UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS FSICAS E MATEMATICAS DEPARTAMENTO DE QUMICA

NOVO COMPLEXO MONONUCLEAR DE COBRE CATALITICAMENTE PROMSCUO: SNTESE, CARACTERIZAO E ESTUDOS CINTICOS

EDUARDO LUIZ SCHILLING

Florianpolis Dezembro/2010
1

Eduardo Luiz Schilling

NOVO COMPLEXO MONONUCLEAR DE COBRE CATALITICAMENTE PROMSCUO: SNTESE, CARACTERIZAO E ESTUDOS CINTICOS

Relatrio apresentado ao Departamento de Qumica da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial da disciplina de Estgio Supervisionado II (QMC 5512)

Orientador: Prof. Dr. Adailton Joo Bortoluzzi Co-Orientadora: M.Sc Geovana Garcia Terra

Florianpolis 12/2010
2

Eduardo Luiz Schilling

NOVO COMPLEXO MONONUCLEAR DE COBRE CATALITICAMENTE PROMSCUO: SNTESE, CARACTERIZAO E ESTUDOS CINTICOS

_______________________________________ Profa. Dra. Ins Maria Costa Brighente Coordenadora de Estgios do Curso de Qumica-Bacharelado

Banca Examinadora:

__________________________________________ Prof. Dr. Adailton Joo Bortoluzzi Orientador

____________________________________ Prof. Dr. Marcos Aires de Brito

__________________________________________ Profa. Dra. Herica Aparecida Magosso

Florianpolis Dezembro/2010
3

Onde cruzam meus talentos e paixes com as necessidades do mundo, l est o meu caminho. Aristteles 4

Agradecimentos
A minha famlia pela oportunidade de existir. Meus pais Waldemar e Vera pelo amor, carinho e liberdade de optar pela arquitetura das molculas. Meu irmo Andr pelas conversas e contato com os gregos. Aos meus tantos amigos e amigas que estiveram comigo durante esta jornada, pela influncia, inspirao e companhia. Sou reflexo das experincias que compartilhei ao lado de vocs. Ao amor, por dar sentido. Aos meus professores e professoras pela sabedoria e exemplos de dedicao ao conhecimento. Ao professor Adailton pela

oportunidade, confiana e parceria. Geovana por acreditar. famlia Labinc, to diversa e divertida, pelos compartilhamentos e orientaes. UFSC, a melhor federal, na melhor cidade. Ao CNPq pelo suporte financeiro.

Sumrio
Agradecimentos ....................................................................................................... 5 Sumrio ..................................................................................................................... 6 Lista de figuras ......................................................................................................... 7 Lista de tabelas ........................................................................................................ 8 Resumo ..................................................................................................................... 9 1 Introduo .......................................................................................................... 10
1.1 1.2 1.3 1.4 A era genmica..................................................................................................... 10 O DNA e as nucleases .......................................................................................... 11 Promiscuidade enzimtica .................................................................................... 13 Qumica inorgnica biomimtica ........................................................................... 15

2 Objetivos............................................................................................................. 18 3 Experimental ...................................................................................................... 19

3.1 Materiais ............................................................................................................... 19 3.2 Mtodos e instrumentao .................................................................................... 19 3.2.1 Temperatura de fuso ....................................................................................... 19 3.2.2 Espectroscopia vibracional na regio do infravermelho IV .............................. 19 3.2.3 Espectroscopia eletrnica (UV-Vis) ................................................................... 19 3.2.4 Difratometria de Raios-X ................................................................................... 20 3.2.5 Titulao potenciomtrica .................................................................................. 20 3.2.6 Eletroqumica .................................................................................................... 21 3.2.7 Promiscuidade cataltica .................................................................................... 21 3.3 Sntese do ligante ................................................................................................. 22 3.3.1 Sntese do N1,N3-bis(2-piridilmetil)1,3-propanodiamina (BPP) ........................... 23 3.3.2 Sntese do 2-(2-piridil)-1,3-bis(2-piridilmetil)hexahidropirimidina (TPP)............... 23 3.4 Sntese do complexo [Cu(TPP)Cl2] 1 ................................................................... 24

4 Resultados e Discusso .................................................................................... 26

4.1 Caracterizao do complexo ................................................................................. 26 4.1.1 Espectroscopia vibracional no infravermelho ..................................................... 26 4.1.2 Estrutura cristalina ............................................................................................. 27 4.1.3 Eletroqumica .................................................................................................... 29 4.1.4 Espectroscopia eletrnica UV-Vis ...................................................................... 30 4.1.5 Titulao potenciomtrica ................................................................................... 32 4.1.6 Titulao espectrofotomtrica ............................................................................ 33 4.2 Reatividade ........................................................................................................... 35 4.2.1 Hidrlise do 2,4-dinitrofenilfosfato (2,4-BDNPP) ................................................ 35 4.2.1.1 Efeito do pH..................................................................................................... 36 4.2.1.2 Efeito do substrato........................................................................................... 36 4.2.2 Oxidao do 3,5-di-terc-butilcatecol (3,5-DTBC) ............................................... 38 4.2.2.1 Efeito do pH..................................................................................................... 38 4.2.2.2 Efeito do substrato........................................................................................... 39

5 Concluses ......................................................................................................... 41 6 Perspectivas ....................................................................................................... 42 7 Referncias ......................................................................................................... 43 6

Lista de figuras
Figura 1. As ligaes fosfodister formam a estrutura bsica das molculas do DNA e RNA. ......................................................................................................... 11 Figura 2. Estrutura da enzima endonuclease EcoRV ligada ao DNA. No detalhe a presena do on metlico assistindo a hidrlise. ......................................... 13 Figura 3. Estrutura do biscloro-1,4,7-triazaciclonano de cobre(II). ........................... 16 Figura 4. Rota sinttica para a obteno do ligante ................................................. 23 Figura 5. Espectro vibracional no infravermelho do ligante TPP em KBr. ................ 24 Figura 6. Espectro vibracional no infravermelho do complexo 1 em KBr. ................ 25 Figura 7. Espectros de infravermelho do ligante (A) e do complexo 1 (B) em KBr. O quadro direita destaca a duplicao do pico atribudo piridina. ............. 26 Figura 8. ORTEP do complexo 1 com elipsides a 50% de probabilidade. ............. 28 Figura 9. Voltamograma do complexo a 2x10-3 mol L-1 em CH3CN a 25 C. ............ 29 Figura 10. Espectro eletrnico do complexo 1 a 4x10-4 mol L-1 (---) e do ligante TPP a 6x10-3 mol L-1 em gua (- - -). ................................................................... 31 Figura 11. Mudana geomtrica do complexo em soluo ...................................... 31 Figura 12. Distribuio e proposta das espcies em equilbrio para o complexo 1 em mistura CH3CN/H2O (1:1) a 25 C. .............................................................. 33 Figura 13. Espectros do equilbrio entre a espcie cida e neutra do complexo 1. . 34 Figura 14. Espectros do equilbrio entre a espcie neutra e bsica do complexo 1. No detalhe, o deslocamento da banda d-d. ................................................. 35 Figura 15. Dependncia do pH para a reao de hidrlise do 2,4-BDNPP pelo complexo 1 a 50 C. Condies: [complexo] = 3,9x10-5 mol L-1, [2,4-BDNPP] = 4,99x10-3 mol L-1, soluo CH3CN/H2O 1:1. ............................................. 36 Figura 16. Perfil de saturao para a reao de hidrlise do 2,4-BDNPP................ 37 Figura 17. Dependncia do pH para a reao de oxidao do 3,5-DTBC pelo complexo 1 a 25 C. Condies: [complexo] = 5,0x10-5 mol L-1, [3,5-DTBC] = 2,4x10-3 mol L-1, soluo MeOH/H2O 32:1................................................... 39 Figura 18. Perfil de saturao para a reao de oxidao do 3,5-DTBC. ................ 40

