7.

28 Primavera 2001

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1a) Estamos estudiando la funcin de RecA in vitro junto con un/a compaero/a de prcticas. Llevamos a cabo varias reacciones con el fin de estudiar qu se necesita para la actividad de RecA. Indicar, para cada una de las reacciones que se presentan a continuacin, los productos que se esperan conseguir una vez que la RecA ha sido eliminada mediante una extraccin de fenol. Las regiones de homologa se representan con lneas gruesas.

1)

+
4 kb ADN monocatenario 4 kb ADN bicatenario

ATP

+
4 kb ADN monocatenario 4 kb ADN bicatenario

2)

RecA ATP

4 kb ADN bicatenario 4 kb ADN bicatenario

4 kb ADN bicatenario 4 kb ADN bicatenario RecA ATP girasa

3)

Le falta un ADN monocaten ario para que el RecA se cargue

4 kb ADN monocatenario 4 kb ADN bicatenario 4)

** * + +*
Le falta Homolog a

+ +

RecA ATP

4 kb ADN monocatenario 4 kb ADN bicatenario 5)

4 kb ADN monocatenario 4 kb ADN bicatenario RecA

1b) Una vez efectuadas estas reacciones, nuestro/a compaero/a prepara un gel de acrilamina no desnaturalizante para analizar los productos. Para cada reaccin prepara 3 caminos: el camino (a) es una reaccin de control sin RecA, el (b) es la reaccin completa cargada directamente en el gel y el (c) es la reaccin completa a la que se le ha extrado fenol para eliminar la protena antes de cargar la reaccin en el gel. Nuestro/a compaero/a expone los 15 caminos de reaccin resultantes en una pelcula de rayos X. En ese momento l/ella se tiene que ir y, tras revelar la pelcula, nos sentamos a redactar el informe de laboratorio.

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Desafortunadamente, nos damos cuenta de que no sabemos el orden en el que l/ella ha ido cargando las reacciones. La pelcula qued de la siguiente manera:

Qu nmeros de reaccin (1-5) se corresponden con las reacciones de la pelcula (U-Z)? Explicar las diferencias entre las columnas a, b y c para cada reaccin. Reaccin U = 3, W = 5, X = 2 e Y Z = 1 4 (las mismas bandas en el gel) 1y4 a: Todas estas tienen el mismo ADN monocatenario circular, que aparentemente mide 3 kb. b: recA se une a ambas molculas de ADN, coge una banda para 2 ADN + retardos de protena (8kb). c: Componentes que no estn indicados en (a), por lo que no se forma ningn nuevo producto de ADN estable (3 kb). 2 a: ADN bicatenario linear caliente de 4 kb. b y c: Sin ADN monocatenario, recA no se puede enlazar, se observa el mismo tamao (4 kb). 3 a: La misma molcula de ADN caliente que en los casos 1 y 4 (3 kb). b: recA se enlaza y forma nuevos productos de ADN combinando los dos ADN, se mantiene el enlace (8 kb). c: El producto final estable sin recA combina dos sustratos de ADN (6 kb). 5 a: el ADN caliente inicial es un ADN monocatenario lineal que aparentemente, va ms rpido que el circular (2kb). b: recA se enlaza para formar un nuevo producto de ADN combinando los dos ADN; se mantiene unido (8 kb). c: El producto final caliente es un ADN bicatenario de 4 kb.

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2a) Algunos elementos transponibles en E. coli, por ejemplo Tn10, se transponen a alta frecuencia justo despus de que pase una horquilla de replicacin. Esta induccin de transposicin por replicacin tiene un gran efecto, tanto, que la mayora de las transposiciones ocurren en un periodo muy corto de tiempo, justo despus de la replicacin. Qu mecanismo podra utilizar Tn10 para asociar la transposicin con el paso de la horquilla de replicacin? Proponer un experimento sencillo in vivo para comprobar si este mecanismo es cierto. La transposicin se puede asociar a la replicacin por el mismo sistema de metilacin de ADN dependiente de dam, que asocia la reparacin de errores en los apareamientos con la replicacin. En este caso, la transposicin sera provocada en transposones que contendran secuencias semimetiladas. [En realidad, la transposasa Tn10 no se une al ADN completamente metilado, pero s al semi-metilado o no metilado, activando as la transposicin tras el paso de la horquilla de replicacin]. En un experimento in vivo se podra comparar la frecuencia de transposicin en cepas sobreexpresadas de metilasa dam, dam y wt. El Tn10 se debera transponer con ms frecuencia de lo normal en las clulas dam - (donde los sitios debern estar siempre no metilados) y con menos frecuencia de lo normal en las dam sobreexpresadas (donde los sitios se metilan ms rpidamente tras la replicacin). La frecuencia de la transposicin se debera medir por medio de una transferencia Southern con una sonda Tn10, como se describe en el apartado b). 2b) Se posee una cepa de E. coli (variedad 708A) que tiene una nica copia de Tn10 en el genoma, integrado en el gen hisB. Se asla un derivado de esta cepa (que denominamos 708A+) en el que se ha transpuesto el Tn10, produciendo una mutacin en el gen necesario para el crecimiento en ausencia de leucina. A continuacin, se muestra la transferencia Southern de ADN sobre una cepa 708, que corresponde a la 708A pero carece de Tn10, 708A y 708A+. La membrana ha sido sometida a tres sondas radioactivas diferentes: (1) el gen hisB, (2) el gen leu y (3) secuencias Tn10. Dado el patrn que se ha mostrado para las otras cepas, dibujar las bandas que se esperaran ver para la cepa 708A+ en cada una de las pelculas mostradas a continuacin:

708 708A

708A+

708 708A

708A+

708

708A

708A+

Sonda His

Sonda Leu

Sonda Tn10

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2c) En una clase, comentamos que el Tn10 es un transposn replicante. Sin embargo, el profesor nos informa de que basndonos nicamente en el experimento realizado en el apartado b), no es posible demostrar si el Tn10 es un transposn replicante o no-replicante. Por qu no? Explicar brevemente el razonamiento del profesor. Una vez que la horquilla de replicacin pasa por la secuencia Tn10, hay temporalmente dos copias de Tn10 en la clula, una en el cromosoma padre y otra en el cromosoma hijo, en la misma ubicacin (el gen His). (1) Si una copia se transpone por medio de un mecanismo replicativo, la clula progenie resultante llevar dos transposones Tn10 a dos sitios diferentes. (2) Si se elimina una copia de transposn por medio de un proceso no replicativo de cortar y pegar, sta dejar a su paso una rotura bicatenaria. Esta rotura se reparar utilizando la regin homloga del cromosoma opuesto, que contiene la nueva copia replicada de la secuencia Tn10. De este modo, se podr encontrar tambin el transposn tanto en el sitio antiguo como en el nuevo sitio objetivo de la clula progenie. 3a) Se dispone a estudiar el problema de la propagacin de la resistencia a los antibiticos en una poblacin bacteriana hospitalaria. Existen motivos para sospechar que la causa del problema subyace en algn fago no caracterizado previamente. Dichos fagos transportan genes de resistencia a los antibiticos, provocando que las clulas infectadas se hagan resistentes cuando el fago se integra en el ADN cromosmico de la clula. Como primer paso para prevenir una propagacin futura de estos fagos, Ud. caracteriza su mecanismo de integracin. Para conseguir comprender los mecanismos que utilizan, Ud. infecta dos de los fagos en diversas cepas de E. coli con mutaciones en los genes que actan en el procesamiento del ADN. A continuacin puede ver una tabla de resultados. Cepa de E. coli Natural polA- (gen de ADN polimerasa I) lig- (gen de ADN ligasa) recB- (gen de RecB) Fago A Se integra No se integra Fago B Se integra Se integra

No se integra No se integra

Se integra Se integra

Segn estos datos, qu tipo de recombinacin (homloga, especfica de sitio o transposicin) se usar con mayor probabilidad para la integracin mediante el fago A? Explique su respuesta. Transposicin. El fago A no requiere recB, por lo que no se trata de una recombinacin homloga. Sin embargo, requiere polimerasa y ligasa, necesarios ambos para la transposicin pero no para la recombinacin especfica de sitio.

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3b)Qu tipo de recombinacin (homloga, especifica de sitio o transposicin) se utilizar con mayor probabilidad para la integracin mediante el fago B? Explique su respuesta. La recombinacin especfica de sitio. El fago B tampoco requiere recB y, por lo tanto, no utiliza la recombinacin homloga. La recombinacin especfica de sitio no necesita sntesis del nuevo ADN, por lo que no requiere polimerasa. La recombinacin une las cepas rotas, por lo que tampoco es necesaria la ligasa. 3c) Usted decide que este mtodo para determinar el mecanismo de integracin es demasiado laborioso e indirecto. Sugiera un ensayo ms directo que le permita determinar si el fago aislado utiliza la ruta de integracin utilizada por el fago A o la utilizada por el fago B. Dispone de una sonda de ADN para los genes de resistencia a los antibiticos transportados por ambos tipos de fagos. Razone el ensayo y lo que espera encontrar con los fagos de cada clase.

