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AFINIDADES ASITICAS Y RADIACIN CONTINENTAL DE LOS CUATRO GRUPOS FUNDADORES DE ADNmt AMERINDIOS. Antonio Torroni, Theodore G. Schurr, M.F.

Cabell, Michael D. Brown, J.V. Neel, Merethe Larsen, David G. Smith, Carlos M. Vullo, y Douglas C. Wallace.

Asian affinities and continental radiation of the four founding Native American mtDNAs. Publicado en: American Journal of Human Genetics, 53: 563-590. 1993. Traducido por Pablo Mones
Resumen: Se examin por anlisis con endonucleasas de restriccin la variacin en el ADNmt de 321 individuos pertenecientes a 17 poblaciones americanas nativas. A partir de distintas fuentes se amplific el ADNmt por PCR. En un subgrupo compuesto por 38 individuos se secuenci la regin del D-loop (regin hipervariable). Los datos resultantes fueron combinados con datos previos de ADNmt provenientes de otras 5 tribus americanas nativas, como as tambin con varias poblaciones asiticas, y fueron utilizados para deducir las relaciones filogenticas entre los ADNmt, y tambin para estimar la divergencia de secuencias. Este anlisis revel la presencia de 4 grupos de haplotipos (haplogrupos A, B, C y D) en los Amerindios, pero solamente 1 (haplogrupo A) en los Na-Dene, y confirm el origen independiente de los Amerindios y NaDene. Se debe aadir que cada haplogrupo parece haber sido fundado por un nico haplotipo de ADNmt, resultado concordante con un hipottico efecto fundador. La mayor parte de la variacin dentro de los haplogrupos era especfica de cada tribu, o sea que los haplogrupos aparecan como polimorfismos particulares. Estas observaciones sugieren un comienzo temprano de tribalizacin en los Amerindios, con un proceso de intercambio gentico posterior relativamente pequeo. La secuenciacin de los 341 nucletidos en el D-loop del ADNmt revel que la variacin de las secuencias est fuertemente correlacionada con los 4 haplogrupos definidos por anlisis de restriccin, sealando que la variacin en el D-loop, en forma similar a la variacin de haplotipos, surgi predominantemente luego de la migracin de los Amerindios ancestrales a travs del puente terrestre de Bering. ________________________________________________________________________________________ Amerindios llegando a Amrica mucho antes que los Na-Dene. Utilizando el rango publicado de Introduccin: estimaciones de tasa de divergencia del ADNmt, y el grado de diversidad encontrado en los Amerindios y Diversas evidencias independientes sugieren Na-Dene, concluimos que la diversidad de ADNmt de que los humanos colonizaron las Amricas en ms de los Amerindios era compatible con una colonizacin una oleada migratoria. De acuerdo a un modelo an del Nuevo Mundo en una etapa pre-Clovis (Schurr et controvertido, la colonizacin del Nuevo Mundo se al 1990; Torroni et al 1992; Wallace y Torroni 1992). habra dado de forma tripartita, donde tres poblaciones Los datos de ADNmt dados por Schurr et al gentica y lingsticamente separadas contribuyeron , (1990) han sido utilizados para un anlisis terico en orden de entrada, a los Paleo-indios (hablantes (Chakraborty y Weiss, 1991) que concluy que los ancestrales amerindios), los Na-Dene, y los Aleutohaplotipos de ADNmt estaban en equilibrio entre Esquimales (Greenberg et al 1986; Greenberg 1987). mutacin y deriva gentica. La existencia de dicho Muchos americanistas no concuerdan con la equilibrio hara imposible determinar si un haplotipo clasificacin lingstica de Greenberg y utilizan la de dado de ADNmt era fundador, una mutacin, o si Campbell y Mithun (1979). haba sido perdido debido a la deriva. Sin embargo, los Estudios previos de polimorfismos de sitios de resultados de anlisis experimentales ms detallados de restriccin del ADNmt de americanos nativos las mismas muestras poblacionales parecen no apoyar revelaron que los indgenas derivaban de cuatro la existencia de dicho equilibrio (Torroni et al, 1992). haplotipos independientes, sugiriendo que estas En 1991, Ward y colaboradores comunicaron poblaciones haban derivado de un nmero limitado de las secuencias del D-loop de ADNmt de 63 Nuu-Chahmigraciones. Ms an, la diversidad de las secuencias Nulth (Nootka). Se encontraron 28 secuencias distintas del ADNmt de los Amerindios y Na-Dene sugera que de D-loop definidas por 26 nucletidos variables. En se habran originado a partir de migraciones diferentes contraposicin con nuestros resultados, estos autores (Shields et al 1992; Torroni et al 1992), con los

concluan que el grado de variacin de secuencia que se encontraba en el ADNmt de los Americanos Nativos no era compatible con un nmero limitado de linajes fundadores, y que la diversidad global del ADNmt de los Americanos Nativos (AN) era similar a la existente en Asia. Para aclarar el punto referente al nmero y naturaleza de las migraciones de los AN hemos analizado la variacin en los sitios de restriccin de 15 tribus Amerindias y 2 Na-Dene . En esta muestra ms extensa se encontraron los mismos 4 grupos de haplogrupos relacionados, confirmando la naturaleza genticamente distinta de las poblaciones Amerindias y Na-Dene. Confirmando esto, al secuenciar el D-loop del ADNmt de cada haplogrupo, se encontr que estas secuencias tambin se agrupaban en los mismos 4 grupos. Como nuestra secuencias del D-loop comprenden toda la variacin detectada por Ward et al (1991) aparentemente este no habra llegado a percibir la subestructura poblacional subyacente y por lo tanto sobrestim la diversidad en secuencia y la edad de los linajes de ADNmt de los AN. Los datos sobre la variacin en ADNmt en AN presentados en este artculo estn complementados por los datos presentados en el artculo que lo acompaa, sobre variacin del ADNmt en poblaciones Siberianas aborgenes. El artculo sobre Siberia muestra que, si bien las poblaciones Siberianas y las de AN derivan de haplotipos fundadores de ADNmt comunes, la radiacin gentica a partir de los mismos se dio en forma independiente en cada continente (Torroni et al 1993). Esto indica que la divergencia de haplogrupos en los AN ocurri desde que estos arribaron a las Amricas, lo que apoya observaciones previas de que las profundas divergencias intertribales en el ADNmt surgieron a partir de la llegada de los Amerindios ancestrales (Noel, 1980). Utilizando tasas evolutivas conocidas del ADNmt, hemos concluido que los primeros americanos llegaron antes que la cultura ltica de Clovis, pero bastante despus que la fecha de divergencia del ADNmt estimada por Ward et al (1991). Materiales y Mtodos Poblacin Analizada Las 361 muestras de sangre analizadas eran una muestra al azar de una coleccin mayor de muestras de AN obtenidas a partir de 311amerindios y 50 Na-Dene. Las ubicaciones de las 17 tribus Amerindias y las 2 Na-Dene analizadas en este artculo se ven en la fig.1, junto con 3 tribus Amerindias y las 2 Na-Dene que haban sido analizadas previamente (Torroni et al, 1992). En la Tabla 1 [VER TABLAS AL FINAL DEL TRABAJO]