Lista de tabelas
Tabela 1. Tipos de promiscuidade enzimtica15. .................................................... 14 Tabela 2. Modos vibracionais e comprimentos de onda destacados do ligante e do complexo. .................................................................................................... 27 Tabela 3. Principais distncias () e ngulos () de ligao do complexo 1. ........... 28 Tabela 4. Coeficientes de absortividade molar do ligante TPP e do complexo 1 em gua. ........................................................................................................... 32 Tabela 5. Parmetros cinticos da reao de hidrlise do 2,4-BDNPP catalisada pelo complexo 1. ......................................................................................... 37 Tabela 6. Parmetros cinticos da reao de hidrlise do 2,4-BDNPP catalisada pelo complexo 1. ......................................................................................... 40

Resumo
Enzimas que possuem atividade cataltica frente a diferentes substratos atravs de diferentes mecanismos so chamadas promscuas. O estudo da promiscuidade cataltica dessas enzimas tem contribudo para o entendimento da evoluo molecular nos organismos, na expanso do uso das enzimas em processos sintticos industriais e no desenvolvimento de drogas multiativas. A sntese de complexos metlicos modelos que mimetizam o stio ativo de enzimas contribui significativamente para a elucidao de suas funes e mecanismos. Porm, so raros os exemplos de modelos mimticos que atuem de maneira promscua. Este trabalho apresenta a sntese de um complexo mononuclear de cobre(II) e sua caracterizao por tcnicas espectroscpicas, cristalogrficas, eletroqumicas e potenciomtricas. As propriedades estruturais e eletrnicas adequadas exibidas pelo complexo motivaram o estudo da sua catlise frente a diferentes reaes. O complexo mostrou-se cataliticamente promscuo, tendo eficincia na catlise da hidrlise do dister 2,4-dinitrofenilfosfato e na oxidao do 3,5-di-terc-butilcatecol.

Palavras-chave: cobre(II); complexo modelo; promiscuidade cataltica; catecolase; hidrolase.

1
1.1

Introduo
A era genmica
No ano de 1944, Erwin Schrdinger, famoso por suas contribuies para a

mecnica quntica ondulatria, publicou o livro What is Life?1, resultado de conferncias realizadas em Dublin no ano anterior. Neste livro o fsico discute a seguinte questo fundamental: Como podem eventos no espao e no tempo, que ocorrem dentro dos limites espaciais de um organismo, ser abordados pela fsica e qumica?. Esta pergunta respondida preliminarmente por Schrdinger: A bvia incapacidade dos fsicos e qumicos atuais para lidar com esses assuntos no , de forma alguma, razo para duvidar que eles podem ser abordados por essas cincias. No decorrer do livro o autor busca interpretar a vida utilizando conceitos fsicos, qumicos e matemticos. Defende a idia de que as instrues hereditrias deveriam estar armazenadas no tecido molecular dos cromossomos. No contexto do final da Segunda Guerra Mundial a comunidade cientfica encontrava-se aturdida pela exploso das bombas atmicas e refletia sobre o papel das cincias e a utilizao do conhecimento para fins de extermnio. Neste cenrio, o livro de Schrdinger foi extraordinariamente influente2. Entre alguns dos que, provocados por Schrdinger, optaram pela cincia da vida esto Francis Crick (fsico), James Watson (bilogo) e Maurice Wilkins (fsico desiludido com sua participao no projeto Manhattan). Em abril de 1953 Watson e Crick, baseados nos estudos cristalogrficos de Maurice Wilkins e Rosalind Franklin modelo da dupla hlice da estrutura do DNA .
Foi um momento e tanto. Estvamos certos que estvamos certos. Algo assim to simples, to sucinto, no podia estar errado. (WATSON, 2003)
5 3-4

, publicaram o

A natureza qumica dos genes havia sido desvendada. O conhecimento da estrutura do DNA levou, entre tantos outros avanos, ao entendimento da biossntese das protenas, desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante e 10

sequenciamento do genoma humano. Iniciava-se a era genmica. Hoje o homem capaz de sintetizar vida6 e interferir no processo evolutivo das espcies, assuntos que geram tanta polmica quanto as bombas atmicas.

1.2

O DNA e as nucleases
A ligao qumica escolhida pela natureza para preservar as informaes

hereditrias foi a do tipo fosfodister, associada a um acar e a uma base nitrogenada. A molcula formada por estas ligaes carrega toda a informao sobre um organismo: o DNA (Figura 1). A capacidade de formar duas ligaes e continuar na forma inica elegeu o cido fosfrico como a espcie ideal para formar a fita da hereditariedade. A carga negativa resultante serve tanto para proteger o dister da hidrlise como para manter a molcula confinada a uma membrana lipdica7.

Figura 1. As ligaes fosfodister formam a estrutura bsica das molculas do DNA e RNA.

O tempo de meia vida estimado em 130000 anos para a reao de hidrlise do DNA8 reflete a estabilidade desta ligao. A dificuldade para quebr-la importante para garantir que a informao seja preservada de forma segura, porm pode se tornar um problema caso alguma mutao ocorra e precise ser reparada, se um DNA estranho for detectado e precise ser destrudo ou para hidrolisar um mRNA a fim de evitar que protenas sejam sintetizadas desnecessariamente9. As hidrolases, especificamente as nucleases, so as ferramentas criadas pela natureza para realizar a manuteno destas ligaes, enzimas que aceleram na ordem de 1012 vezes a reao de hidrlise em relao reao no catalisada10. Inicialmente acreditou-se que as nucleases atuassem somente na reciclagem de cidos nuclicos devido a sua associao com o pncreas. Entretanto, hoje 11

sabe-se que elas participam de uma ampla gama de processos bioqumicos, entre eles: replicao, reparo, recombinao e mutagnese do DNA, alm de atuarem no mecanismo de defesa contra cidos nuclicos estrangeiros e sistema imunolgico de mamferos11. O estudo das nucleases ao longo da histria mostra-se interessante do ponto de vista conceitual e tcnico. A ribonuclease pancretica foi a primeira protena a ter sua sequncia de aminocidos determinada e levou confirmao de que as estruturas terciria e secundria das protenas so determinadas pela sua estrutura primria. As nucleases tm sido estudadas extensivamente na busca por respostas a respeito do mecanismo cataltico de enzimas. As ribonucleases foram usadas no seqenciamento do primeiro tRNA o que levou ao entendimento de seu papel no mecanismo gentico. Acima de tudo, a descoberta das endonucleases de restrio resultou no desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante, metodologias de seqenciamento e novos mtodos de mapeamento gentico11. Com o desenvolvimento da cristalografia de biomolculas tornou-se possvel a resoluo da estrutura de diversas nucleases. Aliado ao estudo de seus mecanismos, notou-se que a grande maioria delas utiliza ctions metlicos (Mg, Ca, Fe, Mn, Zn) para assistir a hidrlise da ligao fosfodister12. Estas so chamadas de metalonucleases e apresentam uma grande variedade de estruturas, contendo centros mono ou multimetlicos. A funo dos metais de principalmente neutralizar o esqueleto carregado do DNA, ativar nuclefilos e estabilizar o estado de transio13. A Figura 2 mostra a enzima endonuclease EcoRV ligada dupla fita do DNA. Amplamente utilizada em biologia molecular, esta enzima cliva a dupla fita de forma simultnea utilizando ons de Mg2+ para neutralizar os oxignios ligados do grupo fosfato e ativar molculas de gua. O nmero de ons envolvidos e qual molcula de gua realiza o ataque ainda incerto10.

12

Figura 2. Estrutura da enzima endonuclease EcoRV ligada ao DNA. No detalhe a presena do on metlico assistindo a hidrlise.

1.3

Promiscuidade enzimtica
A grande maioria das reaes envolvendo a construo ou reciclagem de

biomolculas nos organismos so assistidas por enzimas. As enzimas so protenas, conjunto de protenas ou molculas de RNA. Elas atuam diminuindo a energia do estado de transio e, consequentemente, diminuem a energia de ativao das reaes, acelerando-as10. Tradicionalmente, cursos introdutrios de bioqumica, assim como livros texto, referem-se s enzimas como catalisadores extremamente especficos, com apenas algumas excees10, 14-15. Entretanto, estudos recentes tm revelado que a versatilidade cataltica no a exceo, mas sim a regra entre as enzimas, molculas muito mais flexveis do que se imaginava16. O fenmeno de uma enzima catalisar reaes no esperadas definido como promiscuidade enzimtica15. A promiscuidade ocorre de diferentes formas e pode ser classificada de acordo com o seu tipo, listados na Tabela 1.