Un ensayo simple consistira en realizar una transferencia Southern genmica en las cepas de E. coli infectadas por cada fago. Aislar el ADN de E.coli infectado con cada fago, digerirlo con una enzima de restriccin y llevar a cabo una transferencia Southern (en un gel no desnaturalizante, desnaturalizar el ADN, transferirlo a una membrana, incubar con una sonda y exponerlo en una pelcula). El E. coli infectado por el fago B debera siempre dar una banda del mismo tamao cuando se sondea con el ADN del fago B, ya que la recombinacin especfica de sitio siempre provoca la integracin en el mismo lugar. El E. coli infectado con el fago A mostrar multitud de bandas diferentes cuando se sondea con el ADN del fago A, debido a que los transposones se transponen en puntos aleatorios en el genoma. 3d) Para detener la propagacin de los fagos de resistencia a los antibiticos, Ud. desea aislar un inhibidor del proceso de integracin. En funcin de los estudios con otros inhibidores de enzimas, Ud. piensa que el mejor objetivo para el inhibidor sera el sitio activo de la enzima de recombinacin responsable de la integracin. Para identificar el sitio activo en la recombinacin para el fago B, Ud. utiliza una aproximacin de secuencia de consenso. Primero, identifica una regin del genoma del fago B escasamente homloga al gen de integracin del fago . Despus, secuencia esta regin de cinco fagos parientes cercanos todos ellos del fago B. Ms abajo aparece una secuencia de aminocidos (cdigo de 1 letra) de estos seis fagos de tipo B. Fago B B-001 B-002 B-003 B-004 B-005 IFGYARVSYSQE LFGYARVSYSQE LFGYARVSTSQQ IAGWIRVSTFDQ IAGYIRVSTFDQ IAGYIRVSTFDQ

Segn estos datos de alineacin, qu amino cido de esta regin es ms probable que forme parte del sitio activo? Aporte dos razones que justifiquen su respuesta. La serina conservada es ms probable que forme parte del sitio activo. Est presente en todo pariente del fago B, por lo que debe ser importante. Adems, la serina contiene un grupo OH necesario para atacar el fosfato del ADN y formar un intermediario covalente de ADN-protena.

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4a) Un colega est estudiando una enfermedad dominantemente heredada y se encuentra con un paciente sin historial familiar de la enfermedad. Despus de determinar que el paciente estaba en lo cierto respecto a la identidad de sus progenitores, su colega se ha puesto en contacto con usted, un experto en transposones. Ud. secuencia el gen de la enfermedad procedente del paciente y encuentra una gran insercin en el gen. Qu caractersticas de la secuencia podra esperar que tuviera esta insercin si fuera un transposn? Repeticiones directas cortas (duplicacin en sitio objetivo), repeticiones invertidas, genes con homologa a los transposones.

4b) Ud. decide examinar si realmente ha encontrado un nuevo transposn comprobando si ste puede se puede transferir entre diferentes ADNs en una clula bacteriana. (Se supone que los elementos humanos se pueden transponer en bacterias). La estudiante del UROP (Undergraduate R Research Opportunities Programme) a su cargo inserta un gen Amp en la secuencia de transposones sospechosa y lo clona en un plsmido bacteriano que contiene un gen Tet . A continuacin, la estudiante transforma este plsmido en una cepa bacteriana transportando un R plsmido F con un gen Kan . Despus, hace crecer las clulas donadoras, las empareja con una S S S cepa de receptores Amp Kan Tet , mata las clulas donadoras y sita las bacterias supervivientes en diversas placas de antibiticos para probar el fenotipo de las clulas receptoras. R R R S El 0,05% de las clulas Kan que recupera son Kan Amp Tet , mientras que el restante 99,5% R S S son Kan Amp Tet . Qu conclusin puede extraer a partir de dichos datos? Cortar y pegar el transposn, transponiendo a una tasa baja. 4c) Usted acusa a la estudiante del UROP a su cargo de estropear el ensayo, ya que esperaba un R porcentaje mayor de clulas Amp . Ofendida, ella realiza un duplicado del experimento, esta vez realizando la transformacin en una serie de cepas bacterianas con diferentes plsmidos F, todos R ellos con genes Kan . Esta vez encuentra que una de las cepas produce clulas receptoras, donde R R R el 40% de los genes Kan son Kan Amp . Ud. le indica que secuencie un plsmido F que haya obtenido una insercin del transposn y descubre que tiene un gran contenido de GC. Dado que las regiones del genoma humano que contienen secuencias codificadoras poseen un contenido mucho mayor de GC que las regiones que no tienen, por qu resulta extrao que este transposn prefiera integrarse en ADN rico en GC? (Por qu se integraran la mayora de los transposones en regiones no codificadoras?) La mayor parte de los transposones prefieren el ADN no codificador, supuestamente para poder permanecer en el genoma sin matar por accidente al husped. 4d) Cul es la explicacin para que este transposn pueda preferir integrarse en regiones transcritas activamente con estructuras de cromatina abiertas? (De qu tipo de transposn se tratara?) Quiz sea un retrotransposn, y necesite transcribirse en ARN antes de la transposicin. Los retrotransposones normalmente disponen de sus propios promotores, pero podran transponerse supuestamente con mayor frecuencia si se encontraran en regiones del genoma con estructuras de cromatina abiertas.
R