se presenta una lista de todas las tribus analizadas y sus referencias. Aunque controvertida (Nichols 1990) se sigue la terminologa lingstica de Greenberg (1987) (ver Campbell y Mithun, 1979, para una clasificacin lingstica alternativa). Informacin sobre los temas no citados en este estudio concernientes a esas tribus se puede encontrar en dichas publicaciones previas. Las muestras tribales no descriptas anteriormente en ninguna de nuestras publicaciones son las siguientes: Bella Coola (amerindios) - Los Bella Coola habitan la costa sur de la Columbia Britnica. En base a las frecuencias de haplotipos Gm, Field et al (1988) estimaron una mezcla Caucsica del 12%. Las 25 muestras utilizadas en este estudio fueron seleccionadas a partir de una muestra al azar de 132 individuos del pueblo de Bella Coola (790 residentes), donde cada sujeto representara a una de las 132 familias que all viven. Nuu-Chah-Nulth (amerindios) - Los NuuChah-Nulth viven en la isla de Vancouver, en la Columbia Britnica. Un anlisis de marcadores de grupos sanguneos de los mismos haba indicado una mezcla Caucsica menor al 5% (Ward et al, 1991). El ADNmt analizado en el presente artculo est formado por una muestra de 15 individuos no relacionados. Ojibwa (amerindios) - Los Ojibwa (llamados Chipewa en los EEUU) viven en Amrica del Norte en torno a los Grandes Lagos. Anlisis previos de grupos sanguneos indicaban un 30% de mezcla Caucsica (Szathmary et al 1974, Szathmary 1984). Se seleccionaron al azar 28 sujetos a partir de 231 muestras provedas por varias clnicas y puestos de enfermera (Angling Lake, Eagle Lake, Frenchmans Head, Fort Hope, Kejica, Landsdownw House, Summer Hill, Sachigo Lake, etc.) ubicados en la regin noroeste de Ontario. 8 muestras representaban a Ojibwas del Sudeste y fueron tomadas al azar a partir de 95 muestras recolectadas en el Centro de Salud de la Comunidad de Lac Courte Oreilles en Hayward, WI. 7 muestras eran Ojibwas Salteaux de la Reserva Turtle Mountain y fueron tomados al azar a partir de 189 tomas colectadas en el Hospital Pblico de Servicios Indgenas en Belcourt, ND. Todas las muestras fueron tomadas a partir de pacientes no relacionados y que declararon ser totalmente indgenas. Mataco (amerindios) - Los Mataco viven en la zona Norte del Chaco, Argentina. En el pasado vivan en grupos de 50-60 individuos donde la endogamia era predominante. Actualmente se han sedentarizado y son unos 14.000 16.000 individuos. Los sujetos analizados en este estudio fueron tomados al azar a partir de un nmero mayor recolectado en el pueblo El Sauzalito (aproximadamente 700 habitantes), ubicado en la ribera sudoeste del Ro Bermejo, Provincia de El Chaco. Debido al alto grado de endogamia no fue posible tomar individuos que

estuviesen totalmente no relacionados. Sin embargo, a los efectos de disminuir la endogamia de la muestra, se excluyeron de la misma a hermanos y primos hermanos (Vullo et al. 1984). Haida (Na-Dene) Viven en la Isla de la Reina Carlota, en la Columbia Britnica. Sobre la base de evidencia lingstica, se postula que pertenecen a los Na-Dene , y que estn relacionados con los Atapascoss (Campbell y Mitchum 1979; Greenberg 1987), aunque su asociacin con los hablantes NaDene es controvertida (Krauss 1964; Levine 1979). En base a las frecuencias de los haplotipos Gm en este grupo, Field et al (1988) estimaron una mezcla Caucsica del 20%. Estas muestras fueron tomadas para estudios biomdicos a partir de 2 comunidades (Goffen et al 1975). Los 25 sujetos analizados en este trabajo fueron tomados al azar a partir de una muestra inicial de 238 voluntarios mayores de 30 aos pertenecientes a la comunidad. Apache (Na-Dene) Los Apaches son un grupo de tribus Na-Dene sureas (Jicarillo, Lipan, Apaches Kiowa, Apaches Occidentales, Mescalero y Chiricaua) que estn lingsticamente relacionados con los Na-Dene de Canad y Alaska (Spencer et al 1977). Junto con los Navajo, se originaron a partir de pueblos que migraron desde el noroeste de Canad al sudoeste de los EEUU despus del 1.000 D.C. (Haskell 1987). Se ha confirmado la existencia de mestizaje con los Amerindios vecinos (mayormente Pimas y Pueblos) por la presencia de haplotipos Gm (Williams et al 1985) y variantes de albmina, como la Albmina Mxico, que son propias de los Amerindios del Sudoeste pero estn ausentes en los Na-Dene del Norte (Schell y Blumberg 1988). En 1977 haban aproximadamente 15.000 Apaches (Spencer et al 1977) Las muestras fueron tomadas en la reserva San Carlos a partir de miembros del grupo San Carlos, que es una divisin de la tribu Apache Occidental. Nuestros individuos provienen de una muestra al azar realizada en 1973 entre 569 voluntarios adultos mayores de 35 aos. Preparacin de Muestras. El ADNmt de los Bella-Coola, los NuuChah-Nulth, los Haida, los Apaches de San Carlos y de 15 de los 43 Ojibwa (8 de Wisconsin y 7 de Dakota del Norte) fue extrado de plaquetas presentes en pequeas alcuotas (20-50ul) de plasma. Se extrajo ADN total de todos los Amerindios de Centro y Sud Amrica, exceptuando los Matacos, a partir de glbulos blancos presentes en el lavado de pellets de glbulos rojos(0.5 - 4.0 ml). Estas muestras de sangre fueron tomadas entre 15 y 25 aos atrs, y posteriormente almacenadas en nitrgeno lquido. El ADN total de los Matacos y de los 28 Ojibwa del Norte de Ontario fueron extrados a partir de buffy

coats siguiendo el procedimiento de Torroni et al (1992). Tcnicas de Gentica Molecular. El ADNmt de los 256 Amerindios (28 Ojibwa del Norte de Ontario y 228 muestras de Centro y Sud Amrica) fueron amplificadas por PCR (Saiki et al 1985) en 9 segmentos parcialmente sobrepuestos. Los primers (cebadores) y condiciones del PCR son los de Torroni et al (1992). Cada segmento de PCR fue posteriormente digerido con las siguientes 14 enzimas: AluI, AvaII, BamHI, DdeI, HaeII, HaeIII, HhaI, HinfI, HincII, HpaI, HpaII/MspI, MboI, RsaI y TaqI. La combinacin de estas endonucleasas permite examinar aproximadamente el 15-20% de la secuencia del ADNmt de cada individuo. Los fragmentos de restriccin resultantes fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa SeaKen al 1% ms NuSieve al 1.0-2.5% (FMC BioProducts), visualizados con bromuro de etidio y mapeados por el mtodo de comparacin de secuencias (Johnson et al 1983, Cann et al 1984). Este anlisis con 14 endonucleasas gener haplotipos completos para cada ADNmt (Tabla 2 y Apndice).NOTA: no se muestra la Tabla 2, que contiene haplogrupo por haplogrupo, los haplotipos y la cantidad de individuos de cada tribu que lo presenta. Tampoco se muestra ele Apndice, que muestra los sitios de restriccin analizados en 92 haplotipos) Debido a que el ADN extrado del plasma result ser de pobre calidad, en 105 individuos no fue posible amplificar grandes segmentos por PCR y as definir su haplotipo completo (Bella-Coola, NuuChah-Nulth, Haida, Apaches y 15 Ojibwa de Wisconsin y Dakota del Norte). Sin embargo, como en estos individuos se pudieron amplificar por PCR fragmentos de 200-400pb sin inconvenientes, se los pudo examinar para las siguientes 8 mutaciones, caractersticas del ADNmt de los Americanos Nativos (Schurr et al 1990, Torroni et al 1992): +HaeIII np663; -AluI np 5.176; delecin 9pb COII ARNtLys; +DdeI np10.394: +AluI np10.397; -HincII np13.259 / +AluI np13.262; -RsaI np16.329 y +HaeII np16.517. Para cada muestra subptima, 6 segmentos pequeos con las mutaciones caractersticas se amplificaron por PCR y se digirieron con las endonucleasas correspondientes. En la Tabla 3 se ven los primers y las condiciones del PCR. Luego de la digestin con endonucleasas, los fragmentos de restriccin resultantes fuero analizados por electroforesis en geles de agarosa SeaKen y Nu Sieve y visualizados por fluorescencia inducida por UV. Este procedimiento gener haplotipos parciales para cada ADNmt sobre la base de 8 sitios de restriccin polimrficos (Tabla 4). NOTA: no se muestra la Tabla 4, que peresenta haplohrupo por haplotrupo, y por

mutaci{on, la cantidad de individuos que la presentan en cada poblacin). La secuenciacin de un segmento de 341pb (np 16.030 16.370) de la regin de control mitocondrial (D-loop) de 38 ADNmt de Americanos Nativos y 11 individuos del Este Asitico fue realizadas segn Schoffner et al (1990) y Brown et al (1992). Un segmento de doble hebra fue generado por PCR a partir de primers ubicados en la hebra liviana en np15.723 (L15.723) y en la pesada en np 221 (H221) a una TH de 47C, con todos los primers numerados de acuerdo a la secuencia de Anderson et al (1981). A partir de este segmento se realiz un PCR asimtrico utilizando los siguientes primers y temperaturas de unin, con el primer primer listado en primer lugar: (1) L15.723 y H16.344 (TH = 49C); (2) L15.813 y H16.527 (TH = 51C ) y (3) L 15.997 y H16.527 (TH = 55C). Los siguientes primers fueron utilizados para secuenciar el ADNmt monohebra generado por el PCR asimtrico: (1) L15.997; (2) L16.048; (3) L16.128; (4) H16.242; (5) H16.344 y (6) H16.401. Las muestras de Americanos Nativos que fueron sometidas a la etapa adicional de secuenciacin del D-loop fueron tomadas al azar entre cada uno de los haplogrupos presentes en la poblacin. A los efectos de aumentar la capacidad de deteccin de variaciones en la secuencia, se eligieron las tribus con mayor dispersin geogrfica. De las tribus seleccionadas se tomaron 1 o 2 ADNmt de cada uno de los haplogrupos presentes en la poblacin. Las muestras del Este Asitico sometidas a secuenciacin fueron seleccionadas a partir de ADNmt pertenecientes a los mismos haplogrupos (A, B, C, D) que los Americanos Nativos. Anlisis Filogentico Las relaciones evolutivas entre los haplotipos de los Americanos Nativos (fig. 2) y entre los haplotipos de los Americanos Nativos y Asiticos fueron inferidos por anlisis de parsimonia con PAUP (versin 3.0s; Swofford 1992). Para cada anlisis se generaron rboles de mxima parsimonia (MP) por adicin de secuencias al azar utilizando los algoritmos de Reconexin y Biseccin de rboles (Tree Bisection and Reconection, TBR) y de Intercambio con el Vecino mas Prximo (Nearest-Neighbor Interchange, NNI). Debido al alto nmero de taxones terminales, se podan obtener miles de rboles MP con ambos mtodos. Concluimos el anlisis luego de 1.500 replicaciones y 3.000 rboles, guardando no ms de 10 rboles MP para cada replicacin. Aproximadamente 2.600 de los 3.000 rboles fueron obtenidos en las primeras 1.000 replicaciones. En la mayora de las replicaciones restantes, se descartaron los rboles MP al ser idnticos a los ya guardados, lo que sugera que

la mayora de los 3.000 rboles generados representaran una importante porcin de los rboles MP existentes. Sin embargo, la posibilidad de la existencia de rboles menores no puede ser descartada. En todos los casos, los rboles MP generados por TBR y NNI eran de la misma longitud. Tambin se obtuvieron rboles de consenso estricto a partir de los 3.000 rboles MP generados por TBR y NNI. Los rboles consenso son sumatorias jerrquicas de la informacin comn a un grupo de rboles MP. Un rbol de consenso estricto contiene solamente aquellos grupos que aparecen en todos los rboles MP (Sokal y Rohlf 1981). En los rboles consenso, aquellos generados por el TBR eran siempre varios pasos mas cortos que los producidos por el mtodo NNI, y por lo tanto presentan ndices de Consistencia (IC) y de Retencin (IR) mayores. Sin embargo, a pesar de ello, los dos mtodos arrojan rboles de topologa muy similar. El IC para todos los caracteres (mutaciones) de un rbol se puede considerar como: (longitud mnima del rbol)/(longitud observada). Si el IC = 1, los caracteres no tienen homoplasia. Si IC = 0.5, hay el doble de pasos respecto al nmero mnimo necesario, y as sucesivamente. El IR para todos los caracteres de un rbol se calcula como: [(longitud mxima posible del rbol longitud actual del rbol)/(longitud mxima posible del rbol longitud mnima posible del rbol)]. Si los caracteres en los datos son perfectamente congruentes unos con otros y con el rbol, el IR tendr un valor de 1. El IR tendr valor 0 si los datos tienen la homoplasia mxima (Maddison y Maddison 1992). Todos los dendogramas se realizaron tomando a un haplotipo Africano como control. Este fue obtenido a partir de ADN Senegals, analizado en nuestro laboratorio, y se caracteriza por la presencia de un sitio HpaI en np3.592 (ver apndice). Este sitio define a los haplotipos especficamente Africanos y se observa en el 70-100% de los Africanos subSaharianos, pero est ausente en Asiticos y Europeos (HpaI morfo-3: Denaro et al 1981; Cann et al 1987; Scozzari et al 1988). Las relaciones evolutivas entre secuencias de D-loop de Americanos Nativos y del Este Asitico fueron determinadas en forma similar a travs de anlisis de parsimonia (fig. 4).[ NOTA: no se muestra esta figura. ]Estos dendogramas fueron generados por adicin al azar utilizando el algoritmo TBR y se coloc como raz del arbol, la la secuencia de D-loop de un !Kung (sujeto 1: Vigilant et al 1989). Al igual que para los haplotipos, aunque no se obtuvieron rboles mas cortos, estos podran existir, y tambi{en se obtuvo un gran nmero de rboles MP. Estimaciones de Divergencia de Secuencias. Se calcularon las estimaciones de divergencia de secuencias intragrupales por anlisis de restriccin

utilizando el programa DREST (cedido por L. Jin). Este programa considera la relacin de sitios de restriccin compartidos entre 2 haplotipos, as como la longitud media de las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restriccin, para calcular una estimacin inicial de (probabilidad de que 2 ADNmt tengan nucletidos diferentes en una posicin dada). Cuando se utiliza este valor inicial, se resuelve de forma iterativa utilizando la ecuacin 28, y la divergencia de secuencias () es estimada utilizando la ecuacin 21 (Nei y Tajima 1983). Para calcular el tiempo de divergencia de los haplotipos se utiliz una tasa evolutiva del ADNmt del 2%-4% por milln de aos (MYR) (Stoneking et al 1986; Cann et al 1987; Wallace et al 1987). Esta tasa evolutiva estndar del ADNmt humano no incorpora ningn elemento de varianza. Por lo tanto, un intervalo de confianza del 95% para la tasa de evolucin sera considerablemente amplio. Resultados. Se observaron 49 haplotipos diferentes de ADNmt entre los 216 Amerindios cuyo ADNmt fue caracterizado con el juego completo de 14 endonucleasas. En un anlisis previo de 167 Amerindios y Na-Dene se haban identificado 50 haplotipos (Torroni et al 1992). Como en ambos estudios se observaron 7 haplotipos idnticos, se identificaron un total de 92 haplotipos de ADNmt de Americanos Nativos en un total de 383 Americanos Nativos (AM1-AM63; AM65-AM70 y AM74-AM96) (TablaTabla 2 y apndice). Estos haplotipos estn definidos por 109 sitios de restriccin polimrficos y la delecin intergnica de 9-bp COII/tRNALys (Cann y Wilson 1983; Horai y Matsunaga 1986; Wrischnik et al. 1987; Hertzberg et al. 1989; Schurr et al. 1990). Haplogrupos de ADNmt Amerindios El anlisis del ADNmt de Americanos Nativos confirm que pertenecen a 4 haplogrupos bien definidos, A, B, C y D, cada uno de los cuales est definido por asociaciones especficas de distintos polimorfismos para enzimas de restriccin (TablaTabla 2). En la figura 2 se muestran las relaciones genticas entre estos haplogrupos. Los datos de entrada para la figura 2 muestran uno de los rboles obtenidos por mxima parsimonia (MP), generados por TBR y NNI. Los rboles de MP obtenidos con ambos algoritmos tenan una longitud de 134 pasos mutacionales, con un IC de .593 y un IR de .911. Tambin se generaron rboles de consenso estricto de los 3.000 MP. El rbol que se muestra en la figura 2 fue obtenido con el mtodo de TBR, y tiene una longitud de 166 mutaciones, un IC de .372 y un IR de .780. Mas all de algunas relaciones no del todo