13

Tabela 1. Tipos de promiscuidade enzimtica15. Tipo Descrio

Enzimas com atividade cataltica em vrias condies Condio reacionais diferentes do seu

Exemplo
Maltase: reversa .
17

reao

natural, como: ambiente anidro e condies extremas de temperatura e pH. Enzimas com especificidade relaxada ou Lipase: resoluo quiral de cidos18. que catalisam qumicas A com diferentes diferentes

Substrato

ampla. Enzimas

transformaes estados de

transio.

promiscuidade

cataltica pode ser: (i) Acidental: reao lateral catalisada pela Cataltica enzima natural. Aminopeptidase hidrolisando fosfodiesteres19. (ii) Induzida: catlise frente reao distinta graas a uma ou mais mutaes na enzima natural. Aminopeptidase oxidando catecis20.

O estudo da promiscuidade enzimtica tem-se revelado muito importante para o esclarecimento do processo de evoluo molecular divergente das enzimas15. A atividade secundria pode ser a base para uma nova funo em potencial, o que significa uma vantagem seletiva e evita a necessidade de criar-se uma enzima do zero16. H tambm aspectos prticos, pois a promiscuidade enzimtica pode ser explorada para obteno de novos catalisadores com aplicao na biocatlise21 e desenvolvimento de drogas mais eficientes22.

14

1.4

Qumica inorgnica biomimtica

A aplicao de metais para tratar molstias humanas data de pelo menos 500

anos a.C. Elementos inorgnicos, especialmente os metais, so responsveis por importantes funes biolgicas, incluindo sinalizao celular, metabolismo, produo de energia e sistema imunolgico23. A utilizao de sondas estruturais e funcionais inorgnicas e a expanso da utilizao dos metais na medicina representam outra importante interface entre a qumica inorgnica e a biologia. De fato, a qumica bioinorgnica caracteriza-se por sua ampla multidisciplinaridade24. A inerente complexidade das enzimas representa uma enorme dificuldade aos estudos detalhados de seus mecanismos. Qumicos bioinorgnicos tm se inspirado nos stios ativos das metaloenzimas e planejam anlogos sintticos que mimetizam suas estruturas, propriedades fsicas e funes nos sistemas naturais23. Entre os objetivos da catlise bioinspirada esto: entender, imitar e melhorar as enzimas, catalisadores criados pela natureza ao longo de milhes de anos de evoluo25. Na tentativa de elucidao dos mecanismos envolvidos no processo de hidrlise das ligaes fosfodister, inmeros grupos ao redor do mundo desenvolvem pesquisas relacionadas sntese de composto capazes de clivar as ligaes do DNA e RNA. Alm do entendimento do mecanismo, estas nucleases sintticas podem ser usadas como sondas conformacionais da estrutura do DNA, antibiticos e drogas quimioteraputicas26. Buscam-se molculas capazes de clivar o DNA de maneira mais especfica do que as enzimas naturais, as quais apresentam seletividade de 4, 6 ou 8 bases. Uma atividade hidroltica pronunciada aliada alta especificidade resulta em novas ferramentas de interesse biotecnolgico e em agentes quimioteraputicos capazes de atuar no bloqueio da expresso gnica, a nvel de DNA26. Dentre os primeiros compostos capazes de clivar o DNA esto o [Cu(1,10fenantrolina)] e [Fe(EDTA)]. Estes complexos degradam o DNA via mecanismos oxidativos atravs da formao de espcies radicais hidroxil, as quais possuem alta reatividade porm nenhuma especificidade27. Apesar de teis para determinadas aplicaes (DNA footprinting por exemplo), mecanismos de clivagem oxidativa no

15

geram fragmentos do tipo 5-fosfato e 3-hidroxil produzidos por metalonucleases naturais12. Devido pronunciada acidez de Lewis e ausncia de qumica redox, metais lantandeos tm atrado ateno para o desenvolvimento de complexos que clivem o DNA de forma hidroltica28. Porm, a baixa solubilidade e tendncia a formar hidrxidos sob condies fisiolgicas restringem sua utilizao29. Este problema evitado quando so utilizados metais biodisponveis (Fe, Co, Ni, Cu, Zn) e ligantes bioinspirados que imitam os principais resduos de aminocidos coordenantes (histidina, tirosina, glutamato, aspartato, metionina e cistena). Destaca-se a atividade de complexos de cobre com ligantes N doadores. A riqueza espectroscpica e eletroqumica deste metal aliado a ligantes adequados permite a investigao detalhada do mecanismo de hidrlise. Dentre os sistemas mais estudados esto o complexo biscloro-1,4,7-triazaciclonano de cobre(II) (Figura 3)9 e seus derivados, capazes de clivar o DNA plasmidial e causar apoptose em clulas BEL-7402 (carcinoma hepatocelular humano)29.

Figura 3. Estrutura do biscloro-1,4,7-triazaciclonano de cobre(II).

Com base nas informaes obtidas das hidrolases naturais e de complexos modelos, uma metalonuclease sinttica deve (1) possuir duas posies lbeis cis orientadas a fim de permitir a coordenao do substrato e uma molcula de gua; (2) reduzir o pKa da gua coordenada favorecendo a formao de um hidrxido coordenado ao metal; (3) ativar o substrato frente ao ataque nucleoflico; (4) estabilizar o estado de transio e (5) liberar os produtos rapidamente9. Apesar de existirem inmeros exemplos de modelos que mimetizam com sucesso as propriedades das mais variadas enzimas, so raros os exemplos de estudos que explorem a versatilidade qumica e possvel promiscuidade destes complexos. Recentemente, Neves e colaboradores tm se atentado para o fato de que tambm os complexos modelos so capazes de atuar frente a diferentes substratos, catalisando diferentes reaes. Descobriu-se que um complexo mononuclear de cobre(II), inicialmente projetado como modelo estrutural e funcional da galactose oxidase, catalisa a hidrlise de protenas e da dupla fita de DNA30, 16

mesmo tipo de promiscuidade apresentado pela enzima aminopeptidase P19. Outro complexo binuclear de cobre(II) com ponte hidrxo apresentou atividade como catecolase e nuclease, catalisando a reao de oxidao de catecis e hidrlise do DNA31. Neste trabalho apresentado um novo complexo mononuclear de cobre(II) com um ligante N-doador e a investigao da sua atividade frente s reaes de hidrlise de fosfatos e oxidao de catecis, na busca de maiores informaes sobre o fenmeno de promiscuidade.

17

Objetivos

Sintetizar o ligante 2-(2-piridil)-1,3-bis(2-piridilmetil)hexahidropirimidina (TPP) e caracteriz-lo por tcnicas espectroscpicas e ponto de fuso;

Sintetizar o complexo de cobre(II) com o ligante TPP e caracteriz-lo por tcnicas cristalogrficas, espectroscpicas, eletroqumicas e

potenciomtricas;

Avaliar a atividade do complexo frente hidrlise do substrato modelo 2,4-bisdinitrofenilfosfato (2,4-BDNPP);

Avaliar a atividade do complexo frente oxidao do substrato modelo 3,5-di-terc-butilcatecol (3,5-DTBC).

18

3
3.1

Experimental

Materiais
Os seguintes reagentes e solventes utilizados foram obtidos de fontes

comerciais e empregados sem purificao prvia: acetona, acetonitrila, acetonitrila grau UV/HPLC, cido clordrico, argnio, bicarbonato de sdio, cloreto de cobre hidratado, cloreto de potssio, clorofrmio, diclorometano, etanol, hidrxido de sdio, sulfato de sdio anidro. A 1,3-propanodiamina e o 2-piridilcarboxialdedo foram destilados a presso reduzida.

