UNIVERSIDADE DE VORA

ESCOLA DE CINCIAS E TECNOLOGIA

Mestrado em Bioqumica

Dissertao

Diversidade microbiolgica no solo temperado- uma anlise estrutural e funcional com uso de tcnicas moleculares de fingerprinting

Rui Miguel Vieira Ferreira

Orientador: Doutora Margarida Maria Cabral Lages Azevedo Santana

Setembro de 2012

Mestrado em Bioqumica

Dissertao Diversidade microbiolgica no solo temperado- uma anlise estrutural e funcional com uso de tcnicas moleculares de fingerprinting

Rui Miguel Vieira Ferreira

Orientador: Doutora Margarida Maria Cabral Lages Azevedo Santana

Agradecimentos
Gostava de deixar aqui presente os meus agradecimentos s pessoas que, de alguma forma, tornaram possvel a realizao deste trabalho. Em primeiro lugar, Doutora Margarida Santana, minha orientadora, por me ter dado a oportunidade de integrar este projeto, pelos conselhos, pela dedicao, por tudo o que me ensinou, pelo apoio e pela pacincia. Professora Maria Ivone Clara, Professora Rosrio Flix e Doutora Carla Varanda pelo apoio cientfico, pelo incentivo e simpatia que revelaram durante todo o percurso de trabalho. D. Maria Mrio Azedo, Tcnica de Laboratrio de Virologia Vegetal, por toda a ajuda no apoio tcnico da componente experimental. Ao Doutor Juan M. Gonzales do Instituto de Recursos Naturais e Agrobiologia (IRNAS-CSIC, Sevilla), por todo o apoio cientfico. Professora Solange Oliveira, Doutora Ana Alexandre e Doutora Marta Laranjo do Laboratrio de Microbiologia do Solo, pelo auxlio sempre que necessrio. Ao professor Carlos Alexandre do Departamento de Geocincias da Universidade de vora, pelo apoio cientfico, fornecimento de dados e informao bibliogrfica sobre os valores e contedos a abordar. Ao Engenheiro Gonalo Pinheiro da Fundao Eugnio de Almeida pela ajuda e disponibilidade no momento da recolha das amostras para a realizao do trabalho experimental. minha colega Helena Gaspar, companheira de armas no mbito deste trabalho, por toda a simpatia e pela disponibilidade. minha me, tia, irmo e minha namorada, pela educao, carinho, apoio, compreenso e conselhos. Deram-me a fora e incentivo necessrias para nunca desistir de mim e de que sou capaz de alcanar os meus objetivos Aos meus amigos, colegas e ex-colegas pela partilha de experincias, informao e apoio. Seguimos caminhos separados, mas apoiamo-nos continuamente.

Resumo
Estudos recentes sugerem um papel importante de bactrias termoflicas do Phylum Firmicutes, presentes em solos temperados, na fertilidade dos mesmos, por meio da produo de sulfato e amnia, elementos importantes na nutrio das plantas. Neste trabalho pretendeu-se avaliar a dinmica da populao de bactrias termoflicas de um solo temperado agrcola, e a dos seus potenciais antagonistas quanto utilizao de sulfato e amnia pelas plantas, as bactrias sulfato-redutoras e as bactrias oxidativas da amnia da classe -Proteobacteria, respetivamente. Dois fatores capazes de alterar a diversidade dessas populaes so a temperatura e o cobre, este ltimo frequentemente utilizado em tratamentos fitosanitrios. A diversidade microbiana relativa a estes grupos, sob influncia do cobre e da temperatura, foi avaliada atravs da tcnica de DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), uma tcnica de fingerprint molecular. Como resultado deste estudo, identificaram-se bactrias resistentes ao cobre, presentes no solo agrcola analisado e pertencentes aos grupos taxonmico alvo, e concluiu-se sobre a sua contribuio para a fertilizao no solo tratado.

Microbial diversity in temperate soil a structural and functional analysis using molecular techniques for "fingerprinting"

Abstract
Recent studies suggest an important role of thermophilic bacteria of the Phylum Firmicutes in soil fertility, through the production of sulphate and ammonia, important elements in plant nutrition. In this work, we evaluated the dynamics of the thermophilic bacteria population in a temperate soil, as well as the one of their potential antagonists on the use of sulphate and ammonia by plants, i.e. sulfatereducing bacteria and ammonia oxidizing -proteobacteria. Temperature and copper are factors changing the diversity of these populations; the latter is often used in phytosanitary treatments. The change on the microbial diversity in each of these groups, under the effect of copper and temperature, was evaluated by DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), a molecular fingerprint technique. As a result of this study, we identified copper resistant bacteria belonging to the targeted taxonomic groups, and we concluded on their contribution for fertilization in the copper treated soil.

II

Abreviaturas gerais
A260 absorvncia a 260nm; A280 absorvncia a 280nm; gua MilliQ gua purificada no sistema MilliQ (Millipore); AOB Bactrias Oxidativas de Amnia (Ammonia Oxidizing Bacteria); APS - Persulfato de amnia; ATP Adenosina Trifosfato; Bisacrilamida N,N-metileno-bis-acrilamida; DGGE Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis); DNA cido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid); DNase desoxiribonuclease; dNTPs desoxinucletidos trifosfatados; D.O. densidade tica; EDTA cido etileno-diaminatetractico; g unidade de fora centrfuga; kb kilobases; M molar (quando antecedida de um valor numrico); mM milimolar; NB - Nutrient Broth-Oxid; NBA - Nutrient Broth-Oxid com 15% de agar; nm nanmetro; NOB Bactrias Oxidativas de Nitrato (Nitrite Oxidizing Bacteria); pb pares de bases; PCR Reao em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction); III

ppm parte por milho; p/v relao peso/volume; RNA cido ribonucleico (ribonucleic acid); rpm rotaes por minuto; rRNA RNA ribossomal (ribosomal RNA) SRB Bactrias Redutoras de Sulfato (Sulfate Reducting Bacteria); TAE - tampo Tris-Acetato-EDTA; Taq DNA polimerase de Thermophilus aquaticus; TE Tampo Tris-EDTA; TEMED N,N,N,N-Tetrametiletilenodiamina; Tris tris(hidroximetil)aminometano; UV ultravioleta;

IV

ndice

Introduo ........................................................................................................................ 1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Ciclos biogeoqumicos do azoto e do enxofre....................................................... 1 Metabolismo de oxidao da amnia ................................................................... 4 Metabolismo de reduo do sulfato ..................................................................... 5 Populao bacteriana dos solos ............................................................................ 7 Presena de bactrias termoflicas do Phylum Firmicutes em solos temperados 8 Papel e impacto das bactrias termoflicas em ambientes terrestres ................ 11 Efeito do cobre nas comunidades bacterianas ................................................... 12 Cobre como bioelemento.................................................................................... 13 Mtodos moleculares na anlise da dinmica de comunidades bacterianas ..... 16

Objetivos gerais .............................................................................................................. 18 Objetivos especficos ...................................................................................................... 18 Metodologia ................................................................................................................... 19 1. 2. 2.1. 2.2. 3. 3.1. 3.2. Recolha de amostras do solo e caracterizao do local de amostragem ........... 19 Enriquecimento seletivo das amostras em diferentes condies....................... 20 Quantificao de amnio presente nos enriquecimentos .............................. 22 Quantificao do sulfato presente nos enriquecimentos ............................... 22 Isolamento bacteriano e caracterizao fenotpica, fisiolgica e molecular. ..... 23 Anlise fenotpica ............................................................................................ 24 Anlise fisiolgica ............................................................................................ 24

3.2.1 Culturas do isolado ....................................................................................... 24 3.2.2 Quantificao da Protena celular total do isolado ...................................... 25 3.3. 4. 5. 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. Anlise molecular ............................................................................................ 25 Extrao de DNA total e quantificao ............................................................... 27 PCR-DGGE ............................................................................................................ 28 Amplificao do gene 16S rRNA ...................................................................... 28 Primers e reaes de PCR ................................................................................ 29 Etapas de amplificao .................................................................................... 31 Visualizao dos produtos de PCR .................................................................. 33 Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE) ............................. 33

5.5.1. 5.5.2. 5.6.

Preparao dos gis ................................................................................. 33 Condies de corrida ............................................................................... 34

Exciso de bandas e purificao ...................................................................... 34

Resultados e discusso ................................................................................................... 36 1. 2 Parmetros fsico-qumicos ................................................................................. 36 Quantificao nos enriquecimentos ....................................................................... 37 2.1 2.2 3 Produo de amnio ....................................................................................... 37 Produo de sulfato ........................................................................................ 38

Caracterizao fenotpica, fisiolgica e molecular do isolado ................................ 40 3.1 Anlise fenotpica e fisiolgica ........................................................................ 40

3.2.Anlise molecular ................................................................................................. 43 4. 4.1. 4.2. Anlise dos gis de DGGE e sequenciao .......................................................... 44 PCR-DGGE de amostras de DNA do solo ........................................................ 44 PCR-DGGE de amostras de DNA extrado dos enriquecimentos .................... 45 Phylum Firmicutes .................................................................................... 47 Subgrupo filogentico -Proteobacteria ................................................. 51 Subgrupo filogentico Desulfovibrio/Desulfomicrobium......................... 54

4.2.1. 4.2.2. 4.2.3.

Concluses e perspetivas futuras ................................................................................... 57 Referncias Bibliogrficas............................................................................................... 60 Anexos ............................................................................................................................ 67 i. ii. iii. a. b. c. Tabelas referentes quantificao de sulfato e amnia nos enriquecimentos . 67 Sequncia do 16S rDNA do isolado ................................................................. 68 Sequncias das bandas recolhidas do gel DGGE ............................................. 69 Firmicutes .................................................................................................... 69 -Proteobacteria ......................................................................................... 70 Desulfovibrio/Desulfomicrobium ................................................................. 71

VI

ndice de figuras
Figura 1: Ciclo do azoto (adaptado de Mandigan et al, 2003) ...................................................... 2 Figura 2: Ciclo do enxofre (adaptado de Madigan et al, 2003) .................................................... 3 Figura 3: Via da oxidao da amnia por Nitrosomonas europaea (retirado de Metacyc) .......... 4 Figura 4: Via dissimilativa da reduo do sulfato, proposta para Desulfovibrio vulgaris (retirado de MetaCyC) .................................................................................................................................. 6 Figura 5: Contribuio de cada Phylum em bibliotecas 16S RNA de comunidades bacterianas de solos (2920 clones em 21 bibliotecas) (adaptado de Janssen, 2006) ........................................... 8 Figura 6 : Imagem de satlite mostrando um trajeto de transporte e disperso de partculas com origem no Sahara no dia 13 de setembro e 2001, usando SeaWiFS e modelo de disperso baseado nas estaes EARLINET ................................................................................................. 10 Figura 7: Modelo de homeostase do cobre para Bacilllus subtilis. (adaptado de Chillapaggari et al, 2009)....................................................................................................................................... 15 Figura 8: Fotografia do local de amostragem (Google Earth, 2012) ........................................... 20 Figura 9: Quantificao de amnio nos enriquecimentos seletivos A) Produo absoluta de amnio B) Produo de amnio normalizada por unidades formadoras de colnias ................ 37 Figura 10: Quantificao de sulfato nos enriquecimentos seletivos A) Produo absoluta de sulfato B) Produo de sulfato normalizada por unidades formadoras de colnias. ................. 39 Figura 11: Visualizao do isolado ao Microscpio tico Olympus BX41 aps colorao diferencial de Gram. .................................................................................................................... 41 Figura 12: Produo absoluta de sulfato total (mM) (azul) e produo de sulfato normalizada em relao ao contedo proteico celular (mmol mg-1 ) (vermelho), para os diferentes tempos T1 a T4........................................................................................................................................... 42 Figura 13: Visualizao do isolado ao Microscpio tico Olympus BX41 ao tempo T 3. a) Preparao a fresco, b)) aps colorao diferencial de Gram .................................................... 42 Figura 14: Gis de DGGE das amostras resultantes de amplificao por nested-PCR sobre o DNA extrado das amostras compostas do solo A- Gel resultante da amplificao com os primers para os gneros Desulfovibrio e Desulfomicrobium; B - Gel resultante da amplificao com os primers para a classe -Proteobacteria....................................................................................... 44 Figura 15: Gel de DGGE das amostras resultantes de amplificao direta sobre o DNA extrado dos enriquecimentos................................................................................................................... 46 Figura 16: Gel de DGGE das amostras de DNA extrado dos enriquecimentos seletivos, amplificadas com o par de primers especficos para o subgrupo filogentico Firmicutes. ........ 47 Figura 17: Perfil dos picos obtidos para as bandas da amostra NB30 Cu100, e da amostra NB30 Cu500; o clculo da rea de algumas bandas est indicado ....................................................... 48 Figura 18: Gel de DGGE das amostras de DNA extrado dos enriquecimentos seletivos, amplificadas com o par de primers especficos para o subgrupo filogentico -Proteobacteria51 Figura 19: Montagem do gel de DGGE das amostras de DNA extrado dos enriquecimentos seletivos, amplificadas com o par de primers especficos para os gneros Desulfovibrio/Desulfomicrobium................................................................................................. 54

VII

ndice de esquemas
Esquema 1: Enriquecimento seletivo das amostras a diferentes condies de temperatura e concentrao de sulfato de cobre............................................................................................... 21 Esquema 2. Esquema das metodologias utilizadas, de amplificao direta e por nested-PCR. . 29

ndice de tabelas
Tabela 1: Parmetros registados na recolha de amostras .......................................................... 20 Tabela 2: Sumrio dos primers 16S rRNA universais e especficos para os subgrupos filogenticos em estudo, a sua posio em E. coli e a temperatura de annealing ..................... 32 Tabela 3: Parmetros fsico-qumicos das amostras recolhidas no solo do olival ...................... 36 Tabela 4: Resultados da anlise Blast da sequncia parcial do gene 16S rDNA do isolado ........ 43 Tabela 5: Tabela resultante da anlise conjunta da sequncia e da intensidade relativa de bandas selecionadas no gel-Figura16 ......................................................................................... 50 Tabela 6: Tabela resultante da anlise conjunta da sequncia e da intensidade relativa de bandas, selecionadas no Gel-Figura 18 ....................................................................................... 53 Tabela 7: Tabela resultante da anlise conjunta da sequncia e da intensidade relativa de bandas, selecionadas no Gel-Figura 19 ....................................................................................... 56 Tabela 8 - Quantificao de amnio nos enriquecimentos. ....................................................... 67 Tabela 9 - Quantificao de sulfato nos enriquecimentos.......................................................... 68 Tabela 10 Sequncia 16S rDNA do isolado obtido a partir do enriquecimento....................... 68 Tabela 11 - Sequncias obtidas a partir das bandas recolhidas do gel de DGGE........................ 69 Tabela 12 - Sequncias obtidas a partir das bandas recolhidas do gel de DGGE........................ 70 Tabela 13 - Sequncias obtidas a partir das bandas recolhidas do gel de DGGE........................ 71

VIII

Introduo
Os solos, como sistemas biolgicos complexos, dependem da interao de trs fatores: ambiente geofsico, comunidade microbiana presente e atividade biolgica. Encontra-se documentada a importncia dos microrganismos no solo, em particular de bactrias, que participam nos ciclos biogeoqumicos dos elementos, em particular do carbono (C), fsforo (PO), azoto (N) e enxofre (S); diversos microrganismos so responsveis pela incorporao destes elementos tanto em compostos orgnicos como inorgnicos, graas aos distintos metabolismos envolvendo processos de oxidao e de reduo, que se traduzem na dissimilao versus assimilao de nutrientes no sistema bitico e na contnua reutilizao dos elementos acima referidos.

1. Ciclos biogeoqumicos do azoto e do enxofre

O azoto e o enxofre encontram-se entre os nutrientes fundamentais para o crescimento e manuteno da homeostasia das plantas. O azoto pode ser absorvido pelas plantas na forma de nitrato (NO3-) ou de amnio (NH4+), enquanto o enxofre absorvido na forma de sulfato (SO4 2-). O azoto tambm pode ser absorvido sob a forma de aminocidos biodegradados, nomeadamente glicina (Jones et al, 1999; 2005) Apesar de uma grande frao do azoto presente nos solos estar sob forma orgnica, em muitas situaes, em particular devido lixiviao dos solos, o azoto um elemento limitante para o crescimento vegetal. A produo de alimentos deve-se em grande parte produo de fertilizantes contendo amnio (NH 4+) como fonte de azoto, num processo qumico patenteado por Fritz Haber e Carl Bosh em 1910 ( Appl, 2006). As bactrias do gnero Rhizobium estabelecem uma relao simbitica com plantas leguminosas que constitui uma das principais fontes de fixao biolgica de azoto inorgnico (N2). No processo simbitico de fixao de azoto, os rizbios convertem o azoto atmosfrico, no assimilvel, em amnia passvel de ser utilizado pela planta leguminosa hospedeira. A amnia pode tambm ser sintetizada por intermdio da degradao de aminocidos e reduo de compostos azotados presentes em cidos hmicos resultantes da decomposio da biomassa. Algumas bactrias anaerbias pertencentes ao Phylum Firmicutes e Proteobacteria 1(em particular -Proteobacteria) contribuem

Para descrio sumria, ver seco 2

tambm na produo de amnia ao utilizar o nitrato como aceitador alternativo da cadeia respiratria e reduzindo-o a amnia. A transformao de amnia em nitrato realizada em duas fases; as bactrias do gnero Nitrosomonas realizam a oxidao da amnia a nitrito (NO2-) como parte do seu metabolismo para produo de energia e diviso celular. A oxidao do nitrito em nitrato (NO3-) realizada por microrganismos do gnero Nitrobacter, sendo o nitrato asssimilado pelas plantas (Teske et al, 1994; Suzuki et al, 1997; De Boer et al, 1992, 2000). A Figura 1 mostra como os microrganismos do solo, no seu conjunto, so importantes no ciclo biogeoqumico do azoto e na formao de nitrato ou amnia assimilveis pelas plantas.