resueltas entre los haplotipos del grupo A en el dendograma consenso, la estructura general de los rboles MP y consenso es muy similar y est definida por la presencia de los 4 haplogrupos. Todos los haplotipos del grupo A en Amerindios (AM1-AM12 y AM51-AM63) se definen por una transicin AG en np 663 que promueve la adquisicin de un sitio HaeII en esa posicin. Los haplotipos del grupo B (AM13-AM27 y AM65-AM70) se caracterizan por una delecin de 9pb entre np 8.2728.289 que siempre se ha encontrado asociada a la adquisicin de un sitio HaeIII en 16.517. Los haplotipos Amerindios del grupo C (AM30-AM43 y AM77-AM87) se caracterizan por una transicin AG en np 13.263 que junto con la eliminacin de un sitio HincII en np 13.259 crea simultneamente un sitio AluI en np13.262. Esta mutacin est prcticamente siempre asociada con dos cambios nucleotdicos que se encuentran exclusivamente en poblaciones Asiticas o derivadas de las mismas: una transicin AG en np 10.398 que crea un sitio DdeI en 10.394, y una transicin CT en np 10.400 que crea un sitio AluI en 10.397 (Ballinger et al. 1992). Finalmente, los haplotipos del grupo D (AM44-AM50; AM88-AM96) se definen por una transversin CA en np 5.178 que elimina un sitio AluI en np 5.176. Al igual que los haplotipos del grupo C, el grupo D tambin presenta la adquisicin de un sitio DdeI en np 10.394 y un AluI en np 10.397. Con la excepcin de 5 haplotipos, los restantes 91 correspondan a los haplogrupos A, B, C y D (fig. 2). Los haplotipos AM28, AM29 y AM74-76 carecan de las mutaciones tpicamente Amerindias y probablemente representen ADNmt europeo. Por ejemplo, el haplotipo AM28, encontrado en un Maya, se caracterizaba por la prdida de un sitio AluI en np 7.025 y la adquisicin de un sitio HaeIII en 16.517. Este mismo haplotipo se encuentra en el 10% de los ADNmt Caucsicos, pero aumenta al 30% en Caucsicos si se incluyen los haplotipos derivados de AM28 (Schoffner et al, en prensa). Los haplotipos AM29, AM74, AM75 y AM76 han sido observados exclusivamente en los Ojibwa del Norte de Ontario, donde estn presentes en un 25% de las muestras analizadas. La nica excepcin est constituida por el haplotipo AM29, compartido por Navajos y Ojibwas. Estos 4 haplotipos se caracterizan por la prdida de un sitio DdeI en np1.715 y la ganancia simultnea de un sitio HaeIII en np 16.517, y en los dendogramas de Americanos Nativos se agrupan en forma conjunta (fig. 2). Se ha informado la existencia de haplotipos con las mismas mutaciones en baja frecuencia en una poblacin de Caucsicos mixtos de los EEUU (Schoffner et al., en prensa) y estn ausentes en los Siberianos aborgenes (Torroni et al. 1993).

Datos previos obtenidos a travs de anlisis de genes nucleares indicaban que el grado de mezcla con Europeos detectable en tres poblaciones Ojibwa vara entre el 3 y el 30% (Szathmary 1984). La fuente de flujo gnico hacia los Ojibwa mas probable seran los Franceses o los Britnicos que se asentaron en la regin desde el comienzo de la migracin Europea a la costa Noreste Norteamericana (Spencer et al. 1977). Nuestro anlisis gentico corrobora la idea de que hubo un extenso flujo gnico de los Europeos hacia las comunidades Ojibwas. Sin embargo, los 4 haplotipos caucsicos observados en los Ojibwas estn fuertemente relacionados entre s, pero no son frecuentes en muestras de Caucsicos en los EEUU (1.6%, Shoffner et al, en prensa.). Esto sugiere que fueron adquiridos por los Ojibwa a partir de mujeres Caucsicas pertenecientes a una subpoblacin Europea donde esos haplotipos tendran una frecuencia particularmente alta. Para aclarar el origen se necesitan ms anlisis de grupos Ojibwas y Caucsicos que vivan en la regin. El anlisis parcial de los haplotipos de los Bella Coola, Nuu-Chah-Nulth y los 15 Ojibwa de Wisconsin y Dakota del Norte corrobora la existencia de 4 haplogrupos Amerindios de ADNmt (Tabla 4). En los Bella Coola y los Nuu-Chah-Nulth se observaron ADNmt de los 4 haplogrupos, mientras en los Ojibwa estaba ausente el grupo D. La frecuencia de haplotipos pertenecientes al grupo otros, que no posee las mutaciones caractersticas de los Americanos Nativos tambin fue particularmente alta entre los Ojibwa sureos (26.7%), y estos ADNmt estaban presentes en frecuencias del 13.3% y 4.0% en los Nuu-Chah-Nulth y los Bella Coola respectivamente. Estas frecuencias parecen sugerir que en las poblaciones analizadas el grado de mezcla gentica Caucsica sera mayor en las tribus Amerindias del Norte que en las tribus ms aisladas de Centro y Sudamrica. La coherencia de los 4 haplogrupos nativos americanos se confirm cuando los rboles de MP derivados de los 92 haplotipos de Americanos Nativos se combinaron con 106 haplotipos del Este Asitico (AS17-AS122) identificados por otros en 153 individuos pertenecientes a 7 poblaciones (Ballinger et al. 1992) (fig. 3). La figura 3 representa un rbol MP, con una longitud de 348 pasoss, generado por el mtodo TBR, con un IC de .460 y un IR de .814. El rbol consenso obtenido a partir de 3.000 rboles MP se muestra en el inserto de la figura 3. Sin embargo, en el rbol consenso la mayora de las relaciones entre haplotipos permanecan sin resolver, indicando que el anlisis de parsimonia no es capaz de resolver adecuadamente las relaciones entre grupos cuando el nmero de taxones y caracteres es particularmente grande (Hedges et al. 1991; Templeton 1991). En todo