3.2

Mtodos e instrumentao

3.2.1 Temperatura de fuso

Os pontos (ou, eventualmente, faixas) de fuso dos precursores e ligante final isolados foram medidos utilizando-se um aparelho BCHI, modelo Melting Point B-540.

3.2.2 Espectroscopia vibracional na regio do infravermelho IV

Os espectros vibracionais na regio do infravermelho (4000 400 cm-1) foram coletados em um espectrofotmetro Varian 3100 FT-IR Excalibur Series. A transmitncia (%T) das amostras diludas em pastilhas de KBr foi registrada no Laboratrio de Cintica e Fenmenos Interfaciais Departamento de Qumica UFSC.

3.2.3 Espectroscopia eletrnica (UV-Vis)

Os espectros eletrnicos na regio do ultravioleta, visvel e infravermelho prximo foram obtidos em um espectrofotmetro Perkin-Elmer Lambda-19. Os 19

experimentos em soluo foram realizados utilizando-se solventes de grau espectroscpico apropriado para cada amostra em cubetas de quartzo de caminho ptico de 1 cm.

3.2.4 Difratometria de Raios-X

As anlises cristalogrficas foram realizadas na Central de Anlises do Departamento de Qumica da Universidade Federal de Santa Catarina. Os dados foram coletados em um difratmetro automtico ENRAF-NONIUS CAD-4 para monocristais equipado com um tubo de molibdnio (MoK = 0,71069 ) e monocromador de grafite a temperatura ambiente. A estrutura cristalina foi resolvida atravs de mtodos diretos com a utilizao do programa SHELXS97 e os dados foram refinados pelo mtodo dos mnimos quadrados com matriz completa, com a utilizao do programa SHELXL9732. As representaes grficas das estruturas moleculares foram geradas utilizando o programa PLATON33.

3.2.5 Titulao potenciomtrica

As constantes de protonao do complexo foram determinadas atravs de titulao potenciomtrica em soluo acetonitrila:gua (1:1), mesmas condies dos estudos cinticos. Utilizou-se um pHmetro Micronal B375, com os eletrodos blue glass e de
-1

referncia

(calomelano)

calibrados
-1

com

padres

cido

(HCl 0,100 mol L ) e base (NaOH 0,100 mol L ) em uma clula termostatizada a 25,00 0,005 C, para ler o pH diretamente (pH = -log[H+]). A gua utilizada no preparo das solues foi bidestilada na presena de KMnO4 e a fora inica mantida em 0,100 mol L-1 pela adio de KCl. Solues de 4,00x10-4 mol L-1 de complexo foram tituladas pela adio de volumes fixos de uma soluo padro de KOH 0,100 mol L-1 sob fluxo de argnio. Os clculos foram realizados com o programa BEST7 e os diagramas de distribuio de espcies gerados com o programa Species.

20

3.2.6 Eletroqumica
O comportamento redox do complexo foi investigado por voltametria cclica em um potenciostato-galvanostato BAS (Bioanalytical Systems, Inc.) modelo Epsilon, no Laboratrio de Bioinorgnica e Cristalografia, Departamento de Qumica da UFSC. O experimento foi realizado em soluo de acetonitrila sob atmosfera de argnio. Neste experimento, utilizou-se hexafluorfosfato de tetrabutilamnio (0,1 mol L-1) como eletrlito suporte e uma clula eletroltica com trs eletrodos: eletrodo de trabalho - carbono; eletrodo auxiliar - platina; eletrodo de referncia - Ag/Ag+. Para correo do eletrodo de referncia utilizou-se o par redox ferrocnio/ferroceno como padro interno34.

3.2.7 Promiscuidade cataltica

A capacidade de o complexo catalisar as reaes de hidrlise do substrato 2,4-BDNPP e oxidao do 3,5-DTBC foi investigada espectrofotometricamente em um UV-Vis Varian Cary 50 BIO. Tanto o produto da hidrlise, o 2,4-dinitrofenolato, e o da oxidao, a 3,5-di-terc-butilquinona, apresentam uma banda de absoro em 400 nm com absortividades molares de 12100 mol-1 L cm-135 e 1900 mol-1 L cm-1 36, respectivamente. 3.2.7.1 Hidrlise Devido conhecida baixa atividade dos complexos mononucleares de cobre(II) na reao de hidrlise, as cinticas foram realizadas em banho termostatizado a 50 C. Atravs do mtodo das velocidades iniciais pelo grfico da concentrao em funo do tempo determinou-se os parmetros cinticos. A influncia do pH na faixa de 4 a 11 sobre a reao de hidrlise do fosfato foi estudada em condies de excesso de substrato. Em cubetas de vidro com capacidade para 4 mL e caminho ptico de 1 cm, seladas com tampa de teflon, foram adicionados 1500 L de soluo aquosa de tampo ([T] = 0,10 mol L-1, I = 0,1 mol L-1 LiClO4, TRIS pH 4 a 5, MES pH 6 a 9 e CAPS pH 10 a 11), 500 L de acetonitrila grau HPLC e 200 L de soluo do complexo ([C]final = 3,9x10-5 mol L-1) em acetonitrila. A temperatura foi estabilizada a 50 C e a reao iniciada pela 21

adio de 800 L de soluo do substrato em acetonitrila ([S]final = 4,99x10-3 mol L-1) e monitorada durante 5 minutos. Paralelamente, realizou-se a reao controle sem a presena do complexo com 700 L de acetonitrila. Os estudos em condies de excesso de substrato foram realizados em pH 10,0, correspondente espcie que apresentou maior atividade, a fim de determinar sua eficincia cataltica. cubeta foram adicionados 1500 L do tampo CAPS ([T] = 0,10 mol L-1, I = 0,1 mol L-1 LiClO4), 200 L de soluo do complexo ([C]final = 2,7x10-5 mol L-1) alm de quantidade suficiente de acetonitrila para completar 3 mL. Quando equilibrados a 50 C a reao foi iniciada pela adio variada de volumes da soluo de substrato ([S]final = 6,74x10-4 a 6,79x10-3 mol L-1). Os mesmos experimentos sem a presena do complexo foram realizados paralelamente e a hidrlise no catalisada descontada da constante total da reao. 3.2.7.2 Oxidao As cinticas de oxidao foram realizadas em condies de excesso de metanol devido solubilidade do substrato. A dependncia do pH foi investigada na faixa de 5 a 10 utilizando-se solues aquosas dos tampes MES e TRIS 1,0 mol L-1 sem fora inica e solues metanlicas saturadas com oxignio do complexo e substrato. Os volumes das solues foram adicionados em cada cubeta foram de forma a obter 3,0 x 10-5 mol L-1 de complexo, 5,0 x 10-3 mol L-1 de 3,5-DTBC (167 vezes de excesso) e uma proporo de 32:1 de metanol/gua. Os parmetros cinticos da reao foram obtidos pelo estudo do excesso de substrato, realizado em pH 9.

3.3

Sntese do ligante
A rota utilizada para a sntese do ligante foi adaptada do mtodo proposto por

Hureau e colaboradores37 e est resumida na Figura 4.

22

Figura 4. Rota sinttica para a obteno do ligante

3.3.1 Sntese do N1,N3-bis(2-piridilmetil)1,3-propanodiamina (BPP)

Em 30 mL de metanol foram solubilizados 9,50 mL de 2-piridilcarboxialdedo (100 mmol) e com o auxlio de um funil de adio 4,20 mL de 1,3-propanodiamina (50 mmol) dissolvidos em 10 mL de metanol foram gotejados lentamente soluo. A mistura reacional permaneceu sob agitao por 1,5 h e o acompanhamento por cromatografia de camada delgada (CCD) mostrou o desaparecimento dos reagentes de partida e o aparecimento de uma mancha atribudo formao da imina. A soluo foi resfriada com banho de gelo seguida da adio de 1,89 g de NaBH4 (50 mmol). Depois de mais uma hora sob agitao, o metanol foi rotaevaporado e o leo obtido solubilizado em 90 mL de soluo NH4Cl 10%. O produto foi extrado com CHCl3 (3 x 50 mL) e as fases combinadas foram secas com Na2SO4 anidro. Aps remoo do solvente, o produto BPP foi obtido com 76% de rendimento.

