Introduo

Nossa percepo de bactrias como organismos unicelulares baseia-se essencialmente no conceito de culturas puras, nas quais as clulas podem ser diludas e estudadas a partir de culturas lquidas. Como praticamente todos os conceitos e conhecimentos microbiolgicos foram adquiridos a partir do estudo de organismos em culturas puras, somente h alguns anos comeamos a entender que, na realidade, a maioria das bactrias se encontra na natureza vivendo em comunidades, de maior ou menor estruturao. O tipo de "ecologia" que imaginvamos em relao aos procariotos, ou seja, clulas individuais crescendo de maneira planctnica (livres, em suspenso), raramente so encontradas na natureza. Sabe-se atualmente que, quando em seus habitats naturais, via de regra as bactrias so encontradas em comunidades de diferentes graus de complexidade, associadas a superfcies diversas, geralmente compondo um biofilme, isto , um ecossistema estruturado altamente dinmico, que atua de maneira coordenada. Assim, embora possam ter uma existncia planctnica independente, este tipo de vida parece ser eventual. Os biofilmes, complexos ecossistemas microbianos, podem ser formados por populaes desenvolvidas a partir de uma nica, ou de mltiplas espcies, podendo ser encontrados em uma variedade de superfcies biticas e/ou abiticas. Desta maneira, muitos autores definem biofilmes como associaes de microrganismos e de seus produtos extracelulares, que se encontram aderidos a superfcies biticas ou abiticas. Geralmente, a dinmica de formao de um biofilme ocorre em etapas distintas. Inicialmente temos os organismos denominados colonizadores primrios, que se aderem a uma superfcie, geralmente contendo protenas ou outros compostos orgnicos. As clulas aderidas passam a se desenvolver, originando microcolnias que sintetizam uma matriz exopolissacardica (EPS), que passam a atuar como substrato para a aderncia de microrganismos denominados colonizadores secundrios. Estes colonizadores secundrios podem se aderir diretamente aos primrios, ou promoverem

a formao de coagregados com outros microrganismos e ento se aderirem aos primrios.

Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonizao primria de um substrato; (b) crescimento, diviso celular e produo do exopolissacardeo (EPS), com o desenvolvimento de microcolnias; (c) coadeso de clulas individuais, de clulas coagregadas e grupos de clulas idnticas, originando um biofilme jovem, de mltiplas espcies; (d) maturao e formao de mosaicos clonais no biofilme maduro.
(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)

Assim, o biofilme corresponde a uma "entidade" dinmica pois, de acordo com os microrganismos que o compem, teremos condies fsicas, qumicas e biolgicas distintas. Estas alteraes fazem com que cada biofilme seja nico, de acordo com os microrganismos presentes. Neste sentido, ao longo do tempo a composio microbiana dos biofilmes geralmente sofre alteraes significativas. A figura abaixo ilustra no somente a estruturao fsico-qumica de um biofilme, mas tambm sua evoluo e amadurecimento, dependendo das relaes estabelecidas pelos microrganismos presentes.

Estgios de formao e vida de um biofilme, determinados por fatores fsicos, biolgicos e ambientais
(Adaptado de Jenkinson & Lappin-Scott, Trends Microbiol., 9:9-10, 2001)

Comportamento coletivo

H vrias dcadas, foi proposto que as bactrias poderiam corresponder a organismos interativos, capazes de atuar coletivamente, facilitando sua adaptao s alteraes ambientais. Para que um biofilme de uma ou vrias espcies seja formado, necessrio o estabelecimento de um comportamento multicelular, que se reflete em atividades coordenadas de interao e comunicao dos vrios organismos. Assim, os biofilmes no so simples camadas viscosas contendo organismos. Estes representam sistemas biolgicos altamente organizados, onde as bactrias estabelecem

comunidades funcionais estruturadas e coordenadas.Um dos mecanismos de comunicao interbacteriana que vem se mostrando extremamente importante na formao e desenvolvimento de biofilmes corresponde ao quorum sensing.

