ANLISE DAS HEMOGLOBINAS INSTVEIS EM UMA AMOSTRA DA POPULAO DA CIDADE DE TRS LAGOAS (MS), BRASIL.

Mrio Augusto da Silva Freitas, Jssika Viviani Okumura & Danilo Grnig Humberto da Silva3 Orientador e professor da UFMS, Departamento de Enfermagem aplicada Biotecnologia da SadeUFMS/CPTL, e-mail: maugus@terra.com.br Acadmica de Licenciatura Plena em Cincias Biolgicas - UFMS/CPTL, e-mail: jessika_okumura@hotmail.com Mestrando do Programa de Ps Graduao em Gentica do Laboratrio de Hemoglobinas e Gentica das Doenas Hematolgicas - UNESP/IBILCE, e-mail: dghs_ufms@yahoo.com.br

RESUMO As hemoglobinas instveis constituem um grupo de alteraes genticas em que mutaes no genes das cadeias globnicas afetam a estrutura da molcula, tornado-a instvel. O presente estudo objetivou realizar uma triagem populacional de portadores de hemoglobinas instveis atravs de metodologias especficas e realizar o estudo familial dos portadores oferecendolhes orientao gentica. Foram analisadas 123 amostras de sangue perifrico colhido em frascos estreis contendo EDTA a 5%, aps consentimento informado, de uma amostra populacional do Municpio de Trs Lagoas (MS) estudantes, gestantes e pr-maritais. A metodologia baseou-se em testes seletivos: anlise da morfologia eritrocitria em esfregao sangneo a fresco e, quando necessrio, corados pela a tcnica de May-Grnwald, resistncia globular osmtica em soluo de cloreto de sdio 0,36%, teste de solubilidade em Tampo de Amnio/Fosfato pH 7,1 e eletroforese em gel de poliacrilamida com tampo Tris-Glicina em pH alcalino (8,0). A avaliao da estabilidade da molcula de hemoglobina foi realizada atravs de testes especficos: pesquisa dos corpsculos de Heinz, desnaturao qumica ao isopropanol-tris-HCL pH 7,4 e desnaturao pelo calor (aquecimento da soluo do hemolisado entre 50-60 C). A prevalncia encontrada foi de dois (1,62%) indivduos positivos para todos os testes especficos de estabilidade da molcula de hemoglobina, oito (6,48%) apresentaram alguma alterao nos testes para a Hb instvel e 14 (11,4%) tiveram outros tipos de hemoglobinopatias hereditrias, todos os casos heterozigotos, como, por exemplo, trao alfa-talassmico, trao falciforme, trao beta-talassmico e outros. O resultado, para hemoglobinas instveis, foi baixo, porm concordante com a literatura e de grande importncia, pois diagnosticou de forma adequada, um indivduo que fora por anos tratado como portador de anemia ferropriva recorrente, e demonstrou sua validade e exequibilidade em programas populacionais, principalmente em regies carentes.

Palavras-chave: Hemoglobinopatias, Hemoglobinas instveis. INTRODUO Mutaes que afetam os genes de globinas levam s hemoglobinopatias, que, genericamente, podem ser classificadas em dois grandes grupos: as alteraes de estrutura, com a formao de hemoglobinas (Hb) variantes, e as alteraes de sntese (talassemias), com a supresso parcial ou total de um ou mais tipos de cadeias globnicas; menos freqentemente, esses dois fentipos podem ocorrer em associao (ZAGO et al, 2004; COSTA et al, 2007; WENNING et al, 2007, apud in SONATI et al, 2008). A Organizao Mundial de Sade (OMS) estima que 5% da populao mundial seja portadora de algum tipo de anemia hereditria (BONINI-DOMINGOS et al, 2004). Dentre as hemoglobinopatias conhecidas, so descritas as hemoglobinas instveis, que constituem um grupo de alteraes genticas em que mutaes de aminocidos nas cadeias globnicas alfa ou beta afetam a estrutura da molcula, tornado-a instvel. As tcnicas especficas para o diagnstico laboratorial so: teste de desnaturao pelo calor (aquecimento da soluo do hemolisado entre 50-60 C), teste de desnaturao qumica ao isopropanol-trisHCL pH 7,4 (incubao com isopropanol-HCL a 37 C), ou agitao vigorosa do tubo contendo o hemolisado. Dessa forma, as hemoglobinas que se precipitam mais rapidamente do que as normais so denominadas instveis (NAOUM, 1997). As Hbs instveis formam um grupo de aproximadamente 150 tipos de Hbs anormais que causam anemias hemolticas, crnicas ou agudas de intensidade varivel (grave, moderada ou discreta), ictercia e presena de urina escura em seus portadores. So identificadas pela tendncia de se precipitarem quando submetidas ao calor, agitao intensa e/ou mtodos fsico-quimicos especficos (NAOUM et al, 2007). Fisiologicamente, a instabilizao da Hb decorre de uma ligao anormal entre as cadeias alfa e beta, provocando a desestabilizao das globinas; ou na regio interna da molcula que constitui o nicho do grupo heme, provocando o seu afrouxamento. As globinas desestabilizadas se precipitam e formam os corpos de Heinz (Figura 1) (AC&T). .