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4e) En qu manera cambia esta hiptesis su conclusin acerca de los resultados en la parte b? Los retrotransposones se transponen de forma replicativa (dejan una copia en el genoma a partir del cual se transcribi el ARN), pero no forman un cointegrante. Por tanto, en el ensayo bacteriano no llevaran consigo hasta la clula receptora el plsmido completo que contiene el gen TetR. Lo que en el ensayo pareca una transposicin de cortar y pegar era en realidad una transposicin replicante. 4f) Cmo podra este transposn lograr esta preferencia por el ADN rico en GC? El transposn podra reconocer especficamente una secuencia corta rica en GC en el ADN objeto de estudio. 5) Est interesado en estudiar la regulacin de los genes importantes durante las primeras etapas del desarrollo de los ratones. Su profesor le pide que contine el trabajo de un antiguo estudiante ya licenciado. Este estudiante estaba trabajando en dos genes nuevos a los que llam Hip y Hop. Tanto Hip como Hop son necesarios en los embriones tempranos, pero no despus. El estudiantes licenciado consigui generar el siguiente mapa de restriccin para Hip y Hop:

EcoRI Hip HindIII HindIII

PvuII HindIII

EcoRI Hop HindIII

Ud. decide llevar a cabo una transferencia Southern en Hip y Hop. Sabiendo que estos genes son importantes durante las primeras etapas del desarrollo, decide aislar el ADN genmico de los primeros embriones, as como el de los jvenes adultos. Digiere el HindIII obtiene los siguientes resultados:

Sonda:

Hip

Hop Embrin Adulto

ADN: Embrin Adulto

5a) Est sorprendido con los resultados. Cmo explicara el resultado al utilizar una sonda en la transferencia Southern con Hop? Una vez dada su explicacin, qu podra comentar sobre la regulacin de Hop durante el desarrollo del ratn? Resulta necesario Hop en un ratn adulto o slo durante el desarrollo embrionario?

El gen HOP nicamente es importante durante el desarrollo embrionario. La falta de una banda al pasar la sonda a un ADN adulto indica que el gen HOP ya no est presente en

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los ratones adultos. Es probable que se utilice una recombinacin especfica de sitio para ejercitar este gen una vez que ya no resulta necesario para su desarrollo. Este tipo de regulacin solo es posible en aquellas clulas que estn terminalmente diferenciadas.

5b) Le gustara investigar ms a fondo la regulacin de Hip. Para conseguirlo, utiliza el ADN que aisl anteriormente con dos enzimas, HindIII y EcoRI. En esta ocasin, stos son los resultados obtenidos:

Sonda:

Hip Adulto

Hop Embrin Adulto

ADN: Embrin

Con estos nuevos datos, cmo cree Ud. que se regular Hip durante el desarrollo del ratn? D una explicacin valindose de los datos anteriores. En este caso, la recombinacin especfica de sitio se ha utilizado tambin para regular el gen HIP. Sin embargo, ms que una eliminacin, lo que ha ocurrido es una inversin. Esto se puede comprobar en el cambio en las dimensiones de los fragmentos de restriccin en la transferencia Southern. La situacin asimtrica en el sitio del EcoRI produce dos patrones distintos antes y despus de la inversin.

5c) Utilizando las mismas cepas de ratn que est estudiando, una compaera de laboratorio cra ratones mutantes que no consiguen desarrollarse correctamente. Uno de los ejemplares mutantes muestra mltiples caractersticas embrionarias, an cuando el ratn ha alcanzado la etapa adulta. Entonces, su compaera le pide que realice la caracterizacin de la transferencia Southern en sus ratones mutantes para ver si Hip o Hop son mutantes en la cepa. Usted se presta a ello y digiere el ADN genmico de sus ratones con HindIII y EcoRI. Consigue los siguientes resultados:

Sonda: ADN:

Hip Embrin Adulto

Hop Embrin Adulto

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Con los datos que ya tiene, qu gen cree Ud. que est mutado en los ratones de su compaera? Cmo cree que la regulacin de este gen muta para revelar las caractersticas mutantes anteriormente descritas? El gen HIP parece haber sido mutado en las cepas de su compaera. El gen normalmente se regula por medio de una inversion. El patrn de restriccin en el gel anterior sugiere que algunas clulas no consiguen completar dicha inversin. Las dos bandas del medio son generadas desde clulas donde el HIP se regula de manera correcta, mientras que en las dos bandas de los extremos, se generan de clulas que no consiguen invertir el gen HIP.

6) Ud. ha elaborado un ensayo de transcripcin que recapitula la regulacin in vivo del promotor para el gen Ratchet transcrito ARN Pol II. Al fraccionar este extracto, Ud. ha purificado y clonado dos factores de transcripcin especficos que, junto con los factores de transcripcin ARN Pol II, son necesarios para una correcta regulacin del promotor. Como primer paso a seguir para comprender la funcin de estos factores, Ud. realiza una serie de mutantes de delecin del promotor Ratchet y analiza su efecto en la transcripcin en presencia y ausencia de los factores Click y Clack. Obtiene los siguientes resultados:

-Click -Clack

+Click +Clack

+ + + + + +
6a) Segn estos datos, cul cree que es la funcin de los elementos 3, 6 y 7?

++ + +++ + +++ +++ +++

Lo ms probable es que el elemento 3 sea un sitio de unin activador. Dado que este elemento es necesario para una activacin transcripcional de Click y Clack, seguramente ser el sitio de unin para una de estas protenas. Probablemente, los elementos 6 y 7 forman parte del elemento promotor del ncleo, posiblemente, la caja TATA y la secuencia INR. Esto se puede determinar a partir de sus ubicaciones con respecto al comienzo de la transcripcin y del hecho de que la eliminacin de esas secuencias genera una prdida de los niveles basales de transcripcin.

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Para describir en mayor profundidad los factores identificados, realiza un ensayo de retardo en gel para observar la capacidad de los diferentes factores para unirse al promotor Ratchet. Obtiene los siguientes resultados:

Clack Click

+ +

6b) En funcin de estos datos qu conclusin sacara de la funcin de Click y Clack? Cmo relacionara estos resultados con los datos obtenidos en la parte 3a? Esto muestra que Clack es una protena de unin de ADN, y que Click depende de Clack para asociarse con el ADN. Esto coincide con el hecho de que slo hay un nico sitio de unin activador , como se deduce de su anlisis en el apartado 3. Ya que Click depende de Clack para la asociacin con el ADN , el nico sitio de unin que se necesita es aquel al que Clack est unido. Si ambas protenas unieran ADN, seguramente se observara un sitio de unin para cada protena. 6c) Cmo establecera la regin del factor Clack requerido para la activacin del promotor Ratchet? Para trazar el dominio de activacin de Clack: 1. Fusione Clack al dominio de unin de ADN de una protena de unin de ADN conocida (p.ej. LexA). Esto le permitir trazar dominos de activacin independientes de los efectos sobre una unin de ADN. 2. Realice una serie de deleciones en el extremo de Clack, y fusione cada uno al dominio de unin del ADN LexA. 3. Verifique la capacidad de cada fusin para activar transcripciones a un promotor de prueba. Este promotor debe contener sitios de unin LexA en la regin hacia arriba del sitio inicial transcripcional y un gen indicador (como LacZ) para medir la transcripcin. Esta tcnica permite determinar qu regiones de la protena Clack son necesarias y suficientes para una activacin transcripcional. ** IMPORTANTE: Si contest la pregunta explicando cmo trazar el dominio de unin del ADN de Clack, le restara puntos en un examen. Muchas protenas tienen *ambos* dominios de unin de AND *y* dominios de activacin transcripcional. Asegrese de leer y contestar la pregunta que se le hace.

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Durante su anlisis del promotor Ratchet, Ud. no se ha quedado satisfecho al no poder conseguir el efecto de un tercer factor de transcripcin, Clock, conocido por su capacidad de activar este promotor in vivo. Todos sus anteriores ensayos para transcripcin se efectuaron utilizando ensayos S1 y una sonda de ADN monocatenario de 300 bases de longitud que coincide en 100 bases con el sitio inicial de Ratchet.

100 bases

200 bases

Pensando que quizs haya omitido algo, decide analizar los productos de un conjunto de reacciones de transcripcin realizados en presencia de UTP radiomarcado sobre un gel de agarosa desnaturalizante. Para provocar artificialmente una terminacin de ARN Pol II, corta una cadena de ADN-molde de 2 kb hacia abajo del promotor con una enzima de restriccin. Obtiene los siguientes resultados (ayuda: una depuracin de promotor se completa tras las 100 bases de sntesis de ARN).

Clock Clack Click

+ + + + + + + + + +
2,000 pb 1,000 pb

100 pb
6d) Qu aspecto de la funcin ARN Pol II queda afectado al aadir Clock? Por qu no detect ese efecto el ensayo S1 y s apareci en la prueba de transcripcin no iniciada?

Clock sirve como factor de procesividad para el ARN Pol II. Observe que, cuando se aade Clock, las transcripciones incrementan su longitud de ~300 pb a 2000 pb. Esto no es un efecto en la eliminacin del promotor, dado que esta eliminacin (y con ella, la iniciacin a la transcripcin) se completa a 100 pb. Esto afecta a la elongacin del nuevo transcrito. Otra respuesta plausible es que Clock acta como regulador negativo de la terminacin de transcripcin. As, cuando est presente Clock, los transcritos son ms largos que cuando Clock est ausente.