Bactrias termoflicas (Firmicutes)

Figura 1: Ciclo do azoto (adaptado de Mandigan et al, 2003)

O enxofre outro nutriente necessrio para maximizar a qualidade das culturas, sendo utilizado na sua forma elementar como constituinte de muitos fertilizantes. No solo, o enxofre encontra-se principalmente na forma orgnica SH, em resduos de biomassa na constituio de aminocidos (cistena e metionina) e em compostos mais complexos como o cido hmico. Em solos no fertilizados, a mineralizao do enxofre orgnico em sulfato inorgnico (SO42-) considerado o maior contribuinte para o crescimento das plantas (Eriksen, 1996). Este processo consiste 2

numa decomposio efetuada por exemplo por fungos, do enxofre em sulfureto de hidrognio (SH2), seguida de oxidao do sulfureto em tiossulfato (S 2O32), um produto intermdio da oxidao do sulfato, realizada por bactrias quimiolitotrficas oxidativas do enxofre (por exemplo Beggiatoa, Sulfurimonas). Tambm -Proteobacteria quimiolitotrficas facultativas (p.e.Paracoccus) oxidam o enxofre inorgnico, nestas o sistema multienzimtico de oxidao do tiossulfato (SOX) constitui a via central dessa oxidao (Ghosh et al, 2009).Este sistema induzido pelo tiossulfato, que se liga covalentemente subunidade SoxY, dando-se uma oxidao dos tomos de enxofre do tiossulfato pela transferncia de eletres para a subunidade SoxXA. O complexo pode aceitar outras espcies de enxofre como o sulfureto (SH), enxofre elementar (S0), o sulfito (SO3) e tetrationato (S4O6 (Sauv et al, 2007; Ghosh et al, 2009). As bactrias redutoras de sulfato, que incluem, entre outros, o gnero Desulfovibrio contribuem largamente para a produo de sulfureto de hidrognio, utilizado pelas bactrias quimiolitotrficas suprarreferidas. Diversos estudos apontam uma fraca mineralizao do enxofre orgnico a sulfato no solo (Eriksen, 2008). Diametralmente oposta mineralizao, ocorre a imobilizao do sulfato inorgnico que consiste na assimilao pela comunidade bacteriana e outros organismos (e.g. plantas) e incorporao em matria orgnica. A Figura 2 mostra o ciclo biogeoqumico de enxofre e os microrganismos do solo que nele intervm.

Bactrias termoflicas (Firmicutes)

Figura 2: Ciclo do enxofre (adaptado de Madigan et al, 2003)

2. Metabolismo de oxidao da amnia

A oxidao da amnia em nitrato um dos passos fundamentais para o ciclo do azoto. Esta realizada em dois passos, a converso de amnia em nitrito, que, por sua vez convertida em nitrato, pela ao de dois diferentes grupos de microrganismos: as bactrias oxidativas de amnia (AOB), e as bactrias oxidativas de nitrato (NOB), com metabolismo qumiolitoautotrfico e aerbias obrigatrias (Kowalchuk et al, 2001). As bactrias oxidativas de amnia pertencem na sua grande maioria classe Proteobacteria (Nitrosomonas; Nitrosospira; Nitrosolobus), embora seja conhecido um gnero pertencente classe -Proteobacteria (Nitrosococcus oceanus) (Head et al, 1993). No entanto, nenhuma das -Proteobacterias oxidativas de amnia foi isolada em ecossistemas terrestres (Kowalchuk et al, 2001). A converso de amnia a nitrito envolve duas reaes distintas, a oxidao de amnia (NH3) em hidroxilamina (NH2OH), catalisada pelo complexo enzimtico membranar amnia monooxigenase (AMO; EC 1.14.99.39), codificada pelos genes amoA/B/C; e a oxidao da hidroxilamina a nitrito e produo de 4 eletres, catalisada pela enzima periplasmtica hidroxilamina oxidoreductase (HAO; EC 1.7.3.4), conforme indica a figura 3.

Figura 3: Via da oxidao da amnia por Nitrosomonas europaea (retirado de Metacyc)

Considera-se que a amnia o substrato de eleio para esta via ao invs do io amnio (NH4+), e que o rcio NH3/ NH4+ pode afetar a produo de energia e, consequentemente, o crescimento bacteriano. Assim podemos considerar a oxidao da amnia como o passo limitante para a nitrificao em muitos ecossistemas, visto que a acumulao de nitrito nos ecossistemas rara (De Boer et al, 1992). As bactrias oxidativas de nitrato catalisam o segundo passo na nitrificao: a oxidao de nitrito (NO2-) a nitrato (NO3-). Estudos filogenticos de 16S rRNA consideraram 4 gneros: Nitrobacter (-Proteobacterias), Nitrospina ( Proteobacterias), Nitrococcus (-Proteobacterias) e Nitrospira (domnio Bacteria, Phylum Nitrospira) (Juretschko et al, 1998). A bactria quimiolitotrfica facultativa 4

Nitrobacter considerada a espcie dominante em ecossistemas terrestres e de gua doce. Os outros trs gneros apresentam um metabolismo litoautotrfico obrigatrio e foram isolados em ecossistemas aquticos. A converso de nitrito a nitrato catalisada pela enzima nitrito oxidoreductase (NOR, EC 1.7.2._), constituda por duas subunidades ligadas ao citrocromo C. Esta protena apresenta um heterotomo de molibdnio no seu centro ativo e um cluster [Fe-S]. Em condies aerbicas, participa na cadeia transportadora de eletres, do nitrito para o oxignio, gerando o j enunciado nitrato e o io molibdnio (IV) ( Meincke et al, 1992) Encontra-se bastante documentado que a assimilao de azoto nas plantas determinada pela abundncia e acessibilidade das vrias espcies qumicas no solo, o que leva preferncia por nitrato e amnio sobre outras espcies de azoto em solos agrcolas. Tambm a manuteno do equlibrio inico pelas plantas pode ser fator preferencial na escolha da espcie qumica para a homeostasia das plantas (Wirn et al, 1997). Em solos bastante fertilizados, o nitrato a fonte mais abundante de azoto, com concentraes entre 0.5 e 10 M enquanto que a concentrao de amnio 10 a 1000 x menor, sendo mais abundante em solos onde a nitrificao foi inibida (Marschner, 1995). Assim, em condies normais de fertilizao, o nitrato a espcie mais absorvida pelas razes das plantas, sendo posteriormente reduzida a amnia nos tecidos. No entanto, esta diferena de concentraes no reflete o ratio de absoro de azoto, visto que a maioria das plantas superiores preferencialmente assimila amnio quando o fornecimento de azoto por fertilizantes limitado e estando as duas espcies qumicas disponveis (Jones et al, 2004).

3. Metabolismo de reduo do sulfato

As bactrias redutoras de sulfato (SRB) formam um grupo filogeneticamente diverso de microrganismos anaerbios que utilizam o sulfato. Muitos dos redutores de sulfato pertencem a 23 gneros da classe -Proteobacteria, seguindo-se microorganismos gram-positivos do Phylum Firmicutes (Desulfotomaculum, Desulfosporosinus e Desulfosporomusa). Tambm se encontram sulfato-redutores termoflicos; so membros do gnero Thremodesulfovibrio, Phylum Nitrospirae e membros dos Phylums Thermodesulfobacteria e Thermodesulfobium. No geral, as SRB so classificadas em dois grupos quanto ao seu metabolismo: aqueles que degradam compostos orgnicos de modo incompleto a acetato e aqueles que os degradam completamente a dixido de carbono. O metabolismo de reduo do sulfato representa o maior contributo na degradao de matria orgnica em ecossistemas ricos em enxofre. Estima-se que 50% da degradao da biomassa provenha deste processo oxidativo em ambientes marinhos (Muyzer et al, 2008). 5

O metabolismo das SRB baseia-se na utilizao do sulfato como aceitador de eletres em processos de degradao de matria orgnica com produo de energia e resultando na produo de sulfureto de hidrognio (SH2). Esta reduo do sulfato constitui portanto uma via dissimilatria. Em todos os procariotas que apresentam este metabolismo, o processo dissimilatrio mediado por trs enzimas fundamentais (figura 4). A enzima ATP sulfurilase (EC 2.7.7.4) catalisa a ativao do sulfato inerte em adenosina-5-fosfosulfato (APS). O APS reduzido em adenosina-monofosfato (AMP) e sulfito, por ao da enzima adenilsulfato reductase (EC 1.8.99.2). A ltima enzima da via, sulfito-reductase (Dsr; EC 1.8.99.1/3) catalisa a reduo do sulfito em sulfureto. Esta reduo envolve 6 eletres e considerada o passo fundamental na via dissimilatria de reduo do sulfato (Meyer et al, 2007; Muyzer et al, 2008).

Figura 4: Via dissimilativa da reduo do sulfato, proposta para Desulfovibrio vulgaris (retirado de MetaCyC)

As enzimas Dsr contm um grupo prosttico hemo e clusters [4Fe-4S] e esto presentes em todos os organismos capazes de reduzir sufitos em sulfuretos em condies anaerbicas (Stahl et al, 2002). A estrutura desta enzima apresenta dois polipptidos distintos com conformao 22, em que os genes que codificam as duas subunidades (dsrAB) encontram-se adjacentes nos genomas respetivos (Stahl et al, 2002). Diversos estudos demonstraram a presena de homlogos do gene dsrAB em, 6

pelo menos 5 grupos filogenticos procariotas (Wagner et al, 1998) e um elevado estado de conservao deste gene em SRB e membros do domnio Archaea (Dahl et al, 1993). Estes dados sugerem que a enzima sulfito-reductase presente nas bactrias redutoras de sulfato uma evoluo de genes ancestrais (Stahl et al, 2002). Apesar de as bactrias redutoras de sulfato serem classificadas como organismos anaerbios obrigatrios, foram detetadas em ecossistemas aerbios, tais como zonas de depsitos de cianobactrias ricos em oxignio (Krekeler et al, 1997) e biofilmes que contm oxignio, formados em estaes de tratamento de guas (Ramsing et al, 1993). Tambm no solo, membros do gnero Desulfovibrio encontramse frequentemente na interfase entre a zona xica e anxica dos sedimentos (Dilling et al, 1990)

4. Populao bacteriana dos solos

Os microrganismos do solo desempenham portanto um papel fundamental na manuteno dos ciclos biogeoqumicos dos elementos, com uma grande variedade de taxa microbiana. Estima-se que existam 104 106 diferentes microrganismos por grama de solo e um total de 1010micrbios.g-1 (Gonzalez et al, 2012). A anlise de bibliotecas genmicas de 16S rRNA de comunidades bacterianas de diferentes solos, revelou uma afiliao dos genes de 16S rRNA com 32 Phylums. Os mais dominantes so os Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Bacteroidetes, Cloroflexi, Planctomycetes, Gemmatimonadetes e Firmicutes, contribuindo para um total de 92% das bibliotecas genmicas (Janssen, 2006).

Figura 5: Contribuio de cada Phylum em bibliotecas 16S RNA de comunidades bacterianas de solos (2920 clones em 21 bibliotecas) (adaptado de Janssen, 2006)

Membros do Phylum Proteobacteria, que engloba bactrias gram-negativas anaerbias obrigatrias ou facultativas e metabolismo quimioautotrfico ou heterotrfico, constituem cerca de 39% das bibliotecas. A maior parte pertencem s classes -Proteobacteria, -Proteobacteria, -Proteobacteria e - Proteobacteria sendo as - Proteobacteria as menos abundantes com uma contribuio mdia de 0.04% (Janssen, 2006). De entre estas classes importante nomear as bactrias redutoras de sulfato como por exemplo Desulfovibrio, Desulfobacter ( - Proteobacteria) e as bactrias oxidativas da amnia que incluem membros das e -Proteobacteria. Os gneros Bacillus e Clostridium do Phylum Firmicutes, o qual engloba bactrias gram-positivas (com as excees das classes Megasphaera, Pectinatus, Selenomonas e Zymophilus) anaerbios (Clostridia) ou aerbios obrigatrios ou facaultativos (Bacilli), tm sido considerados pela comunidade cientfica como comuns na comunidade microbiana dos solos, mas as classes Bacilli e Clostridia do Phylum Firmicutes, que compreendem em conjunto 214 gneros, incluindo os gneros acima referidos, contribuem apenas com uma mdia de 2% para as bibliotecas (Janssen, 2006).

5. Presena de bactrias termoflicas do Phylum Firmicutes em solos temperados

Desde h muito, tm sido isolados microrganismos em ambientes considerados extremos nos quais pH, temperatura, concentrao salina e outros parmetros 8

Contribuio (%)

ultrapassam os valores considerados como padres para a proliferao da maioria dos seres vivos. Os microrganismos termoflicos tm sido isolados a partir de ambientes geotermicamente estveis. Estes termoflicos no apenas resistem, mas tambm requerem altas temperaturas para sobreviver. Os microrganismos termoflicos incluem quer termfilos moderados com temperaturas timas de crescimento entre 40 e 50C como termfilos extremos capazes de crescer otimamente a temperaturas entre 65 e 85C. A distribuio biogeogrfica de bactrias termoflicas tem sido alvo de muitos estudos (Wiegel et al, 1979; Mutzel et al, 1996; Rahman et al, 2004), sobretudo desde h cerca de uma dcada quando foram isoladas bactrias do gnero Geobacillus, com temperatura tima de crescimento de 70C em solos temperados frios (temperatura mxima de 15C da Irlanda do Norte (Marchant et al, 2002, 2008). Estes autores propuseram uma origem endmica destes isolados, pois foram obtidos de solos sem qualquer caracterstica geotrmica e encontrados em nmero significativo em camadas subsuperficiais do solo. Huber et al (2009,2010) isolaram bactrias termoflicas anaerbias em sedimentos marinhos recolhidos no rtico e sugeriram que a sua presena neste ambiente hostil era devido proximidade de reservatrios de petrleo no subsolo, que apresentam temperaturas mais elevadas. A comunidade cientfica dividiu-se em duas linhas de pensamento acerca da presena de termfilicos em solos temperados. A ocorrncia de isolados pode ser resultado do transporte e disperso a curta ou longa distncia atravs de via area ou aqutica, de ecossistemas a maiores latitudes que apresentam elevadas temperaturas mdias do solo (Portillo et al, 2008; Huber et al, 2009; Marchant et al, 2010). Esta teoria apoiada por estudos de disperso de partculas proveniente da Africa Sahariana no espao Europeu ou da Amrica do Norte. Outra corrente aponta para uma adaptao e especializao in situ, pelo menos nalguns casos, de modo a explorar nichos espaciais e temporais, como resultado de um longo processo evolutivo ( Portillo et al, 2012). Essa adaptao seria independente, claro est, dos mecanismos de transporte iniciais dos termfilicos, sendo que presentemente estes representam taxa endmica e uma minoria estabelecida entre a comunidade bacteriana do solo temperado.

Figura 6 : Imagem de satlite mostrando um trajeto de transporte e disperso de partculas com origem no Sahara no dia 13 de setembro e 2001, usando SeaWiFS e modelo de disperso baseado nas estaes EARLINET
Fonte: (http://visibleearth.nasa.gov/data/ev102/ev10286_S2001286.L1A_HROM_DUN_CAN.EuropeDust.png) (http://www.earlinet.org/index.php?id=earlinet_homepage)

Os mecanismos de sobrevivncia das bactrias termoflicas em solo temperado, em particular em solos nrdicos esto sob estudo; de facto surpreendente que estes microrganismos possam sobreviver em solos onde so incapazes de crescer. Na literatura, encontra-se documentado que bactrias Gram-positivas termoflicas, que produzem endsporos (p.e. Bacillales e Clostridia), podem sobreviver por longos perodos de tempo, resistindo a condies extremas como a seca, radiao UV e frio. (Saffary et al, 2002). Contudo o trabalho de Marchant el al (2002 e 2008) bem como o de Portillo et al, (2012) confirmam que uma frao desses termoflicos est presente nos solos sob forma vegetativa. A possibilidade de um crescimento muito lento mas contnuo, foi sugerida por Marchant et al (2008). Assim, possvel que em ambientes terrestres temperados como aqueles presentes a latitudes mais prximas dos polos, um crescimento lento resulte num aumento de clulas viveis. Contudo, em locais de maior temperatura, as bactrias termoflicas podem ter oportunidade de crescimento a taxas elevadas durante as estaes mais quentes. Tal ser o caso nos pases do Sul da Europa e regies de latitude similar onde a temperatura de camadas superficiais do solo pode facilmente ultrapassar os 40C durante o vero (Santana et al, no publicado). Apesar de representarem uma minoria dentro das comunidades bacterianas do solo, as bactrias termoflicas esto metabolicamente ativas. Num estudo recente de quantificao relativa do RNA ribossomal por RT-PCR (reao de transcrio reversa, seguida de amplificao por PCR) em tempo real, efetuado em amostras ambientais e visando os gneros Brevibacillus, Geobacillus, e Ureibacilllus foram detetadas fraes metablicas de RNA bacteriano termoflico at 3.14% da comunidade bacteriana 10

(Portillo et al, 2012). Esta quantificao relativa foi tambm realizada em funo da temperatura, revelando que a poro de RNA termoflico em comunidades bacterianas do solo depende da temperatura. Assim, estas bactrias termoflicas podero desempenhar um papel metablico ativo em alguns solos temperados, pelo menos, dentro de um perodo sazonal mais quente.