3.3.2 Sntese do 2-(2-piridil)-1,3-bis(2-piridilmetil)hexahidropirimidina (TPP)

23

Sobre uma soluo de 18,4 g de BPP (72 mmol) em 100 mL de metanol foram adicionados 6,82 mL de 2-piridilcarboxialdedo (72 mmol). A mistura foi mantida em refluxo por 3 horas. A soluo escura resultante foi rotaevaporada e um leo viscoso foi obtido. O leo foi solubilizado em ter e permaneceu em repouso. A lenta evaporao do ter deu origem a bonitos cristais prismticos, que foram filtrados e lavados com acetona gelada. O produto foi obtido com 71% de rendimento e caracterizado por IV (Figura 5) e ponto de fuso = 128,4 129,5 C. IV (KBr) em cm-1: (H2O) 3450; (C-HAr) 3070-3007; (C-HAlif) 2957-2723; (C=C) 1590 e (C=N) 1433.

2957 3007 3070

3450

2723

T%

2792
1590

1433

4000

3500

3000

2500

/ cm

2000
-1

1500

1000

500

Figura 5. Espectro vibracional no infravermelho do ligante TPP em KBr.

3.4

Sntese do complexo [Cu(TPP)Cl2] 1

uma suspenso de 0,276 g (0,8 mmol) do ligante TPP em metanol adicionou-se 0,170 g (1,0 mmol) de cloreto de cobre(II) solubilizado no mesmo solvente, totalizando 30 mL. Depois de uma hora de agitao, a soluo foi filtrada e 24

permaneceu em repouso. Duas semanas depois observou-se a formao de reluzentes cristais verdes adequados resoluo estrutural via difratometria de raios-X. O complexo foi caracterizado por espectroscopia no infravermelho (Figura 6). IV (KBr) em cm-1: (C-HAr) 3075-3027; (C-HAlif) 2956-2870; (C=C) 1611 e (C=N) 1443 e 1433.

T%

2870 2956 3027 3075 1611

1443 1433

4000

3500

3000

2500

/ cm

2000

1500

1000

500

-1

Figura 6. Espectro vibracional no infravermelho do complexo 1 em KBr.

25

4
4.1

Resultados e Discusso
Caracterizao do complexo

4.1.1 Espectroscopia vibracional no infravermelho

A tcnica de espectroscopia no infravermelho foi utilizada, pois alia rapidez e baixo custo fornecendo informaes valiosas sobre a interao entre o ligante e o on metlico. O ligante TPP contm tomos de nitrognio piridnicos e amnicos com pares de eltrons disponveis para interao com o metal, e esta interao afeta as frequncias de absoro vibracionais do ligante. Portanto, a fim de garantir que os cristais formados a partir da sntese so realmente do complexo formado entre o ligante TPP e o cobre, foram comparados os espectros do ligante e do complexo. O espectro de infravermelho dos cristais obtidos na sntese do complexo 1 mostra as principais bandas do ligante ligeiramente deslocadas, evidncia da complexao com o metal. A partir da sobreposio dos espectros do ligante e do complexo (Figura 7) observa-se que a banda referente ao estiramento C=N das piridinas encontra-se duplicado. A banda em 1433 cm-1 presente em ambos os espectros indica a presena de piridina no coordenada no complexo enquanto que a banda de 1443 cm-1 atribuda presena de piridina coordenada ao cobre. Os estiramentos do ligante e do complexo esto resumidos na Tabela 2.

A
T%

4000

3500

3000

2500 2000 ~ / cm-1

1500

1000

500

1600 1500 1400 1300 1200 ~ / cm-1

Figura 7. Espectros de infravermelho do ligante (A) e do complexo 1 (B) em KBr. O quadro direita destaca a duplicao do pico atribudo piridina.

26

Tabela 2. Modos vibracionais e comprimentos de onda destacados do ligante e do complexo.

Atribuies TPP Complexo (C-HAr) / cm 3070-3007 3075-3027
-1

(C-HAlif) / cm 2957-2723 2956-2870

-1

(C=C) / cm 1590 1611

-1

(C=N) / cm 1433

-1

1443 e 1433

4.1.2 Estrutura cristalina

A partir dos monocristais obtidos a estrutura do complexo 1 foi determinada pela tcnica de difratometria de raios X. Esta tcnica permite que sejam determinadas as posies relativas de cada tomo e, portanto, a estrutura da molcula que compe o cristal. O complexo cristalizou no sistema monoclnico e grupo espacial P21/n de forma mononuclear, com quatro molculas de gua de cristalizao. O centro de cobre(II) encontra-se em um ambiente de coordenao N3Cl2 como mostra a Figura 8. As distncias e ngulos de ligao (Tabela 3) em torno do centro metlico indicam que os tomos de nitrognio N1, N12 e N32 ocupam posies em um mesmo plano. A geometria de coordenao do complexo 1 pode ser analisada atravs do clculo do parmetro . Este parmetro, definido por Addison e colaboradores38 como = ( )/60 onde e so os dois maiores ngulos, indica se a geometria de pirmide quadrada ( = 0) ou bipirmide trigonal ( = 1). O complexo apresenta um valor de = 0,53, reflexo do alto grau de distoro geomtrica ao redor do centro metlico.

27

Figura 8. ORTEP do complexo 1 com elipsides a 50% de probabilidade.

A estrutura revelou a presena de uma piridina no coordenada, confirmado a suspeita observada no infravermelho. A presena dos dois tomos de cloro coordenados de maneira cis uma caracterstica importante para que o complexo tenha atividade na hidrlise de disteres de fosfato9 (Seo 4.2.1). Tabela 3. Principais distncias () e ngulos () de ligao do complexo 1.
Cu1-N12 Cu1-N32 Cu1-N1 1.962(5) 1.974(5) 2.085(5) Cu1-Cl1 Cu1-Cl2 2.3063(19) 2.420(2)

N12-Cu1-N32 N12-Cu1-N1 N32-Cu1-N1 N12-Cu1-Cl1 N32-Cu1-Cl1

164.6(2) 83.6(2) 81.4(2) 92.19(17) 95.74(17)

N1-Cu1-Cl1 N12-Cu1-Cl2 N32-Cu1-Cl2 N1-Cu1-Cl2 Cl1-Cu1-Cl2

132.80(16) 95.85(17) 93.57(17) 116.14(16) 111.06(8)

28

4.1.3 Eletroqumica
A fim de estudar o comportamento redox do complexo 1, este foi submetido anlise eletroqumica de voltametria cclica. Nesta tcnica feita uma varredura de potencial em relao soluo do composto em estudo e diversas informaes so obtidas. Entre elas, o potencial de cada transferncia de eltrons da amostra, assim como o a reversibilidade da reao eletroqumica. O voltamograma obtido (Figura 9) bastante claro e mostra apenas um processo quasi-reversvel com E1/2 = -247 mV atribudo ao par CuII/CuI.
40

30

20

i / A

10

-10

-20 1000 800 600 400 200 0 -200 -400 -600

E / mV vs NHE

Figura 9. Voltamograma do complexo a 2x10 mol L em CH3CN a 25 C.

-3

-1

Complexos

de

cobre(II)
II I

geralmente

apresentam

perfil

eletroqumico

irreversvel para o par Cu /Cu pois, ao ser reduzido, o cobre torna-se um sistema d10 e exige uma adaptao na geometria da esfera de coordenao para um tetraedro. Esta mudana geomtrica faz com que ligantes rgidos tenham sua afinidade pelo metal diminuda, e a formao de outras espcies, por exemplo a reduo a cobre(0) na superfcie do eletrodo, acarretam na irreversibilidade do processo. O resultado obtido indica que nas condies do experimento o complexo 1 mantm-se coordenado ao ligante aps sua reduo, e esta espcie cobre(I) ao ser oxidada restitui o complexo original. Esta capacidade do complexo ser restitudo 29

importante quando se busca um catalisador, e um fator importante na atividade do complexo na reao de oxidao de catecis (Seo 4.2.1).

