APLICAO E TESTES DO MTODO APHA-4500-NO3-C PARA DETERMINAO DE NITRATOS EM GUAS POR LEITURA EM UV COM SEGUNDA-DERIVADA Fernando Mota de Oliveira

Correspondncia Rua das Codornas, 202, ap-606, Imbu, Salvador-BA, CEP-41.720-020 e-mail: fernando@Labwin.com.br Resumo At a 20 . edio do manual de Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater o nico mtodo de Nitrato por UV (4500-NO3-B) era por leitura em um nico comprimento de onda (220nm) e considerado de Screening (teste de verificao da presena) por sofrer interferncias facilmente, a. 1 especialmente de matria orgnica. Na 21 edio o mtodo por UV com segunda-derivada foi includo como mtodo proposto uma vez que diversas interferncias do mtodo por leitura direta j no ocorriam. Neste trabalho adaptamos o mtodo para que possa ser usado em qualquer espectrofotmetro com capacidade de leitura na regio UV, testamos as principais possveis interferncias e detalhamos a execuo do mtodo. Summary Until the 20 edition of the Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater , the single Nitrate analytical method by UV (4500-NO3-B) was in single reading at 220nm an called Screening method st 1 with known interferences, specially from organic matter. In the 21 edition , a Nitrate analytical method by UV readings with second-derivative was found as a Proposed Method once many interferences of the direct reading at UV no more occurred. In this work we adapted this method in a way it may be used in any spectrophotometer that can read in the UV region, we tested the main possible interferences and the execution of the method was detailed. Introduo Os nitratos absorvem fortemente na regio ultravioleta (UV), mas a leitura em nico comprimento de onda no vivel porque a matria orgnica natural e outros compostos solveis tambm absorvem radiao nesta regio do espectro. No entanto o espectro (Figura-1) dos nitratos mostra uma curva com inflexo na regio de 220nm, o que no ocorre com outros compostos. Desta forma, trabalhar com a segunda-derivada ao invs de absorbncia o que permite que se obtenha um mtodo adequado.
th 2 a 2

Figura 1. Curva de Absorbncia de uma soluo com 2mg/L de N-NO3 Os Nitritos tambm absorvem na regio ultra-violeta, mas geralmente apresentam-se em teores bem mais baixos. Os bicarbonatos absorvem abaixo de 210nm, mas no afetam a segunda-derivada dos Nitratos. Os brometos interferem em teores tpicos de gua do mar (68mg/L, salinidade 35%o) de modo que o mtodo no se aplica a guas do mar. Os testes que fizemos neste trabalho comprovam a amplitude desta

interferncia. O mtodo original descreve que Ferro e Cobre interferem seriamente na faixa de 20mg/L o que algo extremamente raro de ocorrer. O mtodo foi testado em guas potveis e a viabilidade para o uso em efluentes e esgotos no foi testada. Os testes que fizemos em gua de uma lagoa relativamente poluda mostraram viabilidade do mtodo nesta matriz. A forma como fizemos o teste de interferncia 4 (Seletividade/Especificidade ) pode ser aplicado em outras matrizes. O mtodo original requer que o espectrofotmetro possa calcular segunda-derivada atravs do software original ou atravs de uma interface computadorizada, o que no vivel para muitos laboratrios. Fizemos uma adequao do mtodo realizando a leitura em 03 comprimentos de onda e um clculo simples de segunda derivada, da mesma forma que se encontra o ponto de inflexo em curva de titulao eletromtrica ao se utilizar aparelho no computadorizado. Os seguintes testes foram feitos: a) Calibrao: Preparo de curva analtica em gua ultra-pura. 4 b) Especificidade/Seletividade : Adio de Padro (Spike) em gua do mar diluda 10 vezes. 4 c) Especificidade/Seletividade : Adio de Padro (Spike) em gua de lagoa. 4 d) Especificidade/Seletividade : Adio de Padro (Spike) em gua tratada. 4 e) Especificidade/Seletividade : Adio de Padro (Spike) em gua tratada com adio de Matria orgnica. 4 f) Especificidade/Seletividade : Adio de Padro (Spike) em gua tratada com adio de Bicarbonato 4 g) Validao : Repetitividade e %Recuperao do mtodo a 2mg/L. 3 h) Validao : Limites de Deteco e Quantificao do mtodo. Os testes preliminares foram feitos em um espectrofotmetro FEMTO 700 Plus sem interface computadorizada, com bons resultados, e concludos em um espectrofotmetro VARIAN Cary 5E, que embora seja computadorizado, com capacidade de clculos de segunda-derivada e com feixe duplo foi utilizado com leituras simples em feixe simples. O uso de 02 equipamentos diferentes ocorreu apenas em funo de disponibilidade dos equipamentos e tambm serviu para mostrar a viabilidade do mtodo em 02 instrumentos bem diferentes. Descrio do Mtodo Analtico Reagentes a) Soluo estoque de Nitrato a 100mg/L de N-NO3 (a) b) gua destilada, ultra-pura ou isenta de nitratos.
(a) Ateno: O comum que o padro e as amostras sejam calculados como N-NO3 (Nitrognio) ao invs de NO3 (Nitrato).

