CURSO

: GENTICA MDICA

DOCENTE : DR. CESAR GUZMAN VIGO, MGTER. MARCO ANTONIO GUZMAN TELLO.

TEMA:

polimorfismos del DNA

INTEGRANTES : Benavides Vsquez francisco Bustamante Daz Aldair Gil Salazar Norbil

POLIMORFISMO GENETICO
INTRODUCCIN: El polimorfismo biolgico est definido en la Enciclopedia Britnica (1995) como : la variacin estructural o funcional encontrada entre miembros de una misma especie. Esta variacin puede estar determinada por diferencias genticas o por diferencias en las circunstancias en las que cada individuo vive. En efecto, algunas diferencias biolgicas son de origen puramente gentico, sin que el ambiente pueda ejercer influencia sobre stas: es el caso de los grupos sanguneos. Sin embargo, la mayora de las diferencias perceptibles a simple vista tienen a la vez un origen gentico y ambiental: es el caso del tamao o del peso de cada individuo de una especie dada. En la presente disertacin analizaremos solamente los aspectos relacionados con el polimorfismo puramente gentico en humanos, aunque se incluirn algunos conceptos sobre su funcin en relacin con la respuesta a factores ambientales.

OBJETIVOS.

Definir el trmino de Polimorfismo ADN. Comprender los tipos de polimorfismo en ADN. Importancia del polimorfismo en la gentica.

CONCEPTOS BSICOS: Monomorfismo: El monomorfismo es, como su nombre lo indica, la ausencia de variacin en una poblacin dada. Este se presenta, por lo general, en regiones genticas que codifican para regiones estructurales bsicas de las protenas. Es el caso, por ejemplo, de la mayora de los segmentos genticos que codifican para las regiones transmembrana de las protenas de superficie celular. Polimorfismo: El polimorfismo molecular consiste la variacin que se presenta en individuos de una misma especie, bien sea al nivel gentico o al nivel de las protenas. Un sinnimo corriente para este concepto es el de alelismo. Polimorfismo en regiones codificantes o exones: El polimorfismo gentico se puede presentar en regiones codificantes, lo cual da lugar a mutaciones generalmente visibles en la protena correspondiente. Polimorfismo en regiones no codificantes o intrones: Cuando el polimorfismo gentico se presenta en regiones no codificantes, ste puede invisible al nivel del fenotipo, dando lugar a las mutaciones silenciosas que son la mayora. Esto no es sorprendente si consideramos que el genoma tiene una proporcin de ms del 97% que no es transcrito a protenas. Regiones proteicas altamente polimrficas: Fuera del efecto evidente en cambio de estructura de las mutaciones en las regiones codificantes, se presenta en algunos casos una diversidad aumentada e independiente del polimorfismo propiamente gentico en protenas como los anticuerpos o los receptores de los linfocitos T. Este polimorfismo aumentado, o hipervariabilidad, resulta de mecanismos epigenticos tales como el rearreglo de fragmentos de genes o la insercin nucleotdica Metodologa para el estudio del polimorfismo gentico y de protenas: En trminos generales podemos considerar que hoy en da es posible visualizar directa e indirectamente el polimorfismo molecular. Por un lado, al nivel de las protenas, las reacciones de complementariedad de los antgenos y anticuerpos utilizados in vitro para este fin darn cuenta de las variaciones estructurales que resulten inmunognicas en modelos animales y humanos. Por otro lado, las reacciones de complementariedad de las secuencias nucleotdica (ADN-ADN o ADN-ARN) permitirn poner en evidencia las diferencias estructurales de genes homlogos. Estas ltimas podrn ser mejor definidas gracias a la especificidad de corte de las enzimas de restriccin tanto como a la visualizacin directa de las diferencias en tamao de los alelos correspondientes.

TIPOS DE POLIMORFISMOS RFLP: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restriccin. (Restriction Fragment Length Polimorphism) A finales de la dcada del 60, el descubrimiento de las endonucleasas de bacterias (enzimas de restriccin con muy alta especificidad), las cuales cortaban el ADN en secuencias definidas de usualmente 4-8 pb, conllev al desarrollo de tcnicas para el aislamiento y la manipulacin de fragmentos de ADN. Una de las mayores aplicaciones de esta tcnica fue el ensamblaje de los mapas genticos con el polimorfismo en longitud de los fragmentos de restriccin. Esta tcnica explota las variaciones en las secuencias del ADN por la creacin o abolicin de sitios para el corte de las endonucleasas, dadas por los cambios de bases, las adiciones o deleciones de fragmentos de ADN entre y en estos sitios. Adems, algunas endonucleasas son incapaces de cortar el ADN si la secuencia de reconocimiento contiene uno o ms sitios de citosina metilada, por lo tanto tales enzimas pueden detectar polimorfismo si hay variaciones en los patrones de metilacin.

