Influncia do Diabetes no Estoque de Glicognio Heptico

Maxsuel Ribeiro Silva Rafael Viana Alonso

Universidade Federal de Mato Grosso, Instituto de Cincias Exatas e da Terra, Departamento de Qumica, Aula Experimental da Disciplina de Bioqumica Aplicada, Docente: Prof. Msc. Mayara Peron Pereira Resumo: Objetivo: comparar o estoque de glicognio heptico de ratos com diabetes com o estoque de glicognio hepticos de ratos sem diabetes. Mtodos: Foi realiado a extrao e anlise quantitativa do glicognio heptico de ratos com diabetes e sem diabetes. A extrao do glicognio foi realizada por meio de digesto a quente em ambiente bsico, a sua separao por precipitao utilizando lcool etlico e Na2SO4. Realizou hidrolise no enzimtica do glicognio com cido forte a quente. A anlise quantitativa foi realizada por espectroscopia de absoro. Concluso: o estoque de glicognio superior no fgado de ratos sem diabetes.

Abstract:Objective: To compare the hepatic glycogen storage of diabetic mouse with the
hepatic glycogen storage of mouse without diabetes. Methods: The extraction and quantitative analysis of hepatic glycogen of diabetic mouse and mouse without diabetes were performed by hot digestion in alkaline ambient, your separation were performed by precipitation using ethanol and Na2SO4. The hydrolysis of glycogen was performed with strong acid at hot. Quantitative analysis was performed by absorption spectroscopy. Conclusion: glycogen storage is higher in the liver of mouses without diabetes.

1 - INTRODUO
O Diabetes Millitus um problema de sade pblica mundial, caracterizado por um aumento anormal de glicose no sangue, podendo desencadear vrias complicaes sade, por exemplo, no estgio inicial excesso de sono, problemas de cansao, e quando no tratado adequadamente pode acarretar ataque cardaco, derrame cerebral, nefropatia, problemas na viso, amputao de membro e leses de difcil cicatrizao, dentre outras complicaes. Embora se reconheam os avanos conseguidos, o diabetes ainda uma das principais causas de incapacitaes fsicas pra o trabalho e est entre as cinco doenas de maior ndice de morte no mundo.

Estima-se que existam mais de 150 milhes de pessoas com diabetes no mundo, sendo que projees da Organizao Mundial de Sade pra 2025 sugerem que esse nmero possa chegar a 300 milhes. Frente a essa realidade, justifica-se o visvel direcionamento das pesquisas ao diabetes, nos mais diversos pontos relacionados. A experincia apresentada neste artigo busca evidenciar e quantizar o impacto do diabetes no estoque de glicognio no fgado. O glicognio o estoque reserva de glicose nas clulas animais, aparece em grande quantidade no fgado (at 10% do seu peso efetivo) e tambm

nos msculos esquelticos ( 1 a 2%). formado por unidades de glicose em ligaes glicosdicas 1-4, com ramificaes por meio de ligaes 1 6, uma estrutura similar ao amido (estoque reserva dos vegetais), sendo o glicognio mais compacto e ramificado. Nos hepatcitos o glicognio formado pela via glicognese, por meio da seguinte sequncia enzimtica; glicose convertido em glicose-1-fosfato pela enzima hexoquinase, glicose-6-fosfato convertido em glicose-6-fosfato convertido no nucleotdeo de acar; UDP-glicose pela enzima UDPglicose perofosforilase, que o doador imediato de unidade de glicose para formao da macro molcula de glicognio, a polimerizao por meio das ligaes glicosdicas 1-4 se da pela enzima; glicognio sintetase, j as ramificaes (ligaes 1-6) pela transglicosilase, a protena glicognina necessria para o incio da polimerizao. J a degradao se da pela via glicogenlise, que libera unidades de glicose na corrente sangunea, as extremidade no redutoras sofrem fosforolise pela enzima glicognio fosforilase, liberando -D-glicose-1-fosfato, as ramificaes so desfeitas pela enzima glicosetransferase. A degradao do glicognio tambm ocorre por hidrolise pelas enzimas amilases (degradao intestinal), ou hidrolise no enzimtica em soluo acida a quente. O glicognio pode ser isolado do tecido heptico por digesto a quente, com soluo concentrada de lcalis fortes ou a frio com soluo de cloreto de mercrio, ambas preservando as ligaes glicolticas.