Aparelhagem a) Espectrofotmetro capaz de fazer leituras em 210nm, 220nm e 230nm. b) 02 cubetas casadas, ou de mesma origem, de quartzo com 10mm de caminho tico. Opcionalmente usar somente uma (b) c) Aparelhagem para filtrao de amostras.
(b) Cubetas de vidro causam interferncia na regio UV, sendo invivel o uso. Normalmente as cubetas de Quartzo so marcadas como QS e as de vidro como GS. O uso de apenas uma cubeta aumenta o trabalho das leituras.

Procedimento a) As amostras podem ser preservadas por adio de cido sulfrico ou de cido clordrico caso no venham a ser lidas dentro de 48 horas. Para mais detalhes de preservao para diversos parmetros 1 ver o captulo do manual Standard Methods a este respeito. b) Amostras que apresentem turbidez devem ser previamente filtradas. c) Encha uma cubeta com gua destilada e uma com Amostra ou Padro (c). d) Ajuste o espectrofotmetro a 210nm, zere com gua e anote a absorbncia da amostra ou padro. d) Repita o item anterior a 220nm e 230nm sempre zerando com a cubeta com gua antes de cada leitura. e) Tabele os resultados e calcule a segunda-derivada como (Abs210 - Abs220) - (Abs220 - Abs230) f) Para as amostras, calcule os teores com base na equao da curva analtica.
(c) Tendo-se uma nica cubeta

a) Encha a cubeta de gua, ajuste a 210nm e zere o instrumento. b) Leia (sem zerar) as absorbncias da gua a 220nm e 230nm anotando. c) Ainda sem zerar leia as absorbncias das amostras ou padres a 210nm, 220nm e 230nm subtraindo das leituras da prova em branco as leituras a 220nm e 230nm.

Curva Analtica A curva analtica deve ser feita por leitura de padres de N-NO3 a 0,5mg/L; 1,0mg/L; 2,0mg/L e 4,0 mg/L obtidos por diluio da soluo estoque a 100mg/L de N-NO3. Os pontos de calibrao podem ser modificados se o aparelho em uso apresentar linearidade apenas at 2,0 mg/L, que o recomendado no mtodo original. Considerando concentrao no eixo Y e 2 . derivada no eixo X (d) obtenha a curva: mg/L N-NO3 = 2 . derivada X Inclinao + Intercepto
(d) Embora a estatstica recomende a concentrao no eixo X, o qumico analista perceber facilmente vrias vantagens de se plotar a concentrao no eixo Y, especialmente ao tratar coisas como limite de deteco e incerteza da curva analtica.
a a

Exemplo de Curva Analtica A Tabela 1 mostra um exemplo de preparo de curva analtica. Abs210 0,2894 0,5778 1,1632 2,4968 Abs220 0,1346 0,2672 0,5261 1,1433 Abs230 0,0294 0,0597 0,1153 0,2551 2a. Derivada 0,0496 0,1031 0,2263 0,4653 Concentrao 0,50 1,00 2,00 4,00

Inclinao 8,37 Intercepto 0,11 correlao 0,9999 Tabela 1. Exemplo de Dados para curva analtica mg/L N-NO3 = 2 . derivada X 8,37 + 0,11 Os valores foram tratados em Excel, considerando a concentrao como Y e a segunda derivada como X. Foram usadas as funes do Excel Inclinao, Intercepo e Correl, respectivamente. Validao do Mtodo Repetitividade e % Recuperao
4 a

Uma gua tratada contendo 0,24mg/L de Nitratos teve adio de mais 2mg/L, totalizando 2,24mg/L de NNO3. A mesma foi analisada por um mesmo analista no mesmo instrumento. A Tabela 2 mostra os resultados. Resultado 1 Resultado 2 Resultado 3 Resultado 4 Resultado 5 Resultado 6 Resultado 7 Resultado 8 Resultado 9 Resultado 10 Mdia Desvio Padro Repetitividade (D. Padro x 2,772) 2,18 2,11 2,13 2,17 2,14 2,14 2,16 2,16 2,13 2,15 2,15 0,02 0,06