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En el ensayo S1 una sonda de ADN marcada a 200 pb que se hibrida al transcrito es su lectura para la transcripcin. Se observar en el autoradiograma una banda que se corresponde a esta sonda de 200 pb, para ver si el ARN hibridado mide 200 pb o 2000 pb. De este modo, en un ensayo de proteccin S1, no se dar ninguna informacin sobre la longitud del ARN, y los resultados tanto con la presencia como con la ausencia de la protena Clock sern idnticos. En la prueba de transcripcin no iniciada, uno mide la incorporacin de los rNTP. Se incorporarn rNTP desde el sitio inicial hasta que ocurra la terminacin (que depender de la procesividad intrnseca del ARN Pol II sin Clock, y de la prueba de transcripcin no iniciada del ADN con Clock). Este ensayo le permitir determinar la informacin de la longitud del ARN, y de este modo, podr ver diferentes productos con y sin la protena Clock.

7) Su laboratorio lleva a cabo un estudio sobre una cepa especializada de E. coli que contiene genes inusuales que ayudan en su crecimiento en condiciones de bajos niveles de nutrientes. Ud. est estudiando un gen producido en condiciones de inanicin, el gen funE. Ha utilizado ensayos de proteccin nucleasa S1 para determinar el sitio inicial de la transcripcin para el funE mRNA. La secuencia hacia arriba del sitio inicial incluye regiones -10 y -35 que difieren substancialmente de las secuencias de consenso habituales para E. coli. Utilizando un sitio de restriccin conveniente, fusiona el promotor funE con un gen indicador de -galactosidasa en un plsmido para permitir el estudio detallado de la expresin de este promotor.

FunE Gen: Regin Superior FunE Ncleo Promotor |--FunE secuencia codificadora--> | -35 Gen indicador: Regin Superior | | | -10 +1 EcoRI |--B-gal secuencia codificadora -->

FunE Ncleo Promotor | -35

| | | -10 +1 EcoRI

7a) Ud. mutagena esta cepa y la transforma con su indicador plsmido para encontrar mutantes que afecten la expresin de -galactosidasa. Un mutante, el mutante craZ, tiene una prdida de induccin de actividad -gal en condiciones de inanicin. Ud. examina la expresin de otros genes que han sido producidos en condiciones de inanicin en sus estudios de laboratorio y descubre que estos genes ya no se han producido en el mutante craZ. Teniendo en cuenta que estos genes tienen una regin -35 similar a la del gen funE, d una explicacin sobre la naturaleza del mutante craZ.

Recuerde que la regin -35 est implicada en la especificidad de la unin del ARN polimerasa holoenzima. La mutacin craZ es posible que se encuentre en un factor sigma especializado () que reconoce las regiones -35 inusuales del gen funE gene y genes relacionados. La expresin o actividad de esta subunidad debe ser producida en condiciones de inanicin.

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7b) Estudia una variedad de compuestos para comprobar si incrementan la expresin de la fusin funE / -galactosidasa en clulas de tipo salvaje. Descubre que si le aade calcio, la seal -gal se incrementa significativamente. Para examinar este efecto al nivel transcripcional, realiza primero ensayos de incorporacin en extractos celulares de tipo salvaje, aadiendo el 3 indicador plsmico y el [H ]UTP. Realiza el ensayo con presencia y con ausencia de calcio, luego traslada las reacciones a un gel y expone el gel a una pelcula. La pelcula resultante es la siguiente:

Este resultado sugiere una diferencia en la etapa limitante de velocidad de la iniciacin transcripcional, en presencia y ausencia de calcio. Cul es la etapa limitante de velocidad modificada? Para el ensayo de incorporacin en ausencia de calcio, observar que la mayora de los productos son fragmentos cortos (~5 pb). Esto indica que se han formado complejos ternarios pero que no ha tenido lugar una eliminacin del promotor. Para un ensayo de incorporacin en presencia de calcio, observa que la mayora de los productos son grandes (>300 pb), presumiblemente transcriptos completos. Por ello, en ausencia de calcio, la liberacin del promotor debe ser la etapa limitante de velocidad, pero en presencia de calcio, este paso se hace de manera ms eficiente y ya no limita la transcripcin. 7c) Utilizando el fraccionamiento bioqumico y un ensayo de retardo en gel, su compaero de laboratorio asla una protena que se une sobre la regin -35 de funE. Su compaero determina la secuencia del gen y se da cuenta de que la protena tiene dos dominios, un dominio de unin al ADN y un dominio de unin al calcio. Los dos llegan a la conclusin de que esta protena puede estar transmitiendo los efectos estudiados en (b). Proponga DOS mecanismos posibles para ++ explicar cmo podra traducirse este factor en una transcripcin dependiente Ca -. Qu experimento gentico podra realizar para diferenciarlos? Esta protena podra estar actuando bien como un represor de la transcripcin que se desactiva por la unin al calcio, bien como un activador de la transcripcin que se activa por la unin al calcio. ++ --| Represor --| FunE ++

Ca

OR

Ca

Activador

FunE

Para distinguir entre estas posibilidades, podra eliminar el gen. Si la protena es un represor, el gen eliminado ser insensible al calcio y constitutivamente expresar el FunE a un alto nivel (el