El estudio de los polimorfismos de este tipo consiste en el anlisis en cuanto a nmero y tamao de los fragmentos de ADN que se originan al digerir con las mencionadas enzimas el material genmico o un fragmento amplificado del genoma, de manera que un sitio de restriccin polimrfico o una delecin o insercin entre dos sitios de corte ser detectado como un polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin generados a nivel fenotpico. La tcnica consta de las siguientes etapas (figura 3): digestin del ADN con enzimas de restriccin; separacin por electroforesis de los fragmentos resultantes; transferencia de los fragmentos separados a membranas de nitrocelulosa (Southern Blotting) e hibridacin con sondas moleculares radiactivas y exposicin de la membrana a un filme de rayos X. La identificacin del polimorfismo tambin puede hacerse por PCR. Este mtodo se ha empleado en la caracterizacin de los genes de algunas de las protenas lcteas bovinas. El uso de los RFLP como marcadores para trazar la transmisin de los genes asociados a ellos, es de una utilidad considerable en gentica pues tienen como ventajas el no estar influenciados por el ambiente, no depender del estado ontognico del animal, permitir un anlisis de todo el genoma, poder ser detectados en estadios muy tempranos del

desarrollo independientemente de la expresin del gen, una vez heredados, y adems poseen la caracterstica de ser codominantes en la expresin fenotpica, es decir, permiten discernir entre el individuo homocigtico dominante y el heterocigtico; son muy comunes y cualquier gen debe tener sitios de restriccin polimrficos en una vecindad de varios cientos de pares de bases. Pero tienen como desventajas que son muy costosos, necesitan de un personal calificado y entrenado para trabajarlo, precisan el uso de radioactividad y adems, consumen mucho tiempo. En animales domsticos se ha realizado este tipo de anlisis del ADN desde 1985, con numerosos trabajos en una amplia diversidad de especies. Otras de las aplicaciones de esta tecnologa ha sido el desarrollo de detallados mapas de ligamiento en una amplia variedad de organismos. Aunque sta es la ms conocida, el RFLP se ha empleado tambin en la caracterizacin del genoma de organelos, en la identificacin de lneas o individuos y en las investigaciones sobre el tema de la diversidad gentica. La identificacin y el mapeo de RFLP han revolucionado la gentica humana por el desarrollo del diagnstico asistido por marcadores y la deteccin de una amplia variedad de enfermedades hereditarias. A pesar de haber sido ignorados este tipo de marcadores en sus inicios por los genetistas veterinarios, los mismos mtodos para el mapeo en humanos son empleados para estudios de diferentes especies animales, respecto a los sitios polimrficos, producindose una revolucin en el mejoramiento animal por la introduccin de la seleccin asistida por marcadores (Marker Asisted Selection: MAS). RAPD: Amplificacin aleatoria de ADN polimrfico (Random Amplified Polymorphic DNA) La tcnica RAPD, conocida tambin como AP-PCR es bsicamente una variacin del protocolo de la PCR con dos caractersticas distintivas: utiliza un cebador nico (en lugar de un par de primers) con una secuencia arbitraria, por lo tanto desconocida. Para que ocurra la amplificacin, dos secuencias complementarias al cebador arbitrario deben estarlo suficientemente adyacentes (~400pb) y en orientacin opuesta que permita la amplificacin exponencial por la ADN-polimerasa (Figura 4). En los RAPD se emplean cebadores cortos (10 pares de bases) que se utilizan de forma individual en reacciones de PCR con un nivel de especificacin muy bajos. De esta manera se genera un patrn de bandas sencillos que depender de la capacidad de los cebadores para encontrar zonas en el ADN, parcial o totalmente complementario. Durante la fase de alineamiento de la reaccin de PCR-RAPD, el cebador o primer arbitrario se unir a los sitios de la secuencia complementaria en el ADN molde