6. Papel e impacto das bactrias termoflicas em ambientes terrestres

Diversos estudos caracterizam o cultivo, isolamento e classificao de estirpes termoflicas, muitos focam o interesse em processos e produtos metablicos passveis de uso em processos industriais, graas por exemplo ao facto destes microrganismos possurem enzimas termoestveis (Wiegel et al, 1979; Mutzel et al, 1996; Rahman et al, 2004). Contudo, a recente descoberta de isolados termoflicos extremos em solos temperados revela uma lacuna no estudo do potencial metablico destas bactrias. Gonzalez e colaboradores (Portillo et al (2012); Santana et al (2012)) realizaram diversos estudos que permitiram concluir da capacidade de alguns membros do Phylum Firmicutes, em particular, dos gneros Geobacillus, Brevibacillus e Ureibacillus, na mineralizao do azoto e do enxofre orgnicos. Inicialmente, foram efetuados enriquecimentos seletivos de sedimentos recolhidos em diferentes locais, em meio rico, por incubao a diferentes temperaturas (25C e 50C). A monitorizao do amnio e sulfato produzidos ao longo do tempo revelou uma produo similar a superior do io amnio e ntidamente superior de io sulfato a 50C. Foram isoladas bactrias mesoflicas e termoflicas a partir das amostras estudadas, respetivamente a 25C e a 50C e efetuadas culturas destes microrganismos pertencentes s comunidades microbianas sob estudo. Tambm aqui se verificou um aumento significativo da produo de sulfato; nalgumas estirpes, o contedo em sulfato libertado para o meio de cultura era dez vezes superior ao valor produzido pelos mesoflicos, o qual nunca foi superior ao valor mximo de 0.2 mM, este registado para um isolado do gnero Paenibacillus. Verificou-se tambm que as culturas de termfilicos suplementadas com tiossulfato ou no suplementadas apresentavam valores similares de concentrao de sulfato solvel. O tiossulfato um intermedirio da oxidao do enxofre inorgnico e a maioria das bactrias que a efetuam so capazes de oxidar o tiossulfato a sulfato (Madigan et al, 2003) Este resultado mostra que a produo de sulfato pelos isolados termfilicos independente da oxidao de fontes de enxofre inorgnico. Pelo contrrio, trata-se de uma oxidao dissimilativa do enxofre orgnico, j que os autores observaram uma proporcionalidade na concentrao de sulfato com a disponibilidade de nutrientes orgnicos. Esta proporcionalidade tambm se observa relativamente concentrao de amnio no meio de cultura. 11

Estes resultados revestem-se de particular importncia, dado que validado o papel de bactrias termoflicas de solos temperados na mineralizao de biomassa com consequente produo de sulfato e amnia; as bactrias termfilas sero capazes de explorar nichos espaciais e temporais para participar nos ciclos biogeoqumicos do azoto e enxofre, conforme indicado pelas setas na figura 1 (ciclo do azoto) e figura 2 (ciclo do enxofre). Fica tambm refutada a afirmao sobre o papel limitante das bactrias na mineralizao do S-orgnico, afirmao baseada em estudos efetuados a temperatura moderada (20C) (Ghani et al, 1993). A participao das bactrias termoflicas isoladas do solo na mineralizao direta do S-orgnico define uma nova via no ciclo do enxofre oxidao dissimilativa do enxofre tal como apresentada na figura 2. Atendendo a que tanto o azoto como, em particular, o enxofre orgnicos, constituem fraes maioritrias do N e S em ambientes terrestres, e que ambos os elementos so nutrientes fundamentais para as plantas, as capacidades das bactrias termoflicas aqui descritas reveste-se da maior importncia para o estabelecimento de modelos agrcolas mais produtivos e sustentveis. Nestes futuros modelos possvel prever a possvel aplicao destas bactrias como adjuvantes na fertilizao em solos temperados, com carncia em enxofre e/ou azoto (Santana et al, no publicado).

7. Efeito do cobre nas comunidades bacterianas

O cobre um elemento que ocorre naturalmente em todos os ecossistemas. considerado um micronutriente essencial para os seres vivos, participando nos processos de respirao (participa na cadeia transportadora de eletres como parte da enzima citocromo c oxidase), fotossntese e como cofactor da enzima superxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) (Madigan et al, 2003). No entanto, em elevadas concentraes, o cobre extremamente txico; a toxicidade do cobre pode estar relacionada com a sntese de espcies reativas de oxignio (ROS) e consequente stress celular (ver seco 8). O cobre presente no solo encontra-se maioritariamente no estado oxidativo +2 (io cprico Cu+2), sendo esta forma mais solvel e disponvel para a biota em condies acdicas (Brady et al, 2000). Uma frao do io encontra-se na camada subsuperficial do solo, associada atravs de processos de quelao com molculas de hmus e constituindo uma reserva no solo (Brady et al, 2000). O fluxo deste elemento para os solos provm de vrias fontes tais como emisso area e efluentes de indstrias metalrgicas e eletrnicas, poluio atmosfrica devido ao trfico, efluentes de centrais de tratamento de gua e esgotos, bem como s aplicaes na agricultura como pesticida, fungicida e fertilizante. Devido ao uso contnuo de fertilizantes e fungicidas e a um elevado ndice de bioacumulao, os solos agrcolas normalmente 12

apresentam valores elevados de concentraes de cobre, o que pode levar a uma fitotoxicidade nas plantas A quantificao da concentrao de cobre nos solos revelou valores compreendidos entre 0.3 e 15 mg/kg de solo (Laboratrio Qumico Agrcola, 2006). No entanto, j foram reportados valores que excedem 3000mg/kg em solos florestais com elevados valores de cidos hmicos (Kiikila et al, 2000) Lejoin et al (2010) avaliaram os potenciais efeitos de contaminaes de cobre nas comunidades bacterianas. Para isso os autores recorreram a incubaes de microcosmos (ecossistema artificial, usado para estimular e prever comportamentos de ecossistemas naturais em condies controladas) com distintos tipos e quantidades de matria orgnica do solo. Em cada microcosmo, procedeu-se adio de 250 mg de Cu por kg de solo, um valor elevado. Resultados da contagem e caracterizao molecular bacteriana indicaram que o impacto do cobre na comunidade bacteriana presente dependia das propriedades bioqumicas da matria orgnica presente. Em relao diversidade bacteriana, a amplificao genmica do 16S rRNA bacteriano e subsequente comparao das sequncias obtidas com as da base de dados no GenBank, revelou a ausncia de diferenas significativas nas comunidades bacterianas resistentes ao cobre. A classe -Proteobacteria era a mais representativa (53-57%), com o gnero Methylobacterium em destaque. Os Firmicutes representavam 38-43% da comunidade, sendo maioritariamente Staphylococcus (17-37%) e Bacillus (6-17%).

8. Cobre como bioelemento

O potencial redox do par Cu2+/ Cu+ faz com que este elemento seja cofactor de mais de 30 enzimas, denominadas coproenzimas, em eucariotas superiores ( Karlin, 1993). Dependendo do tipo de coordenao entre o io e a protena, o potencial redox pode variar entre 200 a 800 mV. Em ambientes anaerbios, como na atmosfera primordial, o cobre encontrava-se na forma de Cu(I) em sulfuretos insolveis e apenas biodisponvel em condies acdicas, como fontes hidrotermais, onde a concentrao de ies metlicos elevada. O surgimento de oxignio na atmosfera pela possvel ao de cianobactrias h 3 bilies de anos, levou a que muitos organismos adquirissem um metabolismo oxidativo. As enzimas envolvidas em metabolismos anaerbios tiveram de se adaptar presena do di-oxignio, com a procura de um metal com elevado potencial redox para lidar com as capacidades oxidativas do oxignio. Assim o Cu(I) sofreu uma oxidao a Cu(II), um io solvel, aumentando a sua biodisponibilidade (Solioz et al, 2010) A presena de metaloprotenas no domnio Bacteria relevante. A anlise bioinformtica de sequncias genmicas, quanto presena de genes codificantes de metaloprotenas implicadas no transporte de cobre ou de coproenzimas envolvidas em processos metablicos vrios mostrou que o Phylum Actinobacteria (gram-positivos 13

comuns na comunidade microbiana de ecossistemas terrestres e aquticos e participantes ativos no ciclo do carbono pela decomposio de matria orgnica) apresenta uma taxa de 90% de membros com coproprotenas (Ridge et al, 2008). No Phylum Firmicutes essa taxa decresce para 50%, com a particularidade de as espcies deste Phylum que apresentam coproprotenas, terem um genoma mdio de 3 Mb, superior aos que no as possuem (2.3 Mb) (Solioz et al, 2010) O Phylum Cyanobacteria constitui o nico grupo bacteriano que necessita de importar ies cobre para o espao citoplasmtico para a sntese de coproenzimas. Os restantes grupos apresentam coproenzimas situadas na membrana citoplasmtica ou no periplasma, parecendo no requerer cobre intracelular (Solioz et al, 2010). Em particular, em bactrias Gram-positivas, as enzimas associadas homeostase do cobre podero ter como nica funo a expulso do cobre (Solioz et al, 2010). At presente data, todos os genomas sequenciados de microrganismos, mesmo os que no possuem qualquer protena dependente de cobre, apresentam um ou vrios mecanismos de defesa contra a toxicidade do cobre, atravs da presena de protenas exportadoras de cobre. Uma explicao para este facto pode residir no processo evolutivo que ocorreu nos ecossistemas primordiais, onde elevadas temperaturas, acidez e consequentes altas concentraes de metais pesados dissolvidos causaram a prioridade evolutiva no desenvolvimento de mecanismos de defesa contra estes elementos txicos. frequente a referncia toxicidade do cobre como resultado da formao de espcies reativas de oxignio, nomeadamente radicais hidroxlicos (OH), perxido de hidrognio (H2O2) e superxido (O2-), atravs de uma reao de Fenton. Tambm a oxidao de sulfidril (R-SH) mediada pelo Cu (II) com a formao de dissulfureto (R-SSR) foi avanada como causadora de stress celular. No entanto, vrios dados experimentais inclundo a descoberta de que os nveis de cobre livre intracelular so mnimos ou mesmo no existentes (Solioz et al, 2010) levaram considerao de outros mecanismos de toxicidade alm do stress oxidativo. Dados recentes demonstram um novo mecanismo de toxicidade associado destruio dos centros ferro-enxofre de enzimas, devido deslocaco do ferro pelo cobre (Macomber et al, 2009) O sistema de homeostase do cobre mais estudado o de Enterococcus hirae, bactria gram-positiva da classe Bacilli. Esta possui o opero que contem os genes copY, copZ, copA e copB; copA e copB codificam ATPases transportadoras de cobre, copY codifica um repressor transcripcional dependente do cobre, que desbloqueia a transcrio do opero em condies de excesso do io. O gene copZ codifica uma molcula chaperone de cobre cuja funo guiar o transporte intracelular do io. Este opero permite que a bactria cresa em meios com concentraes de cobre at 8mM e em condies onde o cobre esteja limitado (Solioz et al, 2010). A via de homeostase 14

inicia-se com a entrada do cobre na clula via ATPase copA. O cobre citoplasmtico em excesso liga-se ao chaperone copZ que pode doar o cobre excedente ATPase copB ou ao repressor, o qual associado ao cobre se liberta da sequncia promotora do opero, deste modo induzindo a transcrio dos genes a jusante. Em concentraes baixas de cobre, copY associa-se a tomos de zinco e permanece associado sequncia promotora, impedindo a transcrio do opero. (Solioz et al, 2003, 2010). Em Bacillus subtilis, o gene csoR localizado a montante do opero copZA , codifica um repressor transcripcional que sob elevado nvel de cobre leva desrepresso de copZA. As protenas codificadas pelo opero so responsveis pelo efluxo de cobre. Chillappagari et al (2009) reportaram a identificao de um gene ycnJ com papel fundamental no metabolismo do cobre nesta bactria. ycnJ sobreexpresso em condies limitantes de cobre e um mutante de deleco neste gene tem um crescimento reduzido em condies limitantes deste elemento. Estes dados revelam o papel de YcnJ no transporte de cobre para a clula atravs da membrana citoplasmtica (Cooksey et al, 1994). A montante de ycnJ encontra-se o gene ycnK que codifica um repressor transcripcional da sntese de YcnJ. Quando associado ao cobre, o repressor impede a transcrio de ycnJ. Este sistema permite regular a sntese do transportador mediante a disponibilidade celular de cobre (Figura 7)

Reduo

Figura 7: Modelo de homeostase do cobre para Bacilllus subtilis. (adaptado de Chillapaggari et al, 2009) Os repressores transcripcionais CsoR e YcnK esto representados a verde quando ativos e a vermelho quando inativos.

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Tambm em bactrias gram-negativas, da classe -Proteobacterias possvel encontrar diferentes mecanismos de resistncia a um excesso de cobre intracelular. Estudos realizados em diversas estirpes fitopatognicas de Pseudomonas syringae expostas a concentraes elevadas de cobre mostraram uma acumulao de ies Cu2+ no espao periplasmtico e membrana externa. Este sequestro de cobre determinado por protenas de ligao ao cobre, localizadas no espao periplasmtico (CopA e CopC) e na membrana (CopB e CopD) (Cooksey et al, 1991), e codificadas pelo opero de resistncia ao cobre copABCD. Este opero est presente num plasmdio, e regulado pelos genes do opero copRS, tambm localizado no mesmo plasmdeo. A produo das protenas Cop feita por induo do cobre (Chillappagari et al, 2009). Os stios de ligao ao cobre da protena periplasmtica CopA mostram uma conservao com stios de ligao ao cobre de protenas homlogas presentes em procariotas gram-negativos como E. coli. Mas, apesar desta homologia os mecanismos de resistncia ao excesso de cobre intracelular so distintos. A resistncia ao cobre em E.coli faz-se por mecanismos de efluxo deste io, enquanto que em Pseudomonas syringae, o cobre citoslico em excesso sequestrado (Chillappagari et al, 2009). Estudos reportando a resistncia ao cobre por parte de membros da classe proteobacteria so praticamente inexistentes. Anlises de polimorfismos de fragmentos de restrio terminais (T-RFLP) em sedimentos recolhidos num lago severamente contaminado com cobre identificaram isolados do gnero Ralstonia (Ordem Burkhoderiales, famlia Ralstoniaceae). O mecanismo de resistncia ao cobre foi identificado por microscopia eletrnica de varrimento, consistindo num mecanismo de sequestro deste elemento. A nvel molecular, o mecanismo de resistncia est associada presena de um opero de resistncia ao cobre copABCD, homlogo ao presente em bactrias -Proteobacterias, como a j descrita Pseudomonas syringae (Konstantinidis et al, 2003).

9. Mtodos moleculares na anlise da dinmica de comunidades bacterianas

Devido sua importncia, diversas tcnicas moleculares foram utilizadas para o estudo de comunidades microbianas nos seus ecossistemas. As tcnicas ditas clssicas consistem no uso de sondas, por exemplo oligonucletidos especficos usados para detetar por hibridao um dado grupo microbiano (Ravenschlag et al, 2000). Outras utilizam como base a reao de PCR. Por exemplo, a tcnica ARDRA (do ingls Amplified rDNA restriction analysis) consiste numa amplificao com primers especficos para as regies conservadas do gene 16S rRNA, seguida do uso de endonucleases de restrio que iro reconhecer stios especficos no genoma. Os

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fragmentos obtidos aps clivagem so representativos das espcies analisadas (Sklarz et al, 2009) A eletroforese em gel de gradiente de desnaturao (DGGE) uma tcnica molecular de fingerprinting muito utilizada na caracterizao estrutural e na anlise da dinmica de comunidades microbianas. De facto, este mtodo permite demonstrar a diversidade e alteraes de populaes, registando diferenas no detetveis por outros mtodos de fingerprinting. O uso desta tcnica apresenta algumas limitaes, por exemplo, requer uma concentrao significativa de DNA, obrigando a uma prvia amplificao por PCR (Green, 2005), o que significa que todos os problemas que podem estar associados a esta tcnica, como a conceo de primers, a definio de condies timas de amplificao, etc., devem ser considerados. O princpio bsico desta tcnica consiste na separao dos fragmentos de DNA de cadeia dupla com tamanho idntico mas diferentes sequncias nucleotdicas. A anlise electrofortica destes produtos de PCR feita em gel de acrilamida contendo um gradiente de um agente desnaturante. Os fragmentos de cadeia dupla de DNA ricos em guanina e citosina (G-C) apresentam maior estabilidade devido s trs ligaes de hidrognio por par. Assim a cadeia dupla dos fragmentos s ir dissociar-se quando atingir uma maior concentrao de desnaturante. As molculas de DNA de cadeia dupla apresentam assim uma maior distncia de migrao no gel de acrilamida, enquanto as molculas de DNA desnaturado migram a menor velocidade ou mesmo deixam de migrar (Green, 2005). O uso do DGGE como ferramenta para anlise de comunidades microbianas complementado pela anlise de sequncias nucleotdicas para identificao de componentes de interesse na populao. Uma das desvantagens deste mtodo na anlise de comunidades bacterianas consiste na resoluo dos gis utilizados: mltiplas sequncias podem apresentar comigrao; tambm podem obter-se mltiplas bandas correspondentes ao mesmo microrganismo (Green, 2005). Isto acontece frequentemente quando so usados os genes 16SrRNA, dada a existncia nos procariotas de operes com mltiplas sequncias heterogneas desses genes. Assim, quando se recorre exciso de bandas e aps reamplificao se verifica que constituem uma mistura de sequncias, o produto dessa reamplificao triado num novo DGGE. Desse modo, possvel verificar qual subproduto de PCR reflete a banda excisada. Alternativamente, o produto de PCR pode ser usado de imediato para a obteno de clones, os quais so triados num novo DGGE, em paralelo com o PCR da amostra ambiental (Green, 2005).

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Objetivos gerais
Estudo da diversidade microbiolgica em solo agrcola temperado, sob efeito de diferentes temperaturas e tratamento com cobre, com especial ateno proporo de bactrias do Phylum Firmicutes e Proteobacteria. Relao entre essa diversidade microbiolgica e fisiologia microbiana, com relevo para a produo microbiana de amnia e sulfato. Isolamento de bactrias termoflicas, produtoras de sulfato e resistentes ao cobre.

Objetivos especficos
Uso de mtodos bioqumicos para determinao do contedo de vrios elementos em amostras de solo diretas e enriquecidas. Aplicao de tcnicas moleculares de fingerprinting (DGGE - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) para o estudo da diversidade e posterior sequenciao. Utilizao de mtodos clssicos de microbiologia para isolamento de bactrias resistentes ao cobre.