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nivel causado por el calcio natural). Si la Protena es un activador, el gen eliminado ser insensible al calcio y expresar el FunE a un nivel bajo (el nivel sin calcio natural). 7d) Para estudiar ms a fondo la transcripcin de este promotor, Ud. mutagena la regin promotora de su indicador plsmido y observa sus efectos sobre la expresin -gal en presencia de calcio. Consigue una mutacin en la regin 10 llamada silE, que incrementa la expresin -gal en presencia de calcio. Por el contrario, esta mutacin no tiene efecto en la expresin -gal en ausencia de calcio. ---Natural---------SilE------Ca +Ca -Ca +Ca -gal Actividad + +++ + +++++

Utiliza KMnO 4 Para examinar el ADN que se desenrolla en las reacciones de transcripcin realizadas in vitro con un fragmento de ADN bicatenario linear, marcado por el extremo que porta el promotor funE promoter / -gal fusin. El substrato de ADN y la pelcula resultante se muestran a continuacin:

Qu indican estos resultados sobre la naturaleza de la mutacin del silE? Por qu la mutacin del silE slo afecta a la expresin de -gal en presencia del calcio? (Ayuda: tenga en cuenta tambin los datos del apartado (b)). La mutacin del silE incrementa la extensin del desenrollamiento del ADN y la formacin de complejos abiertos, quizs debido a que acerca la inusual secuencia -10 de funE a la regin 10 del consenso de E. coli. La expresin de gal del gen de fusin viene determinada por la etapa limitante de velocidad de la iniciacin. En la ausencia de calcio, la liberacin del promotor es la etapa limitante de velocidad. Por ello, el incremento del desenrollamiento del ADN y de la formacin de complejos abiertos en ausencia de calcio no tendr efecto alguno en la expresin de gal. En presencia de calcio, la liberacin del promotor ya no es limitante de la velocidad. La formacin de complejos abiertos parece ser la etapa limitante de velocidad bajo esas condiciones, por lo que la mutacin silE, que incrementa la extensin del desenrollamiento del ADN (y por tanto, la formacin de complejos abiertos), incrementa tambin la expresin de gal.

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8) Est estudiando un par de factores de transcripcin que regulan el promotor de bombeo (relacionado con la produccin de protenas especficas de los msculos). Ha purificado ambos factores y estudiado su capacidad para regular la transcripcin del promotor de bombeo tanto con, como sin mutaciones en varios elementos claves del promotor.

A
Factor Aadido Natural Ningu no PTF1 PTF2 + ++++ + -

B
Transcripcin No A-Box + + + + No B-Box -

8a) Basndose en los datos de transcripcin anteriores, asigne roles para los elementos A y B del promotor de bombeo. Sea breve. El elemento A es necesario nicamente para transcripciones activadas. Es probable que contenga una secuencia (UAS) reconocida por un activador transcripcional de unin al ADN con secuencia especfica. El elemento B se necesita para transcripciones basales y activadas. Es posible que contenga secuencias TATA y/o elementos de iniciador reconocidos por los factores de transcripcin generales. 8b) Est intrigado con los resultados del ensayo de transcripcin en los que tanto el PTF1 como el PTF2 se aadieron al mismo tiempo. Ud. considera que PTF2 puede inhibir la funcin de PTF1 alterando sus propiedades de unin al ADN. Para confirmarlo realiza un ensayo de retardo en gel utilizando el promotor de bomba.

PTF1

PTF2

PTF1 + P TF2

Sonda libre
Experimentos previos sostienen que tanto PTF1 como PTF2 son dmeros cuando se unen al ADN. Teniendo eso en cuenta cmo explicara los resultados de este ensayo de retardo en gel? PTF2 es una protena ms grande que PTF1, y el complejo ADN-protena, que contiene un dmero de

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PTF2, es ms lento que el que contiene un dmero de PTF1. Cuando tanto el PTF1 como PTF2 estn presentes, se forma un heterodmero que contiene una molcula de PTF1 y otra de PTF2. Este complejo de ADN-protena tiene un tamao intermedio entre los dos homodmeros. 8c) Habiendo trazado el dominio de activacin de PTF1, ahora se pregunta qu parte de PTF2 se necesita para inhibir la funcin de PTF1. Identifica tres regiones como importantes. Dos de esas regiones estn involucradas en las funciones de dimerizacin y unin al ADN del PTF2. La tercera es un dominio separado que no es necesario ni para la dimerizacin ni para la unin al ADN. Exponga una hiptesis para la funcin de este tercer dominio y describa un modelo para los resultados de transcripcin en el apartado (a).

El tercer dominio es probablemente responsable de inhibir la transcripcin basal en conjuncin con el dominio de activacin del PTF1 (quizs, por medio de una interaccin de protena-protena fsica). (Tenga en cuenta que el PTF2 homodmero no inhibe la transcripcin basal).