desnaturalizado. Si dos molculas se alinean con el molde en cadenas opuestas, con la orientacin apropiada y con una distancia amplificable (menor o igual a 2500 bases) entonces ser amplificado un fragmento discreto de ADN. Cada primer es potencialmente capaz de amplificar un nmero de fragmentos (1-10 o ms) de diferentes loci durante la misma reaccin de PCR resultando en varias bandas. Los segmentos amplificados pueden ser visualizados en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio o en geles de poliacrilamida de alta resolucin visualizados por autorradiografa o teidos con plata detectndose el polimorfismo como ausencia o presencia de bandas de un fragmento particular. Los polimorfismos RAPD resultan de la diferencia de secuencias en uno o ambos sitios de unin de los primers, los cuales evitan el alineamiento de la secuencia molde. Otras fuentes de polimorfismo RAPD pueden incluir diferencias de apenas un par de bases (mutaciones puntuales) que son suficientes para causar complementariedad del primer en el sitio de iniciacin; deleciones o inserciones adyacentes en el sitio de iniciacin de modo que provoquen la accin de la ADN-polimerasa, por lo que los marcadores RAPD tienen naturaleza binaria, el segmento amplificado est presente o no; son marcadores dominantes porque solo se amplifica una variante allica, aquella que cumple con los requisitos de complementariedad entre el cebador y las cadenas de ADN a una distancia menor o igual a 2Kb. AFLP: Polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (Amplified fragment length polymorphisms) Se basa en la amplificacin arbitraria de fragmentos de restriccin de ADN ligados a adaptadores: se utilizan cebadores semiespecficos con secuencia complementaria al adaptador en el extremo 5. Estos marcadores combinan dos enzimas de restriccin,(generalmente la EcoR1 y la Mse1) y dos amplificaciones de PCR usando primeros marcados. Se generan patrones de bandas complejos en donde es fcil encontrar polimorfismos claramente diferenciales. Consiste en la amplificacin de mltiples regiones arbitrarias del genoma. Involucra cuatro etapas: digestin con dos enzimas de restriccin, una de corte raro (reconoce secuencias de 6pb) y otra de corte frecuente (reconoce secuencias de 4pb); acoplamiento de adaptadores especficos de doble cadena a los extremos de los fragmentos de restriccin;

amplificacin selectiva de fragmentos con cebadores especficos. Se lleva a cabo con el uso de iniciadores que contienen una base extra en el extremo 3 lo que produce un conjunto de fragmentos que adems de llevar la secuencia complementaria al primer o iniciador, complementan a la base extra adicional. Hay una segunda amplificacin en la cual se conocen iniciadores con dos o tres bases extras. Los fragmentos son complementarios a las extensiones consideradas. separacin de los fragmentos por electroforesis en geles de poliacrilamida. Se pueden utilizar varios mtodos para revelar el patrn de bandas: empleo de istopos radiactivos y la tincin con nitrato de plata.

Mediante la seleccin del nmero de nucletidos selectivos es posible controlar el nmero de fragmentos a amplificar, en una relacin inversamente proporcional. El polimorfismo es detectado por la presencia o ausencia de bandas debido a mutaciones en los sitios de restriccin o en secuencias adyacentes a estos, los cuales se complementan o se diferencian de los nucletidos selectivos aadidos a los cebadores de la PCR, y por inserciones o deleciones dentro del fragmento amplificado. Tiene como ventajas que se obtiene un alto grado de polimorfismo, un mayor nmero de marcadores por gel analizado y no requiere del conocimiento de la secuencia de ADN. Debido a la cantidad de marcadores que pueden ser generados, el mapeo gentico puede realizarse con mayor rapidez y ms fcilmente. Es una tcnica para estudios de biodiversidad. Comparado con RFLP es ms rpido, menos laborioso y provee mayor informacin. Revela fundamentalmente el polimorfismo dominante, que puede ser por la presencia o ausencia del sitio de restriccin o por una simple variacin de un nucletido en el genoma. POLIMORFISMOS DE SECUENCIAS REPETIDAS Otro tipo de polimorfismos son los de secuencias repetidas, con una mayor aplicacin en el diagnstico gentico y son conocidos como VNTR minisatlites y VNTR-microsatlites o STR (del ingls, short tndem repeats). En ambos casos presentan un nmero variable de repeticiones en tndem (VNTR del ingls, variable number of tndem repeats). Los minisatlites son loci que corresponden a secuencias de ADN de unas pocas decenas de nucletidos repetidas en tndem. El nmero de dichas repeticiones vara de cromosoma a cromosoma, de forma que en un cromosoma el nmero de repeticiones en tndem puede ser de 10, en otro de 15, en otro de 22, etc. La singularidad ms especial de este tipo de polimorfismos est en que cada loci puede presentar muchos alelos distintos (tantos como repeticiones), sin embargo, presentan el inconveniente de que no estn

distribuidos por todo el genoma y slo pueden ser utilizados en el diagnstico de un nmero muy reducido de enfermedades. Los VNTR-minisatlites han encontrado su mxima aplicacin en la determinacin de la paternidad y en los protocolos de identificacin gentica en el mbito judicial. Cuando se habla de huellas dactilares del ADN se est hablando de este tipo de polimorfismo. Los VNTR-microsatlites son por excelencia los polimorfismos annimos utilizados en el diagnstico gentico. Corresponden a la repeticin en tndem de secuencias de entre 2 y 5 nucletidos. Los microsatlites presentan dos caractersticas que los hacen ideales para su uso. En primer lugar, estn distribuidos de forma casi homognea por todo el genoma y en segundo, presentan un nmero elevado de alelos con frecuencias similares entre s, de forma que la probabilidad de que un individuo sea heterocigoto es muy elevada (presentan una alta heterocigosis).

POLIMORFISMOS DE NUCLETIDO SENCILLO (SNP) Como se mencion, los polimorfismos se distinguen terminolgicamente de las mutaciones por su frecuencia. Las diferentes formas de los polimorfismos (llamados alelos) son ms frecuentes que las mutaciones, esto es, en una frecuencia mayor al 1 %. La gran mayora de los SNPs tienen dos alelos los cuales estn representados por una sustitucin de base por otra. En las poblaciones, este tipo de alelos se clasifican en alelo principal o silvestre y alelo raro o mutante, clasificacin basada en la frecuencia observada en las poblaciones. Debido a que los humanos son diploides, un individuo puede tener uno de tres genotipos: homocigoto para el alelo ms frecuente, heterocigoto, u homocigoto para el alelo menos frecuente. Actualmente, en el dbSNPs (base pblica de datos de PNS, dbSNPs por sus siglas en ingls) se han catalogado ms de 9 millones de variantes en la secuencia de ADN. Se describe que los SNPs se presentan uno cada 200 pares de bases en el genoma humano. Basados en ello, se esperara que existieran aproximadamente 6 millones de SNPs en el genoma humano, muchos de los cuales ya han sido descritos en el dbSNP. Los SNPs pueden estar presentes en regiones codificantes y provocar un cambio en un aminocido; a este tipo de SNPs les conoce como no sinnimos. Puesto que este tipo de SNPs afecta directamente la funcin de la protena, muchos investigadores han centrado su atencin en estudios de asociacin gentica en este tipo de variaciones.

Asimismo, existen variaciones funcionales que pueden producir alguna enfermedad o susceptibilidad a sta, pueden estar localizados en la regin promotora del gen, influenciando la actividad transcripcional del gen (modulando la unin de factores de transcripcin), en intrones (modulando la estabilidad de la protena), en sitios de splicing (sitios donde ocurre la eliminacin de intrones y unin de exones) o en regiones intragnicas.