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Metodologia
1. Recolha de amostras do solo e caracterizao do local de amostragem
As amostras de solo foram recolhidas num local designado setor 1, de um olival de variedade cobranosa, pertena da Fundao Eugnio de Almeida, freguesia de So Manos, concelho de vora. Nesse olival, a sementeira feita por enrelvamento linha a linha, o que resulta numa menor eroso do solo. O solo pobre em matria orgnica e sob tratamento fitossanitrio com Cuprital (oxicloreto de cobre, Cl2Cu4H6O6) com recurso a atomizador com cone de proteo, tratamento executado aproximadamente trinta dias antes da recolha das amostras de solo. Este apresentava-se hmido devido forte pluviosidade e baixas temperaturas caractersticas da poca em que foi efetuada a recolha (novembro de 2011) A recolha das amostras foi efetuada numa camada superficial do solo, onde expetvel a presena de grande mistura mineral com hmus e foi executada de modo a minimizar o fator humano, com uso de luvas e com limpeza do material de recolha com etanol, efetuada entre cada amostragem. As amostras recolhidas foram colocadas em tubos de Falcon estreis e devidamente identificados, transportados em gelo, e tambm recolhidas para sacos, devidamente identificados, para posterior anlise dos parmetros fsico-qumicos no laboratrio Qumico Agrcola da Universidade de vora. Foram recolhidas 4 amostras compostas, constitudas por 3 furos paralelos e foram medidas a profundidade e temperatura do solo no ponto de recolha. As amostras foram designadas: T-DC-debaixo de copa com solo tratado-, T-EC -entre copas com solo tratado-NT-DC-debaixo de copas com solo no tratado- e NT-EC -entre copas com solo no tratado. As amostras foram colhidas entre 4,0-7,5cm de profundidade; as temperaturas no stio da recolha foram distintas para as diferentes amostras sendo a mnima de 7,6C e a mxima de 13,2C (tabela 1).

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Tabela 1: Parmetros registados na recolha de amostras

Amostras
Furos # Profundidade recolha (cm) Temperatura (C) I 4.5 5.0 7.6 II

T-DC
III 4.0 - 7.0 7.8 I 4.5 7.5 9.3 II

T-EC
III 4.0 6.0 9.3 I 5.0 6.5 13.2

NT-DC
II 4.5 7.5 13.2 III 5.0 6.0 13.1 I 4.0 6.0 9.6

NT-EC
II 3.5 5.5 10.0 III 4.0 5.5 10.6

4.5 7.0 7.9

4.5 6.0 9.1

Figura 8: Fotografia do local de amostragem (Google Earth, 2012)

A): T-DC-debaixo de copa com solo tratado; B) T-EC -entre copas com solo tratado; C) NT-DC-debaixo de copas com solo no tratado; D) NT-EC -entre copas com solo no tratado

2. Enriquecimento seletivo das amostras em diferentes condies

Foram preparados previamente nove meios de cultura NB (Nutrient Brot Oxoid), em erlenmeyers de 100 mL, divididos em trs sries: a primeira consiste em 15 mL de meio (controlo); a segunda em 15 mL de meio ao qual foi adicionado sulfato de cobre penta hidratado (CuSO4.5H2O) a uma concentrao final de 100 M. A terceira 20

srie consiste em 15 mL de meio a que foi adicionado sulfato de cobre com uma concentrao final de 500 M. Procedeu-se a uma aferio do valor de pH dos meios. A cada meio de cultura previamente esterilizado, foi adicionado 6,00 g da amostra composta NT-EC1 (entre copas com solo no tratado) em ambiente estril, amostra esta que revelou menor contedo em cobre. Os meios foram incubados cerca de 24 horas a 180 rpm e duas temperaturas diferentes: 30C; 50C durante cerca de 24 horas. Um dos erlenmeyers inicialmente a 50C foi posteriormente transferido a 80C durante cerca de 7 horas, sem agitao, conforme indicado no esquema 1:

Esquema 1: Enriquecimento seletivo das amostras a diferentes condies de temperatura e concentrao de sulfato de cobre

A escolha destes valores de temperatura baseou-se nas temperaturas de crescimento de bactrias mesoflicas e termoflicas, conforme descrito na literatura (Wiegel et al, 1979; Mutzel et al, 1996; Rahman et al, 2004). A par da recolha de amostras, para as quantificaes descritas nas seces 2.1 e 2.2. e para extrao de DNA (seco 3.), foram realizadas diluies seriadas (diluies decimais sucessivas) em meio NB a partir destes enriquecimentos. As diluies 10-6 e 10-8 foram plaqueadas em NBA (Nutrient Broth com 15% p/v Agar) por disperso de 50 e 100 L e as placas incubadas a 50C durante 24 horas. Aps este perodo, foram calculadas as unidades formadoras de colnias (cfu/mL) para cada enriquecimento, conforme equao 1.

Equao 1: Clculo de unidades formadoras de colnias

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2.1.Quantificao de amnio presente nos enriquecimentos

Para a quantificao do amnio presente em cada enriquecimento, utilizou-se o protocolo descrito por Kartal et al (2000), com ligeiras modificaes. Este protocolo tem como base a interao entre o-fthalaldeido (OPA) e -mercaptoetanol, dois dos constituintes do reagente utilizado (reagente A) com formao de o-fthalaldedo mercaptoetanol (OPAME), um agente fluorognico. Este agente reage com aminas primrias quando excitado a 420 nm. Preparou-se previamente 50 mL de reagente A, pela adio de 5 mL de etanol (Aga) e 45 mL de tampo fosfato a 400 mM, a 0.249 g de OPA (Fluka). 50 L de -mercaptoetanol so adicionados ao reagente A no momento da quantificao. Para a curva de calibrao, prepararam-se solues de concentrao conhecida de cloreto de amnio em gua destilada. Aps a adio de 40 L de cada soluo de calibrao e 40 L de gua destilada (branco) a 760 L de reagente A, deixou-se repousar cada mistura temperatura ambiente durante 20 min. As solues homogenizadas foram transferidas em seguida para uma placa de microtitrao e leuse a absorvncia a 415nm com uso do leitor de microplacas (Bio-Rad Model 680). As solues foram lidas em triplicado. Para a leitura das amostras, procedeu-se de incio a uma centrifugao a 12 000 g durante 5 min de 1 mL de cada meio enriquecido e recolheu-se o sobrenadante, o qual foi adicionado ao Reagente A, como acima descrito; a mistura obtida foi tratada de igual modo. Foram usados como branco os meios respetivos, no inoculados, submetidos ao mesmo procedimento. A absorvncia foi lida a 415nm no leitor de microplacas (Bio-Rad Model 680). Cada amostra recolhida foi lida em triplicado. A anlise estatistica dos resultados obtidos nos ensaios de quantificao de amnio foi realizada utilizando anlises ANOVA no programa MedCalc verso 12.3.0.

2.2.Quantificao do sulfato presente nos enriquecimentos

Na determinao da concentrao do sulfato presente em cada enriquecimento, utilizou-se o ensaio turbidimtrico descrito por Kolmet et al (2000). Este ensaio turbidimtrico baseado na precipitao de ies SO42- com ies Ba2+ aps a adio de cloreto de brio; essa precipitao seguida por espectrofotometria da suspenso resultante. Para a curva de calibrao, preparam-se solues de concentrao conhecida de sulfato de potssio em gua MilliQ. Aps a adio de 1 mL de cada soluo de calibrao a 1 mL de reagente condicionante, a mistura foi homogeneizada. De seguida, 60 mg de BaCl2.2H2O (Merck) foram adicionados. As misturas foram agitadas no vortex durante 30 segundos. Aps esta agitao, foram transferidas de imediato para cuvettes e foram feitas leituras a 319nm, com recurso ao espetrofotmetro

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NanoDrop 2000 c (ThermoScientific, EUA). Um mL de gua MilliQ, tratado do mesmo modo, foi usado como branco. Para a determinao da concentrao de sulfato nas amostras, foi feita uma centrifugao prvia a 12 000 g, durante 5 min de 1 mL de cada meio enriquecido. Ao sobrenadante recolhido, foram adicionados 1 mL de reagente condicionante e procedeu-se como para as solues de calibrao. Foram utilizados como branco, os meios de enriquecimento no inoculados, tratados do mesmo modo. A anlise estatstica dos resultados obtidos nos ensaios de quantificao de amnio foi realizada utilizando anlises ANOVA no programa MedCalc verso 12.3.0.

3. Isolamento bacteriano e caracterizao fenotpica, fisiolgica e molecular.

O crescimento de populaes microbianas em meios de cultura no laboratrio e posterior isolamento uma das ferramentas mais utilizadas em Microbiologia e permite a obteno de culturas puras. O isolamento promove a separao de um microrganismo a partir de culturas com populaes mistas. As culturas puras podem ser obtidas atravs de vrios mtodos, nos quais se visa o desenvolvimento de uma populao a partir de uma colnia formada a partir de uma nica clula, e importante fazer subculturas a partir de uma nova colnia isolada da cultura precedente, para certificao da pureza das culturas. Foram plaqueados 100L em meio NBA, em duplicado, provenientes de diluies seriadas (ver seco 2) 10-4 a 10-7, efetuadas a partir do enriquecimento em meio NB a 80C contendo 500 M de cobre. Aps incubao das placas a 50C, durante cerca de 24 horas, foram recolhidas colnias isoladas com distintas morfologias, tendo sido cada uma purificada em placa NBA, pela tcnica do riscado. O objetivo do riscado o de produzir colnias bem separadas umas das outras. No riscado usada uma ansa, que flamejada antes da mudana de cada direo de arrastamento da colnia no meio, o que causa uma diminuio do nmero de clulas arrastadas ao longo do riscado, e a formao de colnias isoladas no final deste. Aps a execuo do riscado, as placas de Petri foram incubadas a 50C, durante cerca de 24 horas. Aps esta ltima incubao, cada uma das colnias isoladas foi utilizada como inculo para crescimento em meio NB, a 50C, 180 rpm e posterior congelamento de alquotas a -80oC, mediante a adio de glicerol a 15% (v/v). Amostras do crescimento de um dos isolados obtidos foram usadas para anlise morfolgica por observao ao microscpio tico e para identificao pela colorao de Gram (ver seco 3. 1.).

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3.1.Anlise fenotpica
Para observao de microrganismos pode recorrer-se a preparaes a fresco por exemplo para observar a mobilidade e o tipo de locomoo. H, porm, objetivos que tornam conveniente a colorao das preparaes, como por exemplo na diferenciao de organismos que reagem de modo diferente ao mesmo corante (coloraes diferenciais) e/ou na observao de estruturas particulares (por exemplo, material nucleico, esporos, cpsulas, etc.) A colorao de Gram uma colorao diferencial especfica para bactrias. Quando so usados certos corantes bsicos, as bactrias Gram-negativas podem ser facilmente descoradas com solventes orgnicos (por exemplo, etanol, acetona), enquanto as Gram-positivas resistem a esta descolorao, retendo o corante. A capacidade das clulas reterem ou perderem o corante reflete diferenas na estrutura fundamental da parede celular, nomeadamente ao nvel da camada de peptidoglicano. A soluo de cristal violeta penetra nas clulas bacterianas mas, ligada soluo de lugol, apenas consegue sair atravs das clulas Gram-negativas, que possuem uma parede mais simples e frgil, ficando retida nas Gram-positivas, que adquirem a cor do corante. A resposta colorao de Gram uma caracterstica taxonmica importante, usada numa fase inicial da identificao das bactrias. A colorao de Gram foi usada no isolado obtido tanto como meio fenotpico de identificao como teste complementar da pureza do isolado. Aps preparao de um esfregao em lmina de observao microscpica e fixao das clulas pelo calor, estas foram coradas com uma soluo de Cristal violeta (Merck), cerca de um minuto, e foi adicionada uma soluo mordente de Lugol (Merck), tambm durante um minuto. Seguidamente, as clulas foram lavadas com uma soluo de descolorao, basicamente constituda por etanol, durante cerca de trinta segundos. Entre a adio de cada reagente, foi efetuada uma breve lavagem com gua destilada. Para uma melhor visualizao das bactrias Gram-negativas, foi depois adicionado durante 5 minutos, um corante de contraste, a soluo de Safranina (Merck), que apresenta uma colorao rosada. A anlise morfolgica do isolado e identificao Gram, foram realizadas recorrendo a um Microscpio tico Olympus BX41 e Software Olympus Soft Imaging GelTI.

3.2.Anlise fisiolgica
3.2.1 Culturas do isolado O crescimento do isolado em meio NB a 50C, com e sem adio de sulfato de cobre a 500 M, foi monotorizado pela medio da densidade tica a 600 nm com o espetrofotmetro Beckman DU530. Procedeu-se quantificao do sulfato produzido em meio NB com 500 M de cobre, tal como descrito na seco 2.2. 24

Para contabilizar os esporos formados em cultura, foram retiradas alquotas e aquecidas a 100C durante 10. Foram efetuadas diluies seriadas em meio NB e 50 L de cada diluio foram plaqueados em meio NBA; as placas foram retiradas ca 24h depois para estimao do nmero de esporos germinados 3.2.2 Quantificao da Protena celular total do isolado O ensaio de quantificao de protena baseou-se no mtodo do Coomassie, tambm conhecido por Bradford (Bradford et al, 1976). Este ensaio tem como base a alterao da absorvncia do reagente azul brilhante de Coomassie G-250 de 465 nm para 595 nm, devido formao de um complexo aninico quando o corante se liga a resduos de protena. Este mtodo sensvel, com um nvel de quantificao mnimo de 1g de protena. O mtodo sofre interferncias na presena de detergentes, mas no afetado pela presena de agentes redutores e de ies metlicos. Foi feita uma curva de calibrao, com solues de concentrao conhecida de soro de albumina bovina (BSA, Promega) em gua destilada. A 250L de cada soluo de calibrao adicionou-se, num microtubo, 250L de hidrxido de sdio 1M. A soluo foi homogeneizada e incubada a 99C, durante 10 minutos. Aps arrefecimento da soluo temperatura ambiente durante 15 minutos, esta foi neutralizada pela adio de 50L de cido clordrico 6M. Foram de seguida adicionados 500L de reagente de Bradford (Sigma). A mistura foi agitada no vortex e deixada temperatura ambiente durante 15 minutos. Por fim, a absorvncia foi lida a um comprimento de onda de 595nm, contra gua destilada, tratada de igual modo. Para a leitura da absorvncia foi utilizado o espetrofotmetro Beckman DU530. As amostras a quantificar foram retiradas do crescimento do isolado em meio nutritivo e centrifugadas a 12 000 g, durante 3 minutos; o sobrenadante foi usado para quantificar o sulfato produzido, enquanto o pellet ressuspendido em gua destilada, previamente esterilizada, e submetido a um tratamento de lise com hidrxido de sdio e subsequente neutralizao com cido clordrico, como descrito no pargrafo anterior. Foram ento adicionados 500L de reagente de Bradford a 500L do lisado e feita a leitura da absorvncia a 595nm como acima mencionado.

3.3.Anlise molecular
Para obter uma afiliao taxonmica de isolados, recorre-se a uma amplificao por PCR do gene 16S rRNA. A tcnica de PCR Polymerase chain reaction muito usada em Biologia Molecular, pela sua praticabilidade. Consiste na capacidade de desnaturao da cadeia dupla da molcula de DNA, seguida de uma renaturao das cadeias complementares, amplificadas pela ao de uma polimerase termoestvel. So efetuados vrios ciclos de desnaturao, amplificao e renaturao, pelo uso de diferentes temperaturas em cada ciclo. A tcnica realizada in vitro, no interior de tubos adequados.

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Cada tubo contm uma soluo aquosa com a amostra de DNA a amplificar, uma mistura de desoxirribonuclotidos trisfosfatados (dNTPs mix), cloreto de magnsio, pois o Mg2+ atua com cofator da polimerase, tampo PCR para estabilizar o pH da reao, uma soluo de dois oligonucletidos iniciadores (tambm denominados primers) de 18-30 pb e complementares extremidade 3 de cada cadeia da sequncia alvo e um dado volume de enzima. De salientar que em alguns tampes comerciais, o MgCl2 j se encontra presente. O processo de amplificao inicia-se ento com a etapa de desnaturao onde ocorre uma separao da cadeia dupla do DNA. As cadeias simples resultantes constituem cadeias molde onde se associam os primers por emparelhamento (annealing). O emparelhamento ocorre a uma temperatura condicionada pela temperatura de dissociao dos primers cadeia molde. A ltima etapa corresponde ao alongamento das cadeias complementares por ao da enzima DNA polimerase que adiciona dNTPs complementares cadeia molde. A temperatura desta ltima etapa corresponde temperatura de mxima atividade da polimerase. Cada ciclo do processo permite duplicar a concentrao de DNA. Para a obteno da sequncia parcial do gene 16S rRNA do isolado, procedeuse de incio lise celular de uma nica colnia. Com um palito estril retirou-se uma poro de uma colnia, a qual foi colocada num microtubo com 50L de gua MilliQ. O microtubo foi colocado a 60C, durante 15 minutos, depois a -20C, durante cerca de 45 minutos e novamente a 60C, durante 15 minutos. Este choque trmico em gua permite a lise celular e libertao do DNA molde a ser amplificado. Aps arrefecimento temperatura ambiente, uma alquota do lisado foi utilizada para a reao de PCR. Os primers usados foram 341F (5-CC TAC GGG AGG CAG CAG-3) e o 907R (5 -C CGT CAA TTC MTT TGA GTT T-3) (Muyzer, 1993). Estes so primers universais bacterianos que tm como alvo de hibridao regies conservadas do gene 16S rRNA, mas permitem a amplificao de variantes informativas na atribuio a um dado grupo taxonmico. As letras F e R referem-se aos termos em ingls Forward e Reverse, respetivamente. O primer forward, encontra-se prximo da extremidade 5 do DNA e tem sequncia igual da cadeia modelo, o primer reverse encontra-se prximo da extremidade 3 e tem sequncia complementar e reversa da cadeia modelo. A amplificao foi efetuada num volume total de 50L, contendo Tampo de PCR 1X, 0.2mM de dNTPs, 0.4M de cada primer, 0.25L de enzima FideliTaq DNA Polimerase 5U/L (USB, EUA) e 5L do lisado. A reao de PCR foi realizada no termociclador (Bio-Rad MyCycler) e iniciou-se com uma etapa de desnaturao a 95C durante 2 minutos, seguida de 35 ciclos, cada um com trs etapas consecutivas: desnaturao a 95C, durante 30 segundos, annealing a 54C, durante 30 segundos e extenso a 68C, durante 50 segundos. O ltimo ciclo foi seguido de uma etapa de extenso adicional a 68C, durante 5 minutos. 26

Para verificar o tamanho do produto amplificado (ca 600 pb) e para estimar a sua concentrao, foram depositados 5L do mesmo num gel de agarose (2% p/v em tampo de corrida TAE 1x). Foi aplicado num dos poos do gel 5L de marcador de peso molecular de DNA 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) a 100ng/L. A deposio em gel necessita da adio prvia no DNA a visualizar de um tampo de depsito (2L), o qual contm um componente viscoso, neste caso o glicerol, e um corante, neste caso o azul de bromofenol, permitindo, respetivamente, a fcil deposio e a visualizao da migrao em gel; a migrao durou cerca de duas horas a uma diferena de potencial de 70 volts. Aps a migrao, o gel foi colocado numa tina com brometo de etdio (0.5mg/L) durante 10 minutos. Este agente intercalante do DNA usado com frequncia para a visualizao de cidos nucleicos, devido sua fluorescncia quando exposto luz ultravioleta. Assim, o gel foi retirado da tina e colocado num transiluminador sob luz UV e fotografado com o Software Kodak Gel Logic 200 (Kodak, EUA). O fragmento amplificado foi cortado do gel com uma lmina de bisturi e purificado com o kit DNA Clean & ConcentrationTM (Zymo Research, EUA), de acordo com as instrues do fabricante. O DNA extrado e purificado foi posteriormente sequenciado, com uso dos primers acima referidos, nos Laboratrios da Empresa Macrogen Inc..