MODELO: Normalmente, tanto el PTF1 como el PTF2 estn presentes en igual concentracin en la clula. En esas concentraciones, forman predominantemente heterodmeros unidos a la A-box en el promotor. La inhibicin del PTF2 y los dominios de activacin del PTF1 interactan para inhibir incluso las transcripciones basales en los promotores de bomba. En condiciones de baja activacin, la proporcin de PTF1 a PTF2 en la clula cambia, por lo que predomina el PTF1 (p. ej. o bien se produce ms PTF1, o se produce menos PTF2 o ste ltimo se degrada). Esto fuerza la formacin de los homodmeros de PTF1 (ms que la de los heterodmeros), que se unen a la A-box y activan la transcripcin al promotor de bomba a travs de los dominios de activacin.

[PTF1] = [PTF2]

OFF

[PTF1] >> [PTF2]

ON

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9) A continuacin se muestra un borrador de la regin del promotor lac. Complete la informacin que falta en la siguiente tabla:

-35
Sitio CAP
Condiciones de crecimiento Glucosa + IPTG Glucosa + IPTG + Glucosa IPTG Actividad de Lac Z Explicacin, si es inferior a la actividad mxima reprimido por LacI no activado por CAPcAMP CAP-cAMP promueve la formacin de complejos cerrados y LacI promueve la formacin de complejos cerrados, pero bloquea la formacin de complejos abiertos. adelante!

-10
Operador
Protenas enlazadas al promotor y ala posicin de cada una de ellas.

LacI unido al operador ~ nada

CAP-cAMP unido al sitio CAP, RNAP-sigma70 unido a -35 y 10, y LacI unido al operador.

Glucosa IPTG +

CAP-cAMP unido en el sitio CAP activa el promotor, RNAP sigma 70 se unir y vaciar rpidamente la regin del promotor. ~ nada

cyaIPTG +

Ningn cAMP se une a CAP, por lo que CAP no se unir al sitio CAP y el promotor no est activado.

cya- = un mutante en el gen adenilato ciclasa. CAP-cAMP la activacin del promotor lac incrementa la transcripcin en ~50 veces, por lo que se asume que la actividad LacZ se refiere a su actividad altamente activada (activada por CAP y no reprimida por LacI).

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10) Est estudiando un opern bacteriano de reciente identificacin llamado ygo. Parece estar regulado transcripcionalmente por YGP y por el producto de una pequea molcula llamada del opern, YGO. Est transcrito por el ARNP plus sigma 70. a) A continuacin se muestran los resultados de un anlisis gentico de la regulacin del promotor utilizando una fusin de promotor a lacZ. Interprete cada resultado rellenando la columna de defecto molecular y seale si la mutacin es cis o trans. Asuma que en todos los casos el indicador lacZ no ha mutado.

genotipo wt mutante 1

YGO + YGO +++ +++ +++

wt YGP + + YGO na +++/+++

wt Pygo + + YGO na +++/+++

defecto molecular ninguno Defecto del operador (no se puede unir al represor YGP) (El segundo opern que ha aadido para comprobar cis contra trans est reprimido, pero tambin fusionado a LacZ, que se acaba de crear. Habra estado ms claro si se hubiera fusionado a un gen diferente como el luciferasa, como ya se vio en clase.) Defecto del promotor

tipo de mutacin

Constitutivo (cis)

mutante 2 mutante 3

-/-

- /+++

No-inducible (cis)

+++

+++

- /+++

+++/+++

El represor YGP no se une al operador +/- inductor YGO Mutante represor YGP no reprime y bloquea la represin wt

Constitutivo (trans recesivo)

mutante 4

+++

+++

+++/+++

+++/+++

Constitutivo- no represivo, dominante negativo (trans) No inducible (trans dominante)

mutante 5

-/-

-/-

El represor YGP une el operador independiente del inductor YGO y no lo libera.

Obsrvese que los mutantes 1 y 4 tienen los mismos fenotipos, pero tambin hay otras dos mutaciones posibles que podran causarlo.

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b) Ud. asla una sexta mutacin que tiene un fenotipo como el del mutante 3, con la excepcin de que si sobreexpresa la protena 6 mutante (una trans-mutacin) la represin se observara ahora en presencia de YGO. Cmo podra explicar este hecho? Qu ensayo podra realizar para probar su tesis y cul es el resultado que esperara? Cuando YGO de tipo salvaje (YGOwt) se une a YGP, podra unirse tambin al operador de manera cooperativa y la mutacin 6 elimina esta unin cooperativa. La sobreexpresin podra entonces suprimir el efecto de prdida de cooperatividad y restaurar la represin. Para verificar esta hiptesis utilice un ensayo de retardo en gel del promotor del opern de ygo, con concentraciones en aumento de YGPwt o del mutante 6 en presencia de YGO. A continuacin se muestra el resultado de la unin de YGPwt con el operador cooperativamente cuando est activado por el YGO y el mutante 6.

YGPwt +YGO

YGPmutante 6 + YGO

ADN libre

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