti. Come indicato nella figura, proteine enzimatiche denominate elicasi si attaccano alla doppia elica nel sito di origine della replicazione e sono in grado di separare le due eliche. L'apertura della doppia elica facilitata dalla struttura dei siti di origine della replicazione che sono formati da un alto numero di coppie AT e quindi hanno una minore stabilita dei legami idrogeno fra le basi.

Successivamente altre proteine specifiche chiamate proteine di svolgimento, si attaccano ai filamenti singoli cos formati ed impediscono loro di riassociarsi: per questa loro propriet queste proteine sono anche pi propriamente denominate proteine che destabilizzano l'elica.

L'inizio della sintesi del filamento di DNA avviene mediante un innesco di RNA, che viene successivamente rimosso. Gli enzimi DNA polimerasi non sono capaci di polimerizzare i

deossiribonucleotidi se non legando il gruppo 5 fosfato al 3'OH di un filamento preesistente, che funge da innesco. Lenzima RNA polimerasi (RNA polimerasi DNA dipendente), invece,

polimerizza ribonucleotidi su stampo di DNA e non ha bisogno di innesco.

L'allungamento del filamento crescente nella direzione 5'--->3', copiando due filamenti stampo fra loro antiparalleli, comporta una difficolt. Infatti, mentre la forcella di replicazione progredisce, la duplicazione di un filamento procede nella stessa direzione e quindi una crescita continua mentre nellaltro filamento la duplicazione procede in senso opposto costringendo la DNA polimerasi ad interrompere la duplicazione. Bisogner riformare un primer a monte di questo filamento per consentire la duplicazione di un altro tratto. Ogni volta che la forcella procede nella sua direzione, un nuovo primer dovr essere sintetizzato dalla parte dellemielica che ha una duplicazione contraria allapertura della doppia elica. Come gi detto i primer

vengono rimossi, ne risulta che da un lato avremo una emielica duplicata, dallaltro la duplicazione costituita da tanti frammenti generati dalla rimozione di altrettanti primer. Questi frammenti sono chiamati frammenti di Okazaki dal nome dello scopritore di questo meccanismo replicativo L'unione dei diversi tratti e operata dall'enzima polinucleotide ligasi, capace di formare un singolo legame fosfodiestere fra i terminali 3'OH e 5' fosfato di due filamenti contigui di DNA, ricevendo l'energia necessaria dall'idrolisi di una molecola di ATP. I nucleotidi erroneamente inseriti nel filamento copiato vengono rimossi per opera dellattivit esonucleasica 3'-5' presente nella DNA polimerasi III la quale funge da correttore di bozze, capace di rimuovere quasi tutti i nucleotidi non confacenti alla giusta complementarit delle basi. La meccanica dello svolgimento della doppia elica comporta la formazione a valle di superavvolgimenti del DNA in spire sempre pi strette. La formazione di queste spire porterebbe

allistaurarsi di tensioni dovute alle torsioni. Queste tensioni vengono prevenute grazie allattivit di enzimi chiamati

Topoisomerasi che introducono tagli sui filamenti di DNA. Esistono due tipi di Topoisomersi: la Topoisomerasi I in grado di tagliare un filamento e la Topoisomerasi II in grado di tagliare entrambi i filamenti.

Organizzazione del DNA nella cellula. Mediamente una cellula umana ha un diametro di circa 20 m. Il suo materiale genetico rappresentato da 23 coppie di molecole di DNA in forma di cromosomi. Nell'insieme, queste 46 molecole di DNA ammontano a pi di 2 m di DNA che devono essere contenuti in un nucleo che ha un diametro di circa 5 m. Il DNA per essere contenuto nello spazio del nucleo, deve

essere accuratamente avvolto intorno a rocchetti proteici detti nucleosomi e poi impacchettando i nucleosomi per formare un filamento elicoidale, che disposto in anse associate alla matrice nucleare, impalcatura proteica che fornisce l'intelaiatura

strutturale all'interno del nucleo. Durante l'interfase tra due divisioni cellulari, il DNA nel nucleo di una cellula eucariotica si trova in forma di una complesso nucleoproteico detto cromatina. Le proteine della cromatina rientrano in due classi: istoni e proteine cromosomiche non istoniche. Gli istoni sono proteine strutturali abbondanti, mentre la classe non istonica e

rappresentata da un basso numero di copie per ciascuna delle molte diverse proteine implicate nella regolazione genetica. Gli istoni sono proteine relativamente piccole, con abbondanza di cariche positive, ricche in arginina o in lisina, che interagiscono tramite legami ionici coi gruppi fosfato carichi negativamente dello scheletro polinucleotidico. Sono noti cinque istoni

differenti: H1, H2A, H2B, H3 ed H4. Coppie di istoni H2A, H2B, H3 ed H4 si aggregano per formare una struttura ottamerica, il nocciolo del nucleosoma, intorno al quale si avvolge la doppia elica del DNA.