Figura 1: Corpos de Heinz precipitados em sangue de portador de Hb Instvel (AC&T)

Estes, por sua vez, fixam-se na membrana dos eritrcitos por duplas ligaes de enxofre, alterando-lhe a permeabilidade e a osmose, provocando, consequentemente, a sua destruio precoce e a anemia (AC&T) Devido grande diversidade dos pontos de mutaes por substituies e delees de aminocidos, as formas de instabilidade apresentam grande variabilidade funcional. Algumas hemoglobinas so discretamente instveis e no esto associadas a sintomas clnicos, enquanto outras se precipitam com grande intensidade, causando anemias hemolticas (BONINI-DOMINGOS, 1993). Essas anemias podem ser graves, com acentuada diminuio dos nveis de hemoglobina e reticulocitose, ou ento, podem se apresentar com discreto quadro hemoltico acompanhado por modesta reticulocitose. Uma das principais caractersticas das hemoglobinas instveis que causam anemia hemoltica a presena de corpos de Heinz. A grande maioria das hemoglobinas instveis descritas origina-se de trocas de aminocidos neutros, por exemplo, prolina por treonina, tirosina por leucina, etc. Essas substituies de aminocidos no causam alteraes de cargas eltricas e, portanto, no alteram o ponto isoeltrico da hemoglobina mutante. Por esta razo, dificilmente as hemoglobinas instveis apresentam posies eletroforticas ou cromatogrficas diferentes da HbA. O eritrograma mostra anemia varivel entre discreta e acentuada, VCM normal ou diminudo, HCM sempre diminudo, morfologia eritrocitria com presena de clulas mordidas e reticulocitose moderada a acentuada (NAOUM, 1997; NAOUM et al, 2007). A elevada prevalncia de hemoglobinopatias encontradas na populao brasileira acompanhada de morbimortalidade expressiva, e o fato de as anemias hereditrias serem, geralmente, mal diagnosticadas e tratadas de forma inadequada justificam a necessidade de investigao, por diferentes metodologias laboratoriais e estudo familiar para auxiliar no diagnstico precoce, possibilitando minimizar os sintomas decorrentes da hemoglobina

anormal e a realizao do aconselhamento gentico e educacional de portadores dessas alteraes hereditrias (SCHIAVETO et al, 2002). Mediante o apresentado e tendo em vista que, no existem em nosso pas programas populacionais de triagem para hemoglobinopatias oferecidos pelos servios de sade pblica, a presente pesquisa teve como objetivos: realizar uma triagem populacional de portadores de hemoglobinas instveis atravs de metodologias especficas e realizar o estudo familial dos portadores oferecendo-lhes aconselhamento gentico educacional. METERIAL E MTODOS 1- Casustica A amostra populacional estudada do Municpio de Trs Lagoas (MS) consistiu de indivduos do sexo masculino ou feminino de qualquer origem tnica ou social de diferentes sub-populaes: gestantes da Clnica da Mulher e do Projeto Municipal Colo de Me, prmaritais provenientes de cursos para noivos das Igrejas Nossa Senhora Aparecida e Catedral Sagrado Corao de Jesus e estudantes da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Todas as amostras de sangue foram coletadas em frascos estreis contendo EDTA a 5%, aps assinatura do participante ou de seu responsvel (no caso de menores de idade), de um Termo Consentimento Livre e Esclarecido, de acordo com a orientao do Comit de tica da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Os nicos critrios de excluso consistiram na recusa em participar da pesquisa e o conhecimento prvio de sua condio gentica. 2- Mtodos Aps a coleta, as amostras de sangue foram levadas ao Hemocentro da cidade de Trs Lagoas para a realizao do hemograma completo; e, em seguida, encaminhadas ao laboratrio de Gentica Mdica, onde foram realizadas as tcnicas hematolgicas adequadas ao diagnstico laboratorial de hemoglobinopatias hereditrias: anlise da morfologia eritrocitria em esfregao sangneo a fresco e posteriormente corados pela a tcnica de May-Grnwald; eletroforese em pH alcalino em gel de poliacrilamida em tampo Tris-Glicina, pH 8,0 pesquisa dos corpsculos de Heinz atravs da colorao com Azul Cresil Brilhante a 1% utilizando 50L de corante e 50L de sangue, aquecidos por trinta minutos em banho-maria a 37C, colocar 15L da soluo incubada no centro de uma lmina e

cobrir com lamnula pressionando levemente em um papel para retirar o excesso de amostra e por fim, examinar ao microscpio com objetiva de imerso;