4.1.4 Espectroscopia eletrnica UV-Vis

Apesar de conhecermos a estrutura que compe o complexo na sua forma cristalina, e esta informao ser muito til, ela no suficiente quando os estudos de catlise so realizados em soluo. Diversas interaes entre o solvente e complexo provocam alteraes em sua estrutura. Com o intuito de investigar como o complexo se comporta em soluo foi utilizada a tcnica de espectroscopia eletrnica UV-Vis. Atravs dela possvel relacionar propriedades eletrnicas com caractersticas estruturais. Complexos de cobre(II) so sistemas com 9 eltrons d que dependendo da natureza do ligante e sua estrutura em soluo, iro estar distribudos em diferentes nveis energticos. A diferena de energia entre estes nveis do origem s bandas de absoro do complexo, geralmente na faixa do visvel. Quando pentacoordenados, os complexos de cobre(II) apresentam em seu espectro eletrnico uma banda de absoro mais intensa em mais alta energia e uma menos intensa em menor energia se estiverem em uma geometria piramidal de base quadrada, enquanto que uma banda de absoro menos intensa em mais alta energia e uma mais intensa em menor energia indicam uma geometria de bipirmide trigonal39. Quando da hexacoordenao, as ligaes ao redor do cobre sofrem intensa distoro devido ao efeito Jahn Teller e as transies se desdobram em trs bandas geralmente sobrepostas que do origem uma absoro alargada na regio de 600-700 nm39. O espectro eletrnico do complexo 1 (Figura 10) apresenta trs bandas de absoro na faixa do visvel e ultra-violeta prximo (800 a 200 nm). A absoro de mais baixa energia com mximo em 644 nm atribuda transio d-d do cobre e devido ao seu perfil alargado, acredita-se que em soluo o complexo tenha as posies ocupadas pelos dois tomos de cloro substitudas por trs molculas de gua, adquirindo a geometria octadrica (Figura 11).

30

1,00

0,75

Abs

0,50

0,25

0,00
200 300 400 500 600 700 800

/ nm
Figura 10. Espectro eletrnico do complexo 1 a 4x10-4 mol L-1 ( em gua (- - -). ) e do ligante TPP a 6x10-3 mol L-1

Figura 11. Mudana geomtrica do complexo em soluo

O coeficiente de absortividade molar de 122 cm-1 mol-1 L coerente com as transies do tipo d-d, porm a segunda transio com mximo em 360 nm apresenta um de 970 cm-1 mol-1 L, esperado para transies do tipo transferncia de carga40. Entretanto, na estrutura proposta no h eltrons disponveis para este tipo de transio. O estudo do espectro eletrnico do ligante TPP revelou que este possui duas bandas de absoro com mximos em 260 nm e 367 nm. Os valores dos 31

coeficientes de absortividade molar das transies do ligante e do complexo esto listados na Tabela 4. A comparao destes valores nos leva a concluir que a banda de absoro em 360 nm observada no espectro do complexo referente a uma transio eletrnica -* do ligante que, quando coordenado, torna-se mais permitida. O mesmo observado para a transio em 260 nm, porm em menor grau.

Tabela 4. Coeficientes de absortividade molar do ligante TPP e do complexo 1 em gua.

Mximo de absoro TPP Complexo 644 nm / cm-1 mol-1 L 122 360 nm / cm-1 mol-1 L 36 970 260 nm / cm-1 mol-1 L 11400 15900

4.1.5 Titulao potenciomtrica

As informaes de protonao so muito importantes para a caracterizao das espcies em soluo. Atravs da titulao potenciomtrica do complexo 1 determinou-se a presena de dois pKas na faixa de pH estudada (3 a 12). O pKa1 foi atribudo desprotonao da piridina no coordenada e o pKa2 formao da espcie hidrxido a partir de uma das molculas de gua coordenada ao centro metlico. A distribuio das espcies e o equilbrio proposto entre elas esto apresentados na Figura 12. O que chamou a ateno durante o experimento foi a mudana de colorao da soluo. Percebeu-se que a espcie cida (pH < 4) e a bsica (pH > 9,3) so azuis, enquanto que a espcie neutra verde. Esta observao causou intriga e motivou a realizao do acompanhamento espectral da titulao.

32

Figura 12. Distribuio e proposta das espcies em equilbrio para o complexo 1 em mistura CH3CN/H2O (1:1) a 25 C.

4.1.6 Titulao espectrofotomtrica

Para analisar as mudanas espectrais que ocorreram no decorrer da titulao potenciomtrica e que provocaram as mudanas de colorao, repetiu-se a titulao com acompanhamento do espectro UV-Vis. Este experimento mostrou-se muito interessante, pois contribuiu significativamente para sustentar as atribuies das espcies em soluo. Por motivos de clareza, os espectros foram separados em duas faixas, uma para cada pKa. A primeira faixa que vai do pH 3,06 ao 6,58 possui um ponto isosbstico, evidncia da presena de duas espcies em equilbrio. Na espcie cida, de colorao azul, a absoro referente transio do ligante intensificada pela complexao (Seo 4.1.4) encontra-se deslocada para maior energia, com max = 330 nm e coeficiente de absoro molar maior do que a espcie neutra, que absorve em 360 nm (Figura 13). Observa-se que a transio d-d praticamente no afetada, indcio de que o equilbrio envolve a desprotonao da piridina no coordenada. 33

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6

Abs

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 300 400

pH 3,06 3,16 3,39 3,83 4,20 4,80 6,19 6,58

0,15

0,10 Abs 0,05 0,00 500

550

600

650

700

750

800

/ nm

500

600

700

800

/ nm

Figura 13. Espectros do equilbrio entre a espcie cida e neutra do complexo 1.

Na segunda faixa que vai do pH 6,19 ao 10,35 e envolve o equilbrio entre a espcie neutra e bsica, a mudana espectral significativa ocorre na mesma banda que o equilbrio anterior. A espcie bsica possui um espectro muito parecido ao da espcie cida, com max = 323 nm da transio em questo e maior coeficiente de absoro molar. Porm, neste equilbrio a banda d-d tem seu mximo de absoro deslocado para maior energia como mostra o detalhe da Figura 14. Esta uma evidncia de que o segundo pKa envolve uma gua coordenada diretamente ao centro metlico, para a formao da espcie hidrxido.

34

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6

Abs

pH 6,19 6,58 8,58 9,22 9,69 10,00 10,35

0,15

0,10

Abs
0,05 0,00 500

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 300 400 500 600 700 800 550 600 650
/ nm

700

750

800

/ nm

Figura 14. Espectros do equilbrio entre a espcie neutra e bsica do complexo 1. No detalhe, o deslocamento da banda d-d.

4.2

Reatividade

4.2.1 Hidrlise do 2,4-dinitrofenilfosfato (2,4-BDNPP)

A caracterizao do complexo indicou que, de acordo com o mecanismo proposto na literatura9, este possui caractersticas adequadas para a hidrlise de disteres de fosfato: posies lbeis cis-orientadas e a formao da espcie hidrxido coordenada ao metal em pH acima de 9. Para testar a sua capacidade de hidrlise foram realizados estudos cinticos com o substrato 2,4-BDNPP. A hidrlise de fosfatos uma reao bastante lenta, por isso da utilizao de um substrato

35

como o 2,4-BDNPP com grupos nitro tornando o fenolato um bom grupo abandonador.