4. Extrao de DNA total e quantificao

O sucesso da tcnica de DGGE, como outras de fingerprinting, depende da obteno de cidos nucleicos ntegros, livres de nucleases e de inibidores da reao de PCR. Ora, o solo inclui, entre muitas outras enzimas, nucleases libertadas pelos microrganismos em proliferao ou pela decomposio de animais e plantas aps a morte. Estas enzimas so resistentes inativao e encontram-se adsorvidas s partculas de argila, mantendo a sua atividade. Na camada superficial do solo comum existir hmus, um material amorfo, de composio variada e muito higroscpico. Os coloides hmicos tm capacidade de permuta catinica, e tm poder tamponizante e portanto existe uma certa semelhana entre as propriedades do hmus e as da argila. Pode tambm ocorrer a formao de complexos argilo-hmicos, estando as partculas de argila recobertas por materiais hmicos. Estes complexos de matria orgnica contm inibidores da reao de PCR, de difcil separao durante o processo de extrao de cidos nucleicos (Correia, 1986). A extrao de DNA do solo pois um processo delicado, devido presena de hmus no solo. Geralmente iniciado com uma homogeneizao do material recolhido e lise celular por mtodos mecnicos e qumicos. A adio de hidrxido de sdio durante a lise usada em alguns casos, j que solues alcalinas extraem os 27

cidos hmicos do solo (Benites et al, 2003). Hoje em dia, encontram-se comercialmente disponveis vrios kits de extrao do DNA do solo que incluem reagentes para uma lise celular eficaz com proteo do cido nucleico e a purificao deste com recurso a algum tipo de gel ou coluna de slica. A slica liga-se inicialmente a materiais hmicos que podem ser subsequentemente eludos da matriz. O kit de isolamento de DNA PowerSoil (Mo Bio Laboratories Inc, EUA) foi utilizado para a extrao de DNA a partir das amostras de solo e dos enriquecimentos, Este kit destinado a ser usado em amostras de solo contendo alto teor de cido hmico, incluindo vrios tipos de solos crticos, como a compostagem, sedimentos e excremento. De acordo com as instrues do protocolo fornecido, adicionou-se cerca de 0.25g de cada amostra de solo ou do pellet recolhido por centrifugao dos enriquecimentos a 12 000 g, durante 5 minutos, para um tubo fornecido PowerBead. De seguida, procedeu-se a uma suave homogeneizao e lise celular. Aps centrifugao a 10 000 g durante 30 segundos, o sobrenadante foi sujeito a vrios procedimentos para eliminar materiais hmicos e outros contaminantes orgnicos e inorgnicos. Por fim, a concentrao salina do sobrenadante ajustada para a ligao do DNA a uma membrana de slica e segue-se uma lavagem com etanol afim de remover o sal residual e outros contaminantes. No final desta etapa, procede-se eluio do DNA com uma soluo apropriada, que carece de sal. Aps a extrao, foi realizada uma anlise electrofortica para concluir da integridade do DNA extrado. Fez-se um gel de agarose de 0.8% em tampo de corrida TAE 1x. Foram aplicados 3 L de marcador molecular 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen; 100ng/L) num dos poos e 5 L de DNA genmico extrado nos restantes. As condies de corrida foram 80 volts, durante aproximadamente 2 horas. Aps a corrida, o gel foi colocado numa tina com brometo de etdio (0.5 mg/L) durante 10 minutos, visualizado no transiluminador e fotografado com o software Kodak Gel Logic 200 (Kodak, EUA). Para a determinao da concentrao do DNA extrado, utilizou-se o espectrofotmetro (ThermoScientific NanoDrop 2000 c) atravs da leitura da absorvncia a 260 nm. O sistema fornece tambm o valor da razo A 260/A280, til para verificar a contaminao com protenas tpicas do solo, uma vez que as protenas tambm absorvem a 280nm.

5. PCR-DGGE
5.1.Amplificao do gene 16S rRNA
Para a amplificao do gene 16S rRNA das amostras diretas e enriquecimentos seletivos, foram realizadas duas estratgias distintas: na primeira usaram-se primers universais bacterianos, para avaliao da diversidade global da comunidade. Na 28

segunda, realizou-se uma estratgia de nested PCR (ver esquema 2), na qual so inicialmente utilizados primers concebidos para a amplificao do 16S rDNA de um determinado grupo taxonmico, seguida de uma reao de PCR sobre o produto amplificado obtido, com uso de primers capazes de permitir a amplificao de uma regio interna de qualquer fragmento de DNA obtido na etapa precedente. O ltimo PCR realizado, nesta estratgia permite obter fragmentos de dimenses adequadas para efetuar o DGGE, j que os fragmentos a colocar em gel DGGE no devem ultrapassar 600 pb. Os grupos taxonmicos escolhidos foram o Phylum Firmicutes, que contm as bactrias termoflicas produtoras de sulfato e amnio, a classe -Proteobacteria que contm as bactrias oxidativas de amnia. Por fim, escolhemos as -Proteobacteria que incluem as bactrias sulfato-redutoras. Foram utilizados primers j estabelecidos para cada grupo, e reportados na bibliografia (Muhling et al, 2008). No entanto, no foram encontrados primers para as -Proteobacteria, apenas para grupos especficos de sulfato-redutoras dentro desta classe (Daly et al, 2000; Dar et al, 2005; Muyzer, 2005) Por isso, escolhemos primers descritos como especficos para sulfato-redutoras dos gneros Desulfovibrio e Desulfomicrobium, estes frequentemente encontrados em solos temperados. (Postgate, 1984).

Amplificao com primers universais bacterianos Extrao de DNA Amplificao com primers especficos para grupos filogenticos

Anlise eletrofortica por DGGE Nested-PCR com primers universais e bacterianos Anlise eletrofortica por DGGE

Sequnciao e anlise filogentica

Esquema 2. Esquema das metodologias utilizadas, de amplificao direta e por nested-PCR.

5.2.Primers e reaes de PCR

Para a amplificao do gene 16S rRNA a partir das amostras do solo e enriquecimentos, na abordagem direta, foram escolhidos os primers universais foward, 341F GC (5- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG -3) e o primer reverse 518 R (5 ATT ACC GCG GCT GCT GG -3) (Muyzer et al, 1993). A extenso de 40 bases, rica em G-C no primer foward, confere maior estabilidade aos fragmentos amplificados, o que crucial para evitar 29

que as duas cadeias de DNA do produto de PCR se dissociem completamente durante a eletroforese. As reaes foram efetuadas num volume total de 25L, contendo Tampo de PCR 1X, dNTPs 0.2 mM, cada primer a 0.4M, 0.3L de enzima DreamTaq DNA Polimerase 5U/L (Fermentas, EUA). De seguida, foram adicionados aos microtubos, 10 ng de DNA genmico extrado das amostras do solo ou dos enriquecimentos. Para a estratgia de nested PCR utilizaram-se, tal como mencionado na seco 5.1, os primers referidos por Muhling et al, (2008) e Dar et al, (2005), conforme tabela 2. Para a classe das -Proteobacteria, a primeira amplificao foi efetuada com uso dos primers Beta 359 F (5 GGG GAA TTT TGG ACA ATG GG 3) e Beta 682 R (5 ACG CAT TTC ACT GCT ACA CG 3) de modo a obter fragmentos de cerca de 340pb pertencentes a este grupo filogentico. Para a amplificao posterior, foram utilizados, os primers 518 F GC (5 - CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC AGC AGC CGC GGT AAT 3) e Beta 682 R, acima referido, com obteno de um segundo fragmento de cerca de 180pb, originado a partir do produto obtido no PCR anterior. Para os gneros Desulfovibrio e Desulfomicrobium, foram usados os primers forward DSV 230 (5 - GRG YCY GCG TYY CAT TAG C -3) e reverse DSV 838 (5 SYC CGR CAY CTA GYR TYC ATC 3). A amplificao posterior foi realizada sobre o fragmento obtido, de ca de 600 pb, com os primers supra referidos 341FGC e 518R, obtendo-se um produto de amplificao de ca de 190 pb. Para o Phylum Firmicutes foi usado o primer 9bfm (5 GAG TTT GAT YHT GGC TCA G -3) e o primer reverse 1512 uR (5 ACG GHT ACC TTG TTA CGA CTT - 3), especficos para amplificao de bactrias para uma primeira amplificao, obtendo-se um fragmento de ca de 1.5 Kb. De seguida, foram usados os primers especficos para o Phylum Firmicutes Firm 350 F (5 GGC AGC AGT RGG GAA TCT TC - 3) e o primer reverse Firm 814 R (5 ACA CYT AGY ACT CAT CGT TT 3), obtendo-se um fragmento de PCR de ca 480 pb, a partir do de 1.5Kb. Por fim, foram usados o primer 518FGC, acima descrito e o primer reverse 785 R (5 - CTA CCA GGG TAT CTA ATC C -3), sendo gerado um fragmento de ca 280 pb. As primeiras reaes de PCR, definidas para esta estratgia, foram feitas num volume total de 50L, contendo Tampo PCR 1X, 0.2mM de dNTPs, 0.4M de cada primer e 0.2L de Enzima FideliTaq DNA Polimerase 5U/L (USB, EUA). De seguida, foram adicionados aos microtubos, 10 ng de DNA genmico extrado das amostras do solo ou dos enriquecimentos. No caso da segunda amplificao definida para o Phylum Firmicutes, foram usados 2L do produto de PCR obtido na primeira amplificao.

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As ltimas reaes de PCR, precedendo a deposio em gel DGGE, foram tambm efetuadas num volume total de 50L, contendo Tampo de PCR 1X, dNTPs 0.2mM, 0.4M de cada primer e 0.3L de Enzima DreamTaq DNA Polimerase 5U/L (Fermentas, EUA). Foram usados 2L do produto de PCR obtido na amplificao precedente.

5.3.Etapas de amplificao
A amplificao dos genes 16S rRNA pela abordagem direta e de nested-PCR fez-se no Termociclador (Bio-Rad MyCycler). Para a abordagem direta, procedeu-se a uma etapa de desnaturao a 95C, durante 2 minutos, e, seguidamente, realizaram-se 35ciclos, cada um com trs etapas consecutivas: uma desnaturao a 95C, durante 30 segundos, seguida de annealing a 54C, durante 30 segundos e extenso a 72C, durante 30 segundos O ltimo ciclo foi seguido de uma etapa de extenso adicional a 72C, durante 5 minutos. Para a amplificao das cadeias molde pela estratgia de nested-PCR, a temperatura de annealing foi dependente do par de primers utilizado. Para as amplificaes com uso da enzima FideliTaq DNA Polimerase, aps uma desnaturao inicial a 95C durante 2 min, seguiram-se 35 ciclos incluindo cada um: uma etapa de desnaturao a 95oC durante 30 s, seguida de annealing temperatura apropriada para cada par de primers (ver tabela 2) durante 30 s, e extenso a 68C durante 1 minuto (para o primer 9bfm/1512 Ur, a extenso foi de 90 s). O ltimo ciclo foi seguido de uma etapa de extenso adicional a 68C, durante 5 minutos. Para as amplificaes finais da estratgia referida, realizadas com uso dos primers F-GC e enzima DreamTaq, procedeu-se a uma etapa de desnaturao a 95C, durante 2 minutos, seguida de 25 ciclos, cada um com trs etapas: uma desnaturao a 95C, durante 30 segundos, annealing temperatura apropriada para cada par de primers (ver tabela 2) durante 30 segundos e extenso a 72C, durante 30 segundos. O ltimo ciclo foi seguido de uma etapa de extenso adicional a 72C, durante 5 minutos.

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Tabela 2: Sumrio dos primers 16S rRNA universais e especficos para os subgrupos filogenticos em estudo, a sua posio em E. coli e a temperatura de annealing Temperatura de annealing Estratgia Primer Grupo alvo Posio em E. coli (kb) N de bases ( C)
341 F GC Direta 518 R Nested- PCR (Primeiro PCR Firmicutes) Nested PCR (Segundo PCR Firmicutes) Nested PCR (Pr DGGE Firmicutes) Nested-PCR (Primeiro PCR -Proteobacteria) Nested PCR (Pr- DGGE B-Proteobacteria) Nested PCR (Primeiro PCR) Nested PCR (Pr- DGGE Desulfovibrio e Desulfomicrobium) 9 bFM Bactrias 1512 uR Firm 350 F Firmicutes Firm 814 R 518 F GC Firmicutes 785 R Beta 359 F -Proteobacterias Beta 682 R 518 F GC - Proteobacterias Beta 682 R DSV 230 Desulfovibrio/Desulfomicrobium DSV 838 341 F GC Desulfovibrio/Desulfomicrobium 518 R 518-534 17 818-838 341-398 20 57 56 Muyzer et al, 1993 682-701 230-248 19 18 61 Dar et al, 2005 682-701 518-534 19 17 60 Muhling et al, 2008 785-803 359-378 18 19 63 Muhling et al, 2008 814-833 518-534 19 17 56 Muhling et al, 2008 1492-1512 350-369 Bactrias 518-534 9-27 17 18 20 19 57 Muhling et al, 2008 Universal 341-398 57 56 Muyzer et al, 1993
o

Referncia

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Muhling et al, 2008

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5.4.Visualizao dos produtos de PCR

Aps cada amplificao, foi realizada uma anlise de eletroforese em gel de agarose de 2% p/v em tampo TAE 1x, para concluir da sua eficcia. Foram aplicados 3 L de marcador molecular 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen; 100ng/L) num dos poos e 5 L de cada produto de PCR nos restantes poos do gel. A migrao em gel feita a uma diferena de potencial de 80 volts, durante aproximadamente 2 horas. Aps a corrida, o gel foi colocado em brometo de etdio (0-5 mg/L) durante 10 minutos, e seguidamente visualizado no transiluminador e fotografado com o software Kodak Gel Logic 200 (Kodak, EUA)

5.5.Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE)

A anlise electrofortica em gel de gradiente de desnaturao (DGGE) foi baseada nos procedimentos descritos por Muyzer et al (1993) e Muhling et al (2008). Para o efeito, recorreu-se a um sistema de DGGE -2001 acoplado a uma bomba de agitao, com aquecimento e uma fonte de alimentao EPS-300 II (CBS Scientific, EUA). Foram preparados gis a 8% (p/v) de poliacrilamida, contendo ureia e formamida como agentes desnaturantes, para a migrao dos produtos amplificados. Utilizou-se um marcador contendo uma mistura de fragmentos de amplificao dos genes 16S rRNA de espcies bacterianas, representativas de diferentes classes filogenticas. Esses fragmentos, obtidos com os primers 341F GC 518R, foram amplificados a partir do DNA dos seguintes microrganismos: Escherichia coli K12, e Pseudomonas aeruginosa (-Proteobacteria), Paenibacillus sp. DSM 34 (Bacilli), Streptomyces caviscabies (Actinobacteria). 5.5.1. Preparao dos gis Os gis a 8% (p/v) de poliacrilamida foram preparados a partir de duas solues desnaturantes a 30% e a 50%, por forma a variar o gradiente de desnaturao entre estes dois valores, com recurso a um formador de gradiente de 20 mL e a uma mini bomba peristltica MPP-100 (CBS Scientific, EUA). Prepararam-se solues stock a 0% (1.5 mL de TAE 50x; 30 ml de acrilamida a 39% - acrilamida: 1% - bis-acrilamida (Sigma-Aldrich); 120 mL de H2O destilada) e a 80% (1.5 mL de TAE 50x; 30 ml de acrilamida a 39% - acrilamida: 1% - bis-acrilamida ; 30mL de gua destilada; 48 mL de formamida deionizada (PlusOne); 50.4 g de ureia (PlusOne). A soluo 30 % foi preparada pela adio de 7 mL de soluo stock a 0% a 4 mL de soluo stock a 80%. Para obter a soluo 50%, foram adicionadas 4.1 mL de soluo stock a 0% a 6.9 mL de soluo stock a 80%. A cada soluo foram adicionados 7.7 L do agente polimerizador tetrametilenodiamina (TEMED). 33

Imediatamente antes de inserir as solues no formador de gradiente, foram adicionados 55L de persulfato de amnia a 10% (APS, 0.1g/mL. PlusOne), um agente oxidante que atua na polimerizao da acrilamida. O formador de gradiente utilizado, at o interior das duas placas de vidro, usadas para a montagem do gel, ser preenchido na quase totalidade (o gel liquefeito fica a uma distncia de cerca de 2 cm do topo do sistema de placas). No topo, so rapidamente adicionados, com uma pipeta Pasteur, 10mL de soluo stock a 0%, contendo 7.7L de TEMED e 38L de APS a 10%. Por fim, colocado o pente para formar os poos de deposio das amostras. 5.5.2. Condies de corrida A eletroforese foi realizada em tampo tris-acetato-ETDA a 0.5X com uma voltagem constante de 200 volts, a 60C, durante 3.5 horas. Seguindo a metodologia aconselhada (Green, 2005), o tampo TAE 0.5x foi aquecido no sistema de DGGE at atingir uma temperatura de 60C. Findo este passo, os gis foram montados numa cassete especfica e colocados no interior do sistema. Foi realizada uma pr-corrida de 30 minutos, de modo a testar a migrao a realizar, pois foram colocados nos poos do gel 5L de tampo de depsito contendo Azul de Bromofenol (C19H10Br4O5S, Sigma-Aldrich). Os volumes dos produtos de PCR a depositar foram determinados aps a anlise electrofortica referida em 5.4. Assim foram utilizadas para a migrao 7 L de cada produto de PCR obtido para o grupo Desulfovibrio/Desulfomicrobium e 8 L para os produtos de PCR relativos ao Phylum Firmicutes e classe -Proteobacteria. No caso dos produtos de PCR obtidos pela abordagem direta, foram usados 10 L. Os produtos de PCR foram homogeneizados com tampo de depsito (4 L e 5 L) e depositados nos poos do gel. Aps a corrida, cada gel foi colocado numa tina com brometo de etdio (0.5 mg/L) durante 2 minutos, visualizado no transiluminador e fotografado com o software Kodak Gel Logic 200 (Kodak, EUA). O programa ImageJ, desenvolvido pelo NIH (National Institute of Health, USA), foi usado para a determinao da rea e intensidade relativa das bandas obtidas, por anlise das imagens obtidas em formato tiff.