teste de precipitao por isopropanol que faz algumas Hb instveis se precipitarem por
serem sensveis a produtos qumicos. O procedimento consiste em colocar 2mL de tampo Tris/isopropanol em tubo de ensaio e incubar por 5 minutos a 37C, adicionar

ao tampo incubado 200L de hemolisado, agitar o tubo por inverso, arrolhar com gase e incubar por 40 minutos a 37C observando se houve precipitao a cada 10 minutos (CARREL & KAY, 1972); teste de desnaturao pelo calor que consiste em colocar 1mL de sangue fresco em um tubo de hemlise, centrifugar a 1.500 rpm por 5 minutos e desprezar o plasma, centrifugar por duas vezes a 1.500 rpm por 5 minutos lavando os eritrcitrcitos com NaCl 0,85%, adicionar 5mL de gua destilada, homogeneizar por seis vezes por inverso, adicionar 5mL do tampo fosfato (pH 7,4), homogeneizar por seis vezes por inverso e centrifugar por 10 minutos a 1.500 rpm. Transferir 2mL do sobrenadante para um tubo de ensaio, arrolhar com gase e incuba-lo a 50-60C em banho-maria por uma hora observando se houve precipitao a cada 10 minutos (DACIE & LEWIS, 1985).
Ao trmino das atividades de triagem, todos os portadores de hemoglobinas anmalas receberam cartes de identificao como portadores da respectiva alterao diagnosticada, com algumas recomendaes e cuidados relativos sua condio (Figura 2).

Figura 2 Modelo do carto de identificao de portador do trao falciforme.

RESULTADOS E DISCUSSO No perodo de agosto de 2008 a julho de 2009 foram analisadas 123 amostras de sangue perifrico de diferentes grupos populacionais, destas 10 (8,10%) apresentaram alguma

anormalidade para as hemoglobinas instveis, 4 (3,3%) trao - talassmico, 3 (2,5%) trao talassmico, 1 (0,8%) Hb S/, 1(0,8%) Hb Lepore/, 1 (0,8%) Hb AJ, 1 (0.8%) trao falciforme, 1 (0,8%) Hb AC, 1 (0,8%) eliptocitose e 1 (0,8%) anemia ferropriva (Tabela 1). Tabela 1: Frequncia fenotpica da populao estudada
Total 140 120 100 80 60 40 20 0
10 8,1% 4 3 1 1 1 1 1 1 1 3,3% 2,5% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% 123 100%

Anormalidade para Hbs instveis Trao beta- talassmico Trao alfa- talassmico Hb S/beta Hb Lepore/beta Hb AJ Trao Falciforme Hb AC Eliptocitose Anemia ferropriva

Alterao das Hemoglobinas

Dentre as 10 amostras com certo grau de instabilidade, dois (1,62%) apresentaram positividade para todos os testes especficos, ou seja, pesquisa de corpsculos de Heinz, testes de desnaturao por isopropanol e pelo calor; um (0,81%) para corpsculo de Heinz e desnaturao por isopropanol; dois (1,62%) apenas por isopropanol e 5 (4.05%) somente para corpsculos de Heinz (Grfico 1). GRFICO 1: Distribuio dos diferentes nveis de instabilidade encontrados.

1,62%

Todos os testes Corp. de Heinz e desn por isopropanol

4,05% 1,62%

0,81%

Desn por isopropanol Corp. de Heinz

Por serem as hemoglobinopatias de maior dificuldade diagnstica, so fundamentais para o seu diagnstico adequado as informaes clnicas do paciente, com destaque para processo hemoltico (NAOUM, 1997). Por isso, aps a assinatura do TCLE, foi aplicado um questionrio para obteno de informaes hematolgicas e um breve histrico clnico do indivduo e de sua famlia, relatado pelo prprio. E, atravs dessas informaes foi possvel o esclarecimento da condio e orientao de um dos portadores de Hb instvel, que reclamara de anemia recorrente e por anos foi diagnosticada e tratada erroneamente como portadora de anemia ferropriva. Os resultados demonstram a importncia da continuao e ampliao de tais programas populacionais, os quais esto restritos a pouqussimos centros em nosso pas. CONCLUSES O presente estudo permitiu chegar-se s seguintes concluses: (1) a frequncia total de qualquer grau de instabilidade hemoglobnica na amostra do presente estudo foi de 8,10%, portanto, bastante significativa em termos de triagem populacional para este tipo de doena; (2) a importncia de um diagnstico adequado para hemoglobinopatias hereditrias evitando interpretaes e tratamentos clnicos equivocados e (3) a importncia de aumentar os centros especializados bem como a quantidade de pessoal capacitado para diagnstico e acompanhamento de portadores de anemias hereditrias na rede de Sade. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS SONATI, M.F.; COSTA, F.F. The genetics of blood disorders: hereditary hemoglobinopathies. J Pediatr (Rio J). 2008;84(4 Suppl): S40-51.doi:10.2223/JPED.1802

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