los rboles de MP, incluyendo la figura 3, prcticamente todos los haplotipos de los 4 haplogrupos de Americanos Nativos (A, B, C y D) permanecen juntos y se agrupan con los haplotipos asiticos caracterizados por las mismas mutaciones. En la figura 3, la excepcin la representa el haplotipo AM83, un ADNmt del haplogrupo C observado en un Makiritare que no segregaba con dicho haplogrupo. La posicin anmala de AM83 se debe a la reversin de la prdida del sitio HincII np 13.259 y ganancia de AluI np 13.262. Sin embargo, este haplotipo comparte varias mutaciones con el haplotipo AM82, perteneciente al haplogrupo C, que tambin estaba presente en los Makiritare. Haplotipos de ADNmt de los Na-Dene. Los resultados de un estudio previo de variacin de ADNmt en Americanos Nativos (Torroni et al. 1992) apoyaban la hiptesis que sostena que los Na-Dene se habran originado a partir de una migracin mas reciente e independiente de la que habra dado origen a los Amerindios (Greenberg et al. 1986). Incluso, se propuso que estos Na-Dene ancestrales habran trado de Siberia nicamente haplotipos del grupo A. S es verdadera, esta hiptesis implica que los Na-Dene de Canad y Siberia seran los descendientes ms directos de esos migrantes. Adems, tambin se propuso que la transicin AG en np 16.331 que provocaba la prdida del sitio RsaI en np 16.329 sera especfica de los Na-Dene, ya que se encuentra en el ADNmt del 27% de los Navajo, 26,7% de los Dogrib, 1 de 2 Tlingit, 1 de 22 Athapaskan de Alaska, pero no se observa en ningn ADNmt Amerindio (Shields et al. 1992; Torroni et al. 1992). El anlisis del ADNmt de dos tribus Na-Dene adicionales, los Haida y los Apache, permiti un examen mas profundo de la variacin del ADNmt en este grupo. Se examinaron los ADNmt de ambas tribus para buscar las 8 mutaciones que definen a los haplogrupos de los Americanos Nativos (Tabla 4). Los datos resultantes apoyan la hiptesis de que el ADNmt de los Na-Dene est formado nicamente por el haplogrupo A. La primer tribu analizada, la Haida, presentaba una frecuencia del haplogrupo A del 96%, similar a la de los Dogrib Canadienses (Torroni et al. 1992). Sin embargo, un estudio previo de las frecuencias de los alotipos Gm y Km en los Haida sugera que esta tribu podra derivar de una amalgama de Na-Dene y Amerindios (Field et al. 1988). A los efectos de verificar esta hiptesis, comparamos el ADNmt de los Haida con el de dos grupos Amerindios, los Nuu-Chah-Nulth y los Bella Coola. Estas dos poblaciones estn geogrfica y culturalmente muy prximas a los Haida (Spencer et al. 1977) y, junto con otras poblaciones Amerindias que viven en la regin,

se podran haber mezclado con esta tribu. La comparacin mostr que el ADNmt de los haplogrupos B, C y D representaba el 4% del total de los ADNmt de los Haida, pero eran un 43,2% del total de los Nuu-Chah-Nulth y los Bella Coola (Tabla 4). A partir de estas frecuencias, se estim el total del flujo gnico de los Amerindios hacia los Haida en un 9,3% (Bernstein 1931). Este resultado sugiere que los Haida seran una poblacin Na-Dene que habra experimentado una mezcla gentica limitada con los Amerindios. En forma alternativa, dicha mezcla podra haber sido dada bsicamente por hombres Amerindios. Los Haida tambin difieren de las otras tribus NaDene en la ausencia de la prdida del sitio RsaI en np 16.329 en sus ADNmt del grupo A. Una explicacin de este hecho sera que en la poblacin Na-Dene ancestral estara presente el ADNmt carente del sitio RsaI, pero el mismo habra sido perdido por deriva gentica durante el proceso de diferenciacin de los Haida. Una explicacin alternativa sera que la prdida del sitio RsaI np 16.329, especfica de los NaDene, podra haber tenido lugar luego de la separacin de los Haida ancestrales de los Na-Dene. Este ltimo escenario aparece como el ms probable ya que esta mutacin est ausente en el ADNmt de los Siberianos aborgenes (Shields et al. 1992; Torroni et al. 1993), indicando que la prdida del sitio RsaI habra tenido lugar en Amrica durante la diferenciacin gentica de las tribus Na-Dene. Incluso, es de hacer notar que de todas las tribus Na-Dene, los Haida son los ms divergentes lingsticamente (Krauss 1964; Levine 1979). Por lo tanto probablemente se hayan separado de los otros Na-Dene antes de la ocurrencia de la prdida del sitio RsaI np 16329. La segunda tribu Na-Dene examinada en su ADNmt fuer la Apache de San Carlos. El ADNmt de esta poblacin est relacionado en forma directa y sin ambigedades con el de otros hablantes Na-Dene. Como los Navajo, la mayora (64%) del ADNmt de los Apache perteneca al haplogrupo A, y 28% del ADNmt del grupo A de los Apache tenan la mutacin de RsaI en np 16.329 (Tabla 4). El restante 36% del ADNmt de los Apaches perteneca a los haplogrupos B, C y D. Este hallazgo implica que, tal como los Navajo, los Apache se han mezclado con los pueblos amerindios vecinos. Datos previos de ADNmt (Torroni et al. 1992), al igual que (a) la presencia de haplotipos Gm (Williams et al. 1985) y variantes de albmina especficas de los Amerindios (Albmina Mxico; Schell y Blumberg 1988) en los Apaches y (b) evidencia histrica del secuestro y captura de mujeres provenientes de tribus amerindias vecinas (Basso 1983), apoyan esta interpretacin.

Distribucin de los haplogrupos de ADNmt en los Amerindios y Na-Dene. En la fig. 5 se muestra la distribucin general de los haplogrupos de ADNmt en los Amerindios de Sud, Centro y Norte Amrica, los Na-Dene del Norte(Canad) y del Sur (Sudoeste de los EEUU). Mientras que prcticamente la totalidad de los NaDene del Norte pertenecen al haplogrupo A, los NaDene del Sur presentan frecuencias significativas de haplotipos del grupo B (30.0%), C (4.0%) y D (30.%), un resultado concordante con la ocurrencia de mezcla gnica a partir de Amerindios. En contraposicin, los Amerindios de Sur, Centro y Norte Amrica se caracterizan por la presencia de haplotipos pertenecientes a los 4 haplogrupos, y presentan importantes variaciones de frecuencias dentro de estos tres agrupamientos de poblaciones. Los Amerindios norteos tambin presentan una incidencia relativamente alta de haplotipos clasificados como otros, principalmente por la alta incidencia de ADNmt Caucsico en las muestras de los Ojibwas. En las poblaciones Sud, Centro y Norteamericanas estn representados los 4 haplogrupos (fig. 5) implicando su presencia en la migracin original. Sin embargo, la mayora de las tribus, tomadas individualmente, carecen de haplotipos de por lo menos uno de estos haplogrupos (Tablas 2 y 3). Por ejemplo, el haplogrupo A est ausente en los Yanomama, el haplogrupos B est ausente en los Ticuna, el haplogrupo C en los Mataco y en todos los hablantes Chibcha, y el D en los Ojibwa, Pima, y en los Bribri/Cabecar. Si bien esta observacin puede ser considerada preliminar teniendo en que el nmero de muestras analizados en varias tribus era bastante limitado, la tendencia se presentaba tambin en aquellas tribus en las que se analizaba un nmero mayor de individuos. Estas observaciones apoyan la hiptesis de que la naturaleza haploide y uniparental del ADNmt (Giles et al. 1980) permite que la deriva gentica y el efecto fundador jueguen un rol ms significativo en la fijacin y extincin estocsticas de los haplotipos de ADNmt al ser comparados con los genes nucleares. Este hallazgo se ve apoyado por la alta frecuencia de haplotipos particulares (polimorfismos particulares: Neel 1978a) encontrados en distintas tribus Amerindias. Por ejemplo, los haplotipos AM77 y AM79 representan, cada uno de ellos, el 25.0% de los ADNmt de los Yanomama, el haplotipo AM62 representa el 35.7% de los ADNmt de los Ojibwa, el haplotipo AM89 constituye el 58.3% del ADNmt de los Wapishana, y el haplotipo AM53 est presente en 15 de 16 Kunas analizados. Esta congruencia de datos de nucleares y mitocondriales refuerza un tratamiento previo del rol del aislamiento tribal temprano y de los efectos

fundadores conducentes a la divergencia de los pools gnicos tribales. (Neel y Thompson 1978).