5.6.Exciso de bandas e purificao

As bandas de interesse foram excisadas a partir dos gis com uma lmina de bisturi estril, sob luz UV e trituradas com bisturi ou uma ponta estril. Adicionaram-se 50 L de tampo TE aos tubos contendo as bandas. Os tubos so submetidos a ciclos de variao trmica entre -20 e 65C de modo a libertar o DNA da acrilamida. Aps centrifugao a 12 000 g durante 3 min, 5 L do sobrenadante so utilizados para reamplificao por PCR com primers de sequncia idntica da dos primers usados na 34

ltima etapa da estratgia de nested-PCR, exceto que o primer forward no possui qualquer extenso GC. As reaes de PCR foram efetuadas num volume total de 50 L com tampo de PCR 1x, 0.2 mM dNTPs, 0.6 uM de cada primer e 0.3 L de Dream Taq 5U/L (Fermentas, EUA). Inicialmente o DNA desnaturado a 95C durante 2 min e seguemse 35 ciclos, cada um com trs etapas: uma desnaturao a 95C 30 seg, seguida do emparelhamento dos primers temperatura de annealing respetiva (ver tabela 2) durante 30 seg, e de extenso a 72C a 30 seg. Aps o ltimo ciclo, foi efetuada uma extenso adicional a 72C durante 5 min. Os produtos de PCR foram purificados com o kit Gel Band Purification (GE Healthcare, EUA), de acordo com as instrues do fabricante e visualizados aps eletroforese em gel de agarose a 2% (p/v). Aps estimao da sua concentrao, foram enviados para sequenciao automtica executada nos laboratrios da empresa Macrogen. Para uma identificao preliminar das sequncias obtidas foi feita uma anlise comparativa com as sequncias de genes 16S rRNA presentes na base de dados GEnBank, NCBI (National Center for Biotechnology Information) com recurso ao Blast (Basic Local Alignment Search Tool).

35

Resultados e discusso
1. Parmetros fsico-qumicos
Os resultados dos parmetros fsico-qumicos, conforme dados do Laboratrio Qumico-Agrcola da Universidade de vora, encontram-se na tabela 3:
Tabela 3: Parmetros fsico-qumicos das amostras recolhidas no solo do olival

Amostras
Fsforo (P2O5) (mol/kg) Nitrato (NO3) (mol/kg) Potssio (K2O) (mol/kg) Cobre (Cu) (mol/kg) Textura pH (H2O)

T-DC 7.326x10-4 7.257x10-5 4.980x10-3 1.640x10-3 Mdia 6.80

T-EC 5.494x10-4 7.257x10-5 1.860x10-3 2.187x10-4 Mdia 6.60

NT-DC 6.199x10-4 1.128x10-4 1.990x10-3 1.510x10-3 Mdia 7.30

NT-EC 2.958x10-4 1.048x10-4 1.120x10-3 5.507x10-5 Mdia 7.50

O solo do olival sob estudo apresenta textura mdia, o que significa que apresenta um equilbrio entre os teores de areia, silte e argila. Normalmente, estes solos apresentam boa capacidade de drenagem, bem como de reteno de gua e ndice mdio de erodibilidade. Assim, no requerem cuidados especiais, adequando-se a todos os mtodos de irrigao. As amostras das zonas tratadas com Cuprital (T-DC; T-EC) revelaram-se ligeiramente cidas, o que pode indicar um efeito deste composto (que apresenta pH 6.5 a 1% em gua) sobre o pH do solo. Pela anlise da tabela verifica-se que as concentraes de nitrato nas amostras dos solos tratados eram inferiores s dos solos no tratados. Este resultado poder estar relacionado com algum efeito direto do tratamento, por exemplo, um aumento da lixiviao do nitrato, causada por repulso com cargas negativas acumuladas no solo, e/ou indireto, pela proliferao de bactrias resistentes ao cobre que usam o nitrato. O valor mais elevado de concentrao de cobre foi medido na amostra composta do solo tratado, recolhida debaixo de copa, como era esperado. De facto, o tratamento com Cuprital realizado por projeo sobre a copa das rvores, ocorrendo fenmenos de deposio de fungicida por lixiviao da copa e escorrimento pelo tronco. Apesar de se tratar de um solo de textura mdia, com boa drenagem, foram encontrados nveis de cobre entre 5,507x 10 -5 (NT-EC) e 1,6 x 10 -3 mol/Kg (T-DC) este ltimo valor superior ao valor de referncia (ca 2x 10-4 mol/kg), utilizado em 36

laboratrios de anlises de solos usado para classificar um solo como de teor elevado em cobre (Manual de fertilizao das culturas, 2 Ed. 2006). Este valor foi obtido, apesar de se terem passado aproximadamente 30 dias, entre o tratamento fitossanitrio e a recolha das amostras, podendo j ter ocorrido assimilao pela comunidade microbiana presente e pelas plantas. A amostra de solo NT-DC apresenta aqui um valor mais elevado que a amostra T-EC, o que questionvel, dado que no setor NT ainda no tinha sido efetuado o tratamento fitossanitrio. Sendo o tratamento feito sobre as copas das oliveiras e de modo rotativo (isto , solos no tratados so sujeitos periodicamente a novo tratamento), poderia prever-se uma semelhana de valores para alguns elementos entre estas amostras, dependendo da diferente capacidade de reteno do solo em relao a diferentes elementos. Neste contexto, importante recordar que a recolha das amostras foi feita em solo hmido, devido ocorrncia de precipitao nos dias anteriores, o que pode ter levado a uma diluio dos ies no solo. O alto teor em cobre pode ser portanto um resultado pontual, devido a algum fator localizado. Contudo, s a recolha de um nmero muito maior de amostras permitiria alguma indicao sobre o valor de cobre determinado.

2 Quantificao nos enriquecimentos

2.1 Produo de amnio
A quantificao de amnio presente foi efetuada nos enriquecimentos seletivos, de modo a avaliar o efeito do cobre e da temperatura. Os resultados esto expressos na Figura 9.

Figura 9: Quantificao de amnio nos enriquecimentos seletivos A) Produo absoluta de amnio B) Produo de amnio normalizada por unidades formadoras de colnias Letras diferentes (a,b, a, b, etc) e algarismos diferentes (1, 2,1, 2, etc) representam diferenas estatisticamente significativas para o fator temperatura e concentrao de cobre respetivamente (p <0.05).

37

Todos os enriquecimentos apresentaram uma produo similar de amnio (figura 9, A) embora ligeiramente inferior a 80C. As comunidades microbianas implicadas nessa produo sero distintas a 30C e a 50C, e ambas produzem amnio na mesma amplitude. Dado que os enriquecimentos a 80C so obtidos pela transferncia das culturas a 50C, o decrscimo observado estar associado a um decrscimo metablico dessa comunidade microbiana a 80C, sugerindo que essa comunidade ser constituda na base por microrganismos moderadamente termoflicos e no hipertermoflicos. Experincias similares efetuadas por Portillo et al (2012), e apenas focando o efeito da temperatura, 25C versus 50C, revelaram resultados diferentes, tendo sido observado um incremento da produo a 50C ou no, de acordo com o tipo de solo agrcola (recolhas em solo florestal ou pastagem, por exemplo). Este fenmeno sugere que no s o tipo de solo como a natureza da espcie agrcola cultivada pode influenciar os resultados obtidos. Uma caracterstica no poder ser dissociada da outra e possvel, por exemplo, que a absoro preferencial de algumas culturas agrcolas de amnio versus nitrato, ou o inverso, influencie a dinmica da comunidade microbiana do solo. Ao avaliarmos a produo de amnio normalizada por unidades formadoras de colnias, notrio um aumento de produo de amnio nos enriquecimentos concentrao de cobre mais elevada. Antes de mais, convm lembrar que a determinao de cfu termoflicos foi feita por plaqueamento a 50C. Isso significa que as colnias obtidas sero maioritariamente as formadas por termoflicos moderados, que conseguem proliferar ou sobreviver s restantes temperaturas sob estudo. Por motivos tcnicos, foi-nos impossvel quantificar a protena total nestes enriquecimentos ou realizar uma contagem das clulas totais nos mesmos, por intermdio da qual teramos resultados distintos. Assim, os resultados observados traduzem a natureza da populao termoflica que est sob seleo em cada enriquecimento, donde os valores obtidos para os enriquecimentos com maior concentrao de cobre, indicaro a presena de bactrias termfilicas produtoras de amnia e resistentes ao cobre.

2.2

Produo de sulfato

A quantificao do sulfato presente nos enriquecimentos foi tambm avaliada pela normalizao por unidades formadoras de colnias. Os resultados esto expressos na Figura 10:

38

Figura 10: Quantificao de sulfato nos enriquecimentos seletivos A) Produo absoluta de sulfato B) Produo de sulfato normalizada por unidades formadoras de colnias. Letras diferentes (a,b, a, b, etc) e algarismos diferentes (1, 2,1, 2, etc) representam diferenas estatisticamente significativas para o fator temperatura e concentrao de cobre respetivamente (p <0.05).

importante referir a dificuldade inerente ao mtodo de quantificao do sulfato; um mtodo sensvel, muito dependente do tempo de agitao aquando da adio de cloreto de brio e sujeito a variaes importantes de absorvncia, variaes essas que tendem a aumentar com a concentrao de sulfato (Kolmert et al, 2000). Isso obriga a um nmero elevado de ensaios e leituras, que de facto no efetuamos, no tendo mesmo havido a possibilidade de determinar o desvio padro no caso do enriquecimento a 80C e 500 M de cobre. Os ensaios efetuados mostraram uma tendncia de aumento da produo de sulfato com a temperatura, em particular a 80C e a uma concentrao de cobre de 100 M de cobre. Em estudos similares descritos por Portillo et al (2012), relativos ao efeito da temperatura, foi tambm observado um aumento da produo de sulfato a 50C, sendo esse aumento muito mais significativo. Esta diferena poder estar associada ao tempo de incubao, o qual foi de 4 dias no estudo referido, ao invs de 24 h, como no nosso caso. Santana et al (no publicado) descreveram um aumento na produo de sulfato por isolados termoflicos, em fase estacionria de crescimento, o que pode estar na base desta diferena. Curiosamente, a produo de sulfato normalizada por unidades formadoras de colnias, segue um padro similar ao registado para a produo de amnio. Atendendo, ao mencionado na seco precedente, tambm aqui os valores obtidos para os enriquecimentos com maior concentrao de cobre, indicaro a presena de bactrias termfilicas produtoras de sulfato (e amnio) e resistentes ao cobre. Em suma, os dados sugerem a presena de microrganismos termfilicos resistentes ao cobre e capazes de processar o enxofre e azoto orgnicos presentes no meio de cultura, produzindo sulfato e amnio.

39

A presena de bactrias termoflicas nos enriquecimentos ocorreu, apesar de a temperatura mdia registada, aquando da recolha da amostra composta NT-EC, ter sido de apenas 10C. Os solos temperados podem, no entanto, apresentar valores muito superiores, tendo j sido registados valores de 60C (Portillo et al, 2012). Tambm em vora, j foram registados valores prximos de 40C a 4 cm de profundidade em solo de olival, durante o vero (Santana et al., no publicado). Ser nesta estao mais quente, que as bactrias termoflicas podero proliferar.

3 Caracterizao fenotpica, fisiolgica e molecular do isolado

3.1 Anlise fenotpica e fisiolgica

Dado que foi nos enriquecimentos com maior concentrao de cobre que se registaram valores elevados de produo de sulfato, a qual se manteve alta a 80C, o enriquecimento em meio NB 80C Cu 500M foi utilizado para a obteno de isolados potencialmente capazes de participar na produo observada. Assim, procedeu-se ao isolamento como indicado na seco 3 da metodologia; obtiveram-se vrias colnias isoladas, no entanto apenas uma foi capaz de crescer em meio NB e NB Cu500M. Quando plaqueado, o isolado obtido formou colnias grandes com cerca de 0.8cm de dimetro aps cerca de 20 horas de incubao a 50C. As colnias apresentavam formato irregular, superfcie lisa e cor bege. Esta morfologia de colnias foi tambm detetada pelo plaqueamento do enriquecimento, realizado para a contagem de unidades formadoras de colnias (ver seco 2 da metodologia). Quando observadas ao microscpio verificou-se que as clulas tinham forma de bastonete e encontravam-se frequentemente aos pares ou formando cadeias mais longas, com maior nmero de clulas. Algumas clulas apresentavam grande mobilidade. Em culturas do isolado, foi observada a formao de endsporos durante a fase estacionria de crescimento. Esta formao est associada limitao de nutrientes no meio, durante esta fase de crescimento; os esporos estaro metabolicamente inativos mas em contnua monitorizao das condies externas (Nicholson et al, 2009). A colorao diferencial de Gram identificou o isolado como Gram-Positivo. Em fase estacionria, tal como acontece com as bactrias Gram-positivas nesta fase, as clulas no coravam to intensamente, (assemelhando-se a clulas Gram-negativas) devido diminuio da espessura da camada de peptidoglicano nas clulas mais velhas. Tambm aqui eram visveis os endsporos, que maduros, no absorvem o corante, devido sua estrutura resistente e hidrofbica; os endsporos surgiam assim como zonas dilatadas no coradas dentro da clula vegetativa (ver Figura 11).

40

Figura 11: Visualizao do isolado ao Microscpio tico Olympus BX41 aps colorao diferencial de Gram.
As setas indicam endsporos em diferentes fases de maturao

Quando o isolado cresceu em NB a 50C sem qualquer adio de cobre, o rendimento de crescimento foi cerca de trs vezes superior quele obtido em presena de 500 M de cobre. Para investigar o efeito do cobre no crescimento, bem como para determinar se o isolado obtido contribui para a produo de sulfato na presena de cobre realizaram-se vrios ensaios. O isolado foi inoculado em meio NB Cu 500M a 50C, 180 rpm durante 25 horas, e de seguida a cultura foi transferida a 80C, sem agitao. Foram retiradas amostras ao fim dos tempos T1 20 h, T2 25 h, T3 28 h e T4 44 h. Portanto, as amostras T1 e T2 correspondem ao perodo de incubao a 50C, e T3 e T4 ao perodo de incubao a 80C. Para cada tempo foi medida a densidade tica da cultura e feitas observaes ao microscpio tico a fresco e aps colorao de Gram. Foi quantificada a presena de esporos a cada tempo como descrito em 3.2.1., procedeu-se tambm quantificao do sulfato e de protena nas amostras, tal como indicado em 2.2. e 3.2.2, respetivamente. Verificou-se que a produo de sulfato aumentou de T1 a T4, tal como indicado na Figura 12:

41

1.5 1.2

0.02 0.018 0.016 0.014 0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0

0.9 0.6 0.3 0

T1

T2

Isolados

T3

T4

Figura 12: Produo absoluta de sulfato total (mM) (azul) e produo de sulfato normalizada em relao -1 ao contedo proteico celular (mmol mg ) (vermelho), para os diferentes tempos T1 a T4.

Figura 13: Visualizao do isolado ao Microscpio tico Olympus BX41 ao tempo T3. a) Preparao a fresco, b)) aps colorao diferencial de Gram

A leitura da densidade tica no mostrou diferenas significativas entre T 1-T3. Em T1 a cultura j se encontrava em fase estacionria, e apenas em T 4 se registou uma queda de 24% no valor lido em relao ao valor mximo encontrado em T 2. O ensaio de choque trmico, bem como a observao microscpica revelaram a total ausncia de esporos. Quer nas preparaes frescas, como nas resultantes de Gram, as clulas apresentavam-se muito segmentadas. Nas preparaes Gram, as clulas tinham zonas coradas intervaladas com zonas no coradas, em particular aos tempos T 3 e T4 (ver Figura 13), e no foram observadas cadeias longas. Nas preparaes a fresco no se observaram clulas mveis. Estas observaes sugerem que o isolado termoflico obtido, produtor de sulfato, est sujeito a stress celular na presena de sulfato de cobre a 500 M. A resistncia ao cobre observada, acarreta custos celulares, j que se verificou uma diminuio do rendimento de crescimento; a morfologia das clulas tambm foi alterada: no foram observadas longas cadeias de clulas e a colorao de 42

[SO42-]mmol mg-1 de protena

[SO42-]mM

Gram sugere uma distribuio irregular dos componentes da parede celular. Alm disso, no foram observados esporos; o efeito inibitrio do cobre na esporulao j foi referido para outros membros da classe Bacilli (Rodriguez et al, 2010). Quanto ao aumento da produo de sulfato, que excretado no meio, tambm provvel que este aumento esteja relacionado ao processamento de molculas orgnicas para a manuteno celular em condies de stress. Portillo et al (2011) e Santana et al (no publicado) j tinham relatado uma dependncia da produo de sulfato com a temperatura, que distinta para diferentes isolados termoflicos, alguns apresentam maior produo de sulfato temperatura tima de crescimento, outros, contudo, podem apresenta-la a temperaturas prximas dos limites mximos e/ou mnimos de crescimento.