Comunidades associadas s superfcies

Os procariotos podem habitar qualquer ambiente adequado s formas de vida

superiores, assim como vrios ambientes inspitos maioria das formas de vida. Tal fato decorrente de sua inigualvel diversidade metablica e plasticidade fenotpica. Um dos importantes aspectos associados a esta ubiquidade est relacionado capacidade destes organismos migrarem para diferentes nichos, onde podem se propagar. O mecanismo mais comum que permite a migrao dos procariotos corresponde mobilidade, seja de origem flagelar, deslizante, ou de outro tipo. No entanto, so conhecidos mecanismos que tambm permitem a migrao bacteriana. Por exemplo, algumas espcies podem sintetizar celulose, originando uma pelcula que mantm as clulas prximas interface r-gua, ou na superfcie de plantas. Bactrias fotossintetizantes podem se posicionar nas colunas de gua, em resposta intensidade luminosa, pela produo de vesculas de gs. Outras apresentam magnetossomos, permitindo movimentaes ao longo dos campos magnticos da Terra. Um importante mecanismo na formao de comunidades corresponde agregao ou aderncia, que otimiza tanto as interaes celulares como tambm as taxas de sedimentao dos organismos. As comunidades bacterianas tm importantes papis na natureza, seja na produo e degradao de matria orgnica, na degradao de poluentes, ou na reciclagem de nitrognio, enxofre e vrios metais. A maioria destes processos requer o esforo coletivo de organismos com diferentes capacidades metablicas. Assim, os biofilmes participam metabolizando esgotos e guas contaminadas com petrleo, na nitrificao, na reciclagem de enxofre oriundo de drenados cidos de minas (onde o pH 0) e em vrios outros processos. Outro tipo de biofilme est associado s partculas em suspenso, muitas vezes denominadas neve marinha, extremamente importante nas transformaes biogeoqumicas do carbono em ambientes pelgicos, na metanognese, fixao de nitrognio e produo de enxofre. Estes achados revelam que nos biofilmes podem ser criadas condies de anaerobiose, em ambientes normalmente aerbios.

Exemplo da ecologia de comunidades microbianas. As quatro microcolnias centrais correspondem a organismos que geram e consomem hidrognio. Os fermentadores utilizam acares e produzem cidos orgnicos, utilizados pelos produtores de hidrognio. Alm das interaes metablicas, a comunicao intra e intercelular pode ser mediada por molculas sinalizadoras.
(Adaptado de Davey & OToole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)

As interaes que permitem a agregao de diferentes espcies, ou mesmo gneros microbianos em um biofilme geralmente envolvem a participao de adesinas (molculas de adeso presentes em fmbrias ou dispersar ao longo da superfcie celular), que reconhecem receptores especficos na superfcie de outras clulas, ou em diversos tipos de substratos. Assim, a figura abaixo esquematiza a formao de um biofilme aqutico, revelando a complexidade tanto estrutural como temporal deste ecossistema. As horas correspondem ao tempo mdio necessrio adeso dos diferentes microrganismos, revelando a dinmica de formao e estruturao deste biofilme.

Esquema de coagregaes envolvendo bactrias aquticas.

(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)

Estrutura dos Biofilmes

A maioria dos biofilmes exibe uma certa heterogeneidade, existindo conjuntos de agregados celulares distribudos ao longo da matriz exopolissacardica, que exibem densidades variveis, originando aberturas e canais por onde a gua pode trafegar.

Corte lateral, revelando a estrutura de um biofilme artificial de V. cholerae. A intensidade da cor est associada densidade celular.
(Adaptado de Davey & OToole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)

As microcolnias que compem um biofilme podem ser de uma ou vrias espcies, dependendo das condies ambientais. Por exemplo, em locais de grande stress mecnico, tais como a superfcie dental, o biofilme bastante compactado e estratificado. Os espaos intersticiais (canais) tambm so parte importante dos biofilmes, pois permitem a circulao de nutrientes e a troca de metablitos.

Por que formar um biofilme?

Acredita-se que a formao de biofilmes esteja associada, por exemplo, proteo contra o ambiente, ou seja, bactrias em um biofilme encontram-se abrigadas e em relativa homeostase, graas presena da matriz exopolissacardica. A matriz contm vrios componentes: exopolissacardeo, protenas, cidos nuclicos, entre outros. O exopolissacardeo secretado para o meio externo, sendo de diferentes composies. Ao que parece, o EPS tem diferentes estruturas e funes, dependendo das comunidades e/ou condies ambientais. Este polmero pode impedir fisicamente a penetrao de agentes antimicrobianos no biofilme, principalmente aqueles hidroflicos e carregados positivamente. Em alguns casos o EPS capaz de sequestrar ctions, metais e toxinas. Por estas razes, os biofilmes podem corresponder a excelentes mecanismos de transferncia de metais nos ecossistemas, pois vrios organismos marinhos pastadores se alimentam de biofilmes. Foi tambm descrito que o EPS teria papel de proteo contra radiaes UV, alteraes de pH, choques osmticos e dessecao.