Coeficiente de Varincia (%CV) 1,0 %Recuperao 96 Tabela 2. Resultados dos testes de Repetitividade Limites de Deteco e Quantificao
3

Observando que a curva analtica tem grande influncia neste mtodo analtico escolhemos o mtodo 4 Houbax & Vox para determinao do Limite de Deteco. A leitura de provas em branco poderia ser uma boa alternativa tambm. Foram preparados 03 padres de 0,1mg/L, 03 padres de 0,2mg/L e 03 padres de 0,3mg/L com os quais se preparou uma curva analtica com dados prximos do limite de deteco esperado (0,1mg/L). A curva foi obtida com ajuda do Excel (plotando concentrao como Y) como mostra a Figura 2. Os valores de intercepto, inclinao e correlao tambm foram obtidos diretamente com funes do Excel. O clculo de RSD (Residues Standard Deviation ou Desvio Padro dos Resduos) foi obtido comparando os valores de concentraes calculadas contra concentraes reais. A Tabela 3 mostra os dados usados para o clculo de RSD e LD. Observar que o RSD representa a incerteza da curva analtica. Abs210 Abs220 Abs230 2 . Deriv. 0,0711 0,0319 0,007 0,0143 0,0708 0,0328 0,0079 0,0131 0,0662 0,0307 0,0064 0,0112 0,1347 0,0611 0,0134 0,0259 0,1342 0,0625 0,0153 0,0245 0,1311 0,0607 0,0129 0,0226 0,2659 0,1246 0,0269 0,0436 0,2647 0,1231 0,0288 0,0473 0,2614 0,1214 0,0263 0,0449 D 2 Soma =Soma de (yCalc-yRreal) a Conc. = 2 . Deriv. * 5,94 + 0,037 D RSD =Raiz (Soma / (n-1)) LD = 3 * 0,017 + 0,037 LQ = 10 * 0,017 + 0,037
a

Conc. (yCalc-yRreal) 0,1 0,000470 0,1 0,000212 0,1 0,000011 0,2 0,000089 0,2 0,000315 0,2 0,000843 0,3 0,000019 0,3 0,000311 0,3 0,000011 D Soma => 0,002281 RSD LD LQ 0,017 0,09 0,21

Tabela 3. Dados para clculo de RSD e LD

N-NO3: Determ inao LD via Houbax/Vox - m g/L N-NO3 e 2a Derivada 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0,045 0,05

Figura 2. Curva analtica dos dados para clculo de LD e LQ Seletividade/Especificidade

3

Uma das formas mais utilizadas para caracterizar interferncias pela comparao da curva analtica obtida na padronizao, normalmente por adio de padro em gua ultra-pura ou destilada, com curvas obtidas 1 por adio de padro em matrizes possivelmente interferentes. O manual de Standard Methods define que se houver uma variao superior a 10% no valor de inclinao da curva preparada com a matriz em teste deve-se considerar que a matriz causa interferncia. No acreditamos que estes testes possam garantir absolutamente ocorrncia ou no de interferncia em todos os casos, uma vez que interferncia costuma ser algo imprevisvel algumas vezes. Mas um teste bastante vlido para a maioria dos casos. Uma rotina de Controle da Qualidade Analtica com uma certa freqncia com adio de padro em matrizes suspeitas complementa a garantia dos resultados. Fizemos os testes para validao do mtodo em algumas matrizes suspeitas por comparativo das respectivas curvas analticas com a curva analtica da padronizao do instrumento, preparada com gua ultra-purificada. As Figuras 3 a 8, que seguem so auto-instrutivas. Observar que todos os testes, inclusive a calibrao, foram feitos por adio 0,5mg/L; 1mg/L, 2mg/L, 3mg/L e 4mg/L. Os teores originais obtidos pelas anlises das respectivas matrizes foram somados a estes valores para lanamento nos grficos.
Curva Analtica: mg/L N-NO3 e 2a. Derivada
4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5

y = 8,451x + 0,108 R2 = 0,999

Figura 3. Curva analtica preparada em gua ultra-pura

Adio de Padro em gua do mar: mg/L N-NO3 e 2a. Derivada
4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800

y = 7,503x - 1,154 R2 = 0,992

Figura 4. Curva obtida por adio de padro em gua do mar diluda 10 vezes.