3.2.Anlise molecular
Para obter uma atribuio filogentica preliminar do isolado, foi feita a anlise da sequncia de 16SrDNA obtida, de 259 bp, com recurso ao Blast. A tabela 4 apresenta o resultado obtido. Embora o valor E obtido, bem como a percentagem de identidade indiquem uma igualdade absoluta entre o fragmento sequenciado e outros do gnero Bacillus e Geobacillus, no podemos concluir seguramente quanto a uma afiliao taxonmica a um ou outro gnero e muito menos a qualquer espcie. Seria necessrio efetuar uma anlise filogentica por comparao com sequncias de genes 16S rRNA prximos destes grupos, de modo a estabelecer um dendograma filogentico. A obteno de um fragmento maior seria desejvel para uma maior robustez da anlise Contudo, e em associao com os testes fenotpicos, sabemos tratar-se de uma bactria da classe Bacilli, Phylum Firmicutes.

Tabela 4: Resultados da anlise Blast da sequncia parcial do gene 16S rDNA do isolado

Microrganismo
Bacillus subtilis estirpe P38 Clone procariota no cultivadoMB777 Bacillus sp. MBK-z1 Bacillus sp. MBK-d2 Bacillus subtilis ASC582 Bacillus tequilensis BVC67 Bacillus amyloliquefaciens BVC48 Bacillus tequilensis CRRI-HN4 Geobacillus sp. estirpe CRRI-HN1

Nmero de acesso

Valor E 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Mxima Identidade 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

JQ669676.1 JQ693078.1 JQ729680.1 JQ729678.1 JQ796006.1 JQ660650.1 JQ660631.1 JQ695931.1 JQ695928.1

43

4. Anlise dos gis de DGGE e sequenciao

4.1. PCR-DGGE de amostras de DNA do solo

Pseudomonas aeruginosa

E. coli K12

Paenibacillus sp. DSM 34

Streptomyces caviscabies

Figura 14: Gis de DGGE das amostras resultantes de amplificao por nested-PCR sobre o DNA extrado das amostras compostas do solo A- Gel resultante da amplificao com os primers para os gneros Desulfovibrio e Desulfomicrobium; B - Gel resultante da amplificao com os primers para a classe -Proteobacteria.
A) 1 TDC II; 2 TEC II; 3 NTDC; 4 NTEC. B) M marcador; 1 TDC; 2 TDC II; 3 TEC II; 4 NTDC; 5 NTEC

Foram efetuados gis de DGGE com os produtos de PCR resultantes de amplificao sobre o DNA extrado das amostras de solo. A amplificao foi feita quer com uso dos primers universais, quer pela estratgia de nested-PCR (ver Esquema 2 seco 5.1). No primeiro caso, a resoluo dos gis foi muito fraca para todas as condies de corrida testadas, sendo contudo percebido um fingerprint diferente entre amostras provenientes de solos tratados, por um lado, e no tratado com cobre, por outro (resultados no apresentados). O uso de primers dirigidos para grupos taxonmicos especficos, levou a uma melhoria da resoluo dos gis, em particular no que se refere s -Proteobacteria, abundantes no solo (Figura 14). O gel resultante da amplificao com os primers para os gneros Desulfovibrio/Desulfomicrobium apresenta uma fraca resoluo, sendo possvel verificar que as amostras recolhidas em solo tratado, tanto debaixo de copas como entre copas, apresentam um fingerprint semelhante, embora a anlise da intensidade relativa entre algumas bandas, efetuada com recurso ao ImageJ, seja distinta nos dois casos. Isto sugere que o tratamento fitossanitrio efetuado no setor de solo definido 44

para tal, levou a uma seleo de microrganismos resistentes ao tratamento. As amostras de solo no tratado tm fingerprint distinto das amostras tratadas, e semelhante entre si, como j referido; no caso das -Proteobacteria verificou-se tambm que a amostra NT-EC apresentou o fingerprint mais distinto, entre todas as amostras, no apresentando algumas das bandas dominantes presentes em todos os fingerprints. Por outro lado, NT-DC apresenta uma maior similaridade no fingerprint com o das amostras T, o que no pode deixar de nos lembrar os resultados obtidos aquando da medio dos teores em cobre para esta amostra, a qual apresentava um teor tambm elevado para este elemento (ver tabela 3). Acreditamos que uma maior quantidade de DNA molde, bem como o ensaio de mais condies de corrida poderiam ter levado obteno de informao mais detalhada a partir destas amostas. A quantidade limitante de DNA molde levar amplificao de genes 16SrRNA dominantes na populao. Contudo, sabe-se que o uso do Kit PowerSoil, resulta numa eficiente na remoo de contaminantes que podem limitar a reao de amplificao da Polimerase, mas em contrapartida na diminuio do rendimento de DNA extrado (Dineen et al, 2010).

4.2.PCR-DGGE de amostras de DNA extrado dos enriquecimentos

A realizao de enriquecimentos seletivos diminuiu a representatividade dos microrganismos do solo, enquanto permitiu o aumento da resoluo dos gis. Contudo, os enriquecimentos foram perspetivados precisamente para que fossem representados os grupos alvo que quermos estudar; os enriquecimentos tinham como propsito a obteno de bactrias termoflicas do Phylum Firmicutes, grupo, como j referido, heterotrfico e produtor de amnio e sulfato. As -Proteobacteria, tambm alvo do nosso estudo, sero capazes de proliferar no mesmo meio, por utilizao direta deste e/ou dos produtos metablicos produzidos pelas bactrias termoflicas, provavelmente incluindo as bactrias oxidativas da amnia, pertencentes a esta classe. Do mesmo modo, podero ser encontrados sulfato-redutores, que inicialmente presentes no solo vo proliferar nos enriquecimentos, graas produo de sulfato pelas bactrias termoflicas. As -Proteobacteria oxidativas de amnia, bem como os sulfato-redutores podero ser encarados como microrganismos competidores de amnia e sulfato, tornando-os menos disponveis para as plantas, em especial para aquelas que utilizam preferencialmente a amnia. Os enriquecimentos procuravam tambm estudar o efeito do cobre e identificar quais os microrganismos resistentes dentro dos grupos taxonmicos escolhidos. Caso esses no incluam bactrias termoflicas, isso indicar um efeito 1 2 3 cobre 4 sobre 5 este6 grupo M e levar 7 8 9 negativo do tratamento de a uma diminuio do teor em sulfato e amnio no solo, a menos que se trate de solos submetidos adio de fertilizantes. A concentrao mxima de cobre escolhida (500 M) , grosso modo, trs 45

vezes inferior concentrao mxima registada para a amostra recolhida T-DC (Tabela 3). A escolha das concentraes a usar baseou-se na maior disponibilidade do cobre em soluo, quando comparada com aquela do solo, onde o cobre se encontra associado carga negativa do hmus, bem como em referncias bibliogrficas vrias sobre o estudo de bactrias resistentes ao cobre (Chillappagari et al, 2009).

Figura 15: Gel de DGGE das amostras resultantes de amplificao direta sobre o DNA extrado dos enriquecimentos.
1 NB30; 2 NB30 Cu100; 3 NB30 Cu500; 4 NB50; 5 NB50 Cu100; 6 NB50 Cu500; M marcador 7 NB80; 8 NB80 Cu100; 9 NB80 Cu500;

A Figura 15 mostra um agrupamento de fingerprints similares segundo a temperatura, o que sugere ter ocorrido um efeito mais seletivo da temperatura e no do cobre sobre a comunidade microbiana. No entanto, o efeito da adio de cobre sobre a diversidade foi mais drstico para valores mais elevados de temperatura, e concentrao mais elevada de cobre. Os resultados sugeriram tambm que poderiam ser revelados, pelo uso da estratgia de nested-PCR, presena de micrbios resistentes ao cobre para os distintos grupos taxonmicos, dada a presena de bandas correspondentes a microrganismos resistentes ao cobre para as diferentes temperaturas.

46

4.2.1. Phylum Firmicutes O gel de DGGE com os produtos de PCR resultantes da amplificao com os primers especficos para o Phylum Firmicutes sobre o DNA extrado dos enriquecimentos est na figura 16.

3 7 8

4 2 1 6 5

Pseudomonas aeruginosa

9
Escherichia coli k12

Paenibacillus sp. DSM 34 1 2 3 4 5 6 7 8 M

Figura 16: Gel de DGGE das amostras de DNA extrado dos enriquecimentos seletivos, amplificadas com o par de primers especficos para o subgrupo filogentico Firmicutes.
M Marcador; 1 - NB30 Cu100; 2 - NB30 Cu500, 3 NB50, 4 NB50 Cu100; 5 NB50 Cu500; 6 NB80; 7 NB80 Cu100; 8 NB80 Cu500. As setas a vermelho representam as bandas que foram sequenciadas.

Foram escolhidas as bandas assinaladas para posterior sequenciao. A anlise conjunta das sequncias- com recurso ao Blast- e da sua intensidade relativa em cada enriquecimento-com recurso ao ImageJ - permitiu a identificao preliminar dos microrganismos sob efeito da temperatura e do cobre (ver Tabela 5). A utilizao do programa ImageJ permitiu-nos de facto inferir da proporo relativa de cada banda, dentro da mesma amostra e comparativamente s amostras restantes, por comparao da rea de cada uma, determinada aps descont ar o rudo de fundo (Figura 17), Deste modo, qualquer erro resultante da deposio de diferentes quantidades de DNA obtido nas distintas amplificaes, eliminado.

47

593

451

Figura 17: Perfil dos picos obtidos para as bandas da amostra NB30 Cu100, e da amostra NB30 Cu500; o clculo da rea de algumas bandas est indicado

As identidades encontradas foram exploradas, pela consulta dos nmeros de acesso fornecidos pelo Blast. Lysinibacillus sp. e Bacillus cereus so mesoflicos, frequentemente encontrados no solo, o que est de acordo com o padro obtido pelas bandas correspondentes, consequente ao aumento da temperatura. Tambm se encontra em concordncia com os dados conhecidos, a presena de bandas correspondentes a estes microrganismos na presena de cobre; a base de dados do EMBL revela a existncia de protenas de resistncia ao cobre nos dois casos. A temperaturas mais elevadas, so identificados os gneros Brevibacillus e Geobacillus. Isolados pertencentes a estes gneros j foram descritos como importantes na mineralizao do enxofre e azoto, produzindo sulfato e amnia (Portillo et al, 2012; Santana, no publicado (ver seco 6)) Atendendo distribuio das sequncias apresentada na tabela 5, podero ser membros destes gneros que intervm na produo de amnio e sulfato, nos enriquecimentos a 50C com e sem cobre. Em membros deste gnero, foi encontrado o gene codificante da molcula chaperone CopZ, responsvel no efluxo de cobre (ver seco 8). importante referir que o facto de se ter observado o aumento de intensidade de algumas bandas na presena de cobre, no significa que haja um estmulo proliferao de um dado microrganismo pela ao direta do cobre, mas sim uma inibio da competio ao seu crescimento por parte de outros micrbios no resistentes.

48

Dentro das sequncias obtidas, de salientar, as correspondentes s bandas 8 e 9, com grande intensidade a NB80Cu500. A sequncia da banda 9 idntica sequncia do isolado obtido (ver seco 3.2), alinhando exatamente entre as posies 201 e 449 pb desta ltima, e corroborando a abundncia do isolado no enriquecimento mencionado. Por outro lado, idntica de Bacillus vallismortis, uma espcie isolada a partir de dunas de areia no Vale da Morte, Califrnia. (Roberts et al, 1996). A sequenciao total do gene 16SrRNA do isolado ir revelar se esta espcie poder tambm estar presente no solo hmido de um olival em vora.

49

Tabela 5: Tabela resultante da anlise conjunta da sequncia e da intensidade relativa de bandas selecionadas no gel-Figura16

Amostras
Bandas (amostras) NB30 1 Cu100 NB30 2 Cu500 Resultados BLAST Lysinibacillus fusiformis strain Ulm26 Bacillus cereus strain YAP13 Bacillus cereus strain SPD Uncultured bacterium clone ncd957e10c1 Brevibacillus limnophilus strain DSM 6472 Uncultured bacterium clone ncd957e10c1 Brevibacillus limnophilus strain DSM 6472
Uncultured organism clone Anoxybacillus sp. 3nP4 Geobacillus sp. JAM-FM0901 Geobacillus sp. MKK-2005 Bacillus atrophaeus strain Uz1106 Bacillus subtilis QB928 Bacillus vallismortis strain UAC-21 Bacillus amyloliquefaciens strain UAC-19 Brevibacterium halotolerans strain UAC-13

Valor E 6e 6e
-126

NB30 Cu100 + (-)

NB30 Cu500 (+) +

NB50 (+)

NB50 Cu100 (+)

NB50 Cu500

NB80

NB80 Cu100

NB80 Cu500

Aumento da temperatura

Aumento de [Cu] no meio

-126

NB50 Cu500

3e

-123

+ (+)

(+)

NB50 Cu500

2e

-125

(-)

(-)

(+)

(+)

(-)

NB80 Cu500

2e

-126

(-)

(+)

NB80 Cu500

7e

-120

(-)

(-)

(+)

NB80 Cu500

Bacillus atrophaeus strain Uz1106 Bacillus subtilis QB928 Bacillus vallismortis strain UAC-21 Bacillus amyloliquefaciens strain UAC-19 [Brevibacterium] halotolerans strain UAC-13

2e

-126

(+)

(-)

(-)

Nota: Os smbolos (+) e (-) simbolizam uma diminuio de intensidade e grande diminuio de intensidade, relativa ao total de bandas para cada poo, respetivamente

50

4.2.2. Subgrupo filogentico -Proteobacteria Foram efetuados gis de DGGE com os produtos de PCR resultantes da amplificao por nested-PCR, com os primers especficos para as -Proteobacteria (figura 18).

Pseudomonas aeruginosa

Escherichia coli k12 Paenibacillus sp. DSM34

Figura 18: Gel de DGGE das amostras de DNA extrado dos enriquecimentos seletivos, amplificadas com o par de primers especficos para o subgrupo filogentico -Proteobacteria M marcador composto por uma mistura bacteriana; 6 NB30; 7 NB30 Cu100; 8 NB30 Cu500; 9 NB50; 10 NB50 Cu100; 11 NB50 Cu500; 12 NB80; 13 NB80 Cu100; 14 NB80 Cu500. As setas a vermelho representam as bandas que foram sequenciadas.

Foram escolhidas as bandas assinaladas para posterior sequenciao. A anlise conjunta das sequncias- com recurso ao Blast- e da sua intensidade relativa em cada enriquecimento-com recurso ao ImageJ- permitiu a identificao preliminar dos microrganismos sob efeito da temperatura e do cobre (ver Tabela 6). As identidades encontradas foram exploradas, pela consulta dos nmeros de acesso fornecidos por Blast. O gnero Massilia pertence classe -Proteobacteria, ordem Burkhoderiales, famlia Oxalobacteraceae. Esta inclui grande nmero de bactrias saprfitas, de enorme versatilidade; muitas so utilizadas como agentes de controlo antifngico e de bioremediao, dada sua capacidade de metabolizao de inmeros compostos orgnicos, incluindo herbicidas (Sangodkar et al, 1988). Os relatos sobre a resistncia ao cobre por parte de membros da classe B- Proteobacteria so escassos. Recentemente foram isolados duas espcies de Massilia a partir de superfcies metlicas de cobre (Esprito Santo et al, 2010). Esta descoberta

51

consistente com os nossos resultados, os quais incluram o gnero Massilia nas sequncias derivadas dos enriquecimentos com cobre. Ochrobactrum foi um gnero igualmente identificado nas sequncias obtidas. Surpreendentemente, apenas surge no enriquecimento efetuado a 50 oC, no se tendo encontrado qualquer registo bibliogrfico desse gnero a essa temperatura. Trata-se de um gnero da ordem Rhizobiales, famlia Brucellacea, cujos membros so quimiorganotrficos aerbios. Contrariamente ao esperado uma -Proteobacteria, mas, Muhling et al (2008) obtiveram tambm com a estratgia de nested-PCR mencionada, 17% de sequncias no-pertencentes ao grupo alvo -Proteobacteria. A base de dados UniProt (EMBL) regista a presena de protenas de resistncia ao cobre similares ao sistema Cop j descrito (ver seco 8), tambm em Ochrobactrum. Este organismo tambm j foi detetado aquando do isolamento de bactrias oxidativas da amnia com metabolismo mixotrofico. Algumas espcies sero assim capazes de crescer sob modo heterotrfico e autotrfico, oxidando a amnia com produo de nitrito (Kouki et al, 2011). Assim, a proliferao de bactrias termoflicas poder estar associada proliferao de bactrias de crescimento mixotrfico, oxidando a amnia disponibilizada pelas primeiras.

52

Tabela 6: Tabela resultante da anlise conjunta da sequncia e da intensidade relativa de bandas, selecionadas no Gel-Figura 18

Bandas (amostras) 1 NB30 2 NB30 Cu100 NB30 Cu100 NB50

Resultados BLAST
No Determinado Uncultured bacterium clone YJ-114 Massilia sp. C1804 Unculture bacterium clone YJ-114 Massilia sp. C1804 Naxibacter sp. UFLA0 4-292 Similar a banda 5 Ochrobactrum sp. FDK2 Ochrobactrum sp. He-Xw Uncultured bacterium isolate Uncultured beta proteobacterium Ochrobactrum sp. FDK2 Ochrobactrum sp. He-Xw Uncultured bacterium clone YJ-114 Massilia sp. C1804 Pantoea agglomerans strain ZFJ-15 Ochrobactrum sp. FDK2 Ochrobactrum sp. He-Xw

Valor E
6

NB30 Cu100

NB30 Cu500

NB50

Amostras NB50 NB50 Cu100 Cu500

NB80

NB80 Cu100

NB80 Cu500

Aumento da temperatura

Aumento de [Cu] no meio

1e

-70

(+)

(-)

3 4

9e

-72

+ (-) +

(-) (-)

2e

-55

NB50

2e

-55

(-)

(-)

6 7 8 9

NB50 NB50 Cu100 NB80

2e 9e 1e

-64

7 2 6

+ + + (-) (-)

(+) + (+)

(+) (-) + (+)

-72

-47

NB80 6 + (+) + (+) -63 3e Cu100 NOTA - a banda 5 apresenta comigrao de duas sequncias distintas. Os smbolos (+) e (-) simbolizam uma diminuio de intensidade e grande diminuio de intensidade, relativa ao total de bandas para cada
poo, respetivamente

53

4.2.3. Subgrupo filogentico Desulfovibrio/Desulfomicrobium Foram tambm efetuados gis de DGGE com os produtos de PCR resultantes da amplificao com os primers especficos para o subgrupo filogentico Desulfovibrio/Deslfomicrobium sobre o DNA extrado dos enriquecimentos (figura 19).

Pseudomonas aeruginosa

6 12 8 3 Escherichia coli estirpe k12 Paenibacillus sp. DSM 34 4 2 1 9 7 5 10 11 13

14

Figura 19: Montagem do gel de DGGE das amostras de DNA extrado dos enriquecimentos seletivos, amplificadas com o par de primers especficos para os gneros Desulfovibrio/Desulfomicrobium.
M Marcador; 1 - NB30 Cu500; 2 - NB30 Cu100, 3 NB30, 4 NB50 Cu500; 5 NB50 Cu100; 6 NB50 C; 7 NB80; 8 NB80 Cu100; 9 NB80 Cu500. As setas a vermelho representam as bandas que foram sequenciadas.

Foram escolhidas as bandas assinaladas para posterior sequenciao. Os resultados obtidos atravs da anlise das sequncias pelo Blast, foram, no obstante, distintos dos esperados. Obtiveram-se sequncias correspondentes a microrganismos, todos eles da classe Bacilli, famlia Paenibacillaceae. Em particular, vrias sequncias mostravam identidade com membros do gnero Paenibacillus, gnero no detetado na estratgia prvia de nested-PCR usada para o Phylum Firmicutes. Verificou-se de facto, com uso do Primer-Blast (NCBI), que os primers DSV (ver seco 5.2) podem emparelhar com o gene 16SrRNA de Brevibacillus e Paenibacillus, originando um fragmento de tamanho similar ao esperado pelo emparelhamento com o gene 16SrRNA de membros do grupo-alvo. Esta observao est alis associada degenerescncia dos primers usados. Assim, estes primers descritos por Dar et al (2005), na definio de uma estratgia para a deteo de baixos nmeros de bactrias sulfato-redutoras em comunidades microbianas complexas, revelam-se teis apenas quando usados para aquelas condies que favoream a proliferao de sulfato54

redutores. Este foi alis, o caso estudado pelos autores, que analisaram a diversidade microbiana em reatores de tratamento de guas residuais. Ao conjugar os resultados do Blast com os do ImageJ (Tabela 7), vrias informaes importantes foram colhidas. Alm da deteo de Paenibacillus sp., como acima mencionado, anaerbios facultativos, mesoflicos e esporulantes, frequentemente encontrados no solo, em particular na rizosfera, encontrmos membros do gnero Brevibacillus, com um padro de resposta similar ao observado anteriormente (ver tabela 5). De reparar por exemplo, nas sequncias das bandas 8 e 9, reportando identidade a Brevibacillus, presentes nos enriquecimentos a 50C e na presena de cobre, tal como j tinha sucedido quando da anlise em 4.2.1. Apenas uma banda (banda 11) correspondia a uma sequncia de um clone bacteriano no cultivado, a qual pode corresponder a um membro do gnero Desulfomicrobium.

55

Tabela 7: Tabela resultante da anlise conjunta da sequncia e da intensidade relativa de bandas, selecionadas no Gel-Figura 19

Amostras
Bandas (amostras) NB30 3 Cu100 Resultados BLAST
No determinado Paenibacillus sp. CAU1055 Paenibacillus glebae strain EA14 Brevibacillus borstelensis strain MA5 Paenibacillus residui strain R8-313 Paenibacillus sp. R27413 Brevibacillus borstelensis strain MA5 Uncultured bacterium clone ncd957e10c1 Uncultured compost bacterium partial Brevibacillus limnophilus strain E10 Brevibacillus sp. enrichment culture clone phylotype P25 Uncultured bacterium clone 65_51 No determinado No determinado Paenibacillus barengoltzii 16S

Valor E

NB30

NB30 Cu100

NB30 Cu500

NB50

NB50 Cu100

NB50 Cu500

NB80

NB80 Cu100

NB80 Cu500

Aumento da temperatura

Aumento de [Cu] no meio

+
3e 8e 3e 1e 1e
-66

4 5 6 7 8 9 10

NB30 Cu100 NB50 NB50 Cu100 NB50 Cu100 NB50 Cu500 NB50 Cu500 NB80 NB80 Cu100 NB80 Cu500 NB80 Cu500 NB80 Cu500

(-) +

+ (+) + + (+) ( (+) ( (+) + + + (-) + + (+) (+) (+) (+) + + + (-) (-) (-)

-73

-66

(-)

-71

-71

2e

-59

3e 2e

-67

11 12 13 14

-73

3e

-72

(-)

(-)

(-)

NOTA: Os smbolos (+) e (-) simbolizam uma diminuio de intensidade e grande diminuio de intensidade, relativa ao total de bandas para cada poo, respetivamente

56

Concluses e perspetivas futuras

A descoberta recente do papel das bactrias termoflicas como produtoras de amnio e sulfato, incita a vrios estudos sobre a sua potencial aplicao como biofertilizantes ou adjuvantes na fertilizao dos solos e a consider-las como elementos de importncia na elaborao de futuros modelos agrcolas, mais sustentveis. Num trabalho recente, Santana et al, (no publicado) mostraram um efeito do sobrenadante de cultura de alguns isolados termoflicos do Phylum Firmicutes, na estimulao da germinao de sementes de Nicotiana benthamiana in vitro. assim possvel conceber uma utilizao para as bactrias termoflicas a mdio prazo, em ambientes controlados, como em estufa, e em etapas iniciais do desenvolvimento de plantas agrcolas. Contudo, o seu uso direto em solos agrcolas requer um estudo deveras aprofundado. Esse estudo deve ter em considerao a influncia de vrios fatores fsico-qumicos, aqueles inerentes composio mineral do solo e fatores climticos, bem como fatores associados quantidade, atividade e diversidade microbiana do solo, que agem sobre os primeiros. Ser sempre impossvel de compreender a interao global entre os vrios microrganismos do solo, mas possvel visar grupos especficos e realizar inmeros ensaios em campo, quando for desejada uma futura aplicao dos resultados laboratoriais. Assim, na execuo deste trabalho focamo-nos sobre grupos taxonmicos de interesse: as bactrias termoflicas supramencionadas, e as bactrias oxidativas de amnia (-Proteobacteria) e redutoras de sulfato (Desulfovibrio e Desulfomicrobium), potencialmente competidoras com as plantas na absoro de amnio e sulfato, respetivamente, estes produzidos pelas primeiras. Foi estudado o efeito da temperatura e do cobre sobre a dinmica desses grupos. A temperatura tem uma importncia evidente sobre a proliferao das bactrias termoflicas. O cobre, amplamente usado como elemento fitossanitrio, a maioria das vezes sob a forma de sulfato de cobre, pode ser extremamente txico como referido na seco 8. As alteraes na comunidade microbiana foram avaliadas sobre enriquecimentos seletivos, obtidos a partir de uma amostra composta de solo de olival, visando primariamente o enriquecimento em bactrias termoflicas presentes na amostra. A tcnica molecular de fingerprint PCR-DGGE, foi a utilizada para tal estudo, j que constitu uma ferramenta poderosa no estudo da diversidade microbiana, ao permitir incluso a identificao de membros da comunidade, impossveis de obter com os tradicionais mtodos de cultivo. Entre os resultados obtidos, consequentes a esta anlise, so importantes de referir:

57

 O aumento da temperatura e do cobre permitiram a proliferao de membros do Phylum Firmicutes, dos gneros Bacillus, e em particular de Brevibacillus, gneros com genes codificantes de protenas resistentes ao cobre. Estes so tambm os gneros reportados como produtores de amnio e sulfato, o que mostrou que o tratamento com cobre (o qual foi usado nos ensaios em teor similar ao encontrado no solo sob tratamento) no foi limitativo para o crescimento destes microrganismos. O teor de sulfato produzido foi aumentado a temperatura mais elevada, e em particular maior concentrao de cobre utilizada, mostrando que o tratamento com cobre no limita a produo de sulfato. Esse aumento, concomitante atividade dos gneros Bacillus e Brevibacillus detetados, poder estar associado a um mecanismo de stress despoletado pelo cobre, j que um isolado produtor de sulfato, obtido a partir de um enriquecimento concentrao de 500 M de cobre, mostrou uma diminuio do rendimento de crescimento. O tratamento com cobre no influencia a produo total de amnia, a qual similar nos vrios enriquecimentos. A maior proliferao das bactrias termoflicas produtoras de sulfato e amnia a temperatura mais elevada levou tambm deteo de Proteobacteria (gnero Ochrobactrum) capazes de utilizar amnio em crescimento mixotrfico. Estes dados sugerem algumas estratgias a ter em conta no tratamento dos solos agrcolas com cobre. Se considerarmos o potencial das bactrias termoflicas na fertilizao e que estas incluem membros resistentes ao cobre, ento uma aplicao preventiva deste elemento durante um perodo sazonal quente, teria menos impacto sobre a populao termoflica do solo, a qual, embora resistente ao cobre, ter um fator limitante adicional ao seu crescimento durante uma estao fria (o fator temperatura). Dado que a proliferao das bactrias termoflicas incentivar a proliferao de populaes mixotrficas com a consequente formao de nitrito e nitrato, o uso potencial destas espcies endgenas como fertilizantes seria mais adequado para aa culturas agrcolas que utilizem o nitrato, bem como a amnia. Pretendemos, num futuro prximo, repetir ensaios de DGGE similares, todavia com recurso a primers para genes codificantes de enzimas, como os genes codificantes da amnia monooxigenase (AMO) e da sulfito reductase (DSR), para deste modo proceder a uma anlise comparativa, bem como a eliminar a frequente comigrao nos gis de DGGE, associada existncia de cpias mltiplas dos genes de RNA ribossomal. Tambm perspetivamos a elaborao de bancos genmicos a partir do DNA extrado dos enriquecimentos, e a utilizao dos fragmentos sequenciados como sondas a hibridar nesses bancos, de modo a obter a sequncia total dos genes 58

16SrRNA aqui amplificados parcialmente. Por fim, a realizao de PCR quantitativo em tempo real, com recurso a primers especficos para os gneros aqui determinados fornecer uma informao mais completa sobre a sua interdinmica.

59

Referncias Bibliogrficas
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62

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66

Anexos
i. Tabelas referentes quantificao de sulfato e amnia nos enriquecimentos
Tabela 8 - Quantificao de amnio nos enriquecimentos.

Stock (mM) NB30 NB50 NB80 NB 30 Cu100 NB50 Cu100 NB80 Cu100 NB30 Cu500 NB50 Cu500 NB 80 Cu500

Mdia [NH4] mM 8.048 7.628 5.579 7.990 8.228 4.852 7.777 7.297 4.267

Desvio padro () 0.365836523 1.852541115 1.27166156 1.827855889 2.008670577 1.411358757 1.229623121 1.507482157 1.401566585

Mdia [NH4]/(CFU/ml) 1.13349E-08 7.62812E-09 1.85977E-07 3.99484E-07 8.22846E-09

Desvio padro () 5.15263E-10 1.85254E-09 4.23887E-08 9.13928E-08 2.00867E-09

No determinado 2.59223E-07 2.43233E-07 1.42239E-07 4.09874E-08 5.02494E-08 4.67189E-08

67

Tabela 9 - Quantificao de sulfato nos enriquecimentos

Stock (mM) NB30 NB50 NB80 NB 30 Cu100 NB50 Cu100 NB80 Cu100 NB30 Cu500 NB50 Cu500 NB 80 Cu500

Mdia [SO42-] mM Desvio padro Mdia [SO42-]/(CFU/ml) () 0.287 0.392 0.615 0.288 0.238 0.735 2.254 2.219 1.271 0.153512882 0.171473394 0.092744125 0.089236876 0.178120198 0.301298199 0.025950819 0.035143207 No determinado 4.0359E-10 3.9225E-10 2.0486E-08 1.4405E-08 2.3795E-10

Desvio padro () 2.16215E-10 1.71473E-10 3.09147E-09 4.46184E-09 1.7812E-10

No determinado 7.5145E-08 7.3962E-08 4.2368E-08 8.65027E-10 1.17144E-09 No determinado

ii.

Sequncia do 16S rDNA do isolado

Tabela 10 Sequncia 16S rDNA do isolado obtido a partir do enriquecimento.

Amostra

Sequncia
AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGT GATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTC GAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTG CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT AAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGG GGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTC CACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGC GACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGT TTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGG TCGCAAGACTGAAACT

Isolado

68

iii.

Sequncias das bandas recolhidas do gel DGGE

a. Firmicutes
Tabela 11 - Sequncias obtidas a partir das bandas recolhidas do gel de DGGE.

Bandas

Amostras

Sequncias

CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCCTTTAAGTCTGATGTGA AAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGC NB30 Cu100 AGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGG AGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCG CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG* CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAA AGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCA NB30 Cu500 GAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGA GGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGC GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTA AAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTACGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCA NB50 Cu500 GAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGG AGGAACACCAGTGGCGAAGGCGRCTYTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCG CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTA AAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTACGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCA NB50 Cu500 GAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGG AGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCG CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG CCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGA AAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGC NB80 Cu500 AGAAGAGGAGAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTG GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGC GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG CCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCKCGCAGGCGGTTYCTTAAGTCTGATGTGA AAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGC NB80 Cu500 AGAAGAGGAGAGYGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTG GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGRCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGM GCGAAAGCGTGGGGAGCRAACAGGATTAGATACCCTGGTAG CCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGA AAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGC NB80 Cu500 AGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTG GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGA GCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG NOTA a sublinhado encontra-se a sequncia do primer Reverse (785R) usada na amplificao

por PCR das bandas recolhidas.

69

b. -Proteobacteria
Tabela 12 - Sequncias obtidas a partir das bandas recolhidas do gel de DGGE.

Bandas
1 2

Amostras
NB30 NB30 Cu100

Sequncias
TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGTC TGTCGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCGATGGAGACTGC AAGGCTTGAATCTGGCAGWGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGT GAAATGCGT TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGTC TGTCGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCGATGGAGACTGC AAGGCTTGAATCTGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTG AAATGCGT Similar a banda 5. TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGYGCGCAGGCGGYTMTGTAAGTCT GGTGTTAAAGCCCSGGGCTCAACCCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTA GCTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGTATTCCMCGTGTRKCASTGAAA TGCGT TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTG GTGTTAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAG CTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGCAGTGAAAT GCGT TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGTC TGTCGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCGATGGAGACTGC AAGGCTTGAATCTGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTG AAATGCGT TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCGGGTAAGTCT GATGTCAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTACGCATTGGAAACTGCTCG ACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAA TGCGT TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTG GTGTTAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAG CTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGWATTCCACGTGTAGCAGTGAAAT GCGT

3 4 5

NB30 Cu100 NB50 NB50

NB50

NB50 Cu100

NB80

NB80 Cu100

NOTA a sublinhado encontra-se a sequncia do primer Reverse (682R) usada na amplificao por PCR das bandas recolhidas.

70

c. Desulfovibrio/Desulfomicrobium
Tabela 13 - Sequncias obtidas a partir das bandas recolhidas do gel de DGGE.

Bandas
3 4

Amostras
NB30 Cu100 NB30 Cu100

Sequncias
GYCKGAMTARAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAARGTTTTCGGATCGT AAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGCTTGGGAGAGTAACTGCTCTCAA GGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAG CCGCGGTAAT* SAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATTG TAAAGTTCTGTTGTCAGAGACGAACAAGTACCGTTCGAACAGGGCGGT ACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCARCA GCCGCGGTAAT GCCTGACAGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTA AAACTCTGTTGCCAGAGAAGAAAGCTAAGGAGAGTCACTGCTCTTTGG TTGACGGTATCTGARAAGAAAGCCCCGGCTAACTACSTGCCAGCAGCC SCGGTAAT GTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAARGTCTTCGGATTGTAA AGTTCTGTTGTCAGAGACGAACAAGTACCGTTCGAACAGGGCGGTACC TTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAAT GAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAARGTCTTCGGATT GTAAAGTTCTGTTGTCAGGGACGAACAAGTACTGTTCGAATARGGCAG TACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC AGCCGCGGTAAT GCGGAATAAGSACGCCGCGTGCACGATKATAGTCTTCGGATTGTAAAG TTCTGTTGTCAGGGACGAACAAGTACCGTTTGAACAAGGCGGTACCTT GACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG CGGTAAT GAAGGAGCAACGCCGCGTGAACGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGT TCTGTTGTCAGGGACGAACAAGTACCGTTCGAACAGGGCGGTACCTTG ACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTAAGTGCCAGCAGCCGC GGTAAT GACGAAAGTCTGATGAAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAAGTCTTCG GATTGTAAAGTTCTGTTGTCAGGGACGAACAAGTACCGTTCGAACAGG GCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC CAGCAGCCGCGGTAAT AAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCG TAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGARCGTCCGTTAGAGTAACTGCTAACG GAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCA GCCGCGGTAAT

NB50

NB50 Cu100

NB50 Cu100

NB50 Cu500

NB50 Cu500

10

NB80

11 12 13 14

NB80 Cu100 NB80 Cu500 NB80 Cu500 NB80 Cu500

NOTA a sublinhado encontra-se a sequncia do primer Reverse (518R) usada na amplificao por PCR das bandas recolhidas.

71