Foi utilizado como mtodo de extrao o glicognio do tecido heptico a digesto a quente com hidrxido de potssio. Foi adicionado 500mg de fgado em tubo falcon de 15 ml e colocado 2 ml de KOH a 30%, picou-se o tecido com tesoura, homogeneizou o tecido no homogeneizador de tecido e colocou os tubos(um do G1 e outro do G2) em banho-maria fervente por 1 hora, um minuto antes de retirar os tubos adicionou-se 5 gotas de Na2SO4 saturado, colocou os tubos para esfriar, aps adicionou 4,5 mL de lcool etlico e agitou os tubos no vortex at a soluo ficar bem homogenia, em seguida os colocou em banho Maria a 70C por 15 min, e centrifugou a 2000 RPM p 10 min, descartou o sobrenadante e redissolveu o precipitado em 2mL de gua destilada quente, utilizando o vortex para auxiliar na dissoluo, acrescentou 4,5mL de lcool etlico, agitou utilizando o vortex e leva-se novamente os tubos ao banho-maria a 70C por 15min. Dessa forma descartando o sobrenadante aps a centrifugao a 2000RPM por 10min extraiuse o glicognio. O glicognio foi dissolvido em 5 ml de gua destilada quente e transferida para uma proveta de 10ml lavando varias vezes com gua deionizada ate completar o volume de 10ml.

2.2 PREPARAES DE SOLUES PARA ANLISE ESPECTROSCPICA

As solues problemas para anlise no espectrmetro de absoro (em 490nm) foram obtidos da seguinte forma, da soluo contida na proveta de 10ml (mencionada no item anterior, provida da extrao do glicognio heptico) foram retirados 20L da proveta correspondente a extrao do glicognio do grupo controle e 50L da proveta correspondente ao grupo Diabtico, em ambos os tubos adicionou gua destilada at completar o volume de 1000L. Foram preparadas em tubos de ensaio volumes de 1000L de solues padres (totalizando dez tubos, contanto com o branco) com concentraes conhecidas de glicose, com a finalidade de obtermos a taxa de variao absorbncia X concentrao de glicose, por meio de tratamentos estatsticos. Essas solues foram preparadas pela diluio de diferentes volumes de

2 - MTODOS
Foram utilizados fgados de rato, albinos (Rattus norvegicus), variedade wistar, fornecidos pelo Biotrio Central da Universidade Federal de Mato Grosso Cuiab, Brasil. As amostras de fgado foram divididas em dois grupos; grupo de controle (G1), providas de ratos normais, sem diabete e grupo diabtico (G2) providas de ratos com diabetes, induzida por Aloxin. Foram pesados 500mg de fgado de cada grupo e separadamente foram realizados os procedimentos de extrao do glicognio, hidrolise e determinao por espectroscopia de absoro.

2.1 EXTRAO DO GLICOGNIO HEPATICO

uma soluo inicial (SP), com concentrao de 0,01g de glicose para 100 ml de gua, conforme tabela1.

3 - RESULTADOS
As medidas de absorbncia das solues preparadas (solues problemas; G1 e G2, solues padres; P10, P20, P30, P40, P50, P60, P70, P80 e P90) esto apresentadas na tabela2. Solues padres absorbncia P10 0,2556 P20 0,3684 P30 0,6302 P40 0,7117 P50 1,2312 P60 1,1072 P70 1,2339 P80 1,4220 P90 2,1005 G1 0,9111 G2 0,6323 Tabela 2. Absorbncia das solues padres. Fazendo o tratamento estatstico das absorbncias correlacionadas a cada concentrao padro, chegamos seguinte reta de regresso (grfico 1).
2.5 2 1.5 1 y = 20.21x - 0.0034 R = 0.9377

Concentrao Branco P10 (0,01g.L-1) P20 (0,02g.L-1) P30 (0,03g.L-1) P40 (0,04g.L ) P50 (0,05g.L ) P60 (0,06g.L-1) P70 (0,07g.L-1) P80 (0,08g.L ) P90 (0,09g.L-1)
-1 -1 -1

SP(L) 100 200 300 400 500 600 700 800 900

H2O(L) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100

Tabela 1 Preparo da solues padres

Solues de glicose no so adequadas ara analise por espectroscopia de absoro no ultravioleta/visvel, a estratgia utilizada pra tal a converso da glicose em outro produto que absorva bem na regio do ultravioleta/visvel, em todos os tubos de ensaio preparados (1000L de solues problema, solues padres e o branco), foram utilizados como reagentes cromforos o fenol e acido sulfrico concentrado, seguindo os seguintes passos; adicionou em cada tubo 2 ml de H2SO4 e 10L de fenol na concentrao de 400mg de fenol para 100L de gua, e colocou em banho Maria a 70C por 15min, colocando um bolita em cima de cada tubo. Somente aps esse procedimento e o resfriamento dos tubos foram feitas as medidas de absorbncia no espectrofotmetro em 490nm, zerando o aparelho com o branco.

0.5 0 0 0.02 0.04

0.06

0.08

0.1

Grfico 1. Reta de regresso absorbncia x concentrao Sendo Y igual absorbncia, X a concentrao glicose, e a o coeficiente angular, b coeficiente linear, a taxa de variao da absorbncia em relao a concentrao de glicose. Em posse do valor de a e b(20,21 e -0,0034, respectivamente) podemos calcular a concentrao das solues problemas a partir dos seus valores de absorbncia; G1 0,9111= ax+b , logo CG1= 0,045 g/L G20,6323= ax+b , logo CG2= 0,031 g/L

Com as concentraes de glicose nos tubos das amostras problema (CG1 e CG2) encontramos a quantidade de glicose presente nos tubos ( 1000L de soluo) e considerando a proporo das amostras analisadas em relao ao total de glicognio extrado de 500mg de tecido heptico, chegamos a relao gramas de glicose por gramas de tecido (a extrao do glicognio de ambas as amostras de fgado, normal e diabtico, resultou em uma soluo de 10mL adicionado em uma proveta, ver no item mtodos, sendo retirado para anlise apenas 20L do correspondente ao grupo normal e 50L do grupo diabtico, ou seja uma proporo de 500:1 e 200:1 respectivamente). ( ( ) )

tecido, para isso foi realizado, alm da triturao mecnica do tecido a digesto a quente, banho Maria fervente por uma hora em ambiente bsico, esse processo no hidrolisa as ligaes 1-4 e 1-6, as macromolculas de glicognio permanecem intactas. O prximo passo foi separao do glicognio dos demais componentes do tecido, isso foi realizado por meio do processo de precipitao do glicognio utilizando Na2SO4 e lcool etlico, cujas interaes com a gua reduz a interao gua/glicognio, que precipita. A adio de acido sulfrico concentrado junto com o banho Maria proporcionou a hidrlise no enzimtica do glicognio em unidade de glicose, que em conjunto com o fenol formou um composto chamado hidroximetifurfural de colorao alaranjado, adequado a analise por espectroscopia de absoro no ultravioleta/visvel em contradio com a glicose. O resultado dos clculos mostrou um ndice significativamente inferior de glicose no fgado de ratos com diabetes. Esse resultado no representou nenhum espanto, tendo em vista que a diabetes millitus est relacionada deficincia da produo de insulina pelas clulas do pncreas, que o hormnio que ativa a glicognese atuando na enzima glicognio sintase, logo de se esperar a reduo do estoque de glicognio no fgado.

Onde mg a massa de glicose em gramas pela massa de fgado tambm em gramas, CG1,VG1 e CG2,VG2 so respectivamente as concentraes e volumes(1000L) das solues problemas. Utilizando as equaes anteriores podemos calcular as massas de glicose por grama de fgado. ( ( ) )

5 - CONCLUSO
Os resultados obtidos no fugiram da expectativa, porem isso no qualifica a experincia como desnecessria, tendo em vista que as vias bioqumicas so muito entrelaadas, formando um conjunto absurdamente complexo e auto-ajustvel. Nem sempre se obtm resultados que aparentemente so bvios, pelo comum desconhecimento de todas as variveis diretas e principalmente indiretas ligadas a um processo bioqumico. Em se tratando de processos bioqumicos, a confirmao experimental sempre necessria.

massa de glicose
0.15 0.1 0.05 0 G1 G2

Grfico 2. Comparao das massas de glicose.

4 - DISCUO
A etapa inicial da extrao do glicognio o rompimento das clulas hepticas, a dissoluo do

6 REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS
LEHNINGER, Albert Lester Princpios de Bioqumica 4 ed. Editora Sarvier, SP, 2006.

Mtodos de laboratrio em bioqumica Adelar Bracht e Emy Luiza Ishii-Iwamoto.

Skoog, Douglas Fundamentos de Qumica Analitica, traduo da 8 edio norte-americana, editora Thomson.