4.2.1.1 Efeito do pH
A dependncia da velocidade da reao de hidrlise em funo do pH apresentada na Figura 15. Observa-se que o complexo comea a acelerar a reao a partir do pH 9. O perfil sigmoidal permite a determinao do pKa cintico para este sistema atravs do ajuste dos pontos com o modelo de Boltzman. O valor obtido de 9,4, muito prximo do potenciomtrico, uma evidncia de que a espcie ativa aquela que possui o grupo hidrxido coordenado ao metal.
2,5 2,0

V0 10 / mol L s

-1 -1 -8

1,5 1,0 0,5 0,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0

pH
Figura 15. Dependncia do pH para a reao de hidrlise do 2,4-BDNPP pelo complexo 1 a 50 C. Condies: [complexo] = 3,9x10 mol L , [2,4-BDNPP] = 4,99x10 mol L , soluo CH3CN/H2O 1:1.
-5 -1 -3 -1

4.2.1.2 Efeito do substrato

Uma vez determinada a dependncia da reao de hidrlise do 2,4-BDNPP, estudos cinticos foram realizados no pH 10, em que o complexo apresentou maior atividade. Em experimentos sucessivos, o aumento da concentrao do substrato provocou a saturao do complexo, observado no grfico de v0 vs [2,4-BDNPP]. Os dados obtidos foram tratados de acordo com o modelo de Michaelis-Menten. Muito utilizado para sistemas enzimticos, este modelo considera a formao de um 36

intermedirio enzima-substrato ES que leva formao do produto e restituio da enzima:

Desta proposta deriva-se a seguinte relao41:

v0 =

v max [ S ] K M + [S ]

em que [S] representa a concentrao de substrato, KM a constante de Michaelis e vmax a velocidade mxima da reao. Atravs do ajuste da equao para os valores experimentais (Figura 16) obtm-se alguns parmetros cinticos resumidos na Tabela 5.
2.5
-1 -1 -8

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 2 4

-3

V0 / 10 mol L s

6
-1

[2,4-BDNPP] / 10 mol L

Figura 16. Perfil de saturao para a reao de hidrlise do 2,4-BDNPP.

Tabela 5. Parmetros cinticos da reao de hidrlise do 2,4-BDNPP catalisada pelo complexo 1.

Complexo 1
-4

KM / mol L-1 0,30

-1

Kass / mol-1 L 3,33

kcat / s-1 4,83x10-3

42

kcat/KM / mol L s
-1 -1

kcat/knc* 53

1,61x10-2

* knc = 0,941x10 s (constante de reao no catalizada )

37

A eficincia cataltica desempenhada pelo complexo 1 menor do que a de outros complexos mononucleares de cobre(II) reportados na literatura43. A menor atividade observada atribuda elevada distoro provocada pelo ligante TPP, que provavelmente dificulta o ataque nucleoflico do hidrxido ao centro de fsforo.

4.2.2 Oxidao do 3,5-di-terc-butilcatecol (3,5-DTBC)

Devido ao perfil eletroqumico quasi-reversvel exibido pelo complexo 1 para o par CuII/CuI realizou-se o estudo cintico da atividade do mesmo frente reao de oxidao do 3,5-DTBC. Este substrato o mais utilizado neste tipo de teste pois o orto-catecol com menor potencial de reduo. Os grupos terc-butil alm de aumentarem a densidade eletrnica so volumosos e impedem reaes paralelas de abertura do anel, por exemplo44.

4.2.2.1 Efeito do pH
A anlise da velocidade da reao em funo do pH mostrou que o complexo torna-se cataliticamente ativo na reao de oxidao do 3,5-DTBC a partir do pH 7 (Figura 17). Os valores permitem que seja feito o ajuste sigmoidal dos dados e pela inflexo obtm-se o valor de pKa cintico de 7,8. Este valor no coincide com as constantes de protonao determinadas potenciometricamente para o complexo de 4,0 e 9,3 (Seo 4.1.5). Porm, na literatura so reportados os valores de 7,85 e 9,0245 para as constantes de protonao do substrato 3,5-DTBC em soluo aquosa com 50% de metanol em presena de cobre(II). Portanto, acredita-se que a oxidao comece a ocorrer quando acontece a desprotonao do substrato e este ento coordena-se com o complexo e oxidado.

38

1,6 1,4

v0 / 10-7 mol L-1 s-1

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 5 6 7 8 9 10

pH
Figura 17. Dependncia do pH para a reao de oxidao do 3,5-DTBC pelo complexo 1 a 25 C. Condies: [complexo] = 5,0x10 mol L , [3,5-DTBC] = 2,4x10 mol L , soluo MeOH/H2O 32:1.
-5 -1 -3 -1

4.2.2.2 Efeito do substrato

A fim de determinar alguns parmetros cinticos da reao de oxidao, foi feito o estudo da velocidade inicial da reao em funo da concentrao do substrato. Os valores exibidos na Figura 18 apresentaram um perfil de saturao e por isso foram tratados com o modelo de Michaelis-Menten. Os parmetros (Tabela 6) foram calculados atravs do ajuste dos pontos com a equao que descreve o modelo.

39

2,5

2,0

v0 / 10 mol L s

-1 -1 -7

1,5

1,0

0,5

0,0 0 2 4 6 8 10 12 14

[3,5-DTBC] / 10-3 mol L-1

Figura 18. Perfil de saturao para a reao de oxidao do 3,5-DTBC.

Tabela 6. Parmetros cinticos da reao de hidrlise do 2,4-BDNPP catalisada pelo complexo 1.

Complexo 1 KM / mol L-1 6,74 x 10
-3

Kass / mol-1 L 148

kcat / s-1 1,40x10

-2

kcat/KM / mol L s 2,08x10

-1 -1 -2

O complexo 1 mostrou-se eficiente na catlise da oxidao do 3,5-DTBC, o que o caracteriza como um catalisador promscuo. Esta mesma promiscuidade foi observada na enzima Aminopeptidase P. Sua funo primria a hidrlise de protenas, porm tambm apresenta atividade na reao de hidrlise de disteres de fosfato. A atividade na oxidao do 3,5-DTBC induzida pela substituio do zinco por cobre em seu stio ativo20. A obteno de um complexo to simples, comparado complexidade enzimtica, capaz de hidrolisar o 2,4-BDNPP e oxidar o 3,5-DTBC uma demonstrao de como a versatilidade qumica dos metais pode ter sido utilizada pela natureza para evoluir nas diversas enzimas que conhecemos hoje.

40

Concluses

O complexo de cobre(II) com o ligante TPP foi sintetizado e caracterizado atravs de tcnicas espectroscpicas, eletroqumica, potenciomtrica e cristalogrfica;

A estrutura cristalina do complexo 1 revelou uma coordenao N3Cl2 e a presena de uma piridina no coordenada;

O complexo 1 mostrou-se cataliticamente ativo na hidrlise do dister de fosfato 2,4-BDNPP.

O complexo 1 mostrou-se cataliticamente ativo na reao de oxidao do catecol 3,5-DTBC, caracterizando-o como promscuo.

41

Perspectivas
A caracterizao do complexo em soluo deve ser aprofundada com o

estudo da eletroqumica em diferentes pHs assim como medidas de ressonncia eletrnica paramagntica (RPE). Estas medidas acompanhadas de um estudo computacional de simulao dos espectros iro fornecer informaes importantes para a confirmao das espcies em soluo. Deve ser feito o estudo detalhado das cinticas de hidrlise e oxidao, investigando a ordem da reao em relao ao complexo. Principalmente, devem ser sintetizados ligantes anlogos ao TPP e, atravs do estudo cintico dos complexos desses derivados, ser possvel analisar a influncia de cada modificao na atividade cataltica. A reunio de mais informaes de correlao cintico-estruturais poder dar suporte a uma proposta de mecanismo para as reaes estudadas. Testar a atividade do complexo 1 na catlise de outros processos que envolvam transferncia de eltrons como o desproporcionamento de H2O2 e superxido de hidrognio, tendo em vista que so conhecidos exemplos de complexos com propriedades eletroqumicas similares que so ativos nestas reaes. Estes resultados podero demonstrar o quo verstil so estes complexos e o quo promscuos eles podem ser, contribuindo para o entendimento da evoluo enzimtica molecular.

42

7
1. 2. 3. 4.