Orgenes Mltiples de la Delecin de 9-pb en ADNmt de Americanos Nativos La delecin de 9-pb, asociada a la adquisicin del sitio HaeIII en np 16.517, define a los haplogrupos del grupo B. Con una sola excepcin, este polimorfismo de longitud no fue observado asociado a las mutaciones que definen los haplotipos de los grupos A, C y D. Esta excepcin est dada por el haplotipo Boruca AM52, que tiene la delecin de 9pb asociada a la adquisicin, tpica del haplogrupo A, del sitio HaeIII np 663 junto con la prdida del sitio MspI np 104 presente en la mayora de los hablantes Chibcha con haplotipos del grupo A. Esta poco frecuente asociacin indica que la delecin de 9-pb se origin de novo a travs de un evento mutacional independiente en uno de los haplotipos del grupo A. Se obtuvo evidencia adicional en apoyo de esta hiptesis por anlisis de parsimonia, en el que el haplotipo AM52 se agrupaba en forma clara con los haplotipos del grupo A (fig. 2). Adicionalmente, el anlisis de la secuencia del D-loop confirm su asociacin con los ADNmt del grupo A (secuencia 5, ver debajo). Estudios previos de ADNmt haban mostrado que la delecin de 9-pb ha ocurrido en mltiples ocasiones en los ADNmt Siberianos y Asiticos (Ballinger et al. 1992; Torroni et al. 1993). Por lo tanto, ste no es un evento poco probable. Correlacin entre Haplotipos y Datos de Secuenciacin del D-loop. A los efectos de clarificar el tema sobre el nmero de secuencias de D-loop que habran colonizado las Amricas, secuenciamos los D-loops representativos de cada uno de los 4 haplogrupos. Esto incluy muestras Amerindias, Na-Dene, y del Este Asitico. El anlisis de secuencias del D-loop revel 48 posiciones nucleotdicas variables en 341 nucletidos de ADNmt provenientes de 38 Americanos Nativos y 11 Asiticos del Este, y defini 42 secuencias de D-loop diferentes (Tabla 5). En la fig. 4 se aprecian las relaciones evolutivas entre estas secuencias de D-loop. Este rbol es un de tipo MP generado por el mtodo TBR y tiene una longitud de 72 pasos, con un IC y un IR de .545 y .868 respectivamente. Todas las secuencias de D-loop obtenidas a partir de ADNmt de los haplogrupos A, B y C segregaban en grupos de D-loops anlogos, a los que ahora designaremos como grupo A, grupo B y grupo C de D-loop. En cambio, las secuencias de Dloop provenientes de haplotipos provenientes del

haplogrupo D no se agrupaban en forma conjunta de manera consistente (fig. 4). La causa de este hecho consiste en que las secuencias de D-loop de los haplogrupos A, B, y C presentan mutaciones especficas de grupo, mientras que las secuencias de D-loop de los haplotipos del grupo D carecen de esos polimorfismos distintivos ((Tabla 5). Las secuencias de D-loop del grupo A estn definidas por un residuo T en la posicin 16.290 y un residuo A en la posicin 16.319. Las secuencias de D-loop del grupo B normalmente presentan 2 residuos C en 16.189 y 16.217. Las secuencias de D-loop del grupo C se caracterizan por un residuo C en 16.298 y uno T en 16.327. Sin embargo, las secuencias del grupo D presentan un residuo T en 16.223, que tambin est presente en las secuencias de D-loops de los grupos A y C, as como tambin una C en np 13.362 comn con las secuencias de D-loop del grupo A (Tabla 5). Adems, la comparacin de las secuencias de D-loop de Americanos Nativos con las de Asia mostr que las mutaciones especficas de grupo en los D-loops eran compartidas entre los ADNmt de Americanos Nativos y de Asiticos. Por lo tanto estas mutaciones deben de haber surgido en Asia y fueron llevadas a las Amricas por los ADNmt fundadores. Las mutaciones del D-loop restantes estaban confinadas a los Americanos o Asiticos y eran especficas de los individuos. Por los tanto, al igual que la variacin e los sitios de restriccin, la variacin en secuencia del Dloop probablemente haya surgido luego de que los Americanos Nativos se separaron de Asia. Las nicas excepciones a esta generalizacin estn representadas por un residuo T en la posicin 16.111 y un residuo C en la posicin 16.325. El primero se halla en los D-loops pertenecientes a los haplogrupos A y B de Americanos Nativos, y la segunda se encuentra en D-loop pertenecientes a los haplogrupos C y D de Americanos Nativos. Sin embargo, estos polimorfismos no se encuentran en las secuencias de D-loop de Siberia o Asia pertenecientes a los mismos grupos de D-loop (Tabla 5) (Torroni et al. 1993). Que estas mutaciones impliquen ADNmt fundadores adicionales en los Americanos Nativos o mutaciones paralelas que surgieron en las Amricas es un tpico a ser resuelto. Adems, el anlisis de secuenciamiento del Dloop corrobor evidencias previas de que los Na-Dene presentan una menor heterogeneidad que los Amerindios en su ADNmt (Torroni et al. 1992). 4 de 7 secuencias de D-loop del grupo A de los Na-Dene tenan secuencias idnticas (Tabla 5 y fig. 4). Cada una de ellas derivaba de 4 individuos pertenecientes a tribus diferentes (Haida [10], Tlingit [13], Dogrib [11] y Navajo [15]) pertenecientes a 3 de las 4 mayores divisiones lingsticas internas de los Na-Dene (Haida, Tlingit y Athapaskan) (Haskell 1987). En forma

similar, las secuencias del D-loop del ADNmt de los Dogrib, Tlingit y Navajos, definidas por la prdida, especfica de los Na-Dene de un sitio RsaI np 16.329 (haplotipo AM5), se agrupaban en forma conjunta (12, 14 y 16). Estas observaciones parecen apoyar la hiptesis del origen independiente de los Na-Dene y de los Amerindios. En conclusin, el anlisis de variacin de la secuencia del D-loop obtenida a partir de un nmero limitado de ADNmt pertenecientes a distintas tribus de Americanos Nativos indica un alto grado de correspondencia entre los haplogrupos previamente definidos y los nuevos grupos definidos por el D-loop. Tambin demostr al ADNmt de Americanos Nativos puede ser definido en forma ms completa por el anlisis de restriccin intensivo descripto en este artculo que por secuenciamiento del D-loop. A partir del anlisis por secuenciacin del D-loop no surgen evidencias que permitan afirmar que los ADNmt de los Americanos Nativos derivan de un nmero mayor de ADNmt Asiticos fundadores. Por lo tanto, la variacin existente en ADNmt es mas compatible con el concepto de que los ADNmt de las poblaciones Amerindias modernas derivaran de tan solo 4 ADNmt fundadores originales (Wallace et al. 1985, Schurr et al. 1990). Discusin Haplotipos Amerindios Fundadores El presente artculo, junto con otros previos (Wallace et al. 1985, Schurr et al. 1990; Torroni et al. 1992), confirma que la totalidad del ADNmt de los Amerindios pertenece a 4 haplogrupos diferenciados (A-D). Este resultado hace surgir interrogantes respecto a cul ADNmt dentro de cada haplogrupo representa a los fundadores originales. El intento de identificar los haplotipos fundadores ancestrales de Americanos Nativos asume que desde la colonizacin de las Amricas no ha transcurrido el tiempo suficiente para que los haplotipos fundadores (tanto en Amrica como los que permanecieron en Asia) hayan sido alterados por mutaciones. Dado el intervalo de tiempo relativamente corto involucrado, probablemente este sea un supuesto seguro. Varios abordajes distintos han sido utilizados para investigar este tema. La concordancia en las respuestas nos ha permitido identificar a los haplotipos fundadores con una confidencia significativa. Para que un haplotipo sea considerado como fundador de los Amerindios, los ADNmt candidatos deben cumplir varios criterios. Primero, los haplotipos fundadores deben estar ampliamente dispersos dentro de los Amerindios, y deben ser compartidos por varias tribus ya que precede la diferenciacin tribal amerindia. Segundo, en al anlisis filogentico los