Regolazione dellespressione genica Come gi detto, la cellula, durante il suo ciclo vitale, ha la necessit di regolare lespressione dei propri geni non solo dal punto di vista quantitativo ma anche dal punto di vista del funzionamento. Questo perch in ogni momento del ciclo cellulare funzionano solo i geni utili allo stato funzionali della cellula mentre gli altri sono disattivati. Negli eucarioti il controllo dellespressione genica non si limita al solo controllo della trascrizione ma si estende anche al controllo sullmRNA che subisce una maturazione, alla traduzione ed alla attivazione delle proteine. Nei procarioti il meccanismo di regolazione si esplica

essenzialmente sulla trascrizione. I geni dei procarioti, quando hanno una azione coordinata, si uniscono a formare gli Operoni. Un Operone rappresentato da un gruppo di geni contigui sotto il controllo dello stesso promotore. Gli Operoni si distinguono in operoni catabolici, che codificano enzimi per utilizzare determinati substrati nutritivi, e in operoni anabolici che codificano enzimi utilizzati per la sintesi di composti necessari alla crescita cellulare.

Gli Operoni catabolici sono, in genere, inducibili, cio si attivano solo in presenza del substrato. Gli Operoni anabolici funzionano sempre a meno che non si introduca nel terreno di coltura il composto che produco, nel qual caso diventano reprimibili. La cellula che tende al risparmio energetico, quando ha a disposizione dallesterno un determinato composto necessario alla sua crescita, reprime loperone

anabolico corrispondente. Operone Lattosio o Lac Operon, come esempio di regolazione di espressione genica. Questo Operone catabolico, inducibile, rappresenta il capostipite degli Operoni in quanto stato il primo ad essere studiato svelando i meccanismi di regolazione genica nei Procarioti. Il Lac Operon un segmento di DNA costituito da un promotore che regola tre geni (Z, Y, ed A). Questi tre geni codificano rispettivamente la Galattosidasi, la Permeasi e la Acetitasi.

Questi tre enzimi intervengono nel catabolismo del Lattosio: la Galattosidasi scinde la molecola del Lattosio in una molecola di Glucosio ed una di Galattosio; la Permeasi facilita lingresso del Lattosio allinterno della Cellula Batterica, mentre non chiara la funzione dellAcetilasi. Il Promotore di questi geni, oltre a contenere delle sequenze caratteristiche dei promotori (es. TATA box) contiene un sequenza definita Operatore che si trova immediatamente prima

dei tre geni codificanti ed una sequenza definita sito CAP dalla parte opposta. Infine prima del sito CAP troviamo un altro gene controllato da un proprio promotore che codifica una proteina chiamata Repressore. La cellula batterica utilizza il Lattosio come fonte di energia. Quando il Lattosio manca nel terreno di coltura, la cellula non ha nessuna utilit a far funzionare il Lac Operon, pertanto, in assenza di Lattosio, viene sintetizzata la proteina Repressore che si lega al sito Operatore lattacco del Repressore a questo tratto di DNA stabilizza una struttura a croce che impedisce il passaggio della RNA Polimerasi. I tre geni Z,Y,A non codificano. Se introduciamo Lattosio nel Terreno di coltura, quando questo raggiunge un determinato valore di concentrazione allinterno della Cellula batterica, interagisce con il Repressore ne modifica la struttura, in modo tale che non pi in grado di riconoscere lOperatore. La RNA Polimerasi non trovando pi ostacoli, inizia a trascrivere i tre geni. Uno di questi tre geni codifica la Permeasi che a sua volta facilita lingresso del Lattosio configurando una sorta di regolazione a Feedback positivo. Quando linterno della Cellula contiene concentrazioni alte di Lattosio, lapparato del Lac Operon deve funzionare alla massima efficienza, pertanto interviene una proteina, la proteina CAP che una volta attivata si lega al sito CAP determinando una facilitazione allingresso della RNA Polimerasi. La proteina CAP si attiva solo quando aumentano le concentrazioni di cAMP che a sua volta e regolato da cataboliti della Glicolisi. E evidente che in presenza di Glucosio non

indispensabile ricorrere al Lattosio, i livelli di cAMP scendono, la proteina CAP non viene attivata, la RNA Polimerasi si lega alloperone con pi difficolt.

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