Disponibilidade de nutrientes e cooperatividade metablica

Os canais aquosos dos biofilmes podem ser comparados a um sistema circulatrio primitivo, permitindo a troca de nutrientes e metablitos, assim como a remoo de metabtilos potencialmente txicos. Em um biofilme, torna-se possvel a cooperao metablica. Por exemplo, a degradao de compostos orgnicos

complexos, originando metano e CO2 durante uma digesto anaerbia, requer pelo menos trs grupos de organismos. As bactrias fermentativas iniciam o processo, gerando cidos e alcois, que so utilizados por bactrias acetognicas. Finalmente, as metanognicas convertem o acetato, CO2 e hidrognio, produzindo metano.

Os biofilmes so ambientes ideais para o desenvolvimento de relaes sintrficas, que um tipo de simbiose onde dois tipos de organismos metabolicamente distintos dependem um do outro para utilizarem certos substratos, na produo de energia.

Sintrofia em um grnulo de lodo de um reator metanognico. Corantes fluorescentes revelam organismos metanognicos (em verde) e bactrias que oxidam propionato (em vermelho). A cor amarela resulta da combinao verde e vermelho, revelando microcolnias sintrficas interligadas a cadeias de metanognicos.
(Adaptado de Davey & OToole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)

Aquisio de novas caractersticas genticas

Vrias

bactrias

possuem

plasmdeos,

conferindo

as

mais

diversas

caractersticas. Estes podem ser transferidos horizontalmente por conjugao, para diferentes espcies presentes em um biofilme. Estudo foram realizados com placas dentais artificiais, formadas inicialmente por bactrias do gnero Streptococcus. Uma linhagem de Bacillus, contendo um transposon conjugativo albergando genes de

resistncia tetraciclina, foi inserida no sistema e transferiu este transposon para clulas de Streptococcus. A transduo pode, teoricamente, ser responsvel pela transferncia horizontal de genes em biofilmes. Tal hiptese baseia-se no fato de sistemas marinhos e de gua doce contm uma enorme abundncia de bacterifagos (cerca de 10 8/ml), sendo responsveis pela lise de um grande nmero de bactrias. Diariamente, de 10 a 20% da populao bacteriana lisada por fagos, os quais tm relevante impacto na cadeia alimentar microbiana uma vez que podem aumentar as taxas de mortalidade e/ou reduzir as taxas de crescimento em todos os nveis trficos. Estudos recentes revelam que os fagos podem estruturar ou reestruturar comunidades microbianas. Em uma anlise, onde uma populao de cianobactrias foi praticamente exterminada pelos fagos, observou-se a presena de novas espcies capazes de degradas os compostos orgnicos que surgiram.

Papel dos biofilmes nas doenas

At o momento, a vasta maioria das doenas infecciosas vem sendo tratada eficientemente com antibiticos, entretanto, de acordo com as pesquisas mais recentes, sabemos que tal tipo de estratgia pode ser ineficaz em duas situaes: 1) com organismos exibindo resistncia inata droga e 2) em bactrias presentes em biofilmes. Em um biofilme, as bactrias podem ser 1000 vezes mais resistentes a um antibitico, quando comparadas s mesmas clulas planctnicas, embora os mecanismos envolvidos nesta resistncia sejam ainda pouco conhecidos. Dentre os possveis mecanismos, acredita-se que possa haver a inativao da droga por polmeros ou enzimas extracelulares, ou a ineficincia da droga em decorrncia de taxas de crescimento muito lentas no interior dos biofilmes.

Infeces associadas a biofilmes geralmente so de natureza recorrente, visto que as terapias antimicrobianas convencionais eliminam predominantemente as formas

planctnicas, deixando as clulas ssseis livres para se reproduzir e propagar no biofilme aps o tratamento. Para tornar o quadro ainda mais grave, as bactrias presentes nos biofilmes encontram-se mais protegidas contra o sistema imune do hospedeiro. Exemplos tpicos de doenas associadas a biofilmes incluem as infeces de implantes tais como vlvulas cardacas, catteres, lentes de contato, etc.

Os biofilmes podem ainda promover doenas se formados em tecidos, tais como nas infeces pulmonares provocadas por Pseudomonas aeruginosa, em pacientes com fibrose cstica, que so suscetveis a infeces crnicas por esta bactria. A periodontite outro exemplo de doena provocada por biofilmes. O principal microrganismo associado a esta doena, Porphyromonas gingivalis, coloniza uma grande de superfcies orais direta ou indiretamente, sendo ento capaz de invadir as clulas das mucosas e liberar toxinas.

Biofilmes e resistncia s drogas, devido densidade e tipos celulares, excluso fsica da droga, expresso de genes de resistncia, quorum sensing e alteraes da superfcie celular (Adaptado de Mah & OToole, Trends Microbiol., 9:34-39, 2001)

Esquema

do

desenvolvimento

temporal

de

uma

placa

dental.