haplotipos fundadores deberan estar en una posicin central en el proceso de ramificacin de su haplogrupo respectivo, ya que los haplotipos nuevos se habran originado a partir de ellos. Tercero, debera ser posible encontrar haplotipos fundadores en poblaciones de Siberia y del Este Asitico. Por contraste, los haplotipos de ADNmt derivados de los haplotipos fundadores y que habran surgido nicamente en las Amricas, deberan de tener una distribucin ms limitada, ya sea estando presentes solamente en una tribu o siendo compartidos entre tribus gentica o geogrficamente prximas. Cuando se aplicaron estos criterios a los 85 haplotipos amerindios de ADNmt , se encontr que solamente 11 eran compartidos entre varias tribus (Tabla 6). Los haplotipos restantes (haplotipos particulares) aparecan en bajas frecuencias en tribus especficas. Para el haplogrupo A, solamente los haplotipos AM1, AM9 y AM51 son compartidos entre varias tribus. El haplotipo AM51 est limitado a los hablantes Chibcha de Amrica Central y por lo tanto es poco probable que sea un haplotipo fundador. Sin embargo los haplotipos AM1 y AM9 estn mas ampliamente distribuidos entre las tribus Amerindias y representan el 15.2% y el 9.1% respectivamente de los haplotipos amerindios del grupo A. En forma similar, para el haplogrupo B, el nico haplotipo compartido es el AM13. Est ampliamente distribuido entre tribus Amerindias, estando presentes en 10 de 19 poblaciones estudiadas y representaban el 69.3% de los ADNmt amerindios pertenecientes al grupo B analizados. Para el haplogrupo C, haba cuatro haplotipos compartidos entre distintas tribus Amerindias. Uno de ellos, el AM82, presenta una distribucin limitada, siendo compartido entre dos tribus geogrficamente prximas, los Makiritare y los Macushi, que pertenecen a la misma subdivisin lingstica (Tabla 1). El segundo haplotipo, AM79, es compartido por los Yanomama y los Kraho, tribus pertenecientes a dos subdivisiones lingsticas distintas, pero que viven en regiones geogrficas relativamente prximas. Los otros dos haplotipos, AM32 y AM43, estn ampliamente distribuidos. El primero es compartido entre 5 poblaciones distintas y representa el 14.8% del total de los ADNmt del haplogrupo C, mientras que el segundo es compartido entre una tribu de Amrica Central (Maya) y otra de Sud Amrica (Macushi) y comprende al 4.9% del total de los ADNmt del haplogrupo C. Para el haplogrupo D, hay tres haplotipos (AM44, AM88 y AM91) compartidos entre tribus Amerindias. El haplotipo AM91 es compartido nicamente entre 2 poblaciones geogrficamente prximas, los Makiritare y los Wapishana. En contraste, los haplotipos AM44 y AM88 estn representados de forma mas amplia. AM44 constituye

el 18.3% del total de los haplotipos del grupo D, y es compartido entre 5 poblaciones, mientras que el haplotipo AM88 representa al 26.7% de los ADNmt del grupo D y es compartido entre los Yanomana y los Mataco. Por lo tanto, tomando en cuenta nicamente la frecuencia y distribucin de los haplotipos, el nmero de presuntos haplotipos fundadores para los ADNmt Amerindios es solamente 7: AM1 y AM9 para el grupo A; AM13 para el grupo B; AM32 y AM43 para el grupo C; y AM44 y AM88 para el grupo D. El segundo criterio utilizado para identificar los haplotipos fundadores es determinar si, en los anlisis filogenticos, aparecen en una posicin central en la radiacin de su haplogrupo. Este criterio es cumplido nicamente por AM1 en el grupo A, AM13 en el grupo B, AM32 en el grupo C, y AM88 en el grupo D (figs. 2 y 3). Es de sealar que los tres haplotipos presuntamente fundadores restantes (AM9, AM43, y AM44) difieren de los haplotipos nodales solamente por un cambio en el sitio HaeIII np 16.517. Este sitio est ubicado en la regin hipervariable del D-loop y es polimrfico en todas las poblaciones humanas estudiadas a la fecha (Cann et al. 1987; Stoneking et al. 1990; Ballinger et al. 1992) Su tasa de evolucin particularmente alta hace que sea probable el que esta mutacin haya surgido en distintas ocasiones, de manera independiente, en distintas poblaciones humanas, creando por lo tanto los dos haplotipos similares. Evidencia especfica para esta aseveracin proviene de 2 haplotipos, AM5 y AM6, presentes en los Dogrib canadienses. Los mismos comparten la prdida del sitio RsaI en la posicin 16.329 (transicin AG en np 13.331), especfico de la radiacin Na-Dene tarda, pero difieren en la presencia del sitio HaeIII np 16.517. Se ven situaciones similares en los haplotipos AM89 y AM90 de los Macushi y en los haplotipos AM40 y AM42 de los Ticuna. La comparacin de haplotipos de Americanos Nativos y Asiticos brinda apoyo adicional a la conclusin de que los haplotipos fundadores habran sido AM1 para el grupo A, AM13 para el grupo B, y AM88 para el grupo D (fig. 3). Estos son los nicos haplotipos que tambin han sido observados en Asiticos. Es de sealar que AM1 es idntico a AS56 encontrado en los Han Taiwaneses; AM13 es el mismo haplotipo que AS54, encontrado en 5.0% de los Han Taiwaneses, 7.1% de los Vietnamitas, y 3.3% de los aborgenes Sabah; y AM88 es idntico al haplotipo AS25 observado en 7.7% de los Coreanos, 5.0% de los Han Taiwaneses, y 14.3% de los Chinos Malayos (Ballinger et al. 1992). Sin embargo, en contradiccin con los resultados del anlisis de parsimonia, el presunto haplotipo fundador del grupo C en el Este Asitico no era AM32, sino que lo era AM43, que es