APLICACIONES CLNICAS: Una vez entendido el polimorfismo gentico como la variacin molecular que se presenta en individuos de una misma especie, podemos pasar a discutir sus aplicaciones en la medicina contempornea. Asociacin a enfermedades: Las variaciones genticas o alelos pueden estar asociados directa o indirectamente con enfermedades especficas. El caso ms claro de asociacin directa de un alelo a una enfermedad particular es cuando el producto de este alelo es determinante por su funcin para la patologa. Un buen ejemplo sera el de la distrofia muscular de Dchenme y el gen de la distrofina, el cual, al poseer la mutacin deletrea determina la incapacidad muscular. En cuanto a las asociaciones indirectas de algunos alelos con algunas enfermedades particulares, stas resultan de la presencia del alelo en la misma regin cromosmica de los genes alterados que intervienen en la patologa, comportndose de esta manera apenas como un marcador fortuito de la enfermedad. Es el caso, por ejemplo, de las regiones intrnicas repetidas en tndem cort (STR) o variables (VNTR), que se han regiones intrnicas repetidas en tndem cortos (STR) o variables (VNTR), que se han asociado a algunas enfermedades. Tambin, en el caso de los genes transcritos, es ilustrativo el caso de las molculas HLA que se asocian a la hiperplasia adrenal congnita, por deficiencia de la 21-hidroxilasa cuyo gen est en la misma regin del brazo corto del cromosoma 6 y se transmite con stas en desequilibrio de ligamiento Susceptibilidad a enfermedades: No siempre la existencia de un mutante o de un alelo marcador implica necesariamente que el portador va a sufrir la enfermedad correspondiente. Como dijimos, algunas patologas son multifactoriales, y la sola presencia de un alelo deletreo no condiciona al

individuo. Si no se renen todos los factores necesarios al desarrollo de la enfermedad, hablaremos de marcador de susceptibilidad. Una vez ms, el sistema HLA resulta un buen ejemplo puesto que, por ejemplo, la existencia del alelo HLA-B27 se ha asociado a lo que se ha denominado un riesgo relativo de desarrollar la espondilitis Anquilosante. En este caso el riesgo es alto, pues casi el 90% de los pacientes tienen este marcador. En otras enfermedades, asociadas a otros marcadores de susceptibilidad, aunque el riesgo es ms bajo, ste resulta muchas veces significativo para su diagnstico y/o pronstico. Estudio de poblaciones humanas: La enorme variacin gentica que presenta el ser humano ha permitido, como dijimos, redefinir las poblaciones de nuestro planeta en funcin de los alelos que stas presentan en sus diferentes cromosomas. La aparente filiacin cultural de diferentes comunidades ha podido ser evaluada al nivel gentico mostrando a veces resultados sorprendentes por cuanto la vecindad geogrfica o an lingstica no necesariamente se correlacionan con su filiacin gentica. En estudios sobre poblaciones amerindias colombianas, el doctor Ignacio Briceo, investigador del Instituto de Gentica Humana, ha encontrado que etnias distantes estn muy relacionadas y podran tener un ancestro comn, mientras etnias muy cercanas son divergentes en su genoma. Medicina legal: El resultado prctico del polimorfismo gentico individual, ha permitido, como es lgico, afinar enormemente la identificacin forense tanto como los estudios de filiacin paterna. La huella molecular tiende a reemplazar, de esta manera, a la clsica huella digital.

CONCLUSIONES El estudio de los polimorfismos genticos va en aumento. A partir de los datos generados del estudio de los polimorfismos se han logrado entender parcialmente los mecanismos de susceptibilidad a ciertas enfermedades. Con el desarrollo de nuevas metodologas a nivel de ADN y celular, se espera que los estudios de asociacin aceleren el entendimiento de enfermedades relacionadas con ciertos genes, y establecer la relevancia de un polimorfismo en el contexto funcional. En los ltimos aos se estn desarrollando nuevas metodologas para identificar los polimorfismos funcionales que afecten o regulen la expresin gentica. Por otra parte, es necesario estudiar el papel del medio ambiente y su influencia en los polimorfismos genticos. En este contexto, se han demostrado asociaciones de cierto gen con una enfermedad, que son potencializados dependiendo de algunas condiciones ambientales. Finalmente, es necesario un nuevo entendimiento de la biologa de las enfermedades comunes para ligar, de una manera ms completa, genotipos individuales a fenotipos complejos. El Proyecto Internacional del HapMap (proyecto que desarrolla un mapa de haplotipos del genoma humano) busca proveer muchas de las herramientas que actualmente son necesarias en el estudio del genoma humano.

BIBLIOGRAFA: STRACHAN Tom y READ Andrew P. Human molecular genetics, BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford, 1996. RIDLEY Matt. Genoma, Santillana, Madrid, 2001. BERNAL VILLEGAS Jaime. De genes y gentes, Colciencias, Bogot, 2002. ALBERTS Bruce, JOHNSON Alexander, LEWIS Julian, RAFF Martin, ROBERTS Keith y WALTER Peter, Molecular biology of the cell (4a edicin), Garland Science, New York, 2002.