(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)

Gentica da formao dos biofilmes

Quatro organismos, P. aeruginosa, P. fluorescens, E. coli e V. cholerae, vm sendo intensamente estudados, como modelos na formao de biofilmes de espcies nicas. Este processo pode ser subdivido em etapas: a) Aderncia inicial superfcie, b) Formao das microcolnias, c) maturao das microcolnias em um biofilme contendo a matriz de EPS.

Estudo microscpico da formao de um biofilme por V. cholerae Etapas que uma realiza, em Watnick de nova um & espcie sua J. biofilme Kolter, (Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., bacteriana 182:26752679, 2000) incorporao (Adaptado durante

Bacteriol., 182:26752679, 2000)

Ao que parece, o processo se inicia quando as bactrias percebem determinadas condies ambientais, que disparam o fenmeno de transio de clulas planctnicas em ssseis. Assim, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens parecem ser capazes de formar biofilmes sob quase todas as condies, enquanto E. coli somente os forma se estiver em meios mnimos suplementados com aminocidos, ou em meios pobres em nutrientes. Diferentes vias genticas podem ser utilizadas na formao de biofilmes. Por exemplo, V. cholerae parece ter diferentes vias para realizar a aderncia inicial, dependendo da superfcie. Assim, quando no intestino, este organismo utiliza a fmbria

Tcp para realizar a colonizao, embora tal estrutura no tenha papel na etapa inicial de formao de biofilmes em superfcies abiticas, sendo o processo mediado por outro tipo de fmbria, denominada Msh.

Incio de formao do biofilme

A partir de estudos com linhagens mutantes de P. aeruginosa, foi relatado que, quando as clulas no sintetizam flagelos, so incapazes de realizar as interaes iniciais com as superfcies. Mutantes que no produzem a fmbria tipo IV (associada movimentao das clulas em uma superfcie) so capazes de se aderir formando uma monocamada, ao invs de microcolnias. Existe uma protena, denominada Crc que, alm de atuar regulando o metabolismo das clulas, tambm regula a expresso de dois genes que codificam protenas importantes na montagem da fmbria tipo IV. O LPS da membrana externa tambm tem papel na adeso inicial. Em E. coli, os flagelos tambm so importantes nesta primeira etapa de formao do biofilme. H ainda a participao de fmbrias do tipo I, uma protena de membrana externa, Ag43 e do LPS. Em V. chloreae acredita-se que o processo seja bastante similar ao de E. coli.

Maturao do biofilme

Aps a etapa de interaes iniciais, comea a haver a formao das microcolnias, normalmente associada produo de EPS. Outra etapa importante corresponde organizao da arquitetura do biofilme que, em P. aeruginosa parece ter a participao do "quorum sensing".

Estgios iniciais na formao de biofilmes de Gram negativos (P. aeruginosa, E. coli, e V. cholerae).

(A) Em P. aeruginosa, os flagelos so necessrios para aproximar a bactria da superfcie, enquanto o LPS media as primeiras interaes, havendo talvez a participao de protenas da membrana externa. Quando formam monocamadas, fmbrias tipo IV mediam o movimento pulsante, necessrio formao de microcolnias. A produo destas fmbrias regulada, em parte, por sinais nutricionais (Crc), havendo ainda a ativao de genes envolvidos na sntese de alginato e represso de genes flagelares. A formao do biofilme maduro envolve a participao de homoserina lactonas sinalizadoras. (B) Em E. coli, os flagelos aproximam as clulas do substrato, enquanto as primeiras interaes so mediadas por fmbris tipo I e a protena de membrana externa Ag43. O EPS, cido colnico resonsvel pela arquitetura do biofilme. (C) V. cholerae, tambm usa os flagelos na aproximao, sendo a ligao mediada por fmbrias MshA e talvez outras protenas. (Adaptado de Davey & OToole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)

Disperso

Em determinados momentos, os biofilmes sofrem disperso, liberando microrganismos que podem vir a colonizar novos ambientes. Os mecanismos genticos associados disperso no so ainda bem conhecidos.

Existem trs tipos de processos de disperso: expansiva, quando parte das clulas de uma microcolnia sofrem lise e outras retomam a motilidade, sendo ento liberadas da estrutura. Outro tipo de disperso envolve a fragmentao do biofilme, onde pores de matriz extracelular associadas a microrganismos so liberadas. Finalmente, o terceiro tipo de disperso, denominada superficial, ocorre pelo crescimento do prprio biofilme como um todo.