idntico al haplotipo Asitico AS65 que est presente en el 5.0% de los Han Taiwaneses (Ballinger et al. 1992). Los haplotipos AM32 y AM43 difieren nicamente por el sitio hipervariable HaeIII np 16.517 ubicado en el D-loop. Sitios hipervariables de este tipo producen resultados con mucho ruido de fondo en anlisis filogenticos (Stewart 1993). A los efectos de resolver esta ambigedad, se analizaron los haplotipos del grupo C de poblaciones Siberianas. En dicho anlisis, AM43 apareca en frecuencias significativas en poblaciones Siberianas, mientras que no se pudo encontrar a AM32 (Torroni et al. 1993). Esta observacin sugiere que el haplotipo fundador para el grupo C en Americanos Nativos habra sido AM43. En resumen, la distribucin y frecuencia de los haplotipos de ADNmt en las Amricas, junto con su relacin filogentica con los ADNmt Asiticos y Siberianos, apuntan a que los haplotipos AM1, AM13, AM43, y AM88 seran los haplotipos fundadores para la totalidad de los ADNmt Amerindios modernos. El Proceso de Tribalizacin Una vez establecido el hecho de que la totalidad de los ADNmt de los Americanos Nativos derivan de 4 haplotipos fundadores, tratamos de correlacionar nuestros datos con modelos previos de la radiacin de diversas tribus nativas americanas. Se pueden proponer 2 hiptesis alternativas en torno al origen y diversificacin de estas tribus. La primera postula que las poblaciones de Americanos Nativos habran proseguido ramificndose en nuevos grupos tribales e intercambiando material gentico hasta tiempos recientes. La segunda postula la existencia de radiacin temprana de la poblacin seguida de aislamiento tribal y diferenciacin localizada. El grado de polimorfismos particulares de ADN nuclear y la antigedad potencial de algunos de ellos tienden a apoyar la segunda hiptesis, y por lo tanto implican que las fronteras lingsticas seran barreras efectivas para el flujo gnico (Neel 1980). Nuestros datos de ADNmt tambin parecen apoyar esta segunda interpretacin. Del examen del patrn de variacin del ADNmt se obtiene evidencia a favor del segundo escenario. Con un examen mas detenido, las mutaciones del ADNmt Amerindio pueden ser divididas en tres tipos. El primer tipo de mutaciones son aqullas que definen a los haplogrupos y por lo tanto son compartidas por todos los haplotipos del mismo haplogrupo. Estas mutaciones se originaron en Asia y estn presentes en el conjunto del ADNmt de los modernos Asiticos (Ballinger et al. 1992) y Siberianos (Torroni et al. 1993). El segundo tipo est dado por las mutaciones de ADNmt presentes nicamente en los haplotipos de Americanos Nativos (mutaciones especficas de

haplotipos). Este grupo forma la gran mayora de las mutaciones de ADNmt observadas en Americanos Nativos y en su mayor parte son mutaciones particulares que ocurrieron luego de la diferenciacin tribal. Los haplotipos definidos por estas mutaciones normalmente ocurren en las posiciones terminales de los haplogrupos (fig. 2). El tercer tipo de mutaciones es compartido por un subgrupo de haplotipos Amerindios del mismo haplogrupo. Probablemente hayan surgido in situ en las Amricas durante una fase intermedia del proceso de tribalizacin. De los 109 cambios observados en los sitios de restriccin en NA, solamente 11 pertenecen a este ltimo tipo de mutaciones, y son las que crean los nodos intermedios en los haplogrupos (fig. 2 y Tabla 7). (NOTA: la tabla 7 no se muestra). Seis de ellos (adquisicin del sitio DdeI en la posicin 29, ganancia del sitio RsaI np 4.051, ganancia del sitio MboI en 8.615, prdida del sitio MspI en 931, ganancia del sitio RsaI en 3.403, y prdida del sitio HaeIII en 4.848) son compartidos entre haplotipos presentes en la misma tribu y probablemente hayan ocurrido posteriormente a la diferenciacin tribal. Uno de estos, la prdida del sitio MspI np 104, fue observada en cuatro de las tribus hablantes de Chibcha (los Boruca, los Bribri/Cabecar, los Guaymi, y los Kuna). Esta mutacin no ha sido observada en ninguna otra poblacin previamente analizada (Wallace et al. 1991; Ballinger et al. 1992) y, analizando su distribucin, probablemente haya surgido en el grupo ancestral a partir del cual derivaron todos los hablantes Chibcha. Las cuatro mutaciones restantes son compartidas entre tribus pertenecientes a grupos lingsticos diferentes. La ms interesante de ellas es la prdida del sitio RsaI np 16.049. Fue observada en seis haplotipos del grupo C pertenecientes a los Yanomama, Macushi, Kraho y Warubo. Estas cuatro tribus estn relativamente cercanas desde un punto de vista geogrfico (Fig. 1), y tres de ellas (Macushi, Kraho y Warubo) pertenecen al mismo grupo lingstico (Ge-Pano-Carib; Tabla 1). Por lo tanto, esta mutacin podra haber ocurrido antes de la separacin tribal de estos grupos o, alternativamente, las mismas podran haber sido transmitidas entre tribus a travs de un flujo gnico reciente. La prdida del sitio RsaI en 7.013, la adquisicin de los sitios TaqI en 10.893 y DdeI en 8.569 tambin son compartidas por grupos lingsticos distintos y podran representar mutaciones tempranas o flujo gnico intertibal (Tabla 7). En conclusin, la alta incidencia de polimorfismos particulares de ADNmt y la proporcin y distribucin limitadas de

mutaciones de ADNmt compartidas entre los ADNmt de Americanos Nativos apoyan la conclusin de que la tribalizacin de los Amerindios fue un proceso relativamente rpido que fue seguido por un extenso aislamiento tribal (Neel 1980). Cuantificacin de la Variacin del ADNmt en Americanos Nativos y Fecha de Entrada en las Amricas A los efectos de estimar la fecha de entrada de los primeros Americanos al Nuevo Mundo, calculamos los valores de divergencia de secuencias para cada uno de los cuatro haplogrupos de ADNmt (Tabla 8). Los clculos se basaron en la variacin de secuencia estimada a partir de los haplotipos de los sitios de restriccin de todos los grupos tribales Amerindios y de la tasa de evolucin consenso del ADNmt, estimada en un 2.0%-4.0%/MYR (Stoneking et al. 1986; Cann et al. 1987; Wallace et al. 1987). La divergencia de las secuencias acumulada desde que los haplotipos Amerindios comenzaron a divergir de los de Asiticos y Siberianos es 0.091% para el grupo A, 0.024% para el grupo B, 0.096% para el grupo C , y 0.053% para el grupo D. El valor de divergencia media para los cuatro haplogrupos es 0.067% (Tabla 8), lo que da un tiempo de divergencia de 16.750-33.500 aos antes del presente (aAP). Al asumirse que la cultura de Clovis comenz en Amrica hacia el 13.500 aAP, los datos del ADNmt parecen apoyar una colonizacin del Nuevo Mundo del tipo pre-Clovis. El haplogrupo B, asociado a la delecin de 9pb, present la menor divergencia de secuencias y, por lo tanto, el menor tiempo de divergencia (6.00012.000 AAP). Esta diferencia en el tiempo de divergencia entre haplogrupos podra ser un simple reflejo de los grandes errores intrnsecos de estas estimaciones. Sin embargo, un extenso anlisis de ADNmt de aborgenes Siberianos (Torroni et al. 1993) no pudo encontrar ningn haplotipo del grupo B, pese a que haplotipos de los haplogrupos A, C y D estaban ampliamente dispersos en Siberia. Esto plantea la posibilidad de la entrada del haplogrupo B a Amrica a travs de otra ruta y, por lo tanto, tal vez en un momento distinto al de los otros haplogrupos. Si se elimina el haplogrupo B para estimar la tasa de divergencia de las secuencias de ADNmt de los Amerindios, la divergencia media de los haplogrupos restantes es 0.082% (Tabla 8), y el tiempo de divergencia estimado pasa a ser de 20.500-41.000 aAP. En cualquiera de los dos casos, los datos del ADNmt arrojan tiempos

de divergencia compatibles con un origen pre-Clovis de los primeros americanos.

Figura 2: Arbol de consenso estricto de 92 hplotipos mitocondriales de nativos americanos. Las letras ABCD en los cuadros sombreados indican los cuatro haplobrupos observados en nativos americanos. Los nmeros al final de cada rama denotan los diferentes haplotipos mitocondriales. Los largos horizontales de las ramas son proporcionales al nmero de mutaciones en los haplotipos. Los sitios polimrficos indicados definen cada uno de los cuatro haplogrupos. Este dendrograma es el consenso de 3,000 rboles de mxima parsimonia generados por el mtodo TBR para la construccin de ramas. El inserto muestra uno de los 3,000 rboles de parsimonia usado para generar el rbol de consenso.