Adio de Padro em gua de lagoa: mg/L N-NO3 e 2a. Derivada

4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,000

y = 8,055x - 0,086 R2 = 0,995

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

Figura 5. Curva obtida por adio de padro em gua de lagoa

Adio de Padro em gua Tratada: mg/L N-NO3 e 2a. Derivada
4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,000

y = 7,978x + 0,112 R2 = 0,995

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

Figura 6. Curva obtida por adio de padro em gua tratada

Adio de 10m g/L M.O. em gua tratada: N-NO3 m g/L e 2a. derivada 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600

y = 8,510x + 0,239 R2 = 0,999

Figura 7. Curva obtida por adio de padro em gua tratada que sofreu adio de 10mg/L de Matria Orgnica proveniente de Leite de vaca (gordura, protenas, carbohidratos, etc.)

Adio de 200m g/L Bicarbonato em gua tratada: N-NO3 m g/L e 2a. derivada 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400 0,450 0,500

y = 9,262x + 0,077 R2 = 0,999

Figura 8. Curva obtida por adio de padro em gua tratada que sofreu adio de mais 200mg/L de Bicarbonato de Sdio

Resultados da validao Desvio Padro da Repetitividade a 2mg/l em gua tratada Coeficiente de Varincia a 2mg/L Repetitividade a 2mg/l (k=2,772) %Recuperao a 2mg/L Linearidade e faixa de trabalho 0,02 mg/L

1,0 % (*) 0,06 mg/L 96 % Testado at 4mg/L com um bom valor de r (0,999). O manual de Standard Methods1 recomenda valores de pelo menos 0,995, se no for definido um valor no mtodo. Limite de Deteco 0,09 mg/L Limite de Quantificao 0,21 mg/L Sensibilidade Inclinao da curva analtica 8,45 Interferncias em gua do mar diluda 10 vezes Inclinao da curva 7,5. Variao de 11%, que indica interferncia, apesar da diluio. O intercepto muito negativo (-1,15) tambm indica problemas. Interferncias em gua de lagoa Inclinao da curva 8,06. Variao de 4,6% que indica ausncia de interferncia. Interferncias em gua tratada Inclinao da curva 7,98. Variao de 5,6% que indica ausncia de interferncia. Interferncias em gua tratada com 10mg/L de Matria Inclinao da curva 8,51. Variao de 0,7% que Orgnica (de leite de vaca) indica ausncia de interferncia. Interferncias em gua tratada com adio de mais Inclinao da curva 9,26. Variao de 9,6% que 200mg/L de Bicarbonato de Sdio indica ausncia de interferncia, apesar do elevado teor adicionado de Bicarbonato.
(*) O mtodo cita em precision and bias que a diferena entre o mtodo por Cromatografia a lquido e este mtodo foi de 0,5mg/L na faixa de concentrao de 40mg/L, ou seja 1,25%. Consideramos os valores obtidos compatveis com o citado no mtodo original. Infelizmente o mtodo no cita valores de repetitividade nem de %Recuperao, LD, LQ, etc.

Concluses O mtodo de Nitrato por UV com Segunda derivada mostrou-se um mtodo de fcil aplicao, de execuo fcil, sem qualquer gasto de reagentes e aplicvel s matrizes mais comuns (gua tratada e gua bruta) para anlises em laboratrios prestadores de servios. Comparando-o com o mtodo da coluna de Cdmio percebe-se uma grande vantagem de custos de materiais e de tempo de ocupao dos Analistas. Comparando-o com mtodos de kits as principais vantagens so o fato de ser um mtodo oficial e no ter gastos de reagentes. O principal requisito para a sua aplicao ter um espectrofotmetro com capacidade de leitura na regio UV. Com as adaptaes que aqui fizemos fica dispensado que o instrumento tenha uma interface computadorizada. 1) APHA / AWWA / WEF: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21 . Ed., USA, APHA, 2006. th 2) APHA / AWWA / WEF: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20 . Ed., USA, APHA, 1998. 3) Hubaux, A. and Vox, G.: Decision and detection limits for linear calibration curves, Analytical Chemistry 42, 849 - 855 (1970). 4) EURACHEM: The Fitness for Purpose of Analytical Methods; A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. EURACHEM, First Internet version, December 1998, First English Edition 1.0 1998; www.eurachem.ul.pt/guides 5) Miller, J. C. and Miller, J. N.: Statistics for Analytical Chemistry, second edition, Ellis Horwood Ltd, London, 1992, pp-60-62. 6) Oliveira, Fernando M.: Guia do Usurio do Software LABWIN-CQA. Labwin Ltda, Reviso 00 de 14/06/2004.
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Agradecimentos a) Fundao de Amparo Pesquisa do Estado da Bahia, FAPESB b) Universidade Federal da Bahia, Instituto de Qumica c) Nossa estagiria Ivanice Ferreira dos Santos