Referncias
SCHRDINGER, E., What is Life? 1944: Cambridge University Press. WATSON, J.D., DNA: The Secret of Life. 1 edition ed. 2003: Knopf. FRANKLIN, R.E. e R.G. GOSLING, Molecular Configuration in Sodium Thymonucleate. Nature, 1953. 171(4356): p. 740-741. WILKINS, M.H.F., A.R. STOKES, e H.R. WILSON, Molecular Structure of Nucleic Acids: Molecular Structure of Deoxypentose Nucleic Acids. Nature, 1953. 171(4356): p. 738-740. WATSON, J.D. e F.H.C. CRICK, A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature, 1953. 171: p. 737-738. GIBSON, D.G., et al., Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome. Science, 2010. 329(5987): p. 52-56. WESTHEIMER, F., Why nature chose phosphates. Science, 1987. 235(4793): p. 1173-1178. RADZICKA, A. e R. WOLFENDEN, A proficient enzyme. Science, 1995. 267(5194): p. 90-93. HEGG, E.L. e J.N. BURSTYN, Toward the development of metal-based synthetic nucleases and peptidases: a rationale and progress report in applying the principles of coordination chemistry. Coordination Chemistry Reviews, 1998. 173(1): p. 133-165. LEHNINGER, A., D. NELSON, e M. COX, Lehninger Principles of Biochemistry. 2008: W. H. Freeman. MISHRA, N.C., Molecular Biology of Nucleases. 1 edition ed. 1995: CRC Press. LIU, C. e L. WANG, DNA hydrolytic cleavage catalyzed by synthetic multinuclear metallonucleases. Dalton Transactions, 2009(2): p. 227-239. DUPUREUR, C.M., Roles of metal ions in nucleases. Current Opinion in Chemical Biology, 2008. 12(2): p. 250-255. TAWFIK, O.K. e S. DAN, Enzyme Promiscuity: A Mechanistic and Evolutionary Perspective. Annual Review of Biochemistry, 2010. 79(1): p. 471-505. HULT, K. e P. BERGLUND, Enzyme promiscuity: mechanism and applications. Trends in Biotechnology, 2007. 25(5): p. 231-238. BABTIE, A., N. TOKURIKI, e F. HOLLFELDER, What makes an enzyme promiscuous? Current Opinion in Chemical Biology, 2010. 14(2): p. 200-207. HILL, A.C., LXVI.-Reversible zymohydrolysis. Journal of the Chemical Society, Transactions, 1898. 73: p. 634-658. REETZ, M.T., Directed evolution of selective enzymes and hybrid catalysts. Tetrahedron, 2002. 58(32): p. 6595-6602. ERCAN, A., H.I. PARK, e L.-J. MING, A Moonlighting Dizinc Aminopeptidase from Streptomyces griseus: Mechanisms for Peptide Hydrolysis and the 4 1010-Fold Acceleration of the Alternative Phosphodiester Hydrolysis. Biochemistry, 2006. 45(46): p. 13779-13793. DA SILVA, G.F.Z. e L.-J. MING, Catechol Oxidase Activity of Di-Cu2+Substituted Aminopeptidase from Streptomyces griseus. Journal of the American Chemical Society, 2005. 127(47): p. 16380-16381. 43

5. 6. 7. 8. 9.

10. 11. 12. 13. 14.

15. 16. 17. 18. 19.

20.

LI, K., et al., Lipase-catalysed direct Mannich reaction in water: utilization of biocatalytic promiscuity for C-C bond formation in a "one-pot" synthesis. Green Chemistry, 2009. 11(6): p. 777-779. 22. MENCHER, S.K. e L.G. WANG, Promiscuous drugs compared to selective drugs (promiscuity can be a virtue). BMC clinical pharmacology, 2005. 5(1): p. 3. 23. LIPPARD, S.J., The Interface of Inorganic Chemistry and Biology. Journal of the American Chemical Society, 2010. 132(42): p. 14689-14693. 24. BEINERT, H., Bioinorganic Chemistry: A New Field or Discipline? Words, Meanings, and Reality. Journal of Biological Chemistry, 2002. 277(41): p. 37967-37972. 25. OGO, S., Bioinspired catalysis. Dalton Transactions, 2010. 39(12): p. 29632963. 26. MANCIN, F., et al., Artificial metallonucleases. Chemical Communications, 2005(20): p. 2540-2548. 27. SIGMAN, D.S., A. MAZUMDER, e D.M. PERRIN, Chemical nucleases. Chemical Reviews, 1993. 93(6): p. 2295-2316. 28. COWAN, J.A., Chemical nucleases. Current Opinion in Chemical Biology, 2001. 5(6): p. 634-642. 29. SHELL, T.A. e D.L. MOHLER, Hydrolytic DNA Cleavage by Non-Lanthanide Metal Complexes. Current Organic Chemistry, 2007. 11(17): p. 1525-1542. 30. OLIVEIRA, M.C.B., et al., Mononuclear CuIIPhenolate Bioinspired Complex is Catalytically Promiscuous: Phosphodiester and Peptide Amide Bond Cleavage. Inorganic Chemistry, 2009. 48(7): p. 2711-2713. 31. REY, N.A., et al., Catalytic Promiscuity in Biomimetic Systems: Catecholase-like Activity, Phosphatase-like Activity, and Hydrolytic DNA Cleavage Promoted by a New Dicopper(II) Hydroxo-Bridged Complex. Inorganic Chemistry, 2006. 46(2): p. 348-350. 32. SHELDRICK, G., A short history of SHELX. Acta Crystallographica Section A, 2008. 64(1): p. 112-122. 33. SPEK, A., Single-crystal structure validation with the program PLATON. Journal of Applied Crystallography, 2003. 36(1): p. 7-13. 34. GAGNE, R.R., C.A. KOVAL, e G.C. LISENSKY, Ferrocene as an internal standard for electrochemical measurements. Inorganic Chemistry, 1980. 19(9): p. 2854-2855. 35. BATISTA, S.C., et al., Highly efficient phosphate diester hydrolysis and DNA interaction by a new unsymmetrical FeIIINiII model complex. Inorganic Chemistry Communications, 2003. 6(8): p. 1161-1165. 36. PERALTA, R.A., Novos complexos binucleares de cobre(II) e de ferro(III) zinco(II): Biomimticos sintticos para Catecol Oxidase e para Fosfatases cidas Prpuras, in Tese de Doutorado em Qumica. 2005, Universidade Federal de Santa Catarina: Departamento de Qumica. 37. HUREAU, C., et al., Syntheses, X-ray Structures, Solid State High-Field Electron Paramagnetic Resonance, and Density-Functional Theory Investigations on Chloro and Aqua MnII Mononuclear Complexes with AminoPyridine Pentadentate Ligands. Inorganic Chemistry, 2008. 47(20): p. 92389247. 38. ADDISON, A.W., et al., Synthesis, structure, and spectroscopic properties of copper(II) compounds containing nitrogensulphur donor ligands; the crystal 44

21.

39. 40. 41. 42. 43.

44.

45.

and molecular structure of aqua[1,7-bis(N-methylbenzimidazol-2-yl)-2,6dithiaheptane]copper(II) perchlorate. Dalton Transactions, 1984: p. 1349 1356. LEVER, A.B.P., Inorganic Eletronic Spectroscopy. 2 Ed. ed. 1984, Amsterdam: Elsevier Science Publishers. HUHEEY, J.E., E.A. KEITER, e R.L. KEITER, Inorganic Chemistry: Principles of Structure and Reactivity 4ed. 1997: Prentice Hall. ATKINS, P. e J. PAULA, Physical chemistry. 2002: W.H. Freeman. BUNTON, C.A. e S.J. FARBER, Hydrolysis of bis(2,4-dinitrophenyl) phosphate. The Journal of Organic Chemistry, 1969. 34(4): p. 767-772. SCARPELLINI, M., Sntese, caracterizao e reatividade de novos complexos de ferro e cobre com ligantes imidazlicos de relevncia bioinorgnica., in Departamento de Qumica. 2001, Universidade Federal de Santa Catarina. MONZANI, E., et al., Mechanistic, Structural, and Spectroscopic Studies on the Catecholase Activity of a Dinuclear Copper Complex by Dioxygen. Inorganic Chemistry, 1999. 38(23): p. 5359-5369. TYSON, C.A. e A.E. MARTELL, Equilibriums of metal ions with pyrocatechol and 3,5-di-tert-butylpyrocatechol. Journal of the American Chemical Society, 1968. 90(13): p. 3379-3386.

45