www.bluejayway.it Corso di microbiologia virologia Enrico Colombo Inizialmente, i virus sono stati descritti come agenti ltrabili permeavano oltre le membrane utilizzate per trattenere i batteri I virus sono sempre parassiti intracellulari obbligati: - dipendono per la replicazione dallapparato biochimico della cellula ospite. - La replicazione dei virus avviene per assemblaggio dei singoli componenti, non per scissione binaria. I virus pi semplici consistono di un genoma a DNA o RNA racchiuso in un involucro proteico, talvolta circondato da membrana: - non hanno capacit di produrre energia o substrati - Non fanno sintesi proteica utilizzano lapparato biosintetico della cellula ospite - Non sono in grado di replicare il proprio genoma indipendentemente dalla cellula ospite. La struttura e la genetica dei virus, nel tempo, si sono modicate mediante mutazione selezionate caratteristiche adattative che hanno favorito linfezione nelluomo e in altri ospiti: - per infettare devono anche - Sopravvivere a condizioni ambientali difcili - Attraversare cute e altre barriere dellospite - Adattarsi al macchinario chimico della cellula ospite per la replicazione - Sfuggire alla risposta immunitaria Classicazione Alcuni virus, es parvovirus e picornavirus, sono piccoli e strutturalmente semplici, mentre altri, es poxvirus e herpesvirus, sono grandi e complessi. La nomenclatura utilizzata per i virus, pu descrivere: - caratteristiche - Malattie alle quali essi sono associati - Tessuto che infettano - Localit geograca dove sono stati identicati per la prima volta. I virus possono essere classicati in base a: - malattie causate - Tessuti bersaglio - Via di trasmissione - Vettori I criteri di classicazione pi validi e attualmente adottati, si riferiscono a caratteristiche siche e biochimiche, quali: - dimensioni - Morfologia (es presenza o assenza di un pericapside lipidico) - Tipo di genoma - Strategie di replicazione. I virus a DNA associati a malattie nelluomo sono dividi in sette famiglie. I virus a RNA possono essere divisi in almeno 14 famiglie. Corso di microbiologia - virologia 2 www.bluejayway.it Propriet dei virus Non ltrabili Parassiti intracellulari obbligati Non possono produrre energia o proteine Non possono replicare il proprio genoma Sfruttano lapparato biosintetico della cellula ospite Possono avere capside nudo o pericapside. Possono essere a DNA o a RNA, ma non entrambi Hanno origine dallassemblaggio delle componenti, non dalla divisione binaria. Classicazione, struttura e replicazione dei virus Enrico Colombo Virus a DNA FAMIGLIA VIRUS A DNA Poxviridae Virus del vaiolo, virus vaccinico, virus del vaiolo della scimmia, mollusco contagioso Herpesviridae Virus herpes simplex tipo 1 e 2, virus varicella-zoster, virus di Epstein-Barr, cytomegalovirus, herpes virus umani 6, 7, e 8. Adenoviridae Adenovirus hepadnaviridae Virus dellepatite B Polyomaviridae Virus JC, virus BK, SV 40 Papillomaviridae Papillomavirus Parvoviridae Parvovirus B19, virus adeno-associati Virus a RNA FAMIGLIA VIRUS A RNA Paramyxoviridae Virus parainfluenzae, virus Sendai, virus del morbillo, virus della parotite, virus respiratorio sinciziale Orthomyxoviridae Virus influenzale tipi A, B e C Coronaviridae Coronavirus, SARS (severe acute respiratory sindrome) Arenaviridae Virus ella febbre di Lassa, Tacaribe virus complex, virus della coriomeningite linfocitaria Rhabroviridae Virus della rabbia, virus della stomatite vescicolare Filoviridae Virus di Ebola, virus di Marburg Bunyaviridae Virus dellencefalite della California, virus lucrose, virus della febbre della mosca della sabbia, virus della febbre emorragica, Hanta virus Retroviridae Rotavirus, virus della febbre da zecca del Colorado Picornaviridae Rhinovirus, poliovirus, echovirus, virus coxsackie, virus dellepatite A Togaviridae Virus della rosolia, virus dellencefalite equina occidentale/orientale/del Venezuela, Virus Ross River, virus Sindbis, virus Semplici forest Flaviviridae Virus della febbre gialla, virus degne, virus dellencefalite di St. Louis, virus West Nile, virus dellepatite C, Noroviridae Virus Norwalk, calicivirus Delta Agente delta Struttura del virione Lunit di misura per le dimensioni dei virus il nanometro, in quanto i virus con importanza clinica hanno dimensioni comprese tra: - 18 nm (parvovirus) - 300 nm (poxvirus) visibili al MO, dimensioni circa di 1/4 di stalococco Generalmente, i virus pi grandi possono contenere un genoma pi grande codicano pi proteine sono pi complessi. Il virione, particella virale, consiste di: - genoma di acido nucleico Corso di microbiologia - batteriologia 3 www.bluejayway.it - Rivestimento esterno - Capside di natura proteica - Envelope o pericapside membrana - Pu contenere alcuni enzimi o altre proteine. Il capside ed altre proteine possono legare gli acidi nucleici, associandosi al genoma, formando il nucleocapside, che pu circondare da solo il virione o essere circondato da un pericapside. Il genoma dei virus pu essere a DNA o a RNA: - il DNA pu essere - Singolo lamento (ss) o Doppio lamento (ds) - Lineare o circolare - LRNA pu essere - Polarit positiva (+) o negativa - Doppio lamento (+/-) - Ambisenso (contiene regioni di RNA + e - unite luna allaltra) Il genoma a RNA pu essere anche segmentato in pezzi ogni frammento codica un singolo gene. Tutte le forme di genoma virale possono conservare e trasmettere linformazione genetica del virus. Generalmente, pi grande il genoma pi geni pi grande la struttura capsidica o pericapsidica per contenerlo. Lo strato pi esterno del virione il capside o il pericapside: - forniscono impacchettamento, protezione e veicolo di trasporto per la trasmissione del virus - Le strutture di supercie favoriscono linterazione del virus con la cellula bersaglio - Rimozione o distruzione delle strutture esterne inattivazione del virus - Anticorpi contro le strutture esterne bloccano linfezione virale. Il capside una struttura rigida, in grado di sopportare condizioni ambientali sfavorevoli: - virus con capsidi nudi resistenti allessiccamento, agli acidi e ai detergenti - Molti trasmessi per via oro-fecale, ma possono essere trasmessi anche attraverso acque di scolo. Il pericapside o envelope una membrana composta da: - lipidi, proteine - Glicoproteine. La struttura membranacea del pericapside pu mantenersi solo in soluzioni acquose: - rapidamente distrutta da essiccamento, acidi, detergenti e solventi inattivazione del virus - I virus rivestiti da pericapside devono rimanere in ambiente umido - Trasmissione: uidi, aerosol, sangue e tessuti - La maggior parte non sopravvive alle condizioni avverse del tratto gastrointestinale. Virus con capside (A in gura) Il capside virale assemblato a partire da singole proteine, che si associano in unit progressivamente pi grandi: - tutte le componenti del capside hanno caratteristiche chimiche che permettono di unirsi assieme e assemblarsi in strutture di maggiori dimensioni - Singole proteine strutturali si associano in subunit le quali si uniscono in protomeri pi protomeri formano i capsomeri si uniscono in procapsidi. - Il procapside deve essere ulteriormente modicato per dare il capside nale, trasmissibile. - Per alcuni virus il procapside si forma attorno al genoma - Per altri si forma come guscio vuoto e viene successivamente riempito dal genoma Le strutture virali pi semplici hanno simmetrie: - elicoidali: tali virus hanno forma simile a bacchette - Icosaedro: formano virus simili ad una sfera (approssimativamente) - Asimmetrici hanno forme complesse e sono tipiche di alcuni batteri (fagi) Lesempio classico di simmetria elicoidale il virus del mosaico del tabacco: - capsomeri che si autoassemblano sul genoma a RNA in barre, che si estendono per tutta la lunghezza del genoma - I capsomeri coprono e proteggono lRNA - Nucleocapside elicoidali sono osservati anche allinterno del pericapside di molti virus a RNA con polarit negativa. Icosaedri semplici sono utilizzati da virus piccoli e poco complessi (es picornavirus e parvovirus): - composti da 12 capsomeri, ognuno con simmetria pentamerica (pentameri) - Ogni pentamero dei picornavirus composto di 5 protomeri, costituiti da 3 subunit di 4 proteine distinte. - Fon cristallograa a raggi X e analisi delle immagini di microscopia crio- elettronica si denito a livello molecolare la struttura El capside dei picornavirus. Corso di microbiologia - batteriologia 4 www.bluejayway.it I virioni icosaedri pi grandi sono costituiti per inserzione, tra i pentoni situati ai vertici, di esoni: - gli esoni sono formati da sei capsomeri connanti - Tale icosaedro esteso detto icosadeltaedro la grandezza determinata dal numero di esoni inseriti trai i bordi e le superci denite dai pentoni (es pallone da calcio) - Il nucleocapside dellherpesvirus ha 12 pentoni e 150 esoni, anche circondato da pericapside. - Il capside delladenovirus composto da 12 pentoni e 240 esoni (252 capsomeri) - Ad ogni pentone delladenovirus attaccata una lunga bra, che funge da proteina virale di attacco (VAP) funge da attacco alla cellula bersaglio. Virus con pericapside (B) Il pericapside virale composto da - lipidi, - proteine - glicoproteine Raramente, vi si ritrovano proteine cellulari, anche se il pericapside stesso origina da membrane cellulari. La maggior parte dei virus rivestiti da pericapside ha forma sferica o pleomorfa, con alcune eccezioni. La gran parte delle glicoproteine virali possiede carboidrati legati ad asparagina (N-linked) che si estendono attraverso il pericapside e allesterno della supercie virale: - spesso agiscono come VAP, in grado di legare strutture sulle cellule bersaglio - Emoagglutinina (HA): VAP che legano anche gli eritrociti. - Alcune glicoproteine hanno anche altre funzioni - Orthomyxovirus neuraminidasi - Paramyxovirus proteine di fusione - Herpes simplex recettori Fc e C3b - Le glicoproteine, inoltre, sono i pi importanti antigeni che determinano protezione immunitaria. Il pericapside dei togavirus circonda un nucleocapside icosaedrico, contenente un genoma a RNA a polarit positiva: - il pericapside contiene spicole formate da subunit glicoproteiche si ancorano al pericapside icosaedrico il pericapside aderisce strettamente al capside e si conforma su una struttura icosaedri Tutti i virus a polarit negativa hanno il pericapside: - le componenti dellRNA polimerasi RNA-dipendente si associano col genoma a RNA degli orthomyxovirus, paramyxovirus e rhabdovirus formano nucleocapsidi elicoidali - Tali enzimi, necessari per iniziare la replicazione virale, si associano al genoma assicurato il loro ingresso nella cellula. - Le proteine della matrice, aderenti nel pericapside, facilitano lassemblaggio del ribonucleocapside nel virione Il virus dellinuenza A (un orthomyxovirus) tipico esempio di virus a RNA con genoma segmentato: - il pericapside riveste le proteine di matrice e ha due glicoproteine - Emoagglutinina (HA) funge da VAP - Neuraminidasi (NA) Il pericapside degli herpesvirus una struttura a sacca che racchiude il nucleocapside icosadeltaedrico: - a seconda dello specico herpesvirus pericapside pu contenere no a 11 glicoproteine Corso di microbiologia - batteriologia 5 www.bluejayway.it - Lo spazio interstiziale, tra nucleocapside e pericapside, detto tegumento. - Contiene enzimi e altre proteine, anche mRNA, che facilitano linfezione. I poxvirus sono virus rivestiti, con morfologia grande, complessa, a mattone: - il pericapside racchiude - una struttura detta nucleoide, a forma di manubrio, contenente il DNA. - Corpi laterali, brille e altri enzimi e proteine. Replicazione virale Le fasi principali dei processi replicativi virali sono le stesse per tutti i virus: - la cellula come una fabbrica in quanto fornisce - Substrati - Energia - macchinari per sintesi di proteine/acidi nucleici - I processi che la cellula non pu compiere codicati da enzimi presenti nel genoma virale. Il ciclo di replicazione virale pu essere scomposto in diverse fasi: - fase precoce: il virus riconosce la cellula bersaglio appropriata, penetra la membrana plasmatica, incorporato nella cellula, rilascia il suo genoma nel citoplasma (scapsidamento) e lo trasporta nel nucleo - Fase tardiva: inizia con la replicazione virale e la sintesi delle macromolecole virali, per terminare con lassemblaggio e poi il rilascio del virione. Si deniscono alcuni periodi di infettivit e struttura caratteristica dei virus: - periodo di eclissi: dalla perdita del capside o del pericapside perdita di infettivit e struttura caratteristica. Termina con lassemblaggio dei nuovi virioni, che tornano ad essere infettivi. - Periodo di latenza: non si rilevano virus extracellulari infettanti, comprende il periodo di eclissi e termina solo con il rilascio del virus. Ogni cellula infettata pu produrre no a 10 5 particelle virali, ma solo 1-10% diventano infettive: - particelle difettive: la gran parte, sono il risultato di mutazioni o errori di assemblaggio - Quantit di virus rilasciato: percentuale di virus infettivo per cellula per ogni singolo ciclo riproduttivo. - Determinato dalle propriet del virus e della cellula bersaglio. Riconoscimento ed attacco alla cellula bersaglio Il legame delle VAP (proteine di attacco virale) - strutture sulla supercie del capside virionico - ai recettori espressi sulla cellula bersaglio il fattore determinante per linfezione: - i recettori per il virus proteine o carboidrati posti su glicoproteine o glicolipidi di membrana. - I virus che si legano a recettori espressi su specici tipi cellulari possono determinare uninfezione ristretta a particolari specie o specici tipi cellulari. - La cellula bersaglio suscettibile denisce il tropismo tissutale. - EBV, ad esempio, ha uno spettro dospite e un tropismo molto limitati si lega infatti al recettore CR2 (per C3d) sulle cellule B umane. - Il parvovirus B19 lega il globoside espresso su precursori eritroidi. Per un virus con capside nudo, le strutture virali di attacco possono essere: - parte del capside - Proteine sporgenti dal capside stesso - Solco (canyon) sulla supercie del rhinovirus 14, un picornavirus, funge da toppa per linserimento di una porzione della molecola ICAM-1 sulla supercie della cellula. Le VAP sono glicoproteine speciche dei virus con pericapside: - emoagglutinina (HA) del virus dellinuenza A lega lacido sialico espresso su molte cellule ampio spettro dospite e tropismo tissutale Corso di microbiologia - batteriologia 6 www.bluejayway.it - Flavivirus e -togavirus in grado di legarsi a recettori espressi sulle cellule di diverse specie animali premette di diffondere anche attraverso animali, zanzare e insetti. Penetrazione Interazioni multiple tra VAP e recettori cellulari avvio del processo di ingresso: - il meccanismo di ingresso dipende dalla struttura del virione e dal tipo cellulare - La maggior parte dei virus nudi entra nella cellula per - Endocitosi mediata da recettori: normale processo cellulare, adottato dalla cellula per incorporare le normali molecole ligando di quei recettori - viropessi: picornavirus e paopvavirus dopo il legame del virus alle cellule, possono essere esposte strutture idrofobiche delle proteine del capside, che aiutano il virus a scivolare direttamente in membrana. - I virus con pericapside, entrano nella cellula ospite attraverso fusione delle membrane con le membrane cellulari - Liberano il nucleocapside o il genoma direttamente nel citoplasma. - Il pH ottimale per la fusione di un virus con pericapside determinante, in quanto - A pH neutro la fusione pu avvenire direttamente nel citoplasma - A pH acido la fusione avviene dallinterno di un endosomi. - Lattivit di fusione pu essere fornita dalla VAP o da unaltra proteina. - LHA del virus dellinuenza A si lega ai recettori di acido sialico nellambiente blandamente acido dellendosoma HA subisce un cambiamento conformazionale esposizione di molecole idrofobe fusione delle membrane. - I paramyxovirus possono indurre la fusione cellula-cellula formazione di sincizi (cellule giganti plurinucleate) Scapsidamento Una volta entrato nella cellula ospite sono necessari: - Guida del nucleocapside al sito di replicazione - Il genoma dei virus a DNA trasferito nel nucleo - Genoma dei virus a RNA resta nel citoplasma - Rimozione del capside (scapsidamento) - Pu essere avviato - dallancoraggio al recettore - Dallambiente acido - Da proteasi che si trovano il endosomi o lisosomi I virus con pericapside iniziano lo scapsidamento durante la fusione delle membrane: - la fusione del pericapside degli herpesvirus con la membrana plasmatica rilascia allinterno il nucleocapside si ancora alla membrana nucleare trasferisce nel nucleo il genoma a DNA - Il rilascio del nucleocapside del virus dellinuenza dalla sua matrice e dal pericapside facilitato dal passaggio di protoni allinterno dellendosoma, attraverso i canali ionici formati dalla proteina virale di matrice M2 I reovirus e poxvirus vanno incontro a scapsidamento solo parzialmente durante lingresso: - il capside esterno dei reovirus rimosso, ma il genoma rimane in un capside interno qui sono presenti le polimerasi necessarie alla sintesi dellRNA - I poxvirus fusione di membrana rilascio di una particella subivate nel citoplasma pu avviare la sintesi di mRNA da parte di enzimi presenti nel virione sintetizzato un enzima di scapsidamento rilascio nel citoplasma del core, contenente DNA. Sintesi macromolecolari Una volta allinterno della cellula, il genoma virale deve dirigere: - sintesi dellmRNA virale - Sintesi delle proteine virali - Replicazione di s stesso I processi pi importanti nellambito della moltiplicazione virale sono dunque, trascrizione, traduzione e replicazione del genoma: - il genoma inutilizzato nch non viene trascritto in mRNA funzionali - Questi utilizzano i ribosomi cellulari per essere tradotti proteine - Le strategie di ciascun virus in queste fasi dipendono - dalla struttura del genoma - dal sito dove avviene la replicazione Lapparato di trascrizione e processamento dellmRNA in una cellula eucariotica situato nel nucleo. La maggior parte dei virus a DNA utilizza la RNA polimerasi II DNA-dipendente e altri enzimi correlati per produrre mRNA: - gli mRNA eucariotici, acquisiscono una coda poliA e un cap metilato in 5 e sono processati (rimossi gli introni) prima di raggiungere il citoplasma - Anche i virus devono provvedere a tali funzioni o ad esse alternative. La maggior parte dei virus a RNA replica e sintetizza mRNA nel citoplasma (eccetto orthomyxovirus e retrovirus): - la cellula eucariote non duplica mRNA i virus a RNA devono codicare gli enzimi necessari per la trascrizione e la replicazione Corso di microbiologia - batteriologia 7 www.bluejayway.it I genomi nudi dei virus a DNA e dei virus a RNA a polarit positiva (eccetto i retrovirus) sono sufcienti per iniziare la replicazione dopo che siano stati iniettati in una cellula acidi nucleici infettanti: - possono interagire direttamente con gli apparati della cellula ospite e promuovere la sintesi di mRNA e proteine Generalmente, lmRNA di proteine non strutturali trascritto per primo: - prodotti dei geni precoci: proteine non strutturali, in grado di legare DNA ed enzimi, comprese le polimerasi codicate dal virus - Hanno funzione catalitica - Ne sono sufcienti solo poche copie - - Replicazione del genoma permette di passare alla fase successiva Prodotti dei geni tardivi: codicano per le proteine strutturali. Sono necessarie molte copie per limpiccamento dei virioni - Non sono generalmente necessarie prima che sia replicato il genoma - I genomi appena replicati fungono da ulteriori nuovi stampi per la sintesi degli mRNA dei geni tardivi. - Virus a DNA e RNA diversi controllano la cinetica e la capacit di sintesi dei geni virali e delle proteine attraverso differenti strategie. Virus a DNA La replicazione del genoma a DNA richiede: - DNA polimerasi DNA-dipendente - Altri enzimi - Desossiribonucleotidi trifosfati (in particolare timidina) La trascrizione del DNA genomico virale avviene nel nucleo e utilizza la polimerasi e altri enzimi della cellula ospite per la sintesi degli mRNA virali: - regolata dallinterazione di proteine leganti il DNA speciche per sequenze promotori e enhancer del genoma virale - Promotore e enhancer virali omologie di sequenza con quelli dellospite permettono il legame della RNA-polimerasi DNA-dipendente e dei fattori trascrizionali - Le cellule di alcuni tessuti non esprimono le proteine leganti il DNA necessarie per attivare la trascrizione dei geni virali la replicazione del virus in quelle cellule completamente limitata o impedita il virus rimane nella cellula in forma latente - La trascrizione pu determinare dunque il tropismo tissutale e lo spettro dospite del virus. La regolazione della trascrizione nei virus a DNA differente per i diversi virus: - i virus pi complessi producono i propri attivatori trascrizionali, che innalzano o regolano lespressione dei geni virali - Il virus herpes simplex codica proteine che regolano le cinetiche di espressione virale, tra cui la VMW 65 si trova nel virione, si lega al complesso di attivazione trascrizionale della cellula ospite aumenta la capacit di stimolare la trascrizione dei geni virali precoci - I geni possono essere trascritti da entrambi i lamenti di DNA e in direzioni opposte - Geni precoci e tardivi del paopvavirus SV40 sono situati su lamenti opposti e non sovrapposti. - I geni virali possono contenere introni ed esoni necessario lo splicing La replicazione del DNA virale segue le medesime leggi biochimiche del DNA cellulare: - inizia in una specica sequenza del DNA genomico, detta origine (ori) sito riconosciuto da fattori nucleari o virali e dalla DNA polimerasi DNA- dipendente. - Sintesi semiconservativa - Le polimerasi (virali o dellospite) richiedono un primer per avviare la sintesi della nuova catena - I parvovirus hanno sequenze di DNA ripetute e invertite, per permettere al DNA di ripiegarsi e ibridare con s stesso i tal modo formano un primer - Negli adenovirus la replicazione attivata da una deossicitidina monofosfato attaccata ad una proteina terminale. - Gli herpesvirus codicano una propria primasi, enzima che sintetizza primer di RNA La replicazione del genoma dei virus a DNA: - virus semplici: utilizzano la DNA polimerasi della cellula ospite - Virus pi complessi: utilizzano polimerasi proprie generalmente pi veloci ma meno precise aumento del tasso di mutazione I principali fattori limitanti per la replicazione di un virus a DNA sono: - disponibilit della DNA polimerasi e dei desossiribonucleotidi - La maggior parte delle cellule in fase quiescente non sintetizza DNA perch gli enzimi necessari non sono presenti e i pool di desossitimidina sono limitati. - Pi piccolo il virus e pi dipende da tali mansioni. - Lantigene T di SV40, le proteine E6 e E7 del papillomavirus e la proteina E1a degli adenovirus si legano a proteine cellulari che inibiscono la crescita (es RB, o p53): - maggiore proliferazione cellulare aumento della replicazione virale Corso di microbiologia - batteriologia 8 www.bluejayway.it I virus a DNA pi grandi possono codicare p.e. Runa DNA polimerasi e altre proteine sintesi del DNA facilitata maggiore indipendenza dalla cellula. Virus a RNA Nei virus a RNA la replicazione e la trascrizione si somigliano, in quanto i genomi di tali virus sono: - RNA a polarit positiva: un mRNA - RNA a polarit negativa: lo stampo di un mRNA. Durante la replicazione e la trascrizione formazione di un intermedio di RNA a doppio lamento: - struttura non presente nelle cellule non infettate. Il genoma dei virus a RNA deve codicare delle RNA polimerasi RNA- dipendenti (replicasi e trascrittasi): - la cellula non replica lRNA - LRNA viene degradato velocemente necessaria una RNA polimerasi fornita o subito sintetizzata dopo lo scapsidamento - Molte RNA polimerasi lavorano velocemente molto soggette ad errore. - La replicazione de genoma fornisce nuovi stampi per la produzione di ulteriore mRNA amplicata e velocizzata la replicazione virale Genomi virali a RNA+ I genomi virali a RNA a lamento positivo si comportano come mRNA: - si legano ai ribosomi e dirigono la sintesi proteica - Sintetizzano una RNA polimerasi RNA-dipendente produce un lamento di RNA a polarit negativa sfruttato per produrre nuovi mRNA nuovi genomi - Sintesi di proteine - Nuovi genomi virali Il genoma virale nudo a RNA+ sufciente per avviare da solo linfezione. I virus a RNA+ sono: - picornavirus - Norovirus - Coronavirus - Flavivirus - Togavirus Gli mRNA di tali virus non hanno il cap allestremit 5, ma hanno una corta sequenza poliA. La trascrizione e replicazione dei coronavirus condividono alcuni di questi meccanismi, ma sono pi complessi. Genomi virali a RNA- Il genoma a RNA a lamento negativo non infettante di per s: - funge da stampo per la produzione di mRNA - Deve essere trasportata nella cellula anche una polimerasi, associata come parte del nucleocapside - necessaria a formare mRNA specico per le proteine virali. - Prodotto anche RNA di lunghezza completa positiva stampo per generare altre copie di genoma. - Eccetto che per i virus inuenzali, trascrizione e replicazione dei virus a RNA a polarit negativa avvengono nel citoplasma. La trascrittasi del virus dellinuenza necessita di un innesco per produrre mRNA sfrutta le estremit 5 degli mRNA cellulari presenti nel nucleo come innesco per la polimerasi cattura il cap in 5 sugli mRNA cellulari. I virus a RNA a polarit negativa sono: - rhabdovirus - Orthomyxovirus - Paramyxovirus - Filovirus - bunyavirus Genoma a RNA segmentato a doppio lamento I reovirus sono provvisti di un genoma a RNA segmentato a doppio lamento, con modalit complesse di replicazione e trascrizione. LRNA polimerasi dei reovirus parte del core presente allinterno del capside: - trascritti singoli mRNA da ognuno dei 10 o pi frammenti genomici, mentre si trovano ancora nel core - I lamenti antisenso dei segmenti genomici utilizzati come stampi per gli mRNA in maniera simile a quanto avviene per i virus a RNA a polarit negativa - Enzimi codicati dal reovirus, contenuti nel core interno del capside aggiunta del cap allestremit 5 dellmRNA virale. - Gli mRNA non possiedono la coda di poliA. Gli mRNA sono rilasciati nel citoplasma dirigono la sintesi proteica o sono sequestrati in nuovi core. Nei nuovi core: - RNA+ stampo per la sintesi di RNA a lamento negativo - La polimerasi del core produce RNA progenie a doppio lamento. Corso di microbiologia - batteriologia 9 www.bluejayway.it Genoma circolare ambisenso Gli arenavirus possiedono un genoma circolare ambisenso, con sequenze + adiacenti a sequenze -: - geni precoci trascritti dalla porzione a polarit negativa - Geni tardivi trascritti dallintermedio replicativo a lunghezza completa Retrovirus I retrovirus possiedono un genoma RNA a polarit positiva, ma non possiedono sistemi di replicazione per lRNA nel citoplasma: - contengono nel virione - due copie del genoma - Due molecole di tRNA utilizzato come innesco per la sintesi di una copia di DNA complementare circolare del genoma (cDNA) - Una trascrittasi inversa (DNA-polimerasi RNA-dipendente) Il cDNA sintetizzato nel citoplasma traslocato nel nucleo integrato con la cromatina dellospite: - diviene un gene cellulare - La presenza di promotori allestremit del genoma virale aumentata lestensione della trascrizione delle sequenze di DNA virale - Trascritti completi Nuovi genomi - Singoli mRNA generati per splicing codicano per le proteine virali Deltavirus La strategia di replicazione pi atipica quella dei deltavirus: - genoma a RNA singolo lamento positivo circolare a forma di bacchetta e abbondantemente ibridato con s stesso. - Si replica nel nucleo ad opera della RNA polimerasi II DNA-dipendente della cellula ospite una porzione del genoma forma una struttura a RNA detta ribozima, la quale taglia lRNA circolare per produrre mRNA. Sintesi delle proteine virali Per la sintesi delle proteine tutti i virus dipendono dalla cellula ospite, per quanto riguarda - ribosomi - RNA transfer (tRNA) - Meccanismi di modicazione post-traduzionale Il legame del mRNA al ribosoma pu essere mediato da - cap 5 terminale di guanosina metilata viene attaccata allmRNA in modo differente per i vari virus - IRES, internal ribosome entry sequence struttura di RNA a forma di cappio si lega nella porzione interna del ribosoma per dare inizio alla sintesi proteica Molti, ma non tutti gli mRNA virali hanno una coda poliA. Il ribosoma eucariotico si lega allmRNA e sintetizza una sola proteina prima di distaccarsi dallmRNA: - ogni virus aggira tale fattore limitante in maniera differente, a seconda della struttura del genoma - Lintero genoma di un virus a RNA a lamento positivo viene letto dal ribosoma e tradotto in una poli-proteina gigante la proteina tagliata dopo da proteasi virali e cellulari in varie proteine funzionali. - Virus a DNA, retrovirus e la maggior parte dei virus RNA- trascrivono mRNA separati per singole proteine. I virus utilizzano strategie differenti per favorire la traduzione differenziale del loro mRNA virale al posto dellmRNA cellulare: - spesso, la concentrazione del mRNA virale nella cellula sittanto alta da occupare la maggior parte dei ribosomi - Linfezione da parte delladenovirus blocca luscita di mRNA cellulare dal nucleo - I virus herpes simplex e altri inibiscono le sintesi macromolecolari della cellula inducono degradazione del DNA e mRNA cellulare - Per favorire la traduzione selettiva, il poliovirus inattiva la proteina ribosomiale legante il cap con una propria proteasi Corso di microbiologia - batteriologia 10 www.bluejayway.it - Queste attivit contribuiscono alla citopatogenicit dellinfezione virale. Alcune proteine virali richiedono modicazioni post-traduzionali (fosforilazione, glicosilazione, acilazione o solfatazione): - fosforilazione: attuata da protein chinasi cellulari o virali sistema per attivare/inattivare le proteine - Parecchi herpesvirus e altri virus codicano per delle proprie protein- chinasi. - Glicoproteine virali sono sintetizzate sui ribosomi legati alla membrana e contengono sequenze aminoacidiche che permettono linserzione nel RER, quindi la N-glicosilazione. - La forma precursore delle glicoproteine trasportata al Golgi. - La glicoproteina matura, contenente acido sialico, espressa sulla membrana plasmatica della cellula, salvo che questa non abbia segnali che la trattengono negli organuli. - La presenza di glicoproteine determina la regione dove si assembla il virione. Assemblaggio Lassemblaggio dei virioni analogo a un puzzle ad incastro tridimensionale, che si compone da solo: - si assembla a partire da piccole proteine, per racchiudere il genoma in un pacco funzionale. - Ogni elemento del virione possiede delle strutture di riconoscimento permettono al virus di instaurare le corrette relazioni - Proteina-proteina - Proteina-acido nucleico - Proteina-membrana (virus con pericapside) - Lassemblaggio inizia quando alta la concentrazione di elementi del capside la reazione di assemblaggio procede spinta termodinamicamente - Pu esservi la facilitazione da parte di proteine di impalcatura o altre proteine attivate per proteolisi. Il sito e il meccanismo di assemblaggio dei virioni dipendono: - dalla regione in cui ha luogo la replicazione del genoma - Dal fatto che la struttura nale abbia un capside o un pericapside. I capsidi dei virus possono essere assemblati come: - procapsidi, strutture vuote riempite con genoma - Assemblati attorno al genoma. - Nucleocapsidi di retrovirus, togavirus, virus a RNA a polarit negativa sono assemblati attorno al genoma successivamente oso racchiusi nel pericapside - Il nucleocapside elicoidale di virus a RNA a polarit negativa include la RNA-polimerasi RNA-dipendente, necessaria per la sintesi di mRNA nella cellula bersaglio. Per i virus con pericapside: - glicoproteine virali processate sono trasportate sulle membrane cellulari attraverso trasporto vescicolare - Associazione nucleocapside-regione di membrana con glicoproteine virali gemmazione del nucleocapside nel pericapside. - Le proteine di matrice nel caso dei virus a RNA a lamento negativo preparano e promuovono ladesione dei nucleocapsidi alle membrane - modicate dalle glicoproteine il nucleocapside gemma fuori dalla membrana Il sito di gemmazione determinato da: - tipo di genoma - Sequenza proteica delle glicoproteine. La maggior parte die virus a RNA gemma dalla membrana plasmatica il virus rilasciato al momento della gemmazione. Flavivirus, coronavirus, bunyavirus gemmazione allinterno del RER o del Golgi possono restare nella cellula associati a tali organuli. Virus herpes simplex si assembla nel nucleo e gemma nel reticolo endoplasmatico si porta fuori dal ER, perdendo il pericapside della prima gemmazione si libera il nucleocapside, si associa ad altre proteine virali: - il virione trasportato sulla supercie della cellula e rilasciato per esocitosi durante la lisi cellulare - o trasmesso direttamente ad altre cellule, mediante ponti inter-cellulari. Lassemblaggio di un virione completo o funzionale di virus inuenzale richiesta la presenza di una copia di ogni segmento genico 1 : - 8 segmenti genomici costituiscono il genoma - I virioni ne possono includere casualmente 10/11 - Statisticamente 1 virione completo ogni 20 virioni difettivi Durante lassemblaggio si vericano degli errori: - virioni vuoti - Virioni contenenti genomi difettivi Il rapporto tra particelle virali e virus infettivo (rapporto particelle/unit formanti placca) alto: Corso di microbiologia - batteriologia 11 www.bluejayway.it 1 i virus inuenzali hanno genoma segmentato a RNA doppio lamento - normalmente maggiore di 10, - Con processi replicativi rapidi pu giungere a 10 4 . Virus difettivi possono impiegare gli apparati necessari alla normale replicazione virale particelle difettive interferenti. Rilascio I virus sono rilasciati dalla cellula: - dopo lisi - Per esocitosi - Per gemmazione dalla membrana plasmatica I virus con capside nudo rilasciati generalmente dopo lisi. I virus con pericapside generalmente rilasciati per gemmazione. I virus che gemmano o acquisiscono la loro membrana da organuli citoplasmatici rilasciati per lisi o per esocitosi. Ripresa del ciclo replicativo Quando il virus nel mezzo intracellulare, determina generalmente lavvio di nuove infezioni. Linfezione pu essere diffusa anche attraverso altri meccanismi: - attraversamento di ponti intercellulari - Fusione cellula-cellula virus-indotta - Trasmissione verticale del genoma a cellule glie Tali meccanismi permettono ai virus di eludere il riconoscimento da parte degli anticorpi. Alcuni herpesvirus, retrovirus e paramyxovirus possono indurre la fusione cellula-cellula creazione di cellule giganti multinucleate enormi fabbriche di virus. I retrovirus e alcuni virus a DNA trasmettono verticalmente le copie integrate del loro genoma alle cellule glie trasmissione cellulare. Genetica virale Frequentemente, nei genomi virali si vericano mutazioni spontanee nuovi ceppi virali, con propriet differenti dai virus parentali: - possono essere identicate per - Sequenze nucleotidiche - Differenze antigeniche (sierotipi diversi) - Propriet strutturali o funzionali - Nella maggior parte dei casi le mutazioni non hanno effetto o sono svantaggiose - Mutazioni in geni essenziali inattivazione del virus - Mutazioni in altri geni permettono di - Acquisire resistenza a farmaci - Alterare lantigienicit - Alterare la patogenicit del virus Bassa fedelt delle polimerasi virali + alta velocit di replicazione del genoma virale errori della copiatura del genoma: - in pi, i virus a RNA non possiedono sistemi per la correzione degli errori di replicazione. - Mutazioni sono pi frequenti nei virus a RNA Le mutazioni nei virus possono essere: - mutazioni letali: mutazioni dei geni essenziali - Mutazioni vitali: danno origine a nuovi ceppi mutanti - Mutante per delezione: deriva dalleliminazione o perdita selettiva di una porzione del genoma e della funzione codicata da essa - Mutante di placca: differisce dal tipo selvatico per le dimensioni o laspetto della cellula infetta - Mutante per spettro dospite: diverse cellule bersaglio rispetto al virus selvatico 2
- Mutanti attenuati: varianti che causano malattie meno gravi in animali o uomo - Mutanti condizionali - Temperatura-sensibili: mutazioni in un gene per una proteina essenziale che permette la moltiplicazione dei virus solo a certe temperature. I mutanti temperatura sensibili solitamente crescono bene tra 30 e 35, ma non tra i 38 e 40C. Nuovi ceppi virali possono emergere anche da interazioni genetiche tra virus o tra virus e cellula scambio genetico intramolecolare detto ricombinazione. - Spesso tra virus a DNA correlati I virus con genomi segmentati (virus inuenzali o reovirus) formano ceppi ibridi a seguito dellinfezione nella cellula con un altro ceppo virale riassortimento: - nuovi ceppi del virus dellinuenza A si possono creare a seguito della confezione con virus di specie animali diverse. In alcuni casi, un ceppo virale difettivo pu essere recuperato grazie a: Corso di microbiologia - batteriologia 12 www.bluejayway.it 2 selvatico sinonimo di parentale - replicazione di un altro mutante - Replicazione di un virus selvatico - Linea cellulare che possiede il gene mancante. La replicazione dellaltro virus o lespressione del gene nella cellula fornisce funzione mancante (complementazione) avviene la replicazione. Ceppi virali singoli o mutanti sono selezionati per la loro abilit: - di utilizzare lapparato della cellula ospite - Di resistere alle condizioni avverse dellambiente o dellorganismo Le caratteristiche cellulari che possono esercitare pressione selettiva sono: - tasso di crescita della cellula - Espressione tessuto-specica di alcune proteine utili ai virus (enzimi, glicoproteine, fattori di trascrizione) Le condizioni dellorganismo che premono i virus sono: - temperatura elevata - Meccanismi immunitari - Struttura dei tessuti. I virus che non riescono a sopportare queste condizioni o a eludere le difese dellospite eliminato facilmente. Un leggero vantaggio selettivo in un ceppo mutante pu trasformarlo nel ceppo virale predominante. Alto tasso di mutazione nel virus dellimmunodecienza cambiamento nel tropismo per le cellule bersaglio dai macrofagi ai linfociti T sviluppo di ceppi resistenti ai farmaci anti-virali generazione di varianti antigeniche durante il corso dellinfezione nei pazienti. Corso di microbiologia - batteriologia 13 www.bluejayway.it I virus causano malattia dopo: - aver superato le barriere naturali di difesa dellorganismo - Aver evitato il controllo del sistema immunitario - Aver distrutto le cellule di un tessuto importante - Aver attivato una risposta immunitaria o inammatoria distruttiva Lesito dellinfezione virale determinato da: - natura dellinterazione virus-ospite - Risposta dellospite allinfezione Il sistema immunitario unarma a doppio taglio: - la migliore terapia - uno dei fattori maggiormente responsabili della patogenesi Natura della malattia e sintomi determinati dal tessuto bersaglio I fattori virali e dellospite determinano la gravit della malattia: - ceppo virale - Consistenza dellinoculo - Condizioni generali di salute della persona infettata Una certa malattia pu essere causata da virus differenti che hanno in comune il tropismo. Ad esempio: - il raffreddore comune tropismo per vie respiratorie superiori - Encefalite SNC - Epatite tropismo per fegato Di contro, un certo virus pu causare diversi quadri morbosi o nessuna sintomatologia osservabile, a seconda del tessuto infettato: - esempio, HSV-1 pu causare - Gengivostomatiti - Encefaliti - Ceheratocongiuntiviti - Herpes genitale - Herpes labiale - Faringite - Asintomatico - Nonostante sia innocuo, questo herpesvirus pu mettere in pericolo di vita neonati e immunocompromessi. Molti virus codicano per fattori di virulenza, funzioni che promuovono: - efcienza della riproduzione virale - Entrata nella cellula - Trasmissione virale - Adsorbimento del virus nel tessuto bersaglio - Elusione delle difese dellospite Tali funzioni, bench non essenziali per la crescita in colture del virus, sono necessarie per: - patogenicit - Sopravvivenza del virus nellospite La perdita di questi fattori di virulenza causa attenuazione del virus. FATTORI DETERMINANTI LA MALATTIA VIRALE Natura della malattia: - tessuto bersaglio - Via dingresso del virus - Accesso del virus al tessuto bersaglio - Tropismo tissutale - Permissivit della cellula alla replicazione virale - Ceppo virale patogeno Gravit della malattia: - capacit citopatica del virus - Stato immunitario dellospite - Competenza del sistema immunitario - Precedente immunit contro il virus - Immunopatologia - Quantit dellinoculo virale - Tempo richiesto per la risoluzione dellinfezione - Condizioni generali di salute dellospite - Nutrizione - Altre patologie inuenzanti lo stato immunitario - Patrimonio genetico dellospite - Et Fasi fondamentali della malattia virale Le malattie virali nel corpo umano progrediscono attraverso fasi ben denite: - periodo di incubazione: pu essere asintomatico o produrre sintomi aspecici (prodromo) - I sintomi della malattia sono causati da - Danno tissutale Corso di microbiologia - virologia 14 www.bluejayway.it Meccanismi di patogenesi virale Enrico Colombo - Effetti sistemici causati dal virus - Sistema immunitario - Tali sintomi possono continuare durante la convalescenza, periodo in cui lorganismo ripara i danni. Solitamente, lindividuo produce una risposta immunitaria con memoria protetto contro reinfezioni. PROGRESSIONE DELLA MALATTIA VIRALE 1. Acquisizione (entrata nellorganismo) 2. Inizio dellinfezione nel sito primario 3. Periodo di incubazione durante il quale il virus si amplica e raggiunge un sito secondario 4. Replicazione nel tessuto bersaglio sintomi caratteristici della malattia 5. Risposte immuni che limitano e contribuiscono alla patogenesi 6. Produzione virale in un tessuto che libera il virus possibile contagio di altri soggetti 7. Guarigione o infezione persistente (malattia cronica) Infezioni del tessuto bersaglio La penetrazione del virus nellorganismo pu avvenire attraverso: - discontinuit della cute - Membrane mucoepiteliali che rivestono gli orizi del corpo - Occhi - Apparato respiratorio - Bocca - Genitali - Apparato GI La cute barriera contro le infezioni Lacrime, muco, epitelio ciliato, acidit gastrica, bile e immunoglobuline A proteggono gli orizi. La via inalatoria probabilmente il pi comune metodo di ingresso. Dopo lingresso del virus replicazione nelle cellule che esprimono recettori virali e che hanno adeguato apparato biosintetico: - molti virus possono iniziare nella mucosa orale o nelle vie respiratorie superiori - La replicazione virale pu essere accompagnata da sintomatologia primaria. - Il virus pu restare nel sito primario o diffondere attraverso - Circolo ematico - Fagociti mononucleati - Sistema linfatico - Assoni dei neuroni. Le principali vie di diffusione, sono circolo ematico e sistema linfatico: - il virus vi accede - Dopo danno tissutale - Dopo fagocitosi - Come meccanismi di trasporto attivo attraverso le cellule delle mucose. Il trasporto dei virus in circolo detto viremia libero nel plasma o associato a linfociti e macrofagi: - i virus captati dai macrofagi possono - essere inattivati - replicarsi - essere trasportati ad altri tessuti, attraverso la via dei fagociti mononucleati. - La replicazione di un virus allinterno dei macrofagi, delle cellule endoteliali o del fegato pu causare lamplicazione dellinfezione - seconda fase viremica. Il SNC pu essere raggiunto attraverso - circolo ematico - Meningi - Liquor infetto - Migrazione di macrofagi infetti - Infezione di neuroni periferici e sensoriali (spesso le vie olfattive) I virus in circolo possono: - infettare e distruggere il rivestimento endoteliale - uscire dai vasi o attraversare la barriera ematoencefalica per infettare il sistema nervoso centrale. Patogenesi virale Citopatogenesi Possono vericarsi 3 evoluzioni dellinfezione virale in una cellula: - infezione abortiva: infezione fallita - Infezione litica: morte cellulare - Infezione persistente: infezione senza morte cellulare. Corso di microbiologia - batteriologia 15 www.bluejayway.it I mutanti virali, che causano infezioni abortive non si moltiplicano scompaiono. Le infezioni persistenti comprendono infezioni: - croniche: non litiche, produttive - Latenti: sintesi limitata di macromolecole virali, ma senza produzione di virus - Ricorrenti - Trasformanti: immortalizzazione della cellula. La natura dellinfezione determinata dalle caratteristiche di virus e cellula bersaglio: - cellula non permissiva: non permette la replicazione di un dato ceppo - Cellula permissiva: fornisce il complesso biosintetico per sostenere lintero ciclo replicativo virale - Cellula semipermissiva: inefciente, o pu sostenere alcune, ma non tutte, le fasi della replicazione. La replicazione virale nella cellula pu portare modicazioni: - lisi - Alterazione dellaspetto cellulare - Propriet funzionali - Alterazioni nelle caratteristiche antigeniche Gli effetti sulla cellula possono essere il risultato di: - appropriazione da parte del virus delle sintesi macromolecolari - Accumulo di proteine o particelle virali - Modica o distruzione di strutture cellulari Infezioni litiche Linfezione litica si verica quando la replicazione virale uccide la cellula bersaglio, mediante: - blocco della crescita e della riparazione cellulare attraverso impedimento della sintesi di macromolecole cellulari - Blocco della sintesi proteica pu avvenire in forma - Diretta: esempio, inibendo la traduzione di mRNA cellulari - Indiretta: produzione di grandi quantit di mRNA virale, che entra in competizione con quello cellulare - Accumulo di componenti virali distruggono la struttura e la funzionalit cellulare o danneggiano i lisosomi autolisi. - Espressione di antigeni virali sulla supercie cellulare variazione delle interazioni tra cellule e dellaspetto cellulare lisi immuno-mediata. Alcuni paramyxovirus, herpesvirus e retrovirus espressione di glicoproteine sulla supercie cellulare fusione di cellule adiacenti a formare cellule giganti, dette sincizi: - dallinterno con sintesi proteica - Dallesterno in assenza di neosintesi proteica La formazione di sincizi permette al virus di: - diffondere cellula-cellula - Sfuggire agli anticorpi I sincizi possono essere fragili vanno incontro a lisi o morte cellulare Linfezione virale o le risposte CTL possono indurre la cellula allapoptosi: - attivazione a cascata di eventi che portano al suicidio la cellula. - Pu facilitare il rilascio di virus dalla cellula, - Tuttavia limita la quantit di virus prodotta - Molti virus codicano sistemi di inibizione dellapoptosi Altri sistemi di limitazione dellinfezione virale da parte di una cellula sono: - fosforilazione di eIF2 3 previene lassemblaggio dei ribosomi sul mRNA previene la sintesi proteica - Pu essere attivato da unelevata sintesi proteica oppure in risposta agli IFN. - Gli herpesvirus inibiscono lenzima fosforilate oppure attivando una fosfatasi che defosforila eIF2 Alcune infezioni virali determinano la comparsa di variazioni morfologiche e funzionali nella cellula bersaglio: - degradazione e aberrazioni cromosomiche (es cromatina disposta ad anello addossata alla membrana nucleare) - Corpi inclusi possono essere il risultato di modicazioni virus-indotte a livello di membrana o a livello della struttura cromosomica o rappresentare il sito di replicazione, o di accumulo di proteine virali. - La natura e la collocazione di tali corpi sono caratteristiche di determinate infezioni facile diagnosi - Vacuolizzazione o rigonamento cellulare indice di sofferenza cellulare. Infezioni non litiche Linfezione persistente si verica quando la cellula infettata, ma non uccisa, dal virus: Corso di microbiologia - batteriologia 16 www.bluejayway.it 3 initiating elongation factor 2 fattore di inizio dellelongazione 2 - alcuni virus causano uninfezione produttiva persistente virus rilasciato lentamente per esocitosi o per gemmazione. Uninfezione latente pu risultare da uninfezione da virus a DNA di una cellula che limita o che non possiede il sistema biosintetico necessario alla trascrizione di tutti i geni virali: - i fattori di trascrizione necessari sono espressi solo - In cellule replicanti - Sotto stimolo ormonale o di citochine - In particolari tessuti Ad esempio, HSV infezione latente nei neuroni: - privi dei fattori nucleari richiesti per la trascrizione dei geni virali precocissimi - Lo stress o altri stimoli sono in grado di attivare la replicazione virale Virus oncogeni Alcuni virus a DNA e i retrovirus stabiliscono infezioni persistenti, che possono anche stimolare una replicazione cellulare incontrollata trasformazione o immortalizzazione delle cellule: - replicazione senza senescenza - Alterazioni morfologiche e del metabolismo - Aumentato tasso di crescita cellulare - Aumentato trasporto degli zuccheri - Perdita dellinibizione da contatto - Acquisizione della capacit di crescita in sospensione o di formare foci di cellule sovrapposte quando sono in agar semisolido. I virus oncogeni possiedono differenti meccanismi per immortalizzare le cellule: - attivano o forniscono geni che stimolano la crescita - Rimuovono meccanismi di inibizione che limitano la sintesi del DNA e la crescita cellulare - Prevengono lapoptosi I virus a DNA trasformano cellule semipermissive (esprimono olo alcuni geni virali, senza permettere la produzione di virus) - la sintesi di mRNA, DNA virale o proteine tardive causa morte nella cellula preclude alla trasformazione. - Numerosi virus oncogeni a DNA si integrano nel genoma della cellula bersaglio - Codicano proteine che si legano e inattivano proteine della proliferazione cellulare (es P53, RB) - Adenovirus - Papillomavirus - Sv40 - EBV stimola lespressione delloncogene cellulare bcl-2, gene anti- apoptotico. I retrovirus (RNA) utilizzano due meccanismi di oncogenesi: - alcuni codicano proteine oncogene che sono quasi identiche a proteine cellulari coinvolte nel controllo della crescita cellulare (sis, ras, src, myc, ecc) - Iperproduzione o alterato funzionamento di questi oncogeni stimolo della crescita cellulare rapida formazione di tumori. - Virus HRLV-1 linfotropo per le cellule T umano codica una proteina taxi che transattiva lespressione genica, compresi i geni per citochine stimolanti la crescita si inserisce nelle sequenze enhancer Altri virus, come quelli dellepatite, possono contribuire indirettamente alla cancerogenesi: - per rigenerazione tissutale - Per codica di citochine Difese dellospite contro le infezioni virali La pelle la migliore barriera contro le infezioni: - lesioni nella pelle e orizi naturali permettono lingresso ai patogeni - Aperture naturali (bocca, occhi, orecchie, naso, ano) hanno delle protezioni proprie, che assieme alla pelle sono parte delle barriere naturali del corpo - Muco - Epitelio ciliato - Acido gastrico - Lacrime - Bile Dopo che il virus ha attraversato le barriere naturali, attiva le difese immunitarie innate: - i principali meccanismi di difesa consistono in - Febbre - Interferoni - Macrofagi - Cellule dendritiche - Cellule NK - LRNA a doppio lamento, intermedio replicativo dei virus a RNA e prodotto durante molte infezioni a DNA ottimo induttore della produzione di interferone attivazione della risposta antivirale nella cellula infetta Corso di microbiologia - batteriologia 17 www.bluejayway.it - Glicoproteine virali, DNA e RNA virali attivano i TLR attivazione della risposta cellulare innata. Le risposte immunitarie antigene-speciche (es cellule T helper, anticorpi, CTL, ecc) sono le ultime ad essere attivate e sono divise in: - risposte locali precoci (TH1) - Risposte anticorpali sistemiche tardive (TH2) - Memoria immunitaria. Linterferone e le risposte CTL possono essersi evolute essenzialmente quali meccanismi di difesa antivirali. Il ne ultimo della risposta immunitaria la guarigione, ovvero leliminazione del virus e delle cellule che lo ospitano: - la risposta immunitaria il mezzo migliore per controllare linfezione virale - Importanti contro i virus sia limmunit umorale che quella cellulare Uninfezione virale eradicata quando tutto il virus infettante e le cellule infette sono eliinate: - le risposte innate stimolate da componenti virali e IFN spesso insufcienti - Anticorpi efcienti contro i virus extracellulari sufcienti per controllare i virus citopatici - Essenziali per controllare la diffusione per viremia. - Immunit cellulare essenziale per la lisi delle cellule bersaglio in caso di infezioni non citolitiche e di infezioni causate da virus con pericapside. La maggior parte dei virus possiede meccanismi per evadere o inibire la risposta immunitaria: - prevenzione dellazione dellinterferone - Diffusione mediante trasmissione cellula-cellula - Soppressione della presentazione dellantigene e della funzionalit linfocitaria La mancata guarigione pu condurre a: - infezione persistente - Malattia cronica - Morte del paziente Limmunit dovuta a cellule B e T di memoria pu non prevenire gli stadi iniziali dellinfezione, ma generalmente previene il progredire della malattia: - nuovo contatto gli anticorpi impediscono la diffusione viremica e si sviluppano risposte secondarie pi rapidamente - Le risposte secondarie sono pi efcaci delle primarie - Strategia su cui si basa la vaccinazione. Molti virus sono in grado di evitare uno o pi aspetti del sistema immunitario: - prevenendo le conseguenze dello stato antivirale indotto da IFN- e IFN- - Inibizione del MHC-I previene luccisione delle cellule infette da parte delle cellule T. Immunopatologia Limmunit antivirale pu essere la principale causa dei sintomi e delle manifestazioni patologiche, a causa di reazioni: - inammatorie - Di ipersensibilit Risposte precoci al virus e allinfezione virale possono dare avvio alla risposta inammatoria locale e sistemica: - IFN - Linfochine - Attivazione della componente C3 del complemento IFN e linfochine possono stimolare sintomi sistemici simil-inuenzali: - solitamente associati a infezioni virali respiratorie e viremie - Febbre - Rinorrea - Malessere - Cefalea - Tali sintomi, detti prodromi, spesso precedono i sintomi tipici dellinfezione virali Successivamente si pu vericare danno tissutale causato da: - immunocomplessi - Attivazione della via classica del complemento - Ipersensibilit ritardata mediata dalle cellule T CD4 - Azione delle cellule CTL CD4 La risposta inammatoria iniziata dallimmunit cellulare spesso di difcile controllo danno tissutale: - virus con pericapside risposte cellulo mediate che producono condizioni pi gravi. - Morbillo e parotite risposte inammatorie di ipersensibilit - Grandi quantit di antigene in circolo durante la fase viremica o nel corso di inammazione cronica reazione di ipersensibilit da immunocomplessi (tipo II) - Gli immunocomplessi con virus o antigeni virali possono attivare il complemento risposte inammatorie distruzione tissutale - Possono depositarsi nei tubuli renali danno ai nefroni. Corso di microbiologia - batteriologia 18 www.bluejayway.it Malattia virale La suscettibilit relativa di ciascun individuo e la gravit della malattia dipendono da: - natura dellesposizione - Stato immunitario, et e condizioni di salute dellindividuo - Carica virale - Genetica del virus e dellospite Dopo lavvenuta infezione, probabilmente il sistema immunitario dellospite a determinare la possibilit che linfezione virale sia: - pericolosa per la vita - Benigna - Asintomatica Durante il periodo di incubazione, il virus: - si replica - Non ha raggiunto il tessuto bersaglio - Non ha indotto un danno sufciente a causare malattia - Il periodo di incubazione - Breve se il sito di infezione il tessuto bersaglio sintomi caratteristici della malattia - Lungo i virus che devono diffondersi verso altri siti e amplicare il proprio numero prima di raggiungere il tessuto bersaglio. Durante la fase prodromica si sviluppano sintomi aspecici o simil-inuenzali, prima che si sviluppino i sintomi caratteristici della malattia- La natura e la gravit dei sintomi delle malattie virali sono correlati a: - organo bersaglio - Grado di risposte immunopatologiche scatenatesi Si verica infezione inapparente quando: - tessuto non viene danneggiato - Linfezione controllata prima che il virus raggiunga lorgano bersaglio - Se il tessuto bersaglio sacricabile - Lentit del danno sotto la soglia di disfunzione. Molte infezioni cerebrali sono inapparenti restano sotto la soglia della grave perdita di funzionalit. Tuttavia, le infezioni asintomatiche sono la principale fonte di contagio. Vengono prodotti comunque anticorpi virus-specici. Le infezioni virali possono scatenare malattia acuta o cronica: - labilit e la velocit del sistema immunitario determina una delle due forme Epidemiologia Linfezione di una popolazione simile a quella del singolo, poich il virus deve diffondersi alla popolazione e viene controllato dallimmunizzazione della popolazione: - per sopravvivere, il virus, deve continuamente infettare nuovi ospiti, immunologicamente nave Esposizione Le persone sono esposte ai virus durante tutta la vita: - certe situazioni, professioni, abitudini e condizioni di vita possono aumentare il rischio di contrarre un determinato virus. - Molti virus sono comunque ubiquitari dimostrato dalla presenza di anticorpi anti-virus nella maggior parte degli adolescenti o giovani adulti. Lesposizione a virus respiratori ed enterici aumentata da - scarsa igiene - Condizioni di affollamento a livello di abitazione, ambiente scolastico e lavorativo Asili nido e scuola materna sono fonti importanti di infezioni da virus, soprattutto quelli a diffusione orale o fecale. Viaggi, campeggi estivi e occupazioni che espongono a vettori virali (es zanzare) mettono a rischio di esposizione per arbovirus e altre zoonosi. La promiscuit sessuale promuove la diffusione e lacquisizione di vari virus. Il personale sanitario (medici, dentisti, infermieri e tecnici) frequentemente esposto a virus respiratori e altri virus rischio particolare di contrarre infezioni attraverso: - sangue infetto (es virus epatite B, HIV) - Contatto con liquido di vescicole (HSV). Trasmissione dei virus La trasmissione di un virus pu avvenire attraverso: - contatto diretto (incluso sessuale) - Inoculazione di sangue o altri liquidi infetti - Organi trapiantati - Inalazione - Trasmissione oro-fecale La via di trasmissione dipende da: - sorgente del virus (tessuto sito di replicazione e secrezione) Corso di microbiologia - batteriologia 19 www.bluejayway.it - Capacit del virus di resistere agli ostacoli e alle barriere dellambiente e dellorganismo. La presenza o assenza del pericapside il principale fattore che inuenza la modalit della trasmissione virale: - virus nudi: possono resistere allessiccamento, ai detergenti e a condizioni estreme di pH e temperatura - Possono restare nello stomaco e nellintestino (resistono a bile e succhi gastrici) - Possono resistere al trattamento inadeguato dei liquami o a disinfezione. - Generalmente trasmessi per via inalatoria o via oro-fecale - Spesso trasmessi attraverso oggetti contaminati (fomiti) - Virus con pericapside: sono fragili, richiedono lintegrit del pericapside per essere infettanti. - Devono restare in ambiente umido Trasmessi attraverso - Goccioline respiratorie, sangue, muco, saliva o sperma - Inoculazione - Trapianto dorgano - Normalmente sono labili in ambiente acido e al trattamento con detergenti impossibile la trasmissione oro-fecale 4 Gli animali possono fungere come: - vettori diffondono la malattia virale ad altri animali o alluomo - Serbatoio: mantengono e amplicano la diffusione de virus nellambiente. Le zoonosi sono malattie virali condivise da insetti, uomo e animali: - procioni, volpi, pipistrelli, cani e gatti sono vettori del virus della rabbia - Artropodi (zanzare, zecche e mosche) togavirus, avivirus, bunyavirus e reovirus tali virus sono detti arbovirus. - Spettro dospite molto ampio - Devono stabilire viremia nel serbatoio animale consente allartropode di acquisire il virus durante il pasto di sangue Altri fattori che possono promuovere la trasmissione del virus sono: - possibilit di indurre infezioni asintomatiche - molti virus (esempio HIV o varicella-zoster) vengono rilasciati prima della comparsa dei sintomi, - mentre altri possono dare infezioni persistenti produttive gli individui sono continua fonte di virus - Vivere in condizioni di affollamento - Alcune occupazioni - Stili di vita - Centri di assistenza - Viaggi I virus con molti sierotipi o capaci di mutare rapidamente antigeni trovano alloggio in soggetti nave con facilit Persistenza del virus nella popolazione. La persistenza in una comunit dipende dalla disponibilit di un numero critico di individui immunologicamente vergini, suscettibili di infezione: - lefcienza della via di trasmissione condiziona lentit della diffusione - Limmunizzazione naturale o vaccinatoria strumento migliore per ridurre i soggetti sensibili. Et Let di un individuo un fattore importante nel determinare la suscettibilit ad uninfezione virale: - adulti, bambini e anziani - Sensibili a virus diversi - Risposte sintomatologie differenti. - Probabilmente dato da differenze di - Peso - Caratteristiche tissutali - Capacit rigenerative - Diversit dello stato immunitario - Possono competere anche differenze in - Stile di vita - Abitudini - Ambiente scolastico/lavorativo I neonati e bambini acquisiscono una serie di malattie virali, respiratorie ed esantematiche poich non sono stati esposti ad esse in precedenza e sono dunque immunologicamente vergini: - i pi piccoli sono sensibili a sviluppare forme pi gravi di infezioni respiratorie e gastroenterite - Non attivano reazioni immunopatologiche cos gravi come quelle degli adulti alcune malattie che li colpiscono sono a prognosi pi benigna. Corso di microbiologia - batteriologia 20 www.bluejayway.it 4 i virus dellepatite B e coronavirus sono eccezioni a tale regola Gli anziani sono particolarmente sensibili alle infezioni virali primarie e alla riattivazione di virus latenti: - meno pronti - nellavviare risposte immunitarie, - Nel riparare i danni - Nel guarire - Sono pi sensibili a nuovi ceppi inuenzali dei virus A e B - Sono inoltre pi sensibili a sviluppare lherpes zoster riattivazione del virus della varicella-zoster, come risultato di un abbassamento delle difese immunitarie speciche. Stato immunitario Limmunocompetenza e la storia immunitaria determinano - velocit e lefcienza di risoluzione dellinfezione - Gravit della sintomatologia La ristimolazione di una persona con precedente immunit malattia lieve o asintomatica, senza trasmissione. Individui immunodepressi sono ad elevato rischio di incorrere in forme pi gravi. - di infezione primaria morbillo o vaiolo - Manifestano recrudescenze da infezioni di virus latenti. Altri fattori dellospite Le condizioni generali di salute di un individuo giocano un ruolo importante nel determinare: - la competenza e la natura della sua risposta immunitaria - Riparare i tessuti danneggiati Denutrizione compromette il sistema immunitario e riduce la capacit rigenerativa Malattie e terapia immunodepressiva possono far passare inosservate la replicazione e riattivazione virale. Patrimonio genetico determina la risposta del SI alle infezioni virali: - differenze nei geni della risposta immunitaria, nei geni per recettori virali e in altri loci genici inuenzano la suscettibilit di un individuo ad uninfezione virale e la gravit dellinfezione. Fattori geograci e stagionali La distribuzione geograca di un virus solitamente data dal fatto che: - necessiti o meno di vettori - Esista o meno una popolazione immunologicamente vergine. La diffusione dei trasporti sta eliminando molte delimitazioni geograche che impedivano la diffusione del virus. Le differenze stagionali nellincidenza delle malattie da virus corrispondono ad abitudini che promuovono la diffusione del virus: - virus respiratori prevalenza maggiore nel periodo invernale affollamento e condizioni di temperatura e di umidit - Virus enterici condizioni igieniche probabilmente pi precarie. - Arbovirus si riettono sul ciclo vitale dellartropode-vettore. Focolai dinfezione I focolai di infezione virale risultano spesso dallintroduzione di un virus in un sito nuovo: - origina da una fonte comune (es alimenti) - Pu essere bloccato dopo lidenticazione della fonte. Le epidemie si vericano in unarea geograca maggiore: - originate dallintroduzione di un nuovo ceppo virale in una popolazione immunologicamente vergine. Le pandemie sono epidemie a diffusione mondiale: - comparsa di un nuovo virus (es HIV) - Pandemie di inuenza A si vericano circa ogni 10 anni, per la comparsa di un nuovo ceppo. Controllo della diffusione virale La diffusione di un virus pu essere controllata attraverso: - isolamento dei malati - Misure igieniche adeguate - Modicazione dello stile di vita - Eliminazione dei vettori - Vaccinazione della popolazione La quarantena era lunico mezzo per limitare le epidemie: - efcace per limitare diffusione di virus che causano sempre malattia sintomatica (es vaiolo) - Utilizzata negli ospedali per limitare la diffusione nosocomiale dei virus, specialmente a pazienti a rischio. Pulizia degli oggetti contaminati e disinfezione delle riserve idriche utili per limitare la diffusione di virus enterici. Cambiamenti delle abitudini di vita hanno modicato la diffusione dei virus trasmessi per via sessuale (HIV, epatite B e herpes simplex). Corso di microbiologia - batteriologia 21 www.bluejayway.it Leliminazione dellartropode vettore o della sua nicchia (es bonica delle paludi) efcace controllo degli arbovirus. Il miglior sistema per limitare la diffusione comunque la vaccinazione: - immunizzazione, sia prodotta dallinfezione che naturale, protegge lindividuo e riduce le persone suscettibili allinfezione - Ne previene la trasmissione interindividuale. Corso di microbiologia - batteriologia 22 www.bluejayway.it Diversamente dai batteri, i virus sono parassiti intracellulari obbligati, che utilizzano per la loro replicazione le strutture biosintetiche e gli enzimi della cellula ospite: - pi difcile inibire la replicazione virale senza provocare effetti tossici per la cellula ospite - La maggior parte dei farmaci antivirali enzimi codicati dal virus o strutture virali importanti per la replicazione - Alcuni sono inibitori biochimici di enzimi codicati dai virus - Altri sono stimolatori della risposta immunitaria innata Diversamente dagli antibiotici, lattivit dei farmaci antivirali limitata a speciche famiglie di virus: - messi a punto farmaci antivirali per virus la cui infezione caratterizzata da morbilit e mortalit signicative - Tuttavia, la resistenza ai farmaci antivirali un problema sempre maggiore, a causa dellaumentato trattamento a lungo termine dei pazienti immunodepressi. Bersagli dei farmaci antivirali I diversi bersagli dei farmaci antivirali sono presentati classicati a seconda delle fasi della replicazione virale che inibiscono. Inattivazione del virus Il pericapside del virus sensibile ad alcune molecole lipidiche simil-detergenti dispergono o distruggono la membrana del pericapside prevengono lacquisizione del virus. Nonoxinolo-9 un componente presente nelle capsule anticoncezionali: - inattiva lherpes simplex (HSV) e lHIV previene la trasmissione dellinfezione per via sessuale I rhinovirus sono sensibili allacido lacido citrico pu essere adsorbito nei tessuti facciali per bloccare la trasmissione del virus. Adsorbimento Linterazione tra una proteina virale con funzione di adsorbimento (VAP) e il recettore sulla cellula pu essere bloccata da: - anticorpi neutralizzanti: legano e ricoprono il virione - Antagonisti dei recettori: diminuiscono il numero di recettori liberi. La somministrazione di anticorpi specici, immunizzazione passiva, la pi antica forma di terapia antivirale. Gli antagonisti dei recettori sono analoghi peptidici o polisaccaridici del recettore cellulare o della VAP virale: - bloccano in modo competitivo linterazione virus-cellula. - Peptidi specici della glicoproteina gp120 di HIV o del suo recettore sono in grado di inibire linfezione - Polisaccaridi acidici (es eparano e destran solfato) proposti per il trattamento dellinfezione da HSV e HIV. Penetrazione e scapsidazione Penetrazione e scapsidazione necessarie per liberare lacido nucleico virale nel citoplasma della cellula ospite: - arildone, disossarile, pleconaril e altri metilisossazolici bloccano la scapsidazione dei picornavirus inserendosi in una fenditura del sito capsidico coinvolto nel legame al recettore. - Virus che entrano attraverso endocitosi scapsidazione avviene per cambiamenti conformazionali delle proteine o rottura delle membrane in ambiente acido - amantadina e rimantadina (amine idrofobiche) neutralizzano il pH degli endosomi (specici per inuenza A) bloccano il canale ionico formato dalla proteina M2. - Tromantadina inibisce la penetrazione di HSV - Enfuvirtide (Fuzeon) blocca penetrazione e scapsidazione di HIV inibisce lazione della proteina virale di fusione g4p1. Sintesi dellRNA La sintesi di mRNA essenziale per la produzione dii virus, ma non un buon bersaglio per farmaci antivirali: - difcile inibire la sintesi i mRNA virale senza alterare quella cellulare. - I virus a DNA utilizzano le trascrittasi della cellula ospite. - Le RNA polimerasi codicate da virus potrebbero non differire a sufcienza da quelle della cellula per essere inibite selettivamente. Corso di microbiologia - virologia 23 www.bluejayway.it Batterio Speciche batterio Agenti antivirali Enrico Colombo - Guanidina e 2-idrossibenzil-benzimidina bloccano la sintesi di RNA nei picornavirus legando la proteina 2C, essenziale per la sintesi di RNA - Ribavirina inibisce la biosintesi nucleotidica, camping dellmRNA e altri processi che implicano molti virus Lappropriato processamento e la traduzione dellmRNA virale possono essere inibiti da: - isatin--tiosemicarbazone: induce degradazione di mRNA in cellule infettate da poxvirus. Utilizzato per trattare il vaiolo. - Interferone attiva una cascata di eventi biochimici cellulari che bloccano la replicazione virale - Aumenta la degradazione di mRNA virale - Blocca il legame mRNA-ribosoma Interferone e induttori articiali dellIFN sono stati approvati per lutilizzo clinico. Replicazione del genoma La DNA polimerasi virale (HSV) e la trascrittasi inversa (HIV e virus dellepatite B) sono il bersaglio delezione per i farmaci contro questi virus, in quanto: - essenziali per la replicazione virale - Differenti dagli enzimi dellospite. La maggior parte dei farmaci antivirali sono analoghi nucleosidici nucleosidi con modicazioni della base o dello zucchero: - devono essere fosforilati da enzimi virali nella forma trifosfato prima di essere utilizzati dalla polimerasi - La timidina chinasi di HSV, ad esempio, aggiunge il primo fosfato allaciclovir (ACV) e gli enzimi cellulari aggiungono gli altri. - Mutanti di HSC privi di attivit timidina-chinasica sono resistenti allaciclovir. - Lazidotimidina e altri analoghi nucleosidici sono fosforilati da enzimi cellulari. Tali analoghi nucleosidici inibiscono in maniera selettiva le polimerasi virali: - le polimerasi virali sono meno precise legano un nucleosidico con modicazione - Tali farmaci agiscono in quanto - impediscono lelongazione della catena poich il nucleoside modicato decita del 3-idrossile sullo zucchero - Alterano il riconoscimento e lappaiamento delle basi, in presenza di basi modicate. Questi farmaci sono incorporai nel genoma virale errori di trascrizione e replicazione elevato tasso di nucleotidi incorporati durante la replicazione virale replicazione del DNA sensibile a questi farmaci. Analoghi del pirofosfato, che assomigliano ai prodotti secondari della reazione polimerica, acido fosfonoformico e fosfonoacetato, sono classici inibitori della polimerasi negli herpesvirus. Nevirapina e delavirdina e altri inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa non si legano al sito per il substrato inibitori competitivi per la trascrittasi inversa. Sintesi proteica La sintesi proteica, nonostante bersaglio di molti farmaci, non un bersaglio appropriato: - il virus utilizza ribosomi e meccanismi della cellula ospite impossibile inibizione selettiva - INF- e IFN- bloccano il virus inibendo la sintesi delle proteine nella cellula infetta - Inibizione dei processi di modicazione post-traduzionale a carico di proteine possono inibire la replicazione virale - Agenti che inibiscono il processo di glicosilazione di HIV o HSV - bloccano il rilascio del virus dalla cellula - Inibiscono le funzioni delle glicoproteine bloccato adsorbimento e fusione inibita la diffusione. Assemblaggio e liberazione La proteasi di HIV un enzima unico ed essenziale per lassemblaggio e la produzione di virioni infettanti: - utilizzate analisi molecolari computerizzate per disegnare gli inibitori della proteasi (saquinavir, ritonavir, indinavir) modellati inibitori in grado di posizionarsi nel sito attivo dellenzima Anche proteasi di altri virus sono potenziali bersagli per farmaci antivirali. La neuraminidasi dellinuenza diventata un bersaglio per farmaci antivirali: - zanamivir e oseltamivir (Tamiu) agiscono come inibitori enzimatici possono inibire sia inuenza A che inuenza B. Stimolatori delle risposte dellimmunit innata nellospite I migliori agenti antivirali sono quelli della risposta innata e immunitaria specica dellospite: - stimolazione o integrazione della risposta naturale approccio efcace per imitare o trattare le infezioni virali. - La risposta innata stimolata da - Imiquimod Corso di microbiologia - batteriologia 24 www.bluejayway.it - Resiquimod - CpG oligodeossinucleotide Tali farmaci legano i TLR rilascio di citochine TH1 attivazione delle cellule NK e risposte immunitarie cellulo-mediate. Linterferone e i suoi induttori, inclusi i polinucleotidi mismatched e RNA a doppio lamento facilitano il trattamento di patologie croniche da virus dellepatite C e da papillomavirus. Gli anticorpi prevengono acquisizione e diffusione del virus: - immunizzazione passiva utilizzata anche dopo esposizione a virus della rabbia, dellepatite A e B Analoghi nucleosidici La maggior parte dei farmaci antivirali approvati dalla FDA negli USA della classe degli analoghi nucleosidici inibiscono le polimerasi virali. Tali farmaci sono attivati dalla fosforilazione da parte di chinasi cellulari o virali. Linibizione selettiva della replicazione virale deriva: - dal legame preferenziale del farmaco alla DNA polimerasi virale piuttosto che a quella cellulare - Dallutilizzo maggiore rispetto a quello nelle cellule non infettate a causa della pi rapida sintesi di DNA nelle cellule infettate. Asciolveri e valaciclovir, penciclovir e famciclovir Laciclovir (acicloguanosina) e il suo derivato valaciclovir differiscono solo dal punto di vista farmacologico. Laciclovir differisce dalla guanosina per il fatto eh possiede una catena laterale aciclica al posto dello zucchero ribosio o desossiribosio: - azione selettiva contro HSV e VSV (herpesvirus che codicano una timidina- chinasi - La timidina chinasi virale attiva il farmaco mediante fosforilazione gli enzimi cellulari completano la progressione in forma difosfato e trifosfato. - Nelle cellule non infettate non si verica la fosforilazione iniziale non disponibile un farmaco attivo per inibire la sintesi del DNA cellulare o determinare tossicit. - LACV trifosfato compete con la guanosina trifosfato inibisce lenzima causa - terminazione della catena nascente di DNA virale, poich non ha il 3 idrossilico nella molecola di ACV per permettere lelongazione della catena - Inibizione della DNA polimerasi - Poco tossico perch molto specico per la DNA polimerasi virale. - Resistenza allaciclovir: sviluppa a seguito di mutazioni - della timidina chinasi non pu aversi attivazione di ACV - Della DNA polimerasi virale impossibile il legame di ACV Laciclovir efcace contro tutte le infezioni da herpesvirus: - encefaliti - Herpes diffuso - Gravi manifestazioni erpetiche. Il fatto di non essere tossico permette lutilizzo prolattico nel prevenire episodi ricorrenti, specialmente in pazienti immunocompromessi. Tuttavia, non ha alcun effetto sul virus latente. Pu essere utilizzato anche per il trattamento dellinfezione da VZV (varicella- zoster virus): - necessarie dosi pi elevate - VZV meno sensibile lACV fosforilato meno efcientemente dalla timidina chinasi del virus varicella-zoster Il valaciclovir lestere derivato da ACV: - assorbito con maggiore efcienza dopo somministrazione orale - Convertito rapidamente in ACV - Aumentata la disponibilit di ACV nel trattamento di HSV e VZV Il penciclovir inibisce VZV e HSV con il medesimo meccanismo di ACV, ma si concentra e persiste pi a lungo nelle cellule infettate: - ha un po di attivit anche nei confronti di EBV e cytomegalovirus (CMV) Il famciclovir un profarmaco, derivato del penciclovir: - ben assorbito oralmente - Convertito in farmaco attivo nella mucosa intestinale e nel fegato. Le resistenze a tutti questi farmaci si sviluppano come per laciclovir. Ganciclovir (GCV) Il ganciclovir (diirdossipropossimetil guanina) si differenzia dallACV per laggiunta di un singolo gruppo idrossimetilico nella catena laterale acilica: - tale modicazione consente marcata attivit contro CMV (cytomegalovirus) - Il genoma di CMV non codica una timidina chinasi, ma una proteina chinasi che fosforila il GCV - Quando attivato, il GCV inibisce le DNA polimerasi di tutti gli herpesvirus. - Le DNA polimerasi virali hanno afnit per il farmaco circa 30 volte superiore rispetto a quelle cellulari. Corso di microbiologia - batteriologia 25 www.bluejayway.it Il valganciclovir, come per laciclovir, lestere sviluppato per migliorare le propriet farmacologiche del GCV. GCV efcace nel trattare: - retinite da CMV - Esofagite, colite e polmonite da CMV in pazienti con AIDS. Impiego limitato nel trattamento delle infezioni da CMV nei pazienti con AIDS poich potenzialmente tossico per il midollo osseo. Cidofovir e adefovir Il cidofovir e ladefovir sono analoghi nucleosidici contenenti un fosfato attaccato allanalogo dello zucchero: - rende inutile la necessit di una pi difcile fosforilazione iniziale per diventare nucleotide - Sono substrati per - DNA polimerasi - Trascrittasi inverse - Ampio spettro di virus sensibili Il cidofovir, analogo della cittadina, attivo contro tutte le polimerasi di herpesvirus, poliomavirus, adenovirus, papillomavirus e poxvirus: - approvato per il trattamento delle malattie causate da CMV Ladefovir e ladefovir dipivoxil sono analoghi delladenosina: - approvati per trattare epatite B Azidotimidina Lazidotimidina, inizialmente sviluppata come farmaco antitumorale, utilizzata come terapia utile per linfezione da HIV: - lAZT (nome commerciale Retrovir), analogo della timidina inibisce la trascrittasi inversa di HIV. - Deve essere fosforilata dagli enzimi della cellula ospite - priva del gruppo idrossilico in 3 previene la sintesi della catena complementare di DNA. - Leffetto terapeutico selettivo dellazidotimidina deriva dal fatto che sensibile circa 100 volte di pi per la trascrittasi inversa rispetto alla DNA polimerasi cellulare. Negli individui infetti da HIV, con numero ridotto di cellule T CD4: - AZT per via orale per prevenire la progressione della malattia - Trattamento con AZT di donne gravide infettate da HIV pu prevenire o ridurre la probabilit di trasmettere il virus al nascituro - Tossicit: dalla semplice nausea no a danni al midollo osseo, che possono portare alla morte. Tuttavia alta probabilit di errore della trascrittasi inversa di HIV possibile sviluppo di ceppi resistenti ai farmaci antivirali: - problema risolto utilizzando molteplici farmaci associati come terapia iniziale. Dideossinosina, dideossicitidina, stavudina e lamivudina Numerosi altri analoghi nucleosidici sono stati approvati come agenti anti-HIV: - dideossinosina: analogo nucleosidico convertito a dideossiadenosina trifosfato - Dideossicitidina e stavudina: prive del gruppo OH in 3 - Lamivudina: zucchero modicato attaccato alla lamivudina inibisce la trascrittasi inversa di HIV prevenendo lallungamento della catena di DNA e la replicazione di HIV. Ribavirina La ribavirina un analogo della guanosina: - differisce per il fatto che lanello della base aperto e incompleto inibisce - biosintesi dei nucleotidi - capping dellRNA - Altri processi importanti nella replicazione - Riduce le scorte di guanina inibendo linosina monofosfato deidrogenasi - Deve essere fosforilata Tale farmaco somministrato: - per aerosol ai bambini con grave broncopolmonite da virus respiratorio sinciziale - Agli adulti con gravi orme di inuenza o morbillo - Efcace per trattare linuenza B (endovena) - Attiva contro il virus dellepatite C, soprattutto in combinazione con IFN- Inibitori non nucleosidici della polimerasi Il foscarnet (PFA) e lacido fosfonoacetico (PPA) sono composti semplici, simili al pirofosfato: - inibiscono la replicazione virale si legano la sito di legame del pirofosfato della DNA polimerasi bloccano il legame del nucleotide Corso di microbiologia - batteriologia 26 www.bluejayway.it - PFA e PAA non inibiscono le polimerasi cellulari a concentrazioni farmacologiche - Possono causare problemi renali e di altra natura sono chelanti di ioni metallici bivalenti e vengono incorporati nellosso. Il foscarnet utilizzato contro: - herpesvirus - Trascrittasi inversa di HIV - Retinite da CMV in pazienti con AIDS. La nevirapina, la delavirdina, lefavirenz e altri inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa si legano allenzima in siti differenti rispetto al substrato. - meccanismo dazione differente degli analoghi nucleosidici - Diverso anche il meccanismo di resistenza di HIV a questi agenti. - Utili nelle terapie combinate nel trattamento di HIV. Inibitori della proteasi La proteasi di HIV ha una struttura unica ed essenziale per produrre un virione funzionale ottimo bersaglio per farmaci antivirali. I principali farmaci inibitori della proteasi, che si inseriscono nel sito attivo dellenzima, sono: - saquinavir - Indinavir - Ritonavir - Nelnavir - Amprenavir Come per altri farmaci anti-HIV mutazioni della proteasi ceppi resistenti: - terapia combinata con un analogo nucleosidico e AZT Farmaci antinuenzali Lamantadina e la rimantadina sono composti amminici anpatici efcaci contro il virus dellinuenza A: - non efcaci contro inuenza B e altri - Numerosi effetti sulla replicazione del virus dellinuenza A: - Acidotro si concentrano nelle vescicole endoscopiche coinvolte nelladsorbimento del virus dellinuenza tamponano il pH - Inibiscono le modicazioni necessarie alla fusione del pericapside con la membrana cellulare - La specicit per linuenza A deriva dalla capacit di bloccare il canale protonico della proteina M2 della matrice del virus - Resistenza: alterazione a carico della proteina di matrice M2 o dellemoagglutinina (HA). - Efcacia: possono migliorare la sintomatologia dellinfezione se somministrate entro 48 ore dallesposizione. - Utilizzate anche come trattamento prolattico alternativo alla vaccinazione - Lamantadina una terapia alternativa nel morbo di Parkinson - Effetti collaterali: effetto tossici a carico del SNC nervosismo, insonnia ed irritabilit Zanamivir e oseltamivir (Tamiu) inibiscono sia linuenza A che linuenza B: - inibitori della neuraminidasi dellinuenza lemoagglutinina del virus si lega allacido sialico su altre cellule impedito il rilascio del virus - Riducono la durata della malattia se assunti entro le prime 48 ore di infezione. Immunomodulatori Sono state approvate forme geneticamente ingegnerizzate di IFN- per limpiego nelluomo: - si lega a recettori di supercie risposta cellulare antivirale - Stimola la risposta immunitaria - Promuove la clearance immunitaria dellinfezione virale - Efcace contro numerose infezioni virali: - Epatite A, B e C - HSV - Papillomavirus - Rhinovirus Linterferone normale induce sintomi simil-inuenzali nel corso della terapia, i medesimi sintomi si sviluppano anche con la forma ingegnerizzata. Limiquimod, un ligando dei TLR, stimola la risposta innata a contrastare linfezione virali: - pu attivare risposte difensive locali contro il papillomavirus (che solitamente sfugge al sistema immunitario) Corso di microbiologia - batteriologia 27 www.bluejayway.it Recentemente, la diagnostica virale di laboratorio ha conosciuto molti sviluppi: - pi sensibile - Fornisce identicazioni virali pi rapide dai campioni clinici Tali nuove metodiche includono: - migliori reagenti anticorpali per analisi dirette di campioni - Tecniche di genetica molecolare identicazione diretta del genoma Spesso, lidenticazione dellorganismo non necessaria: - evitata per minimizzare il rischio per il laboratorio e per il personale Il primo indizio di diagnosi virale fornito da: - sintomi - Anamnesi del paziente La diagnosi di infezione virale si effettua anche per esclusione di altri tipi di infezione. Gli esami virali di laboratorio si eseguono per: - conferma della diagnosi - Determinazione della terapia appropriata - Denire il decorso della malattia - Monitorare la malattia a livello epidemiologico - Istruire medici e pazienti Tecniche di laboratorio forniscono i seguenti risultati: - effetti citopatici (CPR) indotti dal virus in colture cellulari - Identicazione di particelle virali al microscopio elettronico - Isolamento e propagazione del virus - Rilevamento delle componenti virali (es proteine, acidi nucleici, enzimi, ecc) - Valutazione della risposta immunitaria del paziente (sierologia). Virus, antigeni virali, genomi virali e CPEs possono essere rilevati attraverso: - esame diretto di campioni clinici - Replicazione del virus in colture cellulari di laboratorio. Raccolta di campioni Le procedure idonee da seguire per identicare un agente virale sono scelte in base a: - sintomi - Viaggi del paziente - Stagione dellanno - Diagnosi presunta Liquor e urine, ad esempio campioni utili per la diagnosi in un paziente con sintomi di malattia del SNC dopo una parotite. - Il liquido cefalorachidiano viene analizzato per sequenze di DNA virale mediante PCR. Spesso diversi virus possono causare il medesimo quadro clinico la scelta del campione idoneo per lisolamento del virus difcile: - esempio: molti virus causano meningite asettica, quindi pu essere necessario ottenere diversi tipi di campioni per identicare il virus. I campioni dovrebbero essere raccolti precocemente nella fase acuta, prima che termini la diffusione del virus: - i virus respiratori possono diffondersi solo da 3 a 7 giorni la diffusione pu terminare prima che niscano i sintomi. - HSV e VZV non possono essere isolati nelle lesioni dopo 5 giorni dallinsorgenza dai sintomi. Minore lintervallo tra la raccolta del campione e larrivo in laboratorio migliore il potenziale di isolamento del virus. Perch: - i virus sono labili - I campioni sono sensibili alla sopracrescita da parte di funghi e batteri Il miglior tipo di trasporto conservazione in ghiaccio in contenitori contenenti antibiotici e proteine. I virus con pericapside, tuttavia, quando congelati a -20C possono portare ad una perdita di titolo infettivo. Corso di microbiologia - virologia 28 www.bluejayway.it Batterio Speciche batterio Diagnosi di laboratorio Enrico Colombo Citologia Lesame citologico di campioni pu fornire informazioni utili per una rapida diagnosi iniziale di infezioni virali che producono un caratteristico CPE 5 . I CPE caratteristici in campioni di tessuto o colture cellulari comprendono: - cambiamenti della morfologia cellulare - Vacuoli - Lisi cellulare - Sincizi - Corpi inclusi I sincizi sono cellule multinucleate giganti, la cui formazione indotta dal virus. I corpi inclusi sono cambiamenti istopatologici delle cellule infettate, dovuti a: - azione di componenti virali - Modicazione di strutture cellulari a seguito dellinfezione. Esempi di alcuni corpi inclusi possono essere: - corpi inclusi nucleari ad occhio di gufo: osservati nelle cellule di tessuti con CMV o nel sedimento urinario di pazienti infetti da CMV - Inclusioni di Cowdry di tipo A: osservate in singole cellule o sincizi infettati da HSV o virus della varicella-zoster. - Corpi di Negri: corpi inclusi nel tessuto cerebrale di pazienti con rabbia. Spesso il campione citologico pu essere esaminato per la presenza di specici antigeni virali, attraverso: - immunouorescenza - Genomi virali marcati Tali test sono specici per i singoli virus e possono essere scelti in base alla diagnosi differenziale. Microscopia elettronica La microscopia elettronica non una comune tecnica di laboratorio: - impiegata per rilevare e identicare alcuni virus, se presenti in numero sufciente - Laggiunta di anticorpi virus-specici al campione pu determinare unaggregazione delle particelle virali facilitata lidenticazione - Metodo utile per il rilevamento di enterovirus, liberati in grandi quantit possibile, in un tessuto opportunamente trattato, visualizzare la presenza di componenti strutturali virali. Isolamento e propagazione Il virus pu replicarsi in: - colture cellulari - Uova embrionate - Animali da esperimento Colture cellulari Per la propagazione dei virus sono utilizzati tipi specici di colture cellulari. Le colture cellulari primarie sono ottenute dalla digestione di specici organi animali con tripsina o collagenasi: - fatte crescere in monostrato (broblasti o cellule epiteliali) o in sospensione (linfociti) su terreni articiali addizionati con siero bovino o altre fonti di fattori di crescita - Possono essere separate con tripsina, diluite e rimesse in coltura per formare nuovi monostrati colture secondarie. Le linee cellulari diploidi sono colture di un singolo tipo cellulare, in grado di essere mantenute in vitro un numero elevato, ma nito, di volte pira della loro senescenza. Le linee cellulari tumorali e le linee immortalizzate singoli tipi cellulari che possono essere propagate in vitro ininterrottamente, senza invecchiare. Alcune colture note sono: - cellule primarie di rene di scimmia: eccellenti per cercare virus inuenzali, paramyxovirus, enterovirus e alcuni adenovirus - Cellule umane fetali diploidi: generalmente cellule broblastiche, permettono la crescita di ampio spettro di virus, tra cui - HSV - VZV - CMV - Adenovirus - Picornavirus - Cellule HEp-2: linea continua di cellule epiteliali derivate da un tumore umano. Eccellenti per isolare - Virus respiratorio sinciziale Corso di microbiologia - batteriologia 29 www.bluejayway.it 5 CPE effetto citopatico - Adenovirus - HSV Isolamento virale Un virus pu essere identicato attraverso: - losservazione del CPE indotto in un monostrato di colture cellulari - Immunouorescenza - Analisi del genoma della coltura infetta Un singolo virus infetta, si replica e diffonde, uccidendo le cellule vicino effetto citopatico localizzato (placca). Per una prima identicazione di virus clinicamente importanti possono essere utilizzati i seguenti dati: - Tipo di coltura cellulare - Caratteristico CPE - Rapidit della replicazione virale Alcuni virus crescono lentamente o non crescono, oppure non causano un effetto citopatico. Altri sono pericolosi per il personale. In assenza di specico CPE si possono identicare i virus per altre caratteristiche: - interferenza eterologa: il virus della rosolia interferisce con la replicazione dei picornavirus se nella coltura con virus della rosolia i picornavirus non crescono, il test positivo - Emoadsorbimento: virus inuenzali e parainuenzali, virus del morbillo e togavirus esprimono lemoagglutinina, proteina che lega gli eritrociti di determinate specie animali - Rilevati mediante emoagglutinazione - Inibizione dellemoagglutinazione (HI): Il ceppo virale pu essere identicato dallantisiero specico che blocca lemoagglutinazione La quantit di virus pu essere calcolata dalla massima diluizione che mantiene le seguenti caratteristiche (titolo): - dose di coltura tessutale (TCD50): il titolo del virus che causa effetti citopatici nel 50% delle cellule in coltura - Dose letale 50 (LD50): titolo del virus che uccide il 50% in un gruppo di animali da esperimento. - Dose infettante (ID50): titolo del virus che induce sintomi, anticorpi o altre risposte rilevabili in un gruppo di animali da esperimento. Il numero dei virus infettivi pu essere valutato contando le placche prodotte da diluizioni a fattore 10 del campione (unit formanti placca): - il rapporto tra particelle virali contate al microscopio elettronico e unit formanti placche sempre maggiore di 1. Interpretazione dei risultati colturali Il rilevamento colturale di un virus, generalmente altamente signicativo. Occorre tenere presente, tuttavia, che la diffusione del virus potrebbe essere data da: - indotta da una condizione non manifesta (es altra infezione, immunosoppressione o stress) e non correlata ai sintomi della malattia - Virus liberati ad intermittenza senza linsorgenza di sintomi Potrebbe darsi che un virus non sia stato isolato a causa di un campione che - manipolato impropriamente - Contiene anticorpi neutralizzanti - stato raccolto prima della liberazione del virus. Rilevamento di proteine virali Durante la replicazione virale, sono prodotti: - enzimi - Altre proteine Queste possono essere rilevate mediante test: - biochimici, - immunologici - di biologia molecolare Le proteine virali possono essere separate attraverso elettroforesi: - i proli elettroforetici possono essere utilizzati per differenziare virus diversi. Il rilevamento e il test di enzimi e attivit caratteristiche possono permettere: - identicazione - Quanticazione di specici virus Esempio La presenza di una trascrittasi inversa nel siero o in una coltura cellulare indica presenza di retrovirus Emoagglutinazione o emoadsorbimento saggio dellemoagglutinina prodotta dai virus inuenzali. Gli anticorpi possono essere strumenti sensibili e specici per rilevare, quanticare e identicare virus e antigeni virali in campioni clinici o colture cellulari: - anticorpi monoclonali o monospecici identicazione di singoli ceppi e mutanti - Gli antigeni virali sulle cellule o nelle cellule immunouorescenza e test immunoenzimatici (EIA). - Virus o antigeni rilasciati da cellule infette possono essere rilevati attraverso Corso di microbiologia - batteriologia 30 www.bluejayway.it - Test colorimetrici (ELISA). - Test radioimmunologici - Agglutinazione con particelle di lattice (LA). Il rilevamento di cytomegalovirus e altri pu essere migliorato utilizzando una combinazione di colture cellulari e metodi immunologici: - campione centrifugato su cellule cresciute su un vetrino o in una provetta accelerato lingresso del virus nelle cellule - Le cellule possono essere analizzate mediante - Immunouorescenza (Fluorescenza diretta) - Test immunoenzimatici (EIA) (antigeni virali) Rilevamento di materiale genetico virale Le maggiori caratteristiche distintive (di ceppo, tipo e virus) per identicare un virus sono: - sequenza genica - Struttura del genoma Le impronte digitali rilevabili sono: - prolo elettroforetico dellRNA - Lunghezze dei frammenti prodotte da endonucleasi di restrizione nei virus a DNA I metodi pi innovativi per rilevare il genoma virale usano: - sonde genetiche - Amplicazione del DNA basata su PCR Le nuove metodiche consentono analisi pi rapide e rischio minimo per il virus infettivo. Si possono utilizzare sonde di DNA con sequenze complementari a speciche regioni del genoma virale: - possono rilevare un virus anche in assenza di replicazione virale - Utile analisi per rilevare i virus a replicazione lenta o non produttivi (esempio CMV e papilloma virus umano) o che non producano antigeni virali immunologicamente rilevabili. - Sequenze geniche virali speciche possono essere identicate in campioni bioptici tissutali attraverso ibridazione in situ. Genomi virali possono essere rilevati in campioni clinici, utilizzando Southern blot: - il genoma virale o i frammenti ottenuto con enzimi di restrizione sono separati elettroforeticamente - Sono trasferiti su ltri di nitrocellulosa - Sono identicati mediante libridazione con sonde di DNA. tecnica di Northern-blot: - RNA separato elettroforeticamente - Trasferito su un ltro di nitrocellulosa - Ibridato con sonde. Le sonde di DNA sono evidenziate con: - autoradiograa - Fluorescenza - Metodi immunoenzimatici. Il rilevamento di genomi virali attraverso PCR e PCR dopo retrotrascrizione (RT-PCR) e test simili diventato il principale strumento per identicazione di numerosi virus per molti laboratori: - utilizzo di idonei primer per PCR amplicazione di milioni di volte una sequenza bersaglio - Utile per identicare sequenze di - virus latenti e integrati (es retrovirus, herpesvirus, papillomavirus) - Virus a bassa concentrazione - Virus difcili o pericolosi da isolare in colture cellulari. La RT-PCR utilizza la trascrittasi inversa retrovirali per convertire lRNA virale in DNA per permettere lamplicazione mediante PCR delle sequenze di acidi nucleici virali. Real-time PCR La real-time PCR pu permettere di determinare la quantit di HIV in un paziente: - la concentrazione del genoma di HIV proporzionale al tasso di amplicazione PCR del DNA genomico La PCR il prototipo di molte tecniche di amplicazione genomica: - amplicazione basata sulla trascrizione: utilizza la trascrittasi inversa e primers specici per sequenze virali - forma un cDNA complementare alla sequenza riconosciuta dalla RNA polimerasi DNA-dipendente del batteriofago T7. - Una RNAasi digerisce lRNA il DNA viene trascritto in RNA dalla T7- RNA polimerasi - Le nuove sequenze di RNA sono circolarizzate in una reazione per amplicare la sequenza bersaglio. Altre tipologie di amplicazione genica e sistemi di rilevamento sono concettualmente simili allELISA: - utilizzano sequenze di DNA immobilizzate complementari alla sequenza virale bersaglio tentano di catturare il genoma virale Corso di microbiologia - batteriologia 31 www.bluejayway.it - Tali sequenze sono a loro volte legate con unaltra sequenza complementare contenente il sistema di rilevamento - La sequenza di cDNA pu essere attaccata ad una catena molto ramicata di DNA, in cui ogni ramicazione attiva una reazione segnale amplicato no ad essere rilevato. Sierologia virale La risposta immunitaria umorale utile per risalire alla storia delle infezioni del paziente. Utilizzata per: - identicazione di virus di difcile isolamento e coltura - Identicare virus che causano malattie con lungo decorso La sierologia pu essere impiegata per identicare: - Virus, ceppo o sierotipo - Denire la fase di una malattia (acuta o cronica) - Determinare se si tratta di infezione primaria o reinfezione. Il tipo di anticorpo, titolo e natura del bersaglio antigene forniscono i dati sierologici dellinfezione virale: - anticorpi IgM virus-specici:presenti durante le prime 2-3 settimane di infezione primaria - Indicano uninfezione primaria. - Sieroconversione aumento di 4 volte del titolo anticorpale tra il titolo determinato nel siero ottenuto in fas acuta della malattia e quello ottenuto 2-3 settimane dopo, durante la convalescenza. - Reinfezione o riattivazione provocano risposta anamnestica. Implicita imprecisione dei test sierologici, basati su diluizioni seriali a fattore due: - necessario un aumento di 4 volte del titolo anticorpale tra fase acuta e convalescente per indicare una sieroconversione. - Poich 1020 e 1030 differiscono, in quanto uno da 1:512 e laltro 1:1024 Si pu determinare con un prolo sierologico anche il decorso di uninfezione cronica: - presenza di anticorpi contro Ag virali chiave determinazione stadio della malattia - Sierologia utile per seguire malattie virali caratterizzate da decorso lento (epatite B e mononucleosi da EBV) - Generalmente - Primi anticorpi diretti contro antigeni pi esposti al sistema immunitario (proteine virali sulla supercie cellulare, antigeni sul virione) - Fase avanzata dellinfezione lisi o risposa cellulo-mediata esposizione di antigeni virali intracellulari anticorpi diretti contro antigeni intracellulari. La scelta dei test virali da includere nel pannello sierologico deve essere condotta anche in base a: - fattori epidemiologici locali - Fattori propri del paziente - Immunocompetenza - Viaggi - Et, - Storia - Stagioni Tecniche dei test sierologici I test di neutralizzazione e di inibizione dellemoagglutinazione saggiano la presenza di anticorpi sulla base del legame della Ig al virus. il mascheramento del virus da parte di anticorpi (neutralizzazione) impedisce il legame alle cellule - Lanticorpo non pu infettare n causare effetti citopatici - una risposta anticorpale neutralizzante ceppo-specica e virus-specica Il test di inibizione dellemoagglutinazione utilizzato per virus che possono agglutinare selettivamente gli eritrociti di diverse specie animali: - gli anticorpi nel siero impediscono che una quantit standard di virus si leghi e agglutini gli eritrociti I test di uorescenza indiretta e immunologici su fase solida per la ricerca di anticorpi (ELISA, LA, RIA) rilevare e quanticare antigeni virali: - ELISA: utilizzato per lo screening delle donazioni di sangue per escludere gli individui sieropositivi per virus dellepatite B, C e HIV. - Western-blot utilizzato per confermare la sieroconversione, quindi linfezione da HIV. - Il riconoscimento da parte degli anticorpi del paziente di speciche proteine virali, blottate su carta da ltro e visualizzate con un anticorpo coniugato ad un enzima conferma la diagnosi di infezione da HIV eseguita con test ELISA Limiti delle tecniche sierologiche La presenza di un anticorpo diretto contro un virus indica una precedente infezione: - non indica quando linfezione avvenuta Indicativi di recente infezione sono: Corso di microbiologia - batteriologia 32 www.bluejayway.it - Rilevamento di IgM virus-speciche - aumento di 4 volte del titolo anticorpale tra i sieri acuti e convalescenti - proli di anticorpi specici Risultati falsi-positivi o falsi-negativi possono indurre confusione nella diagnosi. Le cross-reazioni tra differenti virus possono confondere lidentit dellagente infettante. Gli anticorpi utilizzati nei test, di contro, sono troppo specici possono dare falsi negativi, in quanto non riconoscono altri virus della stessa famiglia. Per formulare la diagnosi sonno dunque indispensabili: - conoscenza dei limiti e problemi dei test sierologici - Buona comprensione dei sintomi clinici Corso di microbiologia - batteriologia 33 www.bluejayway.it La famiglia Papovaviridae stata suddivisa in due famiglie: - papillomaviridae - Polyomaviridae Tali virus possono causare infezioni litiche, croniche, latenti e trasformanti, in relazione alla cellula ospite. I papillomavirus umani (HPV) causano: - verruche - Tumori associati nelluomo (es carcinoma cervicale) I virus BK e JC, membri delle poliomaviridae, solitamente causano infezioni asintomatiche, ma negli immunodepressi sono associati a - JC leucoencefalopatia multifocali progressiva - BK malattie renali Il virus SV-40 il prototipo dei poliomavirus. I papillomavirus e poliomavirus sono: - piccoli - Privi di pericapside - Capside icosaedrico - DNA circolare a doppio lamento - Codicano proteine che promuovono - Crescita cellulare - Ciclo replicativo litico virale - Possono determinare la trasformazione oncogena di una cellula non permissiva. Corso di microbiologia - virologia 34 www.bluejayway.it Papillomavirus e poliovirus Virus piccoli Privi di pericapside Capside icosaedrico DNA ds circolare Proteine promuoventi ciclo cellulare e crescita Possono determinare la trasformazione oncogena Papillomavirus e poliovirus Enrico Colombo Morfologia e replicazione La classicazione dei papillomavirus umani basata sullomologia di sequenze di DNA: - identicati almeno 100 tipi, classicati in 16 gruppi (A P) - Gli HPV 6 possono essere distinti, a seconda della tessuto-specicit, in - Cutanei - Mucosali presente un gruppo associato al carcinoma cervicale. Il capside icosaedrico degli HPV: - diametro 50-55 nm - Costituito da due proteine strutturali si assemblano in 72 capsomeri Il genoma a DNA circolare, costituito da circa 8 kb: - 7-8 geni precoci (E1-E8) - Due geni strutturali/tardivi (L1-L2) - Regione regolatoria a monte - sequenze di controllo per trascrizione - Sequenza N-terminale per le proteine precoci - Origine della replicazione - Tutti i geni sono localizzati su un solo lamento, quello positivo (53) La replicazione di HPV controllata dal meccanismo di trascrizione della cellula ospite: - lesioni della pelle il virus raggiunge lo strato della membrana basale - Geni precoci stimolano crescita delle cellule facilitata la replicazione del genoma, utilizzando la DNA polimerasi della cellula bersaglio aumento del numero di cellule virus-indotto - Ispessimento dello strato cellulare basale e di quello a cellule spinose verruca o papilloma. - Mentre la cellula basale si differenzia fattori nucleari specici esperi nei diversi strati di tipi di pelle e mucose trascrizione dei geni virali espressione di geni virali correlata allespressione di speciche cheratine. - Geni tardivi proteine strutturali, espressi solo nello strato superiore completamente differenziato. il virus si assembla nel nucleo. - Attraverso la maturazione delle cellule cutanee (basali superciali) il virus raggiunge lo strato pi esterno della cute liberato assieme alle cellule desquamanti. Patogenesi I papillomavirus infettano e si replicano per indurre proliferazione epiteliale in cellule: - dellepitelio squamoso della cute verruche - Delle membrane mucose papillomi genitali, orali e congiuntivali. I tipi di HPV sono dotati di alta specicit tissutale causano malattie che si presentano con sintomi differenti: - verruca: stimolazione virale ella crescita cellulare dellispessimento degli strati basale, spinoso e granuloso - coilociti: cheratinociti ingranditi con aloni chiari attorno a nuclei raggrinziti. - Si sviluppano i 3-4 mesi Corso di microbiologia - virologia 35 www.bluejayway.it 6 human papilloma virus Papillomavirus umano Capside icosaedrico DNA ds circolare Si replica nello strato basale degli epiteli Pi di 100 gruppi con differente tropismo tissutale Causa verruche o papillomi Proteine precoci E1 - E8 Proteine tardive L1 e L2 (capside) Papillomavirus umani - Linfezione virale cutanea resta normalmente localizzata regredisce spontaneamente. Immunit innata e cellulo-mediata sono molto importanti per il controllo e la risoluzione delle infezioni da HPV: - HPV pu sopprimere la risposta immune o nascondersi - Il cheratinociti un sito immunologicamente privilegiato per la replicazione - La risposta inammatoria necessaria per attivare le risposte citolitiche protettive e promuovere la guarigione della verruca - Immunosoppressi manifestazioni pi severe Il potenziale oncogeno di HPV stato ampiamente studiato: - il DNA virale ritrovato in tumori benigni e maligni, specialmente papillomi mucosali. - HPV-16 e HPV-18: displasia e papillomi cervicali 7 . - Rottura del genoma circolare allinterno dei geni E1 e E2 per stimolare lintegrazione spesso causa inattivazione dei geni E1 e E2 bloccata la replicazione virale senza modicare lespressione degli altri geni - Vengono espresse le proteine E6 ed E7 di HPV-16 e HPV-18 proteine oncogene legano e inattivano - le proteine soppressive della crescita cellulare - P53 (E6) - RB (E7) - In assenza di tali proteine crescita cellulare meno controllata cellula pi sensibile a mutazioni/aberrazioni cromosomiche possibile evoluzione in cancro. Epidemiologia HPV resistente allinattivazione e pu essere trasmesso attraverso contatto con oggetti contaminati (superci di banconi o mobili, pavimenti del bagno, asciugamani) Leliminazione asintomatica del virus pu promuovere la trasmissione. Le infezioni da HPV sono principalmente trasmesse: - per contatto diretto e tramite piccole lacerazioni cutanee o delle mucose - Durante rapporti sessuali - Durante il passaggio del neonato nel canale del parto. Verruche comuni, plantari e piane frequenti in bambini e giovani adulti. Papillomi laringei bambini piccoli e adulti di et media. Il papillomavirus umano probabilmente linfezione trasmessa sessualmente con maggior prevalenza al mondo alcuni tipi di HPV sono comuni tra le persone sessualmente attive: - 20 milioni negli USA infetti da HPV - 5,5 milioni di casi genitali allanno. - Alto rischio per tumore cervicale: HPV-16/18/31/45 - Il 5% di tutti i app-test contiene cellule infettate da HPV - Circa il 10% delle donne infettate dai tipi di HPV ad alto rischio sviluppa una displasia cervicale (stato precanceroso) I principali fattori di rischio per infezione e progressione verso il carcinoma sono: - numerosi partner sessuali - Fumo - Storia familiare di carcinoma cervicale - Immunosoppressione. Sindromi cliniche Verruca La verruca una proliferazione benigna autolimitante della cute, che regredisce con il tempo: - tipi comuni di HPV: da HPV-1 a HPV-4 capaci di infettare le superci cheratinizzate (solitamente mani e piedi) - Linfezione iniziale comune in infanzia o fanciullezza. - Periodo di incubazione: 3-4 mesi - La comparsa della verruca dipende da - Tipo di HPV - Sito di infezione. Tumori benigni della testa e del collo I papillomi orali singoli sono i pi comuni tumori epiteliali benigni del cavo orale: - peduncolo brovascolare (peduncolati) - Supercie con aspetto papillare rugoso. - Si riscontrano in persone di qualsiasi et Corso di microbiologia - batteriologia 36 www.bluejayway.it 7 almeno l85% dei carcinomi della cervice uterina contiene integrato il DNA di HPV - Sono generalmente isolati - Raramente recidivano dopo rimozione chirurgica. I papillomi laringei, associati a HPV-11 e HPV-6 sono i pi comuni tumori epiteliali benigni della laringe: - pu essere letale nei bambini ostruiscono le vie aeree - Occasionalmente possono diffondere ai bronchi Verruche anogenitali Le verruche genitali (dette condissimo acuminati) si riscontrano quasi esclusivamente su epitelio squamoso di: - genitali esterni - Aree perianali Circa il 90% causato dai tipi di HPV 6 e 11. Raramente diventano maligne. Displasie e neoplasie cervicali Linfezione da HPV del tratto genitale oggi riconosciuta come una comune malattia a trasmissione sessuale: - Infezione asintomatica o con lieve prurito - verruche genitali verruche sofci, color carne, che possono essere piatte, rilevate o simili a cavolori. - Possono apparire settimane o mesi dopo linfezione - Le alterazioni citologiche dellinfezione da HPV si riscontrano negli strisci cervicali colorati con il metodo di Papanicolaou (Pap test) Linfezione con i tipi di HPV 16, 18, 31, 45 (e raramente altri tipi) associata alla neoplasia cervicale intraepiteliali e al cancro: - inizialmente si osserva displasia nel 40-70% dei casi regredisce spontaneamente - ritenuto che il cancro cervicale si sviluppi attraverso au serie di alterazioni cellulari progressive. (CIN I CIN II displasia grave o carcinoma in situ) - Tale sequenza pu durare 1-4 anni - Eseguire regolarmente il Pap test pu prevenire o promuovere cure precoci per il carcinoma cervicale. Diagnosi di laboratorio Per le verruche microscopico alterazioni istologiche - cellule spinose iperplasiche - Ipercheratosi: eccesso di produzione di cheratina. Linfezione da papillomavirus pu essere rilevata in strisci colorati con colorazione di Papanicolaou: - si osservano cellule epiteliali squamose coilocitiche (citoplasma vacuolizzato) - Sono arrotondate e disposte a gruppi. Per diagnosi e tipizzazione dellinfezione da HPV i metodi delezione consistono in metodiche molecolari su tamponi cervicali o campioni istologici: - sonde molecolari di DNA - PCR I papillomavirus non crescono in coltura cellulare Sierologia raramente utilizzata, se non per studi sperimentali. Terapia, prevenzione e controllo Le verruche: - regressione spontanea, dopo mesi/anni - Rimosse poich sono dolorose, esteticamente scomode e diffusibili ad altre persone/parti del corpo - Tecniche per rimuovere - Crioterapia chirurgica - Elettrocauterizzazione - Metodi chimici (es podollina 10%-25%) - La promozione di una guarigione pi rapida pu essere attuata attraverso - Interferone o imiquimod stimolatori della risposta innata - Cidofovir somministrazione topica, uccide le cellule infettate in maniera selettiva Corso di microbiologia - batteriologia 37 www.bluejayway.it disponibile un vaccino per HPV, costituito dalla proteina capsidica assemblata in particelle virus-simile: - pu prevenire linfezione - Dovrebbe essere somministrato a ragazze ancora non sessualmente attive. Per prevenire la trasmissione necessario: - evitare il contato con tessuto infetto - Utilizzare precauzioni per prevenire trasmissione sessuale. Papillomavirus umano Morfologia e replicazione Virus piccoli con capside icosaedrico Genoma costituito da DNA ds circolare replicato e assemblato nel nucleo Pi di 100 tipi deniti, determinati dallomologia del DNA e dal tropismo tissutale Hanno tropismo tessutale ben determinato dalle interazioni con i recettori e dal macchinario trascrizionale della cellula. Codicano proteine che promuovono la crescita cellulare (E7 lega la proteina RB, E6 lega p53) Possono causare infezioni litiche in cellule permissive, ma causano infezioni abortive, persistenti o latenti, o immortalizzano le cellule non permissive Patogenesi Il virus acquisito per stretto contatto Infetta le cellule epiteliali della cute o delle mucose Tropismo tessutale e la presentazione della malattia dipendono dal tipo di papillomavirus. Il virus persiste nello strato basale produce progenie virale nei cheratinociti differenziati Causa verruche, proliferazione benigna delle cellule risoluzione spontanea Alcuni tipi di HPV sono associati a displasia, che pu diventare, con altri cofattori, cancro. Il DNA di alcuni tipi di HPV integrato nei cromosomi delle cellule tumorali, soprattuto nei cancri della cervice uterina (85%). Epidemiologia Capside virale resistente allinattivazione Virus persiste nellospite Probabile la diffusione asintomatica La trasmissione del papillomavirus avviene per: - contatto diretto - Contatto sessuale - Trasmissione durante il canale del parto (papillomavirus laringei) A rischio popolazione sessualmente attiva a rischio di infezione con i tipi di HPV correlati a tumori orali o genitali Distribuzione mondiale Nessuna incidenza stagionale Malattie Verruca cutanea Verruca anogenitali Displasie e neoplasie cervicali cancro Tumori benigni (papillomi) alla laringe e nel cavo orale. Diagnosi Citologia con colorazione di Papanicolaou cellule coilocitiche Analisi in situ con sonde di DNA acidi nucleici virali PCR acidi nucleici virali Southern Blot acidi nucleici virali Immunouorescenza e immunoperossidasi antigeni virali strutturali Microscopia elettronica identicazione del virus Coltura virale impossibile. Terapia, prolassi e controllo. Verruche rimozione attraverso crioterapia chirurgica, cauterizzazione elettrica o metodi chimici. Terapie che aiutano la guarigione - interferone - Imiquimod - Cidofovir Vaccino per prevenire le infezioni da HPV genitali. Corso di microbiologia - batteriologia 38 www.bluejayway.it I poliomavirus umani, virus BK e virus JC, sono ubiquitari, ma generalmente non causano malattie: - crescono con difcolt in colture cellulari SV-40 (poliomavirus delle scimmie) e poliomavirus murini sono stati ampiamente studiati come modelli di virus oncogeni, ma non associati con patologie umane. Morfologia e replicazione Rispetto ai papillomavirus, i poliomavirus sono: - piccoli diametro 45 nm - Contengono meno acido nucleico (5 kb) - meno complessi I genomi dei virus BK, JC e SV-40 sono strettamente correlati e suddivisibili in 3 regioni: - regione precoce: codica le proteine non strutturali T (trasformazione) - Regione tardiva: codica per le tre proteine del capside virale (VP1, VP2, VP3) - Regione non codicante: contiene lorigine di replicazione del DNA e le sequenze di controllo della trascrizione sia dei geni precoci che di quelli tardivi. Dopo lingresso nella cellula il DNA senza capside entra nel nucleo trascritti i geni precoci, che codicano gli antigeni T grande e T piccolo: - la replicazione virale richiede il macchinario trascrizionale e replicativo della cellula - Antigeni T grande numerose funzioni - T grande di SV-40 lega il DNA virale controllo della trascrizione di geni precoci e tardivi, controllo replicazione, - lega p53 e RB le inattiva promuove la crescita cellulare possibile trasformazione Come per HPV, la replicazione dei poliomavirus dipendente dai fattori cellulari: - cellule permissive consentono la trascrizione di mRNA virale tardivo morte litica e rilascio del virus - Cellule non permissive espressi solo i geni precoci, compreso lantigene T stimolazione della crescita cellulare potenziale oncogeno Il genoma di poliomavirus organizzato in maniera efciente: - regione non codicante siti dinizio per gli mRNA precoci e tardivi e lorigine di replicazione del DNA - Le tre proteine tardive sono prodotte da mRNA, stesso sito dinizio, processati successivamente per dare origine a 3 mRNA distinti. Il DNA virale circolare mantenuto e replicato in entrambe le direzioni la replicazione del DNA precede la trascrizione del mRNA tardivo e la sintesi proteica. Il virus si assembla nel nucleo ed rilasciato per lisi cellulare. Corso di microbiologia - virologia 39 www.bluejayway.it Poliomavirus Piccolo DNA ds circolare 5 kb Antigeni T precoci 3 proteine VP tardive Rilasciato per lisi cellulare Potenziale oncogeno Polyomaviridae Virus JC/BK soggetto immunocompetente inoculazione nel tratto respiratorio moltiplicazione nel tratto respiratorio viremia primaria moltiplicazione a livello renale econda viremia transitoria virus latenti nel rene soggetto immunocompromesso riattivazione del virus virus BK moltiplicazione nel tratto urinario possibile cistite emorragica viremia da virus JC infezione SNC con possibile PML Patogenesi Ciascun poliomavirus ha un limitato spettro dospite e limitato tropismo cellulare: - i virus JC e BK umani probabilmente - Penetrano nel tratto respiratorio infettano poi il rene e i linfociti con CPE minimo - Virus BK: infezione latente nel rene - Virus JC: infetta cellule renali, monociti, cellule B. La replicazione virale soppressa nei soggetti immunocompetenti. In pazienti immunocompromessi possono svilupparsi riattivazioni virali, che comportano: - virus BK: liberazione nel virus nelle urine, con infezioni del tratto urinario - Virus JC: possibile infezione del sistema nervoso centrale. - Attraversa la barriera ematoencefalica replicandosi nelle cellule endoteliali capillari - Infezione abortiva degli astrociti parziale trasformazione (cellule ingrossate con nuclei abnormi) - Infezione litica produttiva degli oligodendrociti demielinizzazione. Nonostante i virus SV-40, JC e BK causino tumori negli animali da laboratorio non associati a tumori umani. Epidemiologia Le infezioni da poliomavirus sono ubiquitarie e la maggior parte della popolazione infettata sia da JC che da BK entro i 15 anni: - trasmissione: principalmente per via respiratoria - Riattivazione infezioni latenti in pazienti immunocompromessi (AIDS, trapiantati, donne in gravidanza) - 10% dei pazienti con AIDS sviluppa leucoencefalopatia multifocali progressiva (PML) letale nel 90% dei casi. Sindromi cliniche Linfezione primaria generalmente asintomatica. I virus BK e JC sono riattivati negli immunocompromessi (rilevati nelle urine del 40% di tali pazienti) e nelle donne in gravidanza. Il virus BK associato a: - stenosi uretrale osservata nei trapiantati di rene - Cistite nei trapiantati di midollo osseo Il virus JC associato a leucoencefalopatia multifocale progressiva (PML): - malattia demielinizzante subacuta - Si sviluppa in immunocompromessi (AIDS) - I pazienti possono presentare svariati sintomi neurologici, non attribuibili ad una singola lesione anatomica. - Compromesse - Parola - Facolt mentali - Vista - Coordinazione - Seguono la paralisi degli arti e la morte - Dopo la diagnosi aspettativa di vita da 1 a 4 mesi. La maggior parte dei pazienti muore entro 2 anni. Diagnosi di laboratorio La PML diagnosticata denitivamente attraverso: - amplicazione del DNA virale con PCR nel liquor - Dimostrazione di lesioni cerebrali con RM o TAC Corso di microbiologia - batteriologia 40 www.bluejayway.it Lesame istologico di tessuto cerebrale (bioptico o autoptico) mostra: - focolai di demielinizzazione circondati da oligodendrociti con inclusioni adiacenti alle aree di demielinizzazione - Leucoencefalopatia riferito al fatto che colpita solo la sostanza bianca. La presenza del virus JC pu essere identicata in campioni di liquor, urine e biopsie attraverso: - Immunouorescenza - Immunoperossidasi - Sonde di DNA - Amplicazione genica per sequenze genomiche speciche Esami citologici di urine rilevabile presenza di virus JC o BK: - cellule ingrandite con inclusioni intranucleari basole e dense, Difcoltoso isolare questi virus in colture cellulari. Colorazione immunoistochimica con immunoperossidasi di virus BK in un tubulo renale con antigeni capsulari di SV-40. Si noti la forte reattivit (nuclei neri) nelle cellule tubulari infette. TECNICA RILIEVO PCR del liquor Rilevato DNA virale Immunofluorescenza, immunoperossidasi, sonde di DNA Identificazione diretta in campioni di urine, liquor e biopsie renali o cerebrali Esami citologici di urine Cellule ingrandite con inclusioni intranucleari TAC o risonanza magnetica Demielinizzazione centrale Terapia, prolassi, controllo Non disponibile una terapia specica per linfezione da poliovirus: - se possibile limitare limmunosoppressione responsabile della riattivazione del virus. Natura ubiquitaria + scarse conoscenze dei poliomavirus improbabile la prevenzione dellinfezione primaria. Poliomavirus (virus JC, BK e SV-40) Morfologia e replicazione Virus piccoli con capside icosaedrico Genoma costituito da DNA ds circolare replicato e assemblato nel nucleo Potenzialmente oncogeni, in quanto gli antigeni T legano RB e p53 Patogenesi Vie respiratorie diffusione ematica rene (prima dei 15 anni) Le infezioni sono asintomatiche infezioni persistenti e latenti di polmoni e rene. Pazienti immunocompromessi riattivazione del virus JC PML - trasformazione parziale degli astrociti - Lisi degli oligodendrociti - Lesioni caratteristiche al SNC e demielinizzazione Il virus BK ubiquitario e non associato a malattie gravi. Epidemiologia Capside virale resistente allinattivazione Virus persiste nellospite Probabile la diffusione asintomatica La trasmissione avviene principalmente per aerosol contagioso. Individui a rischio sono i pazienti immunocompromessi Distribuzione mondiale Non incidenza stagionale Controllo impossibile Malattie Virus JC leucoencefalopatia multifocale progressiva (PML) Virus BK infezioni del tratto urinario Diagnosi Diagnosi di PML: PCR + radiologia cerebrale Corso di microbiologia - batteriologia 41 www.bluejayway.it Esame istologico focolai di demielinizzazione circondati da oligodendrociti con inclusi citoplasmatici Immunouorescenza, immunoperossidasi, ibridazione con sonde molecolari di DNA o PCR permettono di identicare il virus in urine, liquor o biopsie. Citologia cellule ingrandite con inclusi basoli e densi. Coltura inutile Terapia, prolassi e controllo. Inutile terapia non disponibile Inutile e difcoltoso il controllo. Corso di microbiologia - batteriologia 42 www.bluejayway.it Sono stati identicati circa 100 sierotipi di adenovirus, dei quali circa 47 infettano luomo: - sierotipi patogeni per luomo sono inclusi in un solo genere - Studi di omologia del DNA e proli di emoagglutinazione divisione in 6 sottogruppi (da A a F) I primi adenovirus umani identicati (da 1 a 7) sono i pi diffusi. Tra le malattie comuni da adenovirus si riscontrano: - infezioni dellapparato respiratorio - Congiuntivite (occhio rosa) - Cistiti emorragiche - Gastroenterite Morfologia e replicazione Gli adenovirus sono virus a DNA ds con un genoma di circa 36 kb, che codica per 30-40 proteine: - genoma a DNA lineare a doppio lamento - Ogni estremit 5 ha una proteina terminale legata covalentemente - Virione icosadeltaedrico, privo di pericapside - Diametro di 70-90 nm Il capside comprende 240 capsomeri, che consistono di esoni e pentoni: - 12 pentoni localizzati a ciascuno dei vertici contengono - Base del pentone - Fibra - La bra contiene le proteine virali di attacco (VAP) e pu agire da emoagglutinina. - La base del pentone e la bra sono tossiche per le cellule. - Pentoni e bra possiedono antigeni tipo-specici. Il complesso del core, nel capside, costituito da: - DNA virale - 2 proteine maggiori Corso di microbiologia - virologia 43 www.bluejayway.it Adenovirus Virus a DNA ds lineare Capside icosadeltaedrico No pericapside 70-90 nm 12 pentoni contenenti base del pentone e bra (proteina dattacco virale e emoagglutinina), entrambe tossiche. Proteine precoci stimolano la crescita cellulare e hanno una DNA polimerasi Le proteine tardive, sintetizzate dopo il DNA virale, costituiscono il capside Ciclo virale 32-36 ore Adenovirus Il virione delladenovirus contiene almeno 11 polipeptidi 9 hanno una funzione strutturale nota. Dalla mappa del genoma degli adenovirus si deduce che: - i geni sono trascritti da entrambi i lamenti di DNA, in ambedue le direzioni e in tempi diversi del ciclo replicativo - Geni per funzioni correlate sono raggruppati assieme. - La maggior parte degli RNA trascritti viene processata per dare numerosi mRNA singoli nel nucleo - Proteine precoci - Stimolano la crescita cellulare - Comprendono una DNA polimerasi replicazione genoma virale - Proteine che sopprimono la risposta immunitaria e inammatoria dellospite. - Proteine tardive: sintetizzate dopo la replicazione del DNA, sono componenti del capside. La replicazione degli adenovirus stata ampiamente studiata, in colture cellulari HeLa: - Durata ciclo: 32-36 ore - Virioni prodotti: 10000 - Il legame degli adenovirus alla supercie cellulari avviene in due fasi: - Fibre interagiscono con una glicoproteina della superfamiglia Ig (alcuni con MHC di classe I) 8 - Base del pentone interagisce con una integrina v promuove linternalizzazione per endocitosi mediata da recettore in vescicola rivestita di clatrina - Il virus lisa la vescicola endosomiale e il capside rilascia il genoma a DNA lineare nel nucleo - Le proteine del pentone e della bra del capside sono tossiche inibizione sintesi delle macromolecole cellulari. La trascrizione dei geni precoci porta alla formazione di prodotti genici in grado di stimolare la crescita cellulare e promuovere la replicazione del DNA virale: - numerosi mRNA degli adenovirus hanno lo stesso promotore divisi successivamente per splicing - Gene E1: suddiviso in 3 mRNA per splicing, porta alla traduzione di 3 proteine - E1A: proteina transattivante precocissima necessaria per la trascrizione delle altre proteine precoci (leganti il DNA, DNA-polimerasi, proteine anti-immunitarie, ecc) - E1B: assieme a E1A un oncogene lega inattivandole p53 e RB stimolazione della crescita cellulare. Nelle cellule permissive, la stimolazione della divisione cellulare facilitata trascrizione e replicazione del genoma: - morte della cellula dovuta alla replicazione virale - Rilascio del virus Nelle cellule non permissive infezione latente e il genoma rimane nel nucleo. La replicazione del DNA: - localizzazione nucleare - Operata dalla DNA polimerasi virale - Utilizza come primer una proteina virale con adesa una citosina monofosfato per replicare entrambi i lamenti di DNA - La proteina terminale rimane attaccata al DNA. La trascrizione di geni tardivi avviene dopo la replicazione del DNA: - la maggior parte dei singoli mRNA tardivi viene generata per processamento di un lungo trascritto primario codicato dal lamento destrorso - Successivamente processato in molti mRNA Le proteine del capside sono prodotte nel citoplasma trasportate nel nucleo per lassemblaggio virale: - inizialmente si formano i pericapside vuoti - DNA e proteine del core entrano del capside attraverso unapertura ad uno dei vertici. Replicazione e assemblaggio sono molto inefcienti: - una particella virale infettiva ogni 1100-2300 virioni prodotti - DNA, proteine e altre particelle accumulate formando corpi inclusi. - Il virus rimane nella cellula liberato quando la cellula si lisa. LEGAME DELLA FIBRA CON LA GLICOPROTEINA IG CAR INTERAZIONE DELLA BASE DEL PENTONE CON LINTEGRINA ENDOCITOSI IN VESCICOLA DI CLATRINA LISI DELLA VESCICOLA DI CLATRINA TRASCRIZIONE DEI GENI PRECOCI (ES E1, SCISSO IN E1A, E1B, E1C) - CELLULE PERMISSIVE: STIMOLAZIONE DELLA DIVISIONE CELLULARE TRASCRIZIONE DEI GENI PRECOCI REPLICAZIONE DEL GENOMA TRASCRIZIONE DEI GENI TARDIVI/STRUTTURALI TRASPORTO DEI CAPSOMERI NEL NUCLEO INGRESSO DEL DNA VIRALE NEI CAPSOMERI LISI CELLULARE A CAUSA DEL GRAN NUMERO DI PARTICELLE DIFETTIVE RILASCIO DEL VIRUS - CELLULE NON PERMISSIVE: IL GENOMA RESTA NEL NUCLEO INFEZIONE LATENTE Corso di microbiologia - batteriologia 44 www.bluejayway.it 8 tale proteina, presente in gran numero sulle cellule umane, anche recettore per Coxsackievirus tipo B. Pertanto, chiamata recettore Adenovirus-Coxsackie (CAR). Patogenesi e immunit Gli adenovirus possono instaurare infezioni di natura: - Litica (cellule epiteliali e mucoepiteliali) - Latente (cellule linfoidi) - Trasformante (non nelluomo) Tali virus infettano: - cellule epiteliali dellorofaringe - Organi respiratori - Organi enterici La specicit per la cellula bersaglio determinata dalle proteine delle bre virali. La tossicit, data dalla base del pentone, agisce attraverso: - inibizione del trasporto degli mRNA cellulari - Inibizione della sintesi proteica - Arrotondamento delle cellule - Danneggiamento dei tessuti. Il marker istologico dellinfezione di adenovirus inclusione intranucleare densa nella cellula infetta: - data da DNA e proteine virali - Ricordano quelle dei cytomegalovirus, ma non causano ingrossamento della cellula La viremia pu vericarsi dopo la replicazione in loco disseminazione agli organi interni: - frequentemente negli immunodepressi (epatiti e polmoniti) - Il virus tende a diventare latente e persistente nei tessuti linfoidi (tonsille, placche di Peyer, ecc) pu essere riattivato in pazienti - Immunodepressi - Infettati da altri agenti. Gli adenovirus sono oncogeni in alcuni roditori, ma non mai stata osservata una trasformazione di cellule umane da adenovirus Gli anticorpi sono importanti: - aiutano la risoluzione dellinfezione litica da adenovirus - Proteggono dalla ripetizione con lo stesso sierotipo (non da altri sierotipi) Limmunit cellulo-mediata importante nel contenere la propagazione del virus: - persone immunodepressi malattie ricorrenti pi gravi Gli adenovirus possiedono vari meccanismi di elusione della difesa dellospite e di aiuto alla persistenza: - corti segmenti di RNA che prevengono lattivazione dellinibitore della sintesi delle proteine virali (mediata dalla PKR indotta da interferone) - Proteina E3 e E1A bloccano lapoptosi indotta dalle risposte cellulari al virus o dalle cellule T o da citochine. - Alcuni ceppi di adenovirus possono inibire lattivit delle cellule T CD8 citotossiche impediscono ladeguata espressione delle molecole HLA I, quindi la presentazione dellantigene Epidemiologia Gli adenovirus possiedono virioni resistenti a: - essiccamento - Detergenti - Secrezioni gastriche - Leggeri trattamenti di cloro. Possono dunque diffondere attraverso il circuito oro-fecale, attraverso - mani - Oggetti - Piscine poco clorate. Gli adenovirus diffondono esclusivamente da uomo a uomo, principalmente attraverso: - contatto respiratorio - Contatto oro-fecale La diffusione del virus facilitata dallo stretto contatto interumano, come si verica in: - classi scolastiche - Caserme militari Gli adenovirus possono essere eliminati in modo intermittente e per lunghi periodi dalla faringe, in particolare con le feci. Per la maggior parte, le infezioni sono asintomatiche diffusione facilitata nella comunit. I sierotipi di adenovirus pi diffusi sono da 1 a 7: - 5-10% dei casi di malattia dellapparato respiratorio in et pediatrica causato da adenovirus (tipi 1, 2, 5, 6) - Sembra che i sierotipi 4 e 7 diffondano facilmente in ambienti militari. Corso di microbiologia - batteriologia 45 www.bluejayway.it Sindromi cliniche Gli adenovirus infettano soprattutto i bambini: - le riattivazioni di adenovirus latenti sono frequenti in bambini e immunodepressi. - Esistono diverse sindromi cliniche associate ad adenovirus. Faringite febbrile acuta e febbre faringocongiuntivale. Gli adenovirus causano faringite, spesso accompagnata da: - congiuntivite (occhio rosa) - Febbre faringocongiuntivale La sola faringite si manifesta nei bambini: - specialmente under 3 - Pu mimare linfezione da Streptococcus pyogenes. I pazienti affetti hanno lievi sintomi simil-inuenzali (congestione nasale, tosse, malessere, febbre, brividi, mialgia e cefalea): - durano 3-5 giorni La febbre faringocongiuntivale si manifesta spesso con epidemie che coinvolgono bambini pi grandi. Malattia respiratoria acuta La malattia respiratoria acuta caratterizzata da: - febbre - Tosse - Faringite - Adenite cervicale Causata dai sierotipi 4 e 7 alta incidenza tra le reclute militari stato prodotto un vaccino. Altre malattie respiratorie Gli adenovirus causano: - sintomi tipici del raffreddore - Laringite - Croup (stridore laringeo) - Bronchioli. - Sindrome simile alla pertosse: decorso clinico prolungato, con una vera e propria polmonite virale. Congiuntivite e cheratocongiuntivite epidemica Gli adenovirus causano una congiuntivite follicolare, in cui: - la mucosa della congiuntiva palpebrale diventa granulosa o nodulosa - Le mucose delle congiuntive sia palpebrale che bulbare risultano inammate. La congiuntivite da piscina un esempio comune di infezione da fonte comune da parte di adenovirus. La cheratocongiuntivite epidemica pu essere un rischio industriale: - il pi grande caso a Pearl Harbor nel 1941 in un cantiere navale - Fattori di rischio Irritazione dellocchio da parte di un corpo estraneo, polvere o simili giorni modificazioni patologiche del tratto respiratorio induzione da interferone risposta immunitaria cellulo- mediata virus nelle secrezioni respiratorie aumento degli anticorpi virus-specifici malattia sintomatica simil- influenzale anticorpi specifici incubazione convalescenz a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 3 3 3 3 3 9 8 3 9 8 5 3 10 9 8 5 3 9 8 5 3 9 8 7 5 3 5 9 8 7 6 5 9 8 7 6 5 9 8 7 6 4 5 9 8 7 6 4 5 9 8 7 6 4 5 9 8 7 6 4 5 9 8 7 6 4 5 9 8 7 6 4 5 9 8 7 6 4 5 9 8 7 4 9 8 7 4 9 8 7 4 9 8 7 4 9 8 7 4 9 7 4 9 7 9 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Infezione da adenovirus Giorni modificazioni patologiche del tratto respiratorio contagiosit virus nelle feci virus nelle secrezioni respiratorie possibile viremia sintomi presenza di anticorpi specifici incubazione Gastroenterite e diarrea Ladenovirus la principale causa di gastroenterite virale acuta: - causa il 15% delle gastroenteriti ospedaliere - I sierotipi enterici (gruppo F) sono 40, 41 e 42 responsabili di diarrea nei neonati - Non si replicano nelle colture cellulari utilizzate per gli altri adenovirus - Raramente causano febbre o sintomi respiratori Altre manifestazioni Gli adenovirus sono associati anche a: - malattia simile alla pertosse - Intussuscezione (stipsi rettale) nei bambini Corso di microbiologia - batteriologia 46 www.bluejayway.it - Cistite emorragica acuta con disuria ed ematuria negli adolescenti - Alterazioni muscolo-scheletriche - Infezioni genitali - Infezioni cutanee Infezione sistemica in pazienti immunodepressi Gli immunodepressi a rischio di gravi infezioni virali: - le malattie da adenovirus comprendono - Polmonite - Epatite - Linfezione pu originare da fonte esogena o endogena (es riattivazione) Diagnosi di laboratorio Lisolamento del virus signicativo se ottenuto da secrezioni o tessuti clinicamente rilevanti: - esempio lisolamento di adenovirus dallorofaringe di un paziente con faringite diagnostico (se escluso lo Streptococcus Pyogenes) Analisi diretta di campioni clinici pu essere impiegata per il rilevamento rapido e identicazione degli adenovirus: - saggi immunologici (anticorpi uorescenti e reazioni immunoenzimatiche) - Ricerche di genomi (PCR e analisi con sonde di DNA) identicazione e tipizzazione dei virus in campioni clinici e in colture) - Tecniche necessarie per gli adenovirus enterici (40, 41, 42) - Test sierologico raro, utilizzato solo per confermare n virus isolato dalle feci o dallapparato respiratorio superiore. Lisolamento della maggior parte dei tipi di adenovirus colture cellulari epiteliali: - cellule primarie di rene fetale - Linee continue (es HeLa o carcinoma dellepidermide umano) Il virus in coltura mostra infezione litica con la comparsa di caratteristici corpi inclusi in 2-20 giorni: - isolamento virale richiede in media circa 6 giorni. - Allesame istologico si possono osservare le caratteristiche inclusioni intranucleari rare e devono essere distinte da quelle di CMV METODOLOGIA CAMPIONE RILIEVO Coltura Congiuntiva, faringe, feci Dopo 6 gg in media, si vedono cellule con inclusi intranucleari Reazioni immunoenzimatiche o anticorpi fluorescenti Campioni di congiuntiva, faringe, feci, ecc Ricerca diretta di antigeni PCR o sonde marcate di DNA Campioni di congiuntiva, faringe, feci, ecc Ricerca DNA virale Test sierologico Campioni di congiuntiva, faringe, feci, ecc Ricerca di anticorpi contro antigeni di adenovirus. Utilizzato raramente, solo per conferma di un virus isolato in coltura Terapia, prolassi e controllo Non disponibile una terapia approvata per trattare linfezione da adenovirus. Per le reclute militari vaccini ottenuti da virus vivi, a somministrazione orale prevengono linfezione da adenovirus. Terapia genica Gli adenovirus sono stati utilizzati e presi in considerazione per applicazioni di terapia genica: - considerati in numerose malattie delluomo - Immunodecienze - Fibrosi cistica - Malattia lisosomiale - Cancro - Ecc - Il virus inattivato per delezione o mutazione dei geni E1 e altri geni (E2, E4) inserito nel genoma il gene appropriato, controllato dal giusto promotore. - Il virus vettore deve essere replicato in una cellula che esprime le funzioni virali mancanti e pu completeranno la funzione mancante per consentire la produzione di progenie virale. Tali virus, nonostante lattenuazione del vaccino, possono ancora provocare patologie umane serie. Corso di microbiologia - batteriologia 47 www.bluejayway.it Adenovirus Morfologia e replicazione Capside icosaedrico nudo con bre VAP ai vertici Genoma lineare a doppio lamento con proteine nelle due porzioni 5 terminale. Sintesi della DNA polimerasi attiva il passaggio dai geni precoci a quelli tardivi Il virus codica proteine che promuovono la sintesi di mRNA e DNA (anche la DNA polimerasi) Gli adenovirus sono raggruppati da A a F in base alle omologie del DNA e in base al sierotipo (pi di 42 tipi) Il sierotipo soprattutto dovuto a differenze nella base del pentone e nella proteina della bra - determinano la natura e il tropismo tissutale Causa infezioni litiche, persistenti o latenti nelluomo. Patogenesi Diffusione attraverso: - aerosol - Contatto - Oro-fecale Infezioni a livello faringeo e oculare (giunge attraverso le dita) Il virus infetta le cellule mucoepiteliali del tratto respiratorio, gastrointestinale, congiuntiva, cornea causa danno diretto. Malattia determinata dal tropismo tissutale dello specico gruppo o sierotipo Il virus persiste nei tessuti linfoidi Lanticorpo importante per la prolassi di infezioni secondarie e la risoluzione di infezioni litiche primarie. Epidemiologia Capside resistente allinattivazione del tratto GI e alla mancanza di umidit Sintomi simili a quelli di altre infezioni respiratorie (streptococco) Possibile diffusione asintomatica aumenta la trasmissione Trasmissione attraverso: - contatto diretto - Aerosol - Materiale fecale sulle mani, oggetti - Stretto contatto - Acqua non sufcientemente clorata nelle piscine A rischio bambini (sotto i 14), gente in aree affollate Non ha incidenza stagionale Diffusione mondiale Controllo con vaccino virus vivo per sierotipi 4 e 7 in ambito militare Malattie Faringite febbrile acuta Febbre faringocongiuntivale Malattia respiratoria acuta Altre malattie del tratto respiratorio Congiuntivite e cheratocongiuntivite epidemica Gastroenterite e diarrea In immunodepressi epatite e polmonite Diagnosi di laboratorio Isolamento da tessuti rilevanti Analisi di campioni clinici senza isolamento virale PCR, sonde molecolari, reazioni immunoenzimatiche, anticorpi uorescenti Test sierologico utile solo per confermare la rilevanza di un virus isolato dalle feci o allapparta respiratorio superiore, determinando il sierotipo. Isolamento in colture cellulari epiteliali Esame istologico inclusioni intranucleari Terapia, prolassi e controllo Non disponibile una terapia Vaccini per i sierotipi 4 e 7 fruibili dai soli militari. Corso di microbiologia - batteriologia 48 www.bluejayway.it Gli herpesvirus sono un importante gruppo di virus a DNA di grosse dimensioni, che presentano le seguenti caratteristiche comuni: - morfologia del virione - Strategia replicativa - Capacit di instaurare infezioni latenti e ricorrenti. Limmunit cellulo-mediata importante per: - controllo dellinfezione di questi virus - insorgenza dei sintomi Il genoma degli herpesvirus codica proteine e enzimi che favoriscono la replicazione e linterazione tra virus e ospite. Gli herpesvirus possono causare infezioni: - litiche - Persistenti - Latenti/ricorrenti - Immortalizzanti (EBV) Gli herpesvirus umani sono classicati in 3 sottofamiglie, sulla base: - delle differenze nelle caratteristiche virali (struttura del genoma, tropismo tissutale, effetto citopatico e sede dinfezione latente) - Patogenesi e sintomatologia della malattia Gli herpesvirus umani comprendono: - virus dellherpes simplex di tipo 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2) - Virus della varicella-zoster (VZV) - Virus di Epstein-Barr (EBV) - Cytomegalovirus (CMV) - Herpesvirus umano di tipo 6 (HHV6) - Herpesvirus umano di tipo 7 (HHV7) - Herpesvirus umano di tipo 8 (HHV8) 9 Gli herpesvirus sono ubiquitari e le loro infezioni sono molto diffuse: - generalmente associati a malattie benigne (soprattutto nei bambini) - Possono tuttavia essere responsabili di elevata mortalit e morbilit, specialmente in individui immunodepressi. Il genoma di alcuni herpesvirus codica bersagli di agenti antivirali. La FDA, ha recentemente approvato un vaccino, costituito da virus vivo attenuato, contro VZV. Morfologia degli herpesvirus Gli herpesvirus sono virus di notevoli dimensioni: - hanno pericapside - Genoma a DNA ds - Il virione ha diametro di circa 150 nm, con morfologia caratteristica - Il core di DNA circondato da un capside icosadeltaedrico di 162 capsomeri da un pericapside glicoproteico Il genoma degli herpesvirus codica per numerose glicoproteine, necessarie per - adsorbimento - Fusione - Evasione della risposta immunitaria Corso di microbiologia - virologia 49 www.bluejayway.it 9 di scoperta recente, associato al sarcoma di Kaposi. Herpesvirus umani Capside icosadeltaedrico Pericapside DNA ds Herpesvirus umani Enrico Colombo Lo spazio compreso tra capside e pericapside detto tegumento: - contiene proteine e enzimi virali che favoriscono linizio della replicazione Come tutti i virus con pericapside, gli herpesvirus sono sensibili a: - acidi - Solventi - Detergenti - Essiccamento I genomi degli herpesvirus sono lineari, a doppio lamento, ma differiscono per dimensione e orientamento dei geni: - sequenze ripetute, dirette o invertite, delimitano regioni uniche del genoma - UL regione unica lunga - US regione unica breve - Tali regioni permettono la circolarizzazione del genoma e la sua ricombinazione - La ricombinazione tra sequenze ripetute e invertite di HSV, VZV e CMV permette che estese regioni del genoma invertano lorientamento reciproco dei segmenti genomici UL e US genomi isomerici. Replicazione degli herpesvirus Il ciclo replicativo degli herpesvirus inizia con linterazione tra glicoproteine virali e recettori presenti sulla supercie di cellule bersaglio: - il tropismo di alcuni herpesvirus limitato allespressione tessuto-specica dei recettori (esempio EBV) - Il pericapside si fonde con la membrana plasmatica libera il nucleocapside nel citoplasma. - Enzimi e fattori trascrizionali portati allinterno della cellula dal tegumento del virione. - Nucleocapside si attacca alla membrana nucleare genoma rilasciato nel nucleo trascritto e replicato La trascrizione del genoma di herpesvirus e la sintesi delle proteine si realizzano con una modalit coordinata e regolata, in 3 fasi: - sintetizzate le proteine precocissime () legano il DNA e regolano la trascrizione genica - Dopo le proteine precoci () ulteriori fattori trascrizionali ed enzimi, compresa la DNA polimerasi virale. - Dopo la replicazione, sono sintetizzate le proteine tardive () proteine strutturali Il genoma, trascritto dalla RNA-polimerasi DNA-dipendente cellulare, sotto il controllo di fattori virali e fattori nucleari cellulari: - interazione di tali fattori produzione di proteine necessarie allinfezione litica, latente o persistente. - Cellule che promuovono linfezione latente trascrivono una serie speciale di geni virali in assenza di replicazione del genoma - Nelle cellule che hanno infezione litica trascritti anche geni precoci () e tardivi (). La replicazione del genoma attuata da una DNA polimerasi virale bersaglio di farmaci antivirali. Gli enzimi virali di recupero dei nucleotidi forniscono i componenti alla polimerasi facilitano la replicazione dei virus che infettano cellule non in fase replicativa. I procapsidi si assemblano vuoti nel nucleo e sono riempiti di DNA virale acquisiscono il pericapside a livello della membrana nucleare o del Golgi fuoriescono per - esocitosi - Lisi cellulare Corso di microbiologia - batteriologia 50 www.bluejayway.it Il genere herpes simplex suddiviso in due tipi: - HSV-1 - HSV-2 Tali due tipi hanno in comune differenti caratteristiche, quali: - omologia del DNA - Determinanti antigenici - Tropismo tissutale - Sintomi della malattia Possono tuttavia, in base a minime, ma signicative, differenze allinterno di queste propriet generiche. Morfologia Il genoma di HSV codica almeno per 80 proteine: - met necessarie per la replicazione virale - Le altre intervengono in - Interazione tra virus e tipi di cellula ospite - Risposta immunitaria Il genoma di HSV codica per diversi enzimi, tra cui: - DNA-polimerasi DNA-dipendente - Enzimi di recupero dei nucleotidi - Desossiribonucleasi - Timidina chinasi fosforila i desossiribonucleotidi - Ribonucleotidi reduttasi converte i ribonucleotidi a desossiribonucleotidi. - Proteasi La specicit di substrato di questi enzimi e la DNA polimerasi differiscono in maniera signicativa dai loro analoghi cellulari rappresentano bersagli potenzialmente validi per la chemioterapia. Il genoma di HSV codica almeno 11 glicoproteine utilizzate come: - proteine virali di assorbimento (gB, gC, gD, gH) - Proteine virali di fusione (gB) - Proteine strutturali - Proteine per evitare il sistema immunitario (gC, gE e gI) - La componente C3 del complemento, ad esempio, si lega a gC eliminata dal siero. - Il complesso gE/gI lega la porzione Fc delle IgG maschera il virus e le cellule infettate dal virus riduce lefcacia degli anticorpi Replicazione HSV pu infettare la maggior parte delle cellule umane e anche di altre specie. Generalmente provoca: - infezioni litiche in: - broblasti - Cellule epiteliali - Infezioni latenti nei neuroni Corso di microbiologia - virologia 51 www.bluejayway.it HSV Capside icosadeltaedrico Pericapside Sintesi di DNA e capside nel nucleo Infezioni litiche e latenti Proteine anti-immunit Geni , e Herpes simplex virus HSV-1 si adsorbe velocemente e efcientemente alleparan-solfato (sulla supercie di molte cellule): - interagisce con recettori proteici della supercie cellulare - Per penetrazione deve interagire con la nectina-1 (HveC 10 ) - Molecola di adesione della famiglia Ig - Presente sulla maggior parte delle cellule e dei neuroni - Anche HveA un altro recettore utile per lingresso degli HSV - HSV penetra nella cellula ospite attraverso fusione del pericapside con la membrana cellulare - Poi il virione abbandona il capside nel citoplasma assieme a - una proteina che promuove linizio della trascrizione virale, - una chinasi virale - Proteine citotossiche - Il capside si attacca ad un poro nucleare rilasciato il DNA nel nucleo I prodotti dei geni precocissimi comprendono proteine leganti il DNA: - stimolano la sintesi di DNA - Inducono la trascrizione dei geni virali precoci In uninfezione latente, lunica regione ad essere trascritta la LAT, trascritti associati alla latenza tali mRNA non sono tradotti in proteine. Le proteine precoci includono: - DNA polimerasi - Timidina chinasi - Proteine che inibiscono la produzione e iniziano la degradazione del DNA e mRNA cellulari Lespressione dei geni tardivi e precoci morte litica della cellula. La replicazione ha inizio non appena viene sintetizzata la polimerasi: - il genoma assume inizialmente forme circolari e concatameriche testa-coda - Pi tardi nellinfezione, si replica attraverso un meccanismo a cerchio rotante lamento lineare di genoma. - I concatameri diventano singoli genomi quando sono incorporati in un procapside. La replicazione del genoma attivazione geni tardivi proteine strutturali e altre: - necessarie molte copie - Le proteine capsidiche sono trasportate nel nucleo assemblati i procapsidi vuoti inserito il DNA i capsidi si associano alla membrana nucleare gemmano fuori dal reticolo endoplasmatico citoplasma - Le glicoproteine virali sintetizzate e processate come quelle cellulari associate al procapside. - Le proteine del tegumento si associano al capside il capside gemma dal Golgi, acquisendo il pericapside glicoproteico. - Rilascio per - esocitosi o lisi cellulare - Diffusione a cellula adiacente - Formazione di sincizi Linfezione dei neuroni pu essere la conseguenza della replicazione virale o dellinstaurarsi della latenza, a seconda del tipo di geni virali che il neurone in grado di trascrivere: - solo LAT latenza - Geni precocissimi possibile replicazione. La timidina chinasi permette di sintetizzare i nucleotidi trifosfato necessari alla sintesi di genomi a DNA anche in cellule che non si replicano. Patogenesi e immunit I meccanismi patogenetici di HSV-1 e HSV-2 sono molto simili: - inizialmente, entrambi, infettano e si replicano in cellule mucoepiteliali generalmente causano malattia nel sito di infezione. - Stabiliscono uninfezione latente nei neuroni che innervano tali epiteli Alcune sono le differenze tra i due tipi di HSV: - HSV-1 associato ad infezioni nella parte superiore del corpo - HSV-2 associato ad infezioni nella parte inferiore del corpo - Causa viremia e sintomi sistemici inuenzali pi facilmente - Differiscono anche per caratteristiche di crescita e antigeniche HSV pu causare infezioni: - litiche: in molte cellule - Persistenti: in linfociti e macrofagi - Latenti: nei neuroni La citolisi il risultato di: - inibizione virus-indotta della sintesi delle macromolecole cellulari - Degradazione del DNA cellulare - Permeabilizzazione della membrana - Distruzione del citoscheletro Corso di microbiologia - batteriologia 52 www.bluejayway.it 10 Herpes virus entry C, mediatore C dellingresso degli herpes virus Si vericano cambiamenti nella struttura del nucleo delle cellule infette - Variazione della localizzazione della cromatina - Formazione di corpi inclusi intranucleari acidoli di Cowdry di tipo A. - Formazione di sincizi (non tutti i ceppi di HSV) In coltura cellulare infezione e citolisi rapida da HSV. Linfezione da HSV inizia: - attraversando le membrane mucose - Penetrando lesioni cutanee Il virus si riproduce nelle cellule basali della lesione: - infetta i neuroni innervanti raggiunge il ganglio per trasporto retrogrado. - Il virus ritorna nel sito iniziale di infezione e pu - rimanere inapparente - Causare lesioni vescicolari rilasciano liquido contenente virioni infettanti - Il danno tissutale causato da una combinazione di eventi virali patologici e immunopatologici. - Generalmente, la lesione si rimargina spontaneamente senza lasciare cicatrice. La progressione dellinfezione limitata dalle rispose innate: - interferone - Cellule NK La risposta citotossica dei linfociti T CD8 e associata a cellule T helper CD4 necessarie per uccidere le cellule infettate e guarire la malattia in atto: - gli effetti della risposta cellulo-mediata e inammatoria, sono tra le principali cause di sintomi. - Anticorpi contro le glicoproteine virale neutralizzano il virus extracellulare limitazione della diffusione - Senza immunit cellulare funzionale linfezione HSV pu diffondere al cervello e altri organi vitali. HSV ha differenti modi per eludere le difese dellospite: - blocca linibizione della sintesi di proteine virale indotta da IFN- - Codica per una proteina che blocca il trasportatore associato con il canale di passaggio (TAP) previene il trasferimento di peptidi nel RE blocca lassociazione della molecola MHC di classe I - Diffusione cellula-cellula (impedisce il riconoscimento anticorpale) - Il virione e le cellule infettate esprimono recettori per Fc degli anticorpi e per il complemento indebolite le difese umorali. Linfezione latente nei neuroni comporta danni non evidenziabili: - si pu avere riattivazione da vari stimoli (stress, traumi, febbre, esposizione alla luce solare) replicazione virale in una singola cellula nervosa consentono al virus di migrare a ritroso lungo il nervo lesioni a livello cutaneo o mucoso (sempre nello stesso sito) - Lo stress favorisce la riattivazione promuove la replicazione del virus nel nervo attraverso o momentanea depressione dellimmunit cellulo-mediata. Le infezioni ricorrenti sono generalmente meno gravi, pi localizzate e di minor durata rispetto agli episodi primari. Epidemiologia Il virus pu instaurare infezioni latenti con riattivazioni anche asintomatiche, dunque una persona infetta sorgente di contagio per tutta la vita: - HSV trasmesso nelle secrezioni e attraverso stretto contatto - Labile rapidamente inattivato dallessiccamento, dai detergenti e dalle condizioni dellapparato GI. - Malattia esclusivamente umana. HSV viene trasmesso con il mescolarsi e combinarsi di mucose infette: - liquido delle vescicole - Secrezioni vaginali Il sito di infezione, quindi la malattia, determinato in primo luogo da quali membrane mucose sono entrate a contatto. Entrambe i tipi di HSV possono causare lesioni: - orali - Genitali HSV-1 diffonde per: - contatto orale (bacio) - Uso in comune di bicchieri, spazzolini o altri oggetti contaminati da saliva. - Contatto bocca-cute delle mani o del corpo in cui il virus passa attraverso una lesione cutanea - Autoinoculazione negli occhi Linfezione da HSV-1 diffusa: - pi del 90% degli individui che vivono in PVS possiede gli anticorpi contro HSV-1 a 2 anni - Dato da sovraffollamento e scarse condizioni igieniche HSV-2 principalmente trasmesso per: - contatto sessuale - Autoinoculazione - Dalla madre infetta al glio durante il parto. Corso di microbiologia - batteriologia 53 www.bluejayway.it A seconda delle pratiche sessuali e delligiene dei singoli, HSV-2 pu infettare: - Tessuti genitali - tessuti anorettali - Orofaringe Lincidenza dellinfezione da HSV-2 genitale circa come HSV-1. HSV pu causare anche: - infezioni primarie o ricorrenti sintomatiche - Infezioni asintomatiche Linfezione neonatale pu essere acquisita con: - le secrezioni della cervice uterina durante il parto vaginale - Infezione uterina ascendente successiva ad uninfezione primaria della madre Linfezione neonatale ha gravi conseguenze malattia disseminata e neurologica. Linfezione primaria da HSV-2 si realizza in et pi avanzata rispetto a quella da HSV-1 ed correlata allaumento di attivit sessuale: - il 22% degli adulti in USA sono affetti da HSV-2 - Associato con il cancro alla cervice della donna probabilmente cofattore del papillomavirus. Sindromi cliniche HSV-1 e HSV-2 sono patogeni umani comuni che possono causare: - sindromi infettive con sintomatologia dolorosa, ma prognosi benigna - Malattia ricorrente. Malattie cutanee La manifestazione classica della lesione erpetica: - vescicola trasparente su base eritematosa - Si trasforma rapidamente in pustole e poi in ulcere si riveste di croste. Entrambi i virus, tuttavia, possono essere causa di mortalit e morbilit, qualora: - infettino locchio o il cervello - Provochino infezioni diffuse in pazienti immunocompromessi o neonati Lherpes orale pu essere causato da HSV-1 e HSV-2: - lesioni iniziano come vescicole chiare progrediscono in ulcere - Tali aree biancastre possono distribuirsi attorno alla bocca, - Possibile coinvolgimento di faringe, gengive, mucosa boccale e lingua La gengivostomatite erpetica primaria nei bambini quasi sempre dovuta a HSV-1. Un individuo pu essere soggetto a manifestazioni mucocutanee ricorrenti, anche senza aver avuto uninfezione primaria clinicamente evidente: - solitamente si presenta ai lati della bocca - Lesioni erpetiche facciali attivate da virus latenti nel ganglio del trigemino - I sintomi di un episodio ricorrente son - Meno gravi - Pi localizzati - Di breve durata rispetto allepisodio primario. La faringite erpetica sta diventando un episodio diffuso nei giovani adulti, con ulcere nella gola date da infezioni virali. In pazienti immunodepressi gravi stomatiti La cheratite erpetica quasi sempre limitata ad un solo occhio: - possibili episodi ricorrenti cicatrici permanenti danno corneale cecit Il virus pu penetrare attraverso tagli e abrasioni della cute, dando: - patereccio erpetico uninfezione delle dita - Spesso manifesto in personale sanitario che si occupano di pazienti con infezioni da HSV, oppure in bambini che succhiano il pollice o persone con infezioni genitali da herpesvirus - herpes dei gladiatori uninfezione del corpo, che spesso si contrae durante lotta a corpo nudo. Leczema erpetico viene contratto dai bambini con eczema attivo: Corso di microbiologia - batteriologia 54 www.bluejayway.it Epidemiologia di HSV MALATTIA/FATTORI VIRALI Produce infezione persistente per tutta la vita Malattia ricorrente fonte di contagio Pu essere eliminato in maniera asintomatica TRASMISSIONE Saliva, secrezioni vaginali, contatto con liquido delle lesioni. Trasmesso per via orale, sessuale, inoculazione oculare, contatto cutaneo. HSV1 generalmente per via orale, mentre HSV2, per via sessuale. A RISCHIO Bambini, soggetti sessualmente attivi, medici e personale ospedaliero (patereccio erpetico), immunocompromessi e neonati (malattia disseminata) GEOGRAFIA/STAGIONE Diffusione mondiale Tutto lanno CONTROLLO Farmaci antivirali Non disponibile un vaccino Guanti protettivi per il personale sanitario Astinenza dai rapporti sessuali per i pazienti con lesioni attive - malattia inapparente facilita la disseminazione su tutta la cute - Potenzialmente si trasmette ad altri organi Herpes genitale Lherpes genitale solitamente causato da HSV-2, ma anche HSV-1 pu esserne il responsabile: - maschio: lesioni sul glande o su tutto il pene. - Femmina: lesioni nella vulva, nella vagina, nella cervice, nellarea perianale o nellinterno-coscia. Accompagnate da prurito e secrezioni vaginali mucose. - Generalmente dolorose in entrambi i sessi - Linfezione primaria pu essere accompagnata da sintomi correlati alla viremia - Febbre - Malessere - Mialgia - Adenite inguinale La proctite lesioni alla parte terminale del retto e dellano. Gli episodi ricorrenti di herpes genitale: - durata e intensit minore rispetto al primario - 50% dei pazienti riattivazioni precedute da bruciore e formicolio nella zona delleruzione. - Possono vericarsi a distanza di 2-3 settimane o pi - Qualsiasi paziente infetto pu diffondere il virus in maniera asintomatica. Encefalite erpetica Lencefalite erpetica una malattia febbrile acuta, causata solitamente da HSV-1: - lesioni limitate a lobo temporale omolaterale - Virus e risposta immunitaria distruzione del lobo temporale - Comparsa di eritrociti nel liquor - Attacchi epilettici - Anomalie neurologiche focali Lherpesvirus la pi diffusa tra le cause di encefalite sporadica mortalit e morbilit elevata anche in pazienti trattati. La malattia non ha et e si manifesta in qualsiasi periodo dellanno Meningite da HSV La meningite da herpesvirus molto spesso una complicazione dellinfezione genitale da HSV-2 risoluzione spontanea. Infezione da HSV in neonati Linfezione neonatale da HSV una malattia devastante e spesso fatale: - causata spesso da HSV-2 contratta durante il passaggio attraverso il canale del parto infetto o dal personale ospedaliero - Il bimbo inizialmente appare settico, con possibili lesioni vescicolari - In assenza di una risposta cellulo-mediata ben sviluppata HSV invade il fegato, il polmone, il SNC e altri organi - Se linfezione raggiunge il sistema nervoso centrale causa - Morte - Ritardo mentale - Disabilit neurologica Diagnosi di laboratorio Test citologici e istologici Gli effetti citopatici caratteristici da herpesvirus possono essere identicati attraverso: - strisci di Tzanck raschiamento alla base della lesione - Strisci di Papanicolaou - Campioni bioptici Si possono osservare: - sincizi - Rigonamento del citoplasma - Corpi inclusi intranucleari di Cowdry tipo A Corso di microbiologia - batteriologia 55 www.bluejayway.it vescicola erpetica Herpes orale Gengivostomatite erpetica primaria Faringite erpetica Cheratite erpetica Patereccio erpetico (dita) Eczema eretico Herpes genitale Proctite Meningite (complicazione da infezione genitale di HSV-2) Malattia erpetica neonatale Malattie erpetiche Una diagnosi rapida e denitiva di HSV pu essere ottenuta attraverso dimostrazione di: - presenza di antigeni virali immunouorescenza o immunoperossidasi - Presenza di DNA virale ibridazione in situ con sonde speciche o PCR In encefaliti erpetiche sospette PCR del liquor Isolamento del virus Lisolamento del virus la prova denitiva per la diagnosi di infezione da HSV: - si pu ottenere dalle vescicole - Non si ottiene dalle lesioni rivestite di crosta Raccoglimento del campione aspirazione del liquido vescicolare o tampone di cotone alle vescicole. Colture cellulari (HeLa, HEp2, broblasti embrionali umani o cellule di rene di coniglio) HSV produce CPE entro 1-3 giorni: - ingrossamento e rigonamento delle cellule infette - Alcuni ceppi formazione di sincizi Una nuova tecnica di isolamento e identicazione linea cellulare che esprime una -galattosidasi in cellule infette da HSV (ELVIS 11 ): - aggiungendo un substrato appropriato produce un colore rilevazione dellenzima nelle cellule infette Per differenziare HSV-1 e HSV-2 e tipizzare entrambi i virus: - sonde di DNA speciche - Primer di DNA specici per PCR - Anticorpi Sierologia I test sierologici sono utili solo per la diagnosi di infezione primaria e per studi epidemiologici: - inutili per diagnosticare malattie ricorrenti - Generalmente, la riattivazione non accompagnata da un aumento del titolo anticorpale. Terapia, prolassi e controllo HSV codica numerosi enzimi bersaglio per la terapia antivirale. La maggior parte dei farmaci antierpetici costituita da: - analoghi nucleosidici - Inibitori della DNA polimerasi virale Il trattamento: - previene/riduce il decorso della malattia primaria o ricorrente - Non pu eliminare linfezione latente. Il prototipo tra i farmaci anti-HSV laciclovir: - presenti farmaci simili per meccanismo dazione, ma propriet farmacologiche differenti valaciclovir, penciclovir e famciclovir. - Cidofovir e adefovir attivi contro HSV, ma approvati solo per trattare CMV. Laciclovir (ACV) il farmaco pi prescritto tra gli anti-erpetici: - ACV attivato dalla timidina chinasi virale specico per cellule infette - Utilizzato dalla DNA polimerasi virale incorporato nel DNA previene lelongazione del DNA - ACV valaciclovir, penciclovir e famciclovir - Atossici - Efcaci nel trattamento di manifestazioni gravi della malattia da HSV e dei primi episodi di herpes genitale - Utilizzati anche per prolassi. La principale resistenza a questi farmaci - mutazione della timidina chinasi riduzione della conversione del farmaco nella forma attiva - Mutazione della DNA polimerasi virale HSV-1 trasmesso da una lesione microcutanea evitando il contatto diretto con le lesioni si riduce il rischio di infezione: - possono per esservi sintomi inapparenti virus pu essere trasmesso inconsapevolmente - Medici, infermiere e dentisti devono utilizzare precauzioni nel maneggiare tessuti o liquidi potenzialmente infetti. - Lutilizzo di guanti pu prevenire linfezione a livello delle dita (patereccio erpetico) - Il virus, lavandosi le mani con il sapone, rapidamente inattivato. Corso di microbiologia - batteriologia 56 www.bluejayway.it 11 sistema inducibile virale legato ad enzima Pazienti con infezione genitale da HSV devono astenersi da rapporti sessuali quando hanno sintomi prodromici o lesioni. Rapporti sessuali solo quando le lesioni si sono riparate Una donna in gravidanza con uninfezione da HSV attiva o che presenti rilascio a livello genitale nella fase terminale di gestazione: - pu trasmettere HSV al nascituro, se il parto avviene naturalmente - Prevenuta utilizzando il parto cesareo. Non sono ancora disponibili vaccini, ma in fase di studio. Herpesvirus umani (HSV) Morfologia e replicazione Grande capside icosadeltaedrico, Genoma a DNA ds Codicano molte proteine che controllano le risposte immuni dellospite Tre classi di prodotti genici precocissimi (fattori di trascrizione), precoci, tardivi (strutturali) Proteine di latenza (LAT) espresse in cellule neuronali Codicano enzimi (tra cui DNA polimerasi) che promuovono replicazione del DNA virale bersagli selettivi di farmaci anti-erpetici Replicazione del DNA e assemblaggio del capside nel nucleo Il virus gemma dalla membrana nucleare/golgi/rer rilasciato per lisi o esocitosi Gli herpesvirus producono infezioni litiche, persistenti e latenti Ubiquitario Controllato attraverso limmunit cellulo-mediata Patogenesi Malattia contratta per contatto diretto e dipende dal tessuto infetto (orale, genitale, cerebrale) Il virus produce citopatologia diretta Il virus pu attuare trasmissione cellula-cellula o formare sincizi evita gli anticorpi Il virus si riattiva dalla latenza per: - stress - Soppressione della risposta immunitaria - Cibo piccante, acido e allergie - Febbre - Radiazione UV Limmunit cellulo-mediata necessaria per la risoluzione. Gli anticorpi hanno ruolo limitato Limmunopatologia cellulo-mediata contribuisce ai sintomi. Epidemiologia Malattia e fattori virali - produce infezione persistente per tutta la vita - La malattia ricorrente fonte di contagio - Il virus pu essere eliminato in modo asintomatico Trasmissione Trasmesso attraverso saliva, secrezioni vaginali, contatto con liquido delle vescicole (mescolamento e combinazione di membrane mucose) Trasmesso per via orale e sessuale, per inoculazione oculare, soluzioni di continuo della cute. HSV1 prevalentemente orale, HSV2 prevalentemente sessuale. A rischio Bambini (HSV-1) e soggetti sessualmente attivi (HSV-2) Medici, infermieri, odontoiatri e persone a contatto con secrezioni orali e genitali possibili infezioni alle dita (patereccio erpetico) Immunocompromessi e neonati possibile malattia disseminata Ubiquitario e planetario Non c incidenza stagionale Controllo Disponibili farmaci antivirali Non disponibile un vaccino Il personale sanitario utilizzo guanti protettivi Pazienti con lesioni genitali attive non trombare Malattie Ulcere cutanee fredde, benigne, generalmente nella zona periorale e vicino alle labbra Possibile faringite erpetica nei giovani adulti Cheratite erpetica coinvolge un solo occhio Patereccio erpetico herpes alle mani Herpes dei gladiatori infezione da HSV che coinvolge tutto il corpo Herpes genitale lesioni erpetiche su glande o vulva/vagina Encefalite erpetica malattia febbrile acuta grave, causata da HSV-1. Distruzione del lobo temporale e comparsa di eritrociti nel liquor, attacchi epilettici, anomalie neurologiche focali. Meningite da HSV complicazione di infezione genitale, con risoluzione spontanea Infezione da HSV nei neonati devastante e spesso fetale disseminazione multiorgano con gravi danni al sistema nervoso centrale. Corso di microbiologia - batteriologia 57 www.bluejayway.it Diagnosi APPROCCIO ESAME/COMMENTO Esame microscopico diretto di cellule prelevate dalla lesione Striscio di Tzanck evidenzia sincizi e corpi inclusi di Cowdry tipo A Coltura cellulare HSV si riproduce e causa CPE nella maggior parte delle colture dopo 1-3 giorni. Test per la ricerca di antigeni di HSV su tessuto bioptico, striscio, liquor o liquido vescicolare Saggi immunoenzimatici, immunofluorescenza, ibridazione in situ con sonde di DNA, reazione PCR Identificazione del tipo di HSV Anticorpi tipo-specifici, mappa dei frammenti di DNA con enzimi di restrizione, profili proteici con gel-SDS, analisi con sonde di DNA e PCR Sierologia Utile per scopi epidemiologici e infezioni primarie Terapie Aciclovir, penciclovir, valaciclovir, famciclovir, adenosina arabinoside Iododeossiuridina Triuoridina Corso di microbiologia - batteriologia 58 www.bluejayway.it Il VZV causa: - varicella - La riattivazione della varicella produce lherpes zoster (detto fuoco di SantAntonio) Il virus della varicella-zoster ha molte caratteristiche in comune con HSV - capacit di stabilire uninfezione latente nei neuroni e malattia ricorrente a livello dei dermatomi innervati - Importanza dellimmunit cellulo-mediata per il controllo e la prevenzione di malattie gravi - Lesioni vescicolari caratteristiche - Codica una timidina chinasi sensibile ai farmaci antivirali Tali due virus, differiscono per la modalit di disseminazione VZV infetta le vie respiratorie e si trasmette per aerosol: - replicazione del virus nel tratto respiratorio - Fase viremica successiva - Formazione di lesioni cutanee su tutto il corpo. Morfologia e replicazione VZV ha il genoma pi piccolo tra gli herpesvirus umani: - replica pi lentamente di HSV - Ha minor tropismo cellulare - Si replica in broblasti umani diploidi in vitro, mentre in vivo si replica in - cellule epiteliali, - cellule dellepidermide - cellule T attivate - Come HSV pu stabilire infezione latente nei neuroni, ma in tali cellule possono essere rilevati molti RNA e molte proteine virali speciche 12 . Patogenesi e immunit VZV si acquisisce per inalazione: - infezione primaria nella mucosa del tratto respiratorio replicazione virale nel polmone maggiore fonte di contagio - Successiva diffusione attraverso sistema circolatorio e sistema linfatico al sistema reticolo endoteliale. - Si verica una viremia secondaria dopo 11-13 giorni il virus si diffonde in tutto il corpo no alla supercie cutanea - Il virus resta associato alle cellule trasmissione solo per interazione cellula-cellula - Solo nelle cellule epiteliali dei polmoni e nei cheratinociti cutanei si trasmette anche con lisi possono rilasciare il virus infettivo. - Causa un rash vescicolopustolare a livello del derma formazione successiva di croste. - Con leritema cutaneo si sviluppano febbre e sintomi sistemici. Dopo linfezione primaria, il virus entra il latenza nei gangli e nelle radici dorsali o dei nervi cranici: - pu essere riattivato negli anziani e in pazienti con immunit cellulare compromessa - Durante la riattivazione, si replica liberato lungo tutto il percorso delle terminazioni neurali infezione della cute rash vescicolare lungo lintero dermatomo (herpes zoster o fuoco di SantAntonio) Gli anticorpi limitano la diffusione viremica del VZV. Limmunit cellulo-mediata specica essenziale: - limita la progressione - Guarisce la malattia - In grave assenza di immunit cellulo-mediata malattia pi disseminata e grave e riattivata in caso di immunosoppressione. - Responsabile dei sintomi - Massiccia risposta immunitaria cellulo-mediata provoca danno cellulare pi esteso, specialmente a livello polmonare - Sviluppate manifestazioni pi gravi rispetto ai bambini. Corso di microbiologia - virologia 59 www.bluejayway.it 12 nelle infezioni da HSV si attivano i soli geni LAT Virus della varicella-zoster inoculazione del virus con aerosol replicazione nel tratto respiratorio fegato, milza, sistema reticolo-endoteliale via linfatica progressione delle vescicole: macule - papule - vescicole - pustole - croste viremia cute mucose latenza nei neuroni Epidemiologia VZV trasmesso con estrema facilit: - infezione supera il 90% nei contatti tra familiari sensibili - La malattia si diffonde principalmente attraverso la via respiratoria, ma anche per contatto con le vescicole cutanee. - I pazienti sono contagiosi prima e durante i sintomi. Lherpes zoster deriva dalla riattivazione del virus latente si sviluppa approssimativamente nel 10-20% della popolazione infetta con VZV: - (lincidenza aumenta con laumentare dellet) - Le lesioni dello zoster contengono virus infettivo sorgente di infezione da virus della varicella in persona non immune (bambino) Sindromi cliniche La varicella uno dei 5 classici esantemi infantili 13 : - causata da infezione primaria da VZV - Generalmente non grave e sintomatica - Possibile infezione asintomatica - Caratterizzata da - Febbre - Eritema maculopapulare Leritema appare dopo incubazione di 14 gg circa: - in poche ore, alla base di ciascuna lesione si forma una vescicola con pareti sottili, diametro 2-4 mm - In circa 12 ore la vescicola si trasforma in pustola e comincia ad incrostarsi assume laspetto di lesione crostosa Corso di microbiologia - batteriologia 60 www.bluejayway.it 13 i 5 esantemi infantili sono: rosolia, quinta e sesta malattia, morbillo e varicella. - Per 3-5 giorni compaiono gruppi di lesioni. In qualsiasi momento sono osservabili tutti gli stadi. Leritema generalizzato pi grave sul tronco che non allestremit: - visibile sul cuoio capelluto distintivo di altre malattie - Lesioni causano prurito e inducono il paziente a grattarsi possibile superinfezione batterica e formazione di cicatrici. - Lesioni mucosali si vericano in - Bocca - Congiuntiva - Vagina Linfezione primaria negli adulti pi grave rispetto a quella dei bambini: - nel 20-30% dei casi si verica anche polmonite interstiziale, che pu essere fatale - Dovuta alle reazioni inammatorie nel sito primario dinfezione giorni modificazioni patologiche del tratto respiratorio induzione da interferone risposta immunitaria cellulo- mediata virus nelle secrezioni respiratorie aumento degli anticorpi virus-specifici malattia sintomatica simil- influenzale infezione batterica secondaria incubazione convalescenz a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 3 7 3 7 3 7 3 7 4 3 7 4 3 8 7 4 3 8 7 3 8 7 3 8 7 3 8 3 8 5 4 3 5 4 3 6 5 4 3 6 5 3 6 5 6 5 6 5 6 6 6 6 6 giorni 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 Giorni replicazione virale nel fegato, milza, altri organi replicazione virale nei linfonodi febbre e vescicole contagiosit viremia secondaria incubazione viremia primaria Lherpes zoster rappresenta la riattivazione di uninfezione latente acquisita in precedenza: - solitamente dolore acuto dellarea innervata successivamente comparsa di lesioni simili a quelle della varicella - eritema generalmente limitato a un dermatomo (ricorda la varicella) - Una sindrome da dolore cronico detta nevralgia posterpetica pu persistere per mesi o anni - 30% dei pazienti over 65 con zoster Linfezione da VZV negli immunocompromessi o nei neonati pu portare a malattia grave, progressiva e potenzialmente fatale: - alterazioni nellimmunit-cellulo mediata aumentato rischio di disseminazione del virus ai polmoni, cervello e fegato - Si pu vericare in risposta a unesposizione primaria o a malattia ricorrente. Diagnosi di laboratorio Test citologici Leffetto citopatico caratteristico (CPE) in cellule infette da VZV simile a quello da HSV: - inclusi intranucleari di Cowdry di tipo A - Sincizi Tali cellule si trovano in: - lesioni cutanee - Campioni respiratori - Campioni di biopsie Strisci di Tzanck ottenuti da raschiamenti alla base delle vescicole visibili i sincizi e gli inclusi. Test con anticorpi uorescenti diretti contro antigeni di membrana utile per esaminare raschiamenti di lesioni cutanee o biopsie. Rilevamento di antigeni e PCR sensibili per la diagnosi di infezione da VZV. Corso di microbiologia - batteriologia 61 www.bluejayway.it Isolamento virale Lisolamento di VZV in colture cellulari non si esegue: - sensibile al trasporto - Replica con difcolt in vitro culture di materiale da lesioni cutanee incrostate (5 gg dallinizio) sono generalmente negative Fibroblasti umani diploidi, sono tuttavia permissivi per la replicazione di VZV esibiscono un CPE simile a quello in cellule infette da HSV. Sierologia I test sierologici che rilevano la presenza di anticorpi anti-VZV sono utilizzati per: - analisi della presenza di immunit per VZV Tuttavia, gli anticorpi hanno livelli molto bassi necessario utilizzare test quali: - immunouorescenza - Saggi immunoenzimatici (ELISA) Signicativo aumento del titolo riscontrato in individui con zoster. Terapia, prolassi e controllo Terapia consigliata a: - adulti immunocompromessi infetti da VZV - Persone con fuoco di SantAntonio Sconsigliata ai bambini con varicella. Approvati per il trattamento ACV, famciclovir, e valaciclovir: - la DNA polimerasi di VZV meno sensibile a quella degli HSV necessarie dosi maggiori di ACV o la maggiore farmacodinamica di famciclovir e valaciclovir. - Analgesici e antidolorici riescono a dare sollievo in caso di nevralgia posterpetica Come per altri virus respiratori controllo di VZV molto difcile: - nei bambini linfezione ha decorso clinico che si evolve spontaneamente induce immunit permanente per la vita si favorisce lesposizione nella prima infanzia - Le persone ad alto rischio (es immunosoppressi) dovrebbero esser protetti dall'esposizione a VZV La malattia dovrebbe essere prevenuta nei pazienti immunosoppressi somministrazione di Immunoglobuline anti-varicella-zoster (VZIG): - previene diffusione viremica - Inefcace come terapia per pazienti che soffrono di varicella informa attiva o malattia da herpes-zoster. Negli USA e in altri paesi attivo un vaccino contro il virus vivo attenuato per VZV somministrato dopo i 2 anni di et con le stesse modalit dei vaccini per morbillo, parotite e rosolia: - induce immunit umorale e cellulare - Efcace nella prolassi anche dopo esposizione - Induce protezione anche nei bambini immunodepressi - Utile la vaccinazione di persone adulte anziane previene il fuoco di SantAntonio. Corso di microbiologia - batteriologia 62 www.bluejayway.it Virus varicella-zoster (VZV) Morfologia e replicazione Grande capside icosadeltaedrico, Genoma a DNA ds Codicano molte proteine che controllano le risposte immuni dellospite Esprime pi mRNA e proteine nelle cellule latenti nel sistema nervoso Codicano enzimi (tra cui DNA polimerasi) che promuovono replicazione del DNA virale bersagli selettivi di farmaci anti-erpetici Replicazione del DNA e assemblaggio del capside nel nucleo Il virus gemma dalla membrana nucleare/golgi/rer rilasciato per lisi o esocitosi solo in polmoni e cheratinociti delle lesinoi Controllato attraverso limmunit cellulo-mediata Patogenesi Iniziale replicazione nel tratto respiratorio VZV infetta le cellule epiteliali, i broblasti e i linfociti T attivati. Infezione latente nei neuroni. VZV forma sincizi e diffonde da cellula a cellula Diffonde attraverso il sangue/linfa alla cute lesioni ad ondate successive Pu sfuggire agli anticorpi necessaria immunit cellulo-mediata per controllare linfezione infezioni disseminate gravi/fatali in immunocompromessi Il virus stabilisce la latenza nei neuroni (radici dorsali dei nervi cranici) Lherpes zoster una malattia ricorrente deriva dalla replicazione virale lungo lintero dermatomo Lherpes zoster pu risultare dalla depressione dellimmunit cellulare e da altri meccanismi di attivazione virale Epidemiologia Malattia e fattori virali - produce infezione persistente per tutta la vita - La malattia ricorrente fonte di contagio Trasmissione Trasmesso prevalentemente per aerosol. Possibile il contatto diretto con pustole A rischio Bambini in et 5-9 anni: malattia classica lieve Adolescenti e adulti forme pi gravi con potenziale polmonite Pazienti immunocompromessi e neonati: rischio per polmonite fatale, varicella disseminata progressiva ed encefalite Anziani e immunocompromessi herpes zoster ricorrenti Controllo Disponibili farmaci antivirali Immunit pu scomparire negli anziani Somministrazione di Ig anti-VZV disponibili per immunocompromessi, persone esposte, neonati di madri con sintomi entro 5 gg dalla nascita. Disponibile un vaccino con virus vivo (ceppo Oka) per bambini a 2 anni. Malattie Varicella dopo 14 gg di incubazione, comparsa di vescicole sottili, che dopo 12 h diventano croste. Diffusione di eritema vescicoloso e crostoso per 5 giorni. Herpes zoster riattivazione della varicella, generalmente localizzata e pruriginosa, con vescicole simili. Diagnosi APPROCCIO ESAME/COMMENTO Esame microscopico diretto di cellule prelevate dalla lesione Striscio di Tzanck evidenzia sincizi e corpi inclusi di Cowdry tipo A Coltura cellulare Scarsamente utilizzata Test per la ricerca di antigeni di VZV su tessuto bioptico, striscio, liquor o liquido vescicolare Saggi immunoenzimatici, immunofluorescenza, ibridazione in situ con sonde di DNA, reazione PCR Sierologia Utile per scopi epidemiologici Terapie Aciclovir, penciclovir, valaciclovir, famciclovir, Immunoglobuline anti-varicella-zoster (VZIG) Plasma immune zoster (ZIP) Vaccino con virus vivo per bambini Corso di microbiologia - batteriologia 63 www.bluejayway.it EBV evoluto no a diventare un parassita estremo dei linfociti B: - scoperto in linfomi a cellule B (linfoma di Burkitt africano - AfBL) - Associato alla mononucleosi infettiva - mitogeno immortalizza le cellule B in coltura EBV causa la mononucleosi infettiva positiva per anticorpi eteroli ed stato associato con - linfoma di Burkitt endemico - Malattia di Hodgkin - Carcinoma nasofaringeo - Linfomi a cellule B in pazienti con immunodepressione acquisita o congenita Morfologia e replicazione EBV ha uno spettro dospite ristretto e un tropismo tissutale denito dalla limitata espressione del suo recettore - riconosce il recettore per C3d (CR2) espresso su - Linfociti B - Cellule epiteliali del nasofaringe e dellorofaringe - Utilizza la molecola MHC di classe II come corecettore. Linfezione da EBV ha 3 potenziali decorsi: - pu replicare nelle cellule B o nelle cellule epiteliali permissive - Pu determinare uninfezione latente delle cellule B in presenza di cellule T competenti - Pu stimolare e immortalizzare le cellule B EBV codica per pi di 70 proteine espressi differenti gruppi di proteine per differenti infezioni. Le cellule epiteliali e le cellule B permissive permettono la trascrizione e la traduzione della proteina attivatrice trascrizionale ZEBRA attiva i geni precocissimi e il ciclo litico. - sintesi della DNA polimerasi e replicazione del DNA - Successivamente sintesi del capside virale e delle glicoproteine correlate (la glicoproteina virale di adsorbimento gp350/220, e gp85) - Le proteine virali prodotte durante uninfezione litica sono denite sierologicamente e raggruppate come - Antigene precoce (EA) - Antigene capsidico virale (VCA) - Glicoproteine dellantigene di membrana (MA). Durante uninfezione non permissiva delle cellule B, queste hanno un piccolo numero di genomi di EBV circolari simili ai plasmidi, che replicano solo durante la divisione cellulare: - geni virali espressi selettivamente in relazione allo stato della cellula B - Antigeni nucleari di Epstein-Barr (EBNA) 1, 2, 3A, 3B, 3C - Proteine latenti (LP) - Proteine latenti di membrana (LMP) 1 e 2. - Due piccoli RNA detti EBER-1 e EBER-2 - EBNA e LP sono proteine leganti il DNA essenziali per determinare e mantenere - EBNA-1 infezione - EBNA-2 immortalizzazione - LMP sono proteine di membrana ad attivit simile a quella degli oncogeni stimolano la crescita e immortalizzano le cellule B EBV stabilisce una latenza nelle cellule B di memoria, il cui sono espressi solo EBNA-1 e LMP-2: - genoma conservato nelle cellule - Minima probabilit di riconoscimento immunologico. INFEZIONE ANTIGENI ESPRESSI Litica (permissiva) di cellule B e cellule epiteliali del nasofaringe e dellorofaringe EA, VCA, MA Non permissiva di cellule B EBNA, LP, LMP Latente in cellule B memoria EBNA-1, LMP-2 Corso di microbiologia - virologia 64 www.bluejayway.it Epstein-Barr virus Virus con pericapside DNA ds lineare Recettore: CR2 del complemento (C3d) Le cellule epiteliali e linfociti B permissivi permettono di trascrivere la proteina ZEBRA infezione litica ZEBRA non trascritta infezioni latenti o immortalizzazione delle cellule Virus di Epstein-Barr Patogenesi e immunit EBV si adattato alle cellule B umane: - manipola e utilizza le fasi dello sviluppo della cellula B per - stabilire uninfezione che dura tutta la vita - promuovere la sua trasmissione - La malattia da EBV pu risultare in - Mononucleosi risposta immunitaria iperattiva - Linfoma e leucoplachia a cellule capellute mancanza di controllo immunitario efcace Linfezione produttiva delle cellule B e delle cellule dellorofaringe (tonsille): - liberazione del virus nella saliva trasmette il virus ad altri ospiti - Viremia diffusione del virus ad altre cellule B nel tessuto linfatico e nel sangue Le proteine di EBV: - attivano la crescita delle cellule B - Prevengono lapoptosi Le cellule T controllano solitamente linfezione: - assenza di cellule T EBV pu immortalizzare le cellule B linee di cellule linfoblastoidi B - In vivo attivazione e proliferazione di cellule B possono essere segnalate dalla produzione spuria di un anticorpo IgM diretto contro lantigene di Paul Bunnel (anticorpo eterolo) Proliferazione continua della cellula B + cofattori possibile sviluppo di linfomi. In uninfezione produttiva, lanticorpo inizialmente prodotto contro i componenti del virione, VCA e MA e poi contro EA: - dopo la guarigione dellinfezione prodotto anticorpo contro antigeni nucleari (EBNA) Le cellule T sono essenziali per: - limitare la proliferazione delle cellule B infettate da EBV - Controllare la malattia EBV contrasta alcune risposte protettive delle cellule TH1: - produce un analogo dellIL-10 14 inibizione delle cellule TH1 - Stimola la crescita incontrollata delle cellule B La mononucleosi infettiva il risultato di una guerra tra cellule B infettate da EBV e cellule T protettive: - le cellule T sono circondate da cellule B infette e attivate da peptidi antigenici virali presentati su entrambe le molecole di MHC (classe I e II) - Liperattivazione e proliferazione di cellule T causa - Linfocitosi classica aumento delle cellule mononucleate - Ingrossamento degli organi linfoidi (fegato, linfonodi e milza) - Malessere - Le cellule T - appaiono come linfociti atipici (cellule di Downey) - aumentano di numero nel sangue periferico durante la seconda settimana (+ 10-80%) Bambini risposta immunitaria meno attiva EBV malattia pi lieve Il virus persiste in almeno una cellula B memoria/ml di sangue per tutta la vita : - EBV pu essere riattivato quando viene riattivata la cellula B memoria Pu essere liberato nella saliva Epidemiologia Il virus di Epstein-Barr trasmesso attraverso la saliva: - pi del 90% dei soggetti infettati da EBV, anche se asintomatici, rilascia il virus in maniera intermittente durante la vita - Bambini possono acquisire linfezione precocemente, condividendo bicchieri contaminati generalmente presentano infezione subclinica. - Adolescenti e adulti trasmissione attraverso il bacio - La malattia pu essere subclinica o avere manifestazioni a diversa gravit - Circa il 70% della popolazione USA infettata entro i 30 anni. La distribuzione geograa di alcune neoplasie EBV-associate indica una possibile associazione con cofattori: - immunosoppressivo della malaria pu essere cofattore nella progressione da infezione cronica/latente da EBV AfBL - Meccanismi pi sosticati possono facilitare il ruolo di EBV nel 30-50% dei casi di Linfoma di Hodgkin. Pazienti trapiantati, affetti da AIDS e immunodecienti alto rischio per sviluppo di disordini linfoproliferativi da EBV: - possono evidenziarsi come linfomi policlonali e monoclonali di cellule B - Alto rischio per lo sviluppo di infezioni come leucoplachia orale a cellule capellute. Corso di microbiologia - batteriologia 65 www.bluejayway.it 14 IL-10 ha funzione di spegnimento delle risposte T Sindromi cliniche Mononucleosi infettiva positiva per anticorpo eteroli La mononucleosi si presenta con la classica triade sintomatologica: - linfoadenopatia: ghiandole ingrossate - Splenomegalia: milza ingrandita - Faringite essudativa associata a febbre elevata, malessere e epatosplenomegalia - Sintomi correlati - Possibile eritema dopo trattamento con ampicillina - Astenia 15
La malattia raramente letale nei soggetti sani: - nei bambini pi lieve che negli adulti - Pu presentare gravi complicazioni risultanti da - Alterazioni neurologiche - Ostruzione laringea - Rottura splenica - Meningoencefalite - Sindrome di Guillain-Barr Sindromi simil-mononucleosi possono anche essere causate da: - CMV - HHV-6 - Toxoplasma gondii - HIV Malattia cronica Il virus di Epstein-Barr, in alcuni pazienti, pu causare una malattia ricorrente ciclica: - stanchezza cronica - Febbricola - Cefalea - Faringodinia Tale sindrome deve essere differenziata da quella da affaticamento cronico. Disordini linfoproliferativi indotti da EBV In soggetti privi di immunit cellulo-mediata EBV causa una malattia proliferativa delle cellule B, tipo leucemia policlonale: - pu essere letale, con rischio di sviluppare linfomi - Decit genetico nella funzione delle cellule T patologia detta malattia linfoproliferativa X-linked - decit della proteina SLAM, associata allattivazione del linfocita T - impedisce che la cellula T controlli la crescita delle cellule B durante una risposta immunitaria normale indotta da un antigene o dallEBV - Trapiantati o immunosoppressi rischio di disordini linfoproliferativi post-trapianto a seguito di esposizione ad EBV Il linfoma di Burkitt africano (linfoma endemico) un linfoma monoclonale di cellule B della mandibola e del viso poco differenziato: - Endemico nei bambini in paesi dove presente la malaria - Le cellule tumorali contengono le sequenze di DNA di EBV esprimono solo lantigene virale EBNA-1 - Le cellule tumorali contengono anche traslocazioni cromosomiche giustapposto loncogene c-myc ad un promotore molto attivo (es quello dei locus Ig) - Le cellule tumorali sono invisibili al sistema immunitario privilegiate Molti linfomi di Hodgkin sono associati ad EBV. Il carcinoma nasofaringeo endemico in Asia: - negli adulti - Le cellule tumorali contengono EBV-DNA - Le cellule di origine sono epiteliali Leucoplachia orale a cellule capellute La leucoplachia orale a cellule capellute una presentazione rara dellinfezione da Epstein-Barr virus: - infezione produttiva da cellule epiteliali - Caratterizzata da lesioni orali - Infezione opportunistica in pazienti con AIDS. Diagnosi di laboratorio La mononucleosi infettiva indotta da EBV diagnosticata in base a: Corso di microbiologia - batteriologia 66 www.bluejayway.it 15 mancanza di forze - sintomi - Linfocitosi - Linfociti atipici - Anticorpi eteroli - Anticorpi diretti contro antigeni virali. La diagnosi di infezione viene eseguita attraverso: - analisi con sonde di DNA e RNA - Immunouorescenza per identicare gli antigeni virali I linfociti atipici sono probabilmente il segno pi precoce di infezione da EBV compaiono allesordio dei sintomi e scompaiono con la guarigione. Gli anticorpi eteroli derivano dallattivazione aspecica delle cellule B da parte di EBV: - agisce come un mitogeno ampia produzione di anticorpi - Tra gli anticorpi Anticorpo eterolo IgM, che riconosce lantigene di Paul- Bunnell sugli eritrociti di pecora, cavallo e bovino. - La risposta anticorpale eterola evidenziabile alla ne della prima settimana di malattia permane per mesi buon marker di infezione negli adulti (non x bambini) - Diagnosticato attraverso - Test su cellule di cavallo - ELISA I test sierologici per anticorpi contro antigeni virali + specici rispetto agli anticorpi eteroli per confermare la diagnosi da infezione di EBV: - identicabile da uno dei seguenti reperti - IgM contro VCA - Ig contro VCA e assenza di anticorpi contro EBNA - Aumento di anticorpi contro VCA e antigeni precoci - La presenza di anticorpi sierici contro VCA e EBNA indice di infezione contratta tempo addietro. - La produzione di anticorpi contro EBNA richiede la lisi indica controllo da parte dei linfociti T. CONDIZIONE CLINICA DEL PAZIENTE ANTICORPI ETEROFILI ANTICORPI SPECIFICI CONTRO EBV ANTICORPI SPECIFICI CONTRO EBV ANTICORPI SPECIFICI CONTRO EBV ANTICORPI SPECIFICI CONTRO EBV CONDIZIONE CLINICA DEL PAZIENTE ANTICORPI ETEROFILI VCA-IGM VCA-IGG EA EBNA Suscettibile - - - - - Infezione primaria acuta + + +/- - - Infezione primaria cronica - + + - - Infezione pregressa - + - + - Infezione riattivata - + + + EA limitato o diffuso Linfoma di Burkitt - + + + EA solo limitato Carcinoma nasofaringeo - + + + EA solo limitato Corso di microbiologia - batteriologia 67 www.bluejayway.it Markers di infezione da EBV NOME ABBREVIAZIONE CARATTERISTICHE ASSOCIAZIONE BIOLOGICA ASSOCIAZIONE CLINICA Antigeni nucleari EBNAs Nucleare EBNA sono antigeni non strutturali e i primi a comparire; presenti in tutte le cellule infette e trasformate; legano il DNA Anticorpi anti-EBNA si sviluppano tardivamente nellinfezione. Indice di controllo da parte dei linfociti T Antigene precoce EA-R Solo citoplasmatico EA-R appare prima di EA-D; la sua comparsa segno dellentrata delle cellule infettate nel ciclo litico Anticorpi anti-EA-R sono presenti nel linfoma di Burkitt EA-D Citoplasma e nucleo Anticorpi anti-EA-D sono presenti nel linfoma di Burkitt Antigene capsidico virale VCA Citoplasmatico VCA un antigene tardivo, presente nelle cellule producenti virus Anticorpi IgM anti-VCA sono transitori; IgG anti-VCA sono persistenti Antigene di membrana definito per i linfociti LYDMA Non presente in cellule di linfoma di Burkitt. Presente nelle cellule infettate in vitro e in cellule non produttive Non rilevabile da anticorpi Antigene di membrana MA Superficie cellulare MA sono le glicoproteine del pericapside Come VCA (anticorpi IgM precoci e transitori, IgG persistenti) Anticorpi eterofili Evidenziabili dallantigene di Paul-Bunnel su eritrociti di pecora, cavallo o bovino La proliferazione delle cellule B indotta da EBV promuove la produzione di anticorpi eterofili Sintomi precoci sono presenti in circa il 50% dei pazienti Terapia, prolassi e controllo Non disponibili vaccino e terapia. Diffusione ubiquitaria del virus e potenziale diffusione asintomatica impossibile controllare linfezione. Linfezione induce immunit per tutta la vita per prevenire la mononucleosi infettiva il miglior modo esporsi ai virus nei primi anni di vita: - nellinfanzia infezione benigna Epstein-Barr virus Morfologia e replicazione Grande capside icosadeltaedrico, Genoma a DNA ds Recettore per C3d del complemento (CR2) sui linfociti B e sulle cellule epiteliali dellorofaringe e nasofaringe. Codicano enzimi (tra cui DNA polimerasi) che promuovono replicazione del DNA virale bersagli selettivi di farmaci anti-erpetici Controllato attraverso limmunit cellulo-mediata Infezioni produttive prodotti antigene precoce (EA), antigene capsidico virale (VCA) e glicoproteine dellantigene di membrana (MA) Infezioni non permissive EBNA1, 2, 3a, 3b, 3c (antigeni nucleari di Epstein-Barr), LP (proteine latenti) e LMP (proteine latenti di membrana) Patogenesi Infetta le cellule B e ne manipola le differenti fasi dello sviluppo Le manifestazioni cliniche possono essere determinate: - risposta immunitaria iperattiva mononucleosi Corso di microbiologia - batteriologia 68 www.bluejayway.it - Mancanza di efcace controllo immunitario linfoma e leucoplachia a cellule capellute. Linfezione produttiva delle cellule B e delle cellule epiteliali orofaringee liberazione del virus nella saliva e viremia. Linfezione solitamente controllato dalle cellule T se mancano EBV pu immortalizzare le cellule linfomi a cellule B, carcinomi orofaringei Mononucleosi mostra linfocitosi, epatosplenomegalia faringite con febbre. EBV contrasta le cellule T producendo un analogo di IL-10. Epidemiologia Infezione persistente che dura tutta la vita Infezioni ricorrenti sono fonte di contagio Pu essere eliminato in odo asintomatico Trasmissione attraverso la saliva, ma anche contatti stretti o condivisione di oggetti (es bicchieri e spazzolini) A rischio - bambini infezione asintomatica o con lievi sintomi - Adolescenti e adulti mononucleosi infettiva - Immunocompromessi malattie neoplastiche fatali La mononucleosi infettiva diffusa in tutto il mondo. Il linfoma di Burkitt associato ale regioni africane in cui la malattia endemica Non c incidenza stagionale. Malattie Mononucleosi lieve nei bambini, sintomi febbre, linfoadenopatia e epatosplenomegalia, faringite, malessere e affaticamento. Durante la malattia il virus nella saliva. Linfoma di Burkitt linfoma a cellule B endemico, DNA virale di EBV integrato, traslocazione delloncogene c-myc in locus Ig. Carcinoma nasofaringeo endemico in Asia Leucoplachia orale a cellule capellute infezione produttiva caratterizzata da lesioni orali, opportunistica in affetti da AIDS Diagnosi Diagnosi di mononucleosi: - sintomi - Ritrovamento di linfociti atipici - Linfocitosi - Anticorpi eteroli comprendono un anticorpo ce riconosce lantigene di Paul-Bunnel su eritrociti di pecora, cavallo e bovino. Marker afdabile per gli adulti. Riconosciuti con ELISA e test su cellule di cavallo. - Test sierologici per anticorpi contro antigeni virali Non utilizzato lisolamento virale Diagnosi di infezione eseguita con sonde genetiche di DNA e RNA o immunouorescenza per identicare gli antigeni virali. Trattamento, prevenzione e controllo Nessun vaccino Nessuna terapia Difcile controllo Linfezione da protezione se contratta da bambini molto lieve
Corso di microbiologia - batteriologia 69 www.bluejayway.it Il Cytomegalovirus (CMV) un patogeno comune per luomo: - infetta lo 0,5-2,5% di tutti i neonati - Circa il 40% delle donne che afferiscono agli ambulatori di malattie sessualmente trasmesse. - la causa pi comune di difetti congeniti - Malattia lieve o asintomatica in bambini o adulti sani - Importante patogeno opportunista negli immunocompromessi. Morfologia e replicazione Cytomegalovirus considerato un virus linfotropico: - ha il genoma pi grande tra gli herpesvirus umani (contiene DNA lineare ds) - Contiene sia DNA che RNA, nel senso che il CMV trasporta mRNA nella cellula facilita linfezione - Si replica solo in cellule umane - Permissive broblasti, cellule epiteliali, macrofagi e altre - Infezioni latenti linfociti mononucleati, cellule stromali del midollo osseo e altre Patogenesi e immunit La patogenesi dellinfezione da CMV simile a quella degli altri herpesvirus sotto molti aspetti: - eccellente parassita instaura rapidamente infezioni latenti e persistenti, piuttosto che infezioni diffusamente litiche - Fortemente associato alle cellule diffonde a tutto lorganismo in cellule infettate, soprattutto linfociti e leucociti. - attivato da - immunosoppressione: corticosteroidi, infezione da HIV, ecc - stimolazione allogenica: esempio la risposta dellospite a cellule trapiantate. Per controllo e guarigione da CMV immunit cellulo-mediata: - il CMV ha diverse strategie di evasione: - Altera la funzione di linfociti e leucociti - Previene la presentazione dellantigene sia per le cellule T CD4 che CD8 - Inibisce la presentazione di MHC-I - Interferisce con la presentazione delle molecole MHC di classe II indotta da citochine dalle APC - Una proteina virale blocca lattacco delle cellule NK alle cellule infettate da CMV - Produce un analogo di IL-10 16 inibite risposte TH1 GRUPPO DI ET FONTE DI CONTAGIO Neonati Trasmissione transplacentare, infezioni intrauterine, secrezioni cervicali, trasfusione Bambini Secrezioni corporee: latte materno, saliva, lacrime, urine Adulti Trasmissione sessuale (liquido seminale o secrezioni vaginali), trasfusione, trapianto dorgano Epidemiologia e sindromi cliniche Nella maggior parte dei casi il virus si replica ed eliminato, senza causare sintomi clinici. Lattivazione e la replicazione di CMV nel rene e nelle ghiandole secretorie promuove la sua secrezione nelle urine e nei liquidi corporei. isolato in: - urine - Sangue - Saliva - Gargarizzato - Lacrime - Latte materno - Sperma Corso di microbiologia - virologia 70 www.bluejayway.it 16 funzione presente anche in EBV Cytomegalovirus - Feci - Liquido amniotico - Secrezioni vaginali e cervicali - Tessuti utilizzati per trapianti. Le vie di trasmissione da CMV sono: - orale - Sessuale - Congenita - Trasfusione o trapianto La malattia da CMV un disordine opportunistico: - raramente sintomi in pazienti immunocompetenti - Grave malattia in persone immunodecienti. TESSUTO BAMBINI E ADULTI IMMUNOSOPPRESSI Presentazione predominante Asintomatico Malattia disseminata grave Occhi - Retinite Polmoni - Polmonite Tratto gastroenterico - Esofagite, colite, gastroenterite Sistema nervoso Polinevrite, mielite Meningite, encefalite, mielite Sistema linfatico Sindrome mononucleosica negativa per anticorpi eterofili, sindrome post-trasfusionale Leucopenia, linfocitosi Organi maggiori Cardite, epatite (complicanze di mononucleosi o sindromi post-trasfusionali) Epatite Neonati Sordit, calcificazione intracerebrale, microcefalia, ritardo mentale Infezione congenita Cytomegalovirus la causa pi frequente di malattia virale congenita: - Affetti lo 0,5-2,5% dei neonati negli USA - Ampia percentuale di bambini infettata entro i primi mesi di vita - Circa il 10% di questi neonati infetti ha segni clinici di malattia - Piccole dimensioni - Trombocitopenia - Microcefalia - Calcicazioni intracerebrali - Ittero - Epatosplenomegalia - Eritema - Sequele comuni da infezione di CMV congenita sono anche - Sordit mono- o bilaterale - Ritardo mentale - Rischio elevato nei bambini nati da madri che hanno contratto infezioni primarie da CMV durante la gravidanza. I feti sono infettati: - infezione primaria: dal virus presente nel sangue materno - Dopo riattivazione: durante il parto dal virus proveniente dalla cervice. I sintomi dellinfezione congenita sono meno gravi o possono essere prevenuti dalla risposta immune della madre sieropositiva. Infezione perinatale Negli USA, circa il 20% delle donne gravide ha CMV nella cervice al termine della gravidanza - probabile riattivazione dellinfezione al termine della gravidanza - Circa il 50% dei neonati da madre infetta acquisisce linfezione la elimina dopo 3-4 settimane di vita - possibile che i neonati la contraggano anche dal latte materno. - Linfezione perinatale non provoca malattia clinicamente evidente nei neonati sani a termine. I neonati possono acquisire linfezione da CMV anche attraverso trasfusioni: - il 13,5% dei bambini sieronegativi esposti al sangue di donatori sieropositivi acquisisce linfezione in periodo postnatale - In neonati prematuri che acquisiscono linfezione da sangue infetto i segni clinici sono - Polmonite - Epatite Infezione in bambini e adulti Solo il 10-15% degli adolescenti infetto da CMV, ma la percentuale aumenta no a 50-85% nei primi 40 anni: - CMV pi diffuso tra individui di modesta classe socioeconomica (aree sovraffollate) - CMV uninfezione a trasmissione sessuale il titolo di CMV maggiore nello sperma piuttosto che in tutti gli altri uidi corporei. Corso di microbiologia - batteriologia 71 www.bluejayway.it Maggior parte delle infezioni nelladolescenza asintomatica. Alcune pazienti (donne) possono presentare una sindrome mononucleosica negativa per gli anticorpi eteroli: - sintomi simili allinfezione da EBV, ma - Faringite meno grave - Linfoadenopatia pi contenuta - Linfezione da CMV promuove linfocitosi atipica simile a EBV, ma non sono presenti gli anticorpi eteroli. - Riette le differenze di meccanismo patogenetico e bersaglio cellulare Trasmissione attraverso trasfusione e trapianto La trasmissione di CMV attraverso sangue trasfuso generalmente non causa una sintomatologia clinica evidente - possibile sindrome siml-mononucleosica febbre, splenomegalia e linfocitosi dopo 3-5 settimane dalla trasfusione. CMV pu essere trasmesso anche con il trapianto dorgano riattivazione durante intensa terapia immunosoppressiva. Infezione nel paziente immunocompromesso CMV prevalentemente un agente infettivo opportunista in immunocompromessi, causa - malattia primaria sintomatica - malattia ricorrente La malattia del polmone da CMV, detta pneumopatia e polmonite una manifestazione comune in immunocompromessi: - pu essere fatale se non trattata CMV provoca anche: - retinite in pazienti con AIDS o immunodecienze gravi - Polmonite interstiziale - Encefalite - Colite e esofagite si sviluppano nel 10% dei pazienti con AIDS - Sintomi gastrointestinali febbre, anoressia, diarrea e perdita di peso. Il CMV anche responsabile del fallimento di trapianti di rene replicazione virale dopo riattivazione nel rene trapiantato. Diagnosi di laboratorio Istologia La caratteristica istologica dellinfezione da cytomegalovirus la cellula citomegalica: - cellula ingrandita - Contiene uninclusione intranucleare densa, basola a occhio di gufo. Cellule reperibili in ogni tessuto e nelle urine e paiono cellule epiteliali. Visibili con colorazioni: - ematossilina-eosina - Papanicolaou Corso di microbiologia - batteriologia 72 www.bluejayway.it Cellula ingrandita Contiene una voluminosa inclusione intranucleare: - densa - Basola - A occhio di gufo Cellula citomegalica Tecniche immunologiche e sonde di DNA Una diagnosi rapida e sensibile pu essere ottenuta mediante il rilevamento - di antigene virale immunouorescenza o ELISA - Di genoma virale PCR o tecniche molecolari Tale rilevamento pu partire da campioni di cellule, di biopsia, sangue, broncolavaggio o urine. Esame colturale CMV cresce solo in colture cellulari di broblasti diploidi: - necessita di 4-6 settimane per lo sviluppo del caratteristico CPE CPE lento a manifestarsi se il titolo virale molto basso - Lisolamento di CMV utile in pazienti immunocompromessi hanno titoli virali elevati Si possono ottenere risultati pi rapidi attraverso centrifugazione del paziente sulle cellule cresciute su un vetrino copri oggetto i campioni sono esaminati attraverso immunouorescenza diretta dopo 1-2 giorni. Test sierologici Un eccellente marker per linfezione primaria da CMV la sieroconversione: - i titoli degli anticorpi IgM specici in pazienti affetti da AIDS possono essere molto elevati - Tuttavia, gli IgM CMV-specici possono essere riscontrabili anche durante la riattivazione indicatori non afdabili di infezione primaria TEST REPERTO Citologici e istologici Corpo incluso a occhio di gufo Rilevazione antigenica Ibridazione in situ con sonde di DNA PCR Coltura cellulare CPE su fibroblasti diploidi umani Rilevamento dellantigene mediante immunofluorescenza PCR Test sierologici Sieroconversione che evidenzia infezione primaria Terapia, prolassi e controllo Farmaci approvati dalla FDA sono: - Ganciclovir: strutturalmente simile allaciclovir, fosforilato e attivato da una proteina chinasi codicata da CMV inibisce la DNA polimerasi virale terminazione della catena di DNA - Pi tossico di ACV - Pu essere usato per trattare infezioni gravi in pazienti immunocompromessi - Valganciclovir: profarmaco del ganciclovir che pu essere somministrato oralmente e convertito in ganciclovir nel fegato. Migliore biodisponibilit rispetto al ganciclovir Corso di microbiologia - batteriologia 73 www.bluejayway.it - Cidofovir: analogo nucleosidici fosforilato della citidina, che non richiede lenzima virale per lattivazione. - Foscarnet: molecola semplice che inibisce la DNA polimerasi virale, mimando la porzione di pirofosfato dei nucleotidi trifosfato. La modalit di trasmissione principale da CMV per via: - sessuale - Trapianti dorgano - Trasfusione di sangue La trasmissione quindi prevenibile: - utilizzo di prolatici e lastinenza - Valutazione della sieronegativit nei donatori di sangue e organi importante per sangue che deve essere trasfuso ai neonati. Nonostante non sia possibile prevenire la trasmissione di CMV congenita e perinatale, una madre sieropositiva ha meno probabilit di dare alla luce un bambino con infezione sintomatica. Non disponibile un vaccino per CMV Cytomegalovirus Morfologia e replicazione Virus con pericapside Capside icosadeltaedrico DNA ds lineare Possiede mRNA nello spazio tra capside e pericapside facilitazione dellinfezione Patogeno opportunista in pazienti immunocompromessi Principale virus causa di difetti congeniti Patogenesi e immunit Si trasmette con sangue, tessuti e molte secrezioni corporee. Causa infezione produttiva in broblasti, cellule epiteliali e altre cellule CMV va in latenza in linfociti e macrofagi. Limmunit cellulo-mediata fondamentale per la risoluzione della malattia Gli anticorpi hanno un ruolo limitato. Lassenza di immunit cellulo-mediata recidive e sintomatologia grave. Infezioni subcliniche in pazienti sani Epidemiologia Causa infezione persistente La malattia ricorrente fonte dinfezione Possibile diffusione asintomatica Trasmissione attraverso sangue, trapianto dorgano e tutte le secrezioni. Alla nascita, il virus trasmesso attraverso sangue materno o cervice uterina in madre infetta. Non ha prevalenza stagionale ed diffuso in tutto il mondo A rischio sono: - bambini - Figli di madri che presentano sieroconversione a termine della gravidanza difetti congeniti - Riceventi di sangue o organi - Individui sessualmente attivi - Immunocompromessi malattia sintomatica e ricorrente Malattie Infezione congenita colpisce il 10% dei neonati infetti, causando: microcefalia, dimensioni ridotte, calcicazioni intracerebrali, ritardo mentale, sordit, epatosplenomegalia e eritema Infezione perinatale acquisita dalla cervice di madri malate al momento della nascita. Solitamente asintomatica Infezione di bambini e adulti la maggior parte della popolazione stata infetta. Generalmente asintomatica. Possibile sviluppo di una sindrome mononucleosi infettiva negativa per anticorpi eteroli. Polmonite e epatite dopo trasfusioni o trapianti dorgano In pazienti immunocompromessi pneumopatia e polmonite, retinite (gravi immunocompromessi), polmonite interstiziale e encefalite, colite, esofagite, gastroenteriti. Diagnosi Citologia e istologia: - microscopia: cellula citomegalica con corpo incluso a occhio di gufo. Ematossilina- eosina o Papanicolaou - Ricerca DNA virale: Ibridazione in situ con sonde di DNA o PCR - Ricerca antigeni virali: immunouorescenza o ELISA Coltura su broblasti umani rilevamento mediante immunouorescenza degli antigeni precoci o PCR. Test sierologici la sieroconversione evidenzia linfezione primaria. Terapia Ganciclovir, valganciclovir, cidofovir e foscarnet Prevenzione Preservativo e astinenza limitano la trasmissione sessuale Valutazione della sieronegativit di organi e sangue. Corso di microbiologia - batteriologia 74 www.bluejayway.it I poxvirus comprendono i: - virus umani - Del Vaiolo (Orthopoxvirus) - Del mollusco contagioso (Molluscipoxvirus) - Altri virus che infettano gli animali, ma possono causare infezioni nelluomo (zoonosi) Molti di questi virus condividono determinanti antigenici con il virus del vaiolo possibile lutilizzo di poxvirus animali come vaccini per luomo. Il vaiolo era responsabile, nel XVIII secolo, in Inghilterra, del 7-12% dei decessi e di 1/3 delle morti infantili: - nel 1796 si sviluppato il primo vaccino, preparato con virus vivi ha permesso di eradicare il vaiolo nel 1980 - Nel 1996 distrutti gli stock di riferimento dellOMS - Tuttavia, a scopi bioterroristici, stock di virus conservati in USA e Russia possono essere utilizzati, in quanto ancora presenti - Il vaiolo ha grandi potenzialit mortali e infettanti. Nota positiva, la possibilit di utilizzare i poxvirus vaccini e dei canarini come vettori per il trasporto di geni per lo sviluppo di vaccini ibridi tali virus ibridi contengono ed esprimono i geni di altri agenti infettivi la loro infezione provoca immunizzazione verso entrambi gli agenti. Morfologia e replicazione I poxvirus sono i virus pi grandi, di dimensioni attorno a 230x300 nm: - morfologia complessa varia da ovale a prismatica - La particella virale contiene numerosi enzimi, tra cui la RNA polimerasi DNA-dipendente, che consente la sintesi di mRNA virale nel citoplasma. - Il genoma a DNA ds lineare congiunta alle estremit, - Nel virus vaccinico costituito da 86000 paia di basi. La peculiarit della replicazione dei poxvirus rispetto ad altri virus che si svolge nel citoplasma necessaria la codica di enzimi di sintesi di mRNA e DNA. Il poxvirus lega un recettore di supercie rivestimento esterno si fonde con le membrane cellulari o allinterno della cellula: - formazione di vacuolo di endocitosi rimossa la membrana esterna inizia la trascrizione dei geni precoci - Il core virionico ha un attivatore trascrizionale e tutti gli enzimi necessaria alla trascrizione, compresi - RNA polimerasi - Enzimi di poliadenilazione - Enzimi per il Capping del mRNA - Sintetizzate le proteine precoci, tra cui - Uncoatasi rimuove la membrana del capside liberazione del DNA virale nella cellula - Il DNA virale si replica nelle inclusioni citoplasmatiche, dette ofcine. - Viene poi tradotto lmRNA per le proteine tardive (strutturali del virione) - A differenza di quanto accade negli altri virus, le membrane si assemblano attorno al core. - prodotte e liberate per lisi circa 10,000 particelle virali per cellula infetta. Corso di microbiologia - virologia 75 www.bluejayway.it Poxvirus Virus grande (300 nm) DNA lineare ds, con estremit unite Forma da ovale a mattone Doppia membrana e pericapside Contiene nel tegumento vari enzimi, tra cui DNA e RNA polimerasi Replicato e assemblato nel citoplasma, in corpi inclusi del Guarneri, dove acquisisce le membrane esterne Poxvirus Enrico Colombo VACCINI RICOMBINANTI I virus vaccinico e dei canarini sono stati utilizzato come vettori despressione per produrre vaccini vivi ricombinanti ibridi contro agenti infettanti pi virulenti: - inseriti in un plasmide il gene estraneo che codica la molecola immunizzante, afancata da sequenze di un gene dei poxvirus, per stimolare la ricombinazione - Il plasmide ricombinante introdotto in una cellula ospite - infettata la cellula ospite con il virus vaccinico - Grazie allomologia tra il genoma del virus infettante e le sequenze vacciniche inserite nel plasmide il gene estraneo si inserisce nel genoma del virus. Limmunizzazione con il virus vaccinico ricombinante frutto dellespressione del gene autologo e della presentazione al sistema immunitario. Il vaccino con virus ibrido contenente la proteina G del virus della rabbia stato utilizzato con successo per immunizzare procioni lavatori, volpi e altri mammiferi Con le medesime tecniche vaccini sperimentali contro: - AIDS - Epatite B - Inuenza - Altri virus. Patogenesi e immunit Il virus del vaiolo inalato: - si replica nelle vie respiratorie superiori - Diffonde per via linfatica/ematica veicolato dalle cellule sanguigne - In una seconda viremia pi intensa infettati i tessuti interni e cutanei formazione delle pustole (rash cutaneo). Il mollusco contagioso e gli altri poxvirus trasmessi per contatto diretto con le lesioni 17 e non hanno marcata tendenza alla diffusione. I poxvirus codicano numerose proteine che favoriscono replicazione e patogenesi nellospite: - inizialmente stimolano la crescita della cellula - Successivamente causano la lisi cellulare liberazione del virus Il virus del mollusco contagioso causa una lesione simile ad una verruca piuttosto che infezione litica. Limmunit cellulo-mediata fondamentale per guarire linfezione da poxvirus Poxvirus codicano proteine che permettono di eludere il sistema immunitario - Diffusione cellula-cellula - Proteine inibenti - interferone, - complemento - risposta inammatoria Corso di microbiologia - batteriologia 76 www.bluejayway.it 17 anche mediante oggetti-vettore inalazione o contatto con croste replicazione nel tratto respiratorio linfonodi via linfatica (macrofagi) viremia secondaria viremia primaria milza, fegato, midollo osseo, altri linfonodi emorragia dei piccoli vasi del derma rash e lesioni cutanee Epidemiologia Il vaiolo e il mollusco contagioso virus rigorosamente umani. Gli ospiti naturali degli altri virus patogeni per luomo sono i vertebrati non umani (mucca, pecora, capra, ecc) la trasmissione alluomo avviene prevalentemente in ambito lavorativo (zoonosi). Il vaiolo era estremamente contagioso: - si contraeva per via respiratoria - Il contagio poteva essere pi rapido se avveniva per contatto diretto con il virus disidratato presente su oggetti o vestiti Sindromi cliniche Virus del vaiolo Le due varianti del vaiolo erano: - vaiolo maggiore mortalit pari al 15-40% - Vaiolo minore mortalit 1% In genere la malattia iniziava con infezione respiratoria coinvolgimento linfonodale locale viremia: - incubazione di 5-17 giorni - Inizio con febbre alta, stanchezza, forte mal di testa, mal di schiena e malessere - Segue un rash di vescicole in bocca e subito dopo su tutto i corpo - Subito dopo si presentano - Vomito - Diarrea - Sanguinamento protratto - Linsorgenza simultanea del rash vescicolare differenzia il vaiolo dalla varicella 18 DIAGNOSI La diagnosi del vaiolo era solitamente clinica si confermava attraverso crescita del virus in uova embrionate o colture cellulari: - sulla membrana delle uova comparivano caratteristiche lesioni. - Le nuove tecniche di PCR e sequenziamento rapido di DNA sono disponibili al CDC di Atlanta. Corso di microbiologia - batteriologia 77 www.bluejayway.it 18 il virus della varicella-zoster, infatti, vede insorgere a gruppi le vescicole, che progressivamente si trasformano in croste (3-5 giorni). Il vaiolo, invece, vede linsorgenza simultanea del rash su tutto il corpo TERAPIA Un rinnovato interesse stato rivolto verso i farmaci antivirali che siano efcaci contro il vaiolo e gli altri poxvirus: - cidofovir analogo nucleotidico che inibisce la DNA polimerasi virale, efcace contro poxvirus Virus vaccinico Il virus vaccinico stato utilizzato nella vaccinazione anti-vaiolosa: - si inoculava nel paziente il virus vivo, attraverso scaricazione della cute - La comparsa di vescicole e pustole confermava limmunizzazione Con la diminuzione dellincidenza del vaiolo si vericavano pi complicazioni legate alla vaccinazione che casi di vaiolo: - encefalite - Infezione progressiva manifesta in immunocompromessi sbadatamente vaccinati Poxvirus della pecora e della capra (ORF), dei bovini e della scimmia Infezione umana con poxvirus di pecora e capra, bovini frequentemente un rischio occupazionale: - causato dal contatto diretto con lesioni di animali infetti - Solitamente si formano su dita, mano o avambraccio delle lesioni emorragiche (virus vaccinico, ovvero il virus del vaiolo bovino) o granulomatose (ORF e virus dello pseudovaiolo bovino) - Regrediscono in 25-30 giorni, senza formare croste - Possono essere confuse con lantrace. - Solitamente la diagnosi basata su - Storia clinica del paziente - sintomi - possibile la coltura o indagine al microscopio elettronico per confermare il virus. Corso di microbiologia - batteriologia 78 www.bluejayway.it Al virus del vaiolo della scimmia sono stati attribuiti pi di 100 casi di una malattia simile al vaiolo vericatasi nelluomo: - si sono manifestati tutti nello Zaire - Versione pi lieve del vaiolo, ma con vescicole simili Virus del mollusco contagioso Le lesioni cutanee provocate dal virus del mollusco contagioso sono diverse da quelle del vaiolo nodulari e simili a verruche: - inizialmente hanno laspetto di papule - Diventano noduli perlacei, ombelicati, con diametro di 2-10 mm - Hanno un tappo centrale caseoso, che pu essere facilmente schiacciato - Si riscontrano frequentemente in gruppi da 5-20 noduli su - Genitali - Busto - Estremit - Il periodo di incubazione: 2-8 settimane - Trasmissione: contatto diretto (sessuale o per stretto contatto) o attraverso oggetti domestici. La malattia pi comune nei bambini lincidenza degli adulti sta aumentando a causa dellaumento dei sessualmente attivi. DIAGNOSI La diagnosi confermata: - istologicamente caratteristiche inclusioni citoplasmatiche eosinole (corpi del mollusco) nelle cellule epiteliali - Possono essere osservate nei campioni bioptici o nel core caseoso - Clinicamente La coltura non pu essere eseguita La risoluzione avviene in 2-12 mesi, come risultato di una risposta immunitaria. I noduli possono essere rimossi per: - scaricazione - Applicazione di azoto liquido o soluzioni iodate. Corso di microbiologia - batteriologia 79 www.bluejayway.it I Parvoviridae sono i pi piccoli virus a DNA: - dimensioni ridotte e corredo genico limitato dipendenti, per replicare, da - Cellula ospite - O da un virus helper. - Unico membro dei parvoviridae patogeno per luomo B19 Il virus B19 in genere causa leritema infettivo (quinta malattia): - malattia esantematica, moderatamente febbrile, che si manifesta nei bambini. - I nome comune dato dal fatto che il quinto degli esantemi infantili (dopo rosolia, varicella, roseola infantum e morbillo) anche responsabile di: - crisi aplastiche in pazienti con anemia emolitica cronica - Associato a poliartrite acuta negli adulti. - Aborto in caso di infezione intrauterina I virus adeno-associati (AAV), membri del genere Dependovirus, infettano spesso luomo, ma solo lassociazione ad un secondo virus helper (generalmente un adenovirus) permette linfezione: - non causano malattia - tendenza a integrarsi nel genoma AAV geneticamente modicati per terapia genica. Struttura e replicazione I parvovirus sono estremamente piccoli (18-26 nm di diametro): - virione icosaedrico, privo di pericapside - Genoma costituito da ununica molecola di DNA lineare a singolo lamento, - Filamenti di DNA a polarit positiva o negativa sono incorporati separatamente nei virioni - lamento positivo: codica per 3 proteine strutturali e 2 non strutturali Il virus B19 replica in cellule in attiva divisione mitotica: - predilige la linea eritroide (cellule del midollo osseo umano, cellule eritroidi di fegato fetale e cellule di leucemia eritroide) - Legame allantigene P degli eritrociti e penetrazione scapsidamento nel citoplasma il DNA raggiunge il nucleo sintetizzato un lamento complementare - Per sintetizzare il lamento complementare di DNA sono necessari - Fattori nucleari presenti solo in fase S del ciclo cellulare - DNA polimerasi cellulare Per trascrizione e replicazione necessario un genoma a doppio lamento: - sintesi del DNA virale facilitata da sequenze palindromiche alle estremit si ripiegano e agiscono come primer per la DNA polimerasi cellulare. Le principali proteine non strutturali e le principali proteine del capside (VP1 e VP2) sono tradotte utilizzando mRNA formato per splicing alternativo da un trascritto primario: - sintetizzate nel citoplasma tornano nel nucleo assemblate nel virione - La proteina VP3 si forma per taglio proteolitico di VP2 - La membrana nucleare e citoplasmatica degenerano rilascio per lisi cellulare. Corso di microbiologia - virologia 80 www.bluejayway.it Parvovirus Pi piccolo virus a DNA Genoma DNA ss con estremit palindrome che si ripiegano e fanno da primer. Capside icosaedrico nudo Infettano i precursori eritroidi nel midollo Parvovirus Enrico Colombo Patogenesi e immunit Il virus B19 infetta e lisa i precursori delle cellule eritroidi: - la malattia dovuta a - lisi di queste cellule - Risposta immunitaria conseguente (eruzione cutanea e atralgia) - Studi suggeriscono che - B19 replica inizialmente nel nasofaringe o nelle vie respiratoria superiore - Diffonde per viremia al midollo osseo e altri siti replica uccidendo i precursori delle cellule eritroidi La malattia ha un decorso bifasico: - stadio febbrile iniziale corrisponde alla fase infettante - Produzione di eritrociti bloccata per circa 1 settimana - Viremia elevata entro 8 giorni dallinfezione accompagnata da sintomi simil-inuenzali aspecici - Nelle secrezioni orali e respiratorie alti titoli virali - Gli anticorpi bloccano la viremia superamento della malattia, ma contribuiscono ai sintomi - Secondo stadio sintomatico, legato alla risposta immunitaria - Leruzione cutanea e latralgia coincidono con - comparsa di anticorpi virus-specici - Scomparsa del virus B19 - Formazione di immunocomplessi Pazienti con anemia emolitica cronica (es anemia falciforme) infettati con il virus B19 rischiano una reticolocitopenia potenzialmente mortale per crisi aplastica: - data dalla combinazione tra deplezione dei precursori indotta da B19 e diminuzione della vita media degli eritrociti Epidemiologia Circa il 65% della popolazione adulta infettata dal virus B19 prima dei 40 anni: - leritema infettivo (quinta malattia) diffuso soprattutto tra i bambini e gli adolescenti tra i 4 e i 15 anni - Negli adulti si vericano atralgia e artrite. - Pazienti con anemia cronica possono avere crisi aplastiche - Le gestanti contraggono linfezione e portano malattia al feto - Diffusione: ubiquitario - Stagionalit: ne dellinverno e in primavera - Trasmissione: secrezioni orali e respiratorie - Attraverso la placenta - Parenterale, attraverso un concentrato del fattore di coagulazione del sangue. Il periodo di contagiosit precede linsorgenza dei sintomi. Corso di microbiologia - batteriologia 81 www.bluejayway.it inalazione del virus B19 replicazione nel tratto respiratorio replicazione virale nei precursori eritroidi nel midollo osseo viremia secondaria viremia primaria produzione anticorpi rash e atralgia replicazione nel tratto respiratorio superiore paziente sano anemico emolitico Lieve diminuzione del livello di emoglobina possibile crisi aplastica, potenzialmente fatale Sindromi cliniche Eritema infettivo (quinta malattia) Il virus B19 lagente eziologico delleritema infettivo (o quinta malattia): - periodo prodromico non evidenziabile di 7-10 giorni lindividuo contagioso - Linfezione di un soggetto sano pu essere - Inapparente - Causare febbre e sintomi aspecici (mal di testa, brividi, mialgia e malessere, diminuzione del livello di emoglobina) - Successivamente compare una eruzione sulle guance diffonde poi sulle zone di cute esposta (braccia o gambe) - Scompare in una o due settimane. - Possono vericarsi recidive. CASO CLINICO BAMBINO DI 10 ANNI PER 5 GIORNI HA UNA SINDROME SIMIL-INFLUENZALE (MAL DI TESTA, FEBBRE, DOLORI MUSCOLARI E STANCHEZZA), POI SVILUPPA SULE GUANCE UN RASH ROSSO INTENSO, CHE SI DIFFONDE SUL TRONCO E SUGLI ARTI, MA CON COLORE MENO PRONUNCIATO. Corso di microbiologia - batteriologia 82 www.bluejayway.it giorni modificazioni patologiche del tratto respiratorio induzione da interferone risposta immunitaria cellulo- mediata virus nelle secrezioni respiratorie aumento degli anticorpi virus-specifici malattia sintomatica simil- influenzale infezione batterica secondaria incubazione convalescenz a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 3 3 3 3 3 6 4 3 8 6 4 3 8 7 6 4 8 7 6 4 8 7 6 4 8 7 6 4 8 7 6 4 8 7 6 5 4 8 6 5 8 6 5 8 5 8 5 8 5 8 5 8 5 8 5 8 5 8 5 4 8 5 4 8 5 4 8 5 4 8 5 4 8 5 4 8 5 4 8 5 5 giorni 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 Giorni diminuzione dei reticolociti e dei livelli di Hb virus nella gola viremia presenza di anticorpi IgG virus-specifici rash/atralgia incubazione sintomi influenzali aspecifici Poliartrite negli adulti Negli adulti, linfezione da parte del virus B19 causa poliartrite: - pu durare anche qualche mese - Si osserva principalmente artrite di mani, polsi, ginocchia - Raramente pu essere preceduta da eruzione cutanea. Crisi aplastica Linfezione da parvovirus pu dare la crisi aplastica, una complicazione molto seria in pazienti con anemia emolitica cronica 19 : - temporanea diminuzione delleritropoiesi reticolocitopenia che dura da 7 a 10 giorni - La crisi accompagnata da sintomi aspecici - Febbre - Malessere - Mialgia - Brividi - Prurito. - Pu manifestarsi anche uneruzione maculo-papulosa con atralgia e gonore articolare. Infezione fetale Linfezione da B19 da una madre sieronegativa aumenta il rischio di aborto spontaneo: - il virus pu infettare il feto e distruggere i precursori degli eritrociti anemia e scompenso cardiaco congestizio (idrope fetale) - Linfezione di una gestante sieropositiva, generalmente, non ha effetti sul feto. Corso di microbiologia - batteriologia 83 www.bluejayway.it 19 ad esempio lanemia con cellule falciformi Diagnosi di laboratorio La diagnosi di eritema infettivo generalmente clinica, ma per una diagnosi certa 20 da B19 necessario riscontrare: - IgM speciche saggi immunoenzimatici (ELISA) per determinare IgM e IgG speciche per B19 - DNA virale PCR molto sensibile per evidenziare il genoma di B19 Non si utilizza lisolamento in coltura del virus. Terapia, prolassi e controllo Non sono disponibili trattamenti antivirali. Esistono vaccini per i parvovirus di cane e gatto Impossibile il controllo. Parvovirus B19 Morfologia e replicazione Capside icosaedrico nudo Pi piccoli tra i virus a DNA Genoma a DNA ss (elica + o -) Necessitano di cellule in crescita attiva o di un virus helper I lamenti + o - sono incapsidati in virioni separati Le estremit del genoma hanno sequenze ripetute e palindrome che si appaiano a formare strutture ripiegate a forcina (harpin) e un innesco per la DNA polimerasi Diverse regioni codicano proteine non strutturali (NS) e strutturali (VP) Patogenesi Diffusione tramite secrezioni orali o respiratori. Tropismo per cellule eritroidi miticamente attive nel midollo osseo infezione litica Il virus stabilisce una viremia e pu attraversare la placenta. La risposta anticorpale importante per la risoluzione e la prolassi Il virus causa malattia bifasica: - fase iniziale infettiva viremia sintomi simil-inuenzali e rilascio del virus - Fase secondaria non infettiva risposta immunitaria immunocomplessi circolanti di anticorpi e virus che non ssano il complemento rash eritematoso maculopapulare, atralgia e artrite La deplezione dei precursori eritroidi e il depauperamento degli eritrociti crisi aplastiche in pazienti affetti da anemie croniche. Epidemiologia Il capside virale resistente allattivazione Il periodo contagioso precede i sintomi Il virus attraversa la placenta e infetta il feto Trasmissione aerosol respiratorio A rischio: - bambini, soprattutto in et scolare (5 malattia) - Pazienti con anemia cronica (crisi aplastica) - Gestanti (infezione e malattia del feto) - Genitori di bambini con infezione da B19 Virus ubiquitario Prevalenza ne-inverno e primavera Malattia Lieve malattia simil-inuenzale (febbre, mal di testa, brividi, mialgia, malessere) Eritema infettivo (quinta malattia) Crisi aplastica in pazienti con anemia cronica Artropatia (poliartrite) Rischio di aborto in seguito al passaggio transplacentare del virus. Diagnosi Generalmente clinica Conferma attraverso: - ELISA contro anticorpi IgM e IgG - PCR Terapia Non esistono terapie o vaccini umani Non possibile il controllo. Corso di microbiologia - batteriologia 84 www.bluejayway.it 20 pu essere necessario, ad esempio, distinguere leruzione da B19 da quella della rosolia in una gestante La famiglia Picornaviridae una delle pi grandi famiglie di virus, contenente alcuni tra i maggior virus patogeni per animali e uomo: - virus piccoli a RNA - Capside nudo La famiglia comprende pi di 230 membri, divisa in 5 generi: - Enterovirus - Rhinovirus - Heparnavirus - Cardiovirus (non umano) - Aphthovirus (non umano) Gli enterovirus si distinguono dai rhinovirus per: - stabilit del capside a pH 3 - Temperatura ottimale di crescita - Modalit di trasmissione - Malattie di cui sono responsabili. ENTEROVIRUS Di enterovirus esistono almeno 71 sierotipi patogeni per luomo, compresi poliovirus, coxsackievirus e echovirus: - uno specico sierotipo di enterovirus pu causare pi malattie - Sierotipi differenti, daltro canto, possono causare la stessa malattia, a seconda del tessuto bersaglio. I capsidi degli enterovirus resistono bene in condizioni ambientali difcili e nel tratto gastroenterico: - facilitata la trasmissione per via oro-fecale - Ad ogni modo, gli enterovirus causano raramente malattie enteriche - Normalmente le infezioni sono asintomatiche. - Lenterovirus conosciuto maggiormente il poliovirus. - I coxsackievirus prendono il nome dalla citt di Coxsackie, e sono dividi in due gruppi (A e B) in base alle differenze biologiche e antigieniche. Il nome di echovirus deriva da enterico citopatico umano (Human) orfano: - Nome dato dal fatto che inizialmente si pensava che non fosseo associati a patologie cliniche - Se ne conoscono 32 sierotipi RHINOVIRUS I rhinovirus umani comprendono almeno 100 sierotipi e sono causa principale del comune raffreddore: - sensibili a pH acido - Replicano male a temperature superiori a 33C. - Infezione limitata al tratto respiratorio superiore. HEPARNAVIRUS Gli heparnavirus comprendono il virus dellepatite A, discusso in seguito a riguardo delle epatiti: - diffusione attraverso il tratto gastroenterico 5 generi 5 generi enterovirus cardiovirus rhinovirus aphthovirus hepatovirus Picornaviridae famiglia famiglia specie specie poliovirus mengovirus rinovirus FMDV-C virus dellepatite A coxsackievirus > 100 sierotipi echovirus >60 sierotipi Picornavirus uomo uomo uomo Struttura Il lamento positivo di RNA dei picornavirus circondato da un capside icosaedrico del diametro di circa 30 nm: - 12 vertici pentamerici ognuno composto da 5 protomeri proteici - I protomeri sono composti da 4 polipeptidi virionici (VP1 a VP4) - VP2 e VP4 sono generati dal taglio proteolitico del precursore VP0 Corso di microbiologia - virologia 85 www.bluejayway.it Picornavirus Piccoli virus a RNA RNAss + che codica per una sola poliproteina 5 generi della famiglia Picornaviridae. Genoma simile a un mRNA Capside icosadeltaedrico nudo Recettori della superfamiglia Ig Picornavirus Enrico Colombo - VP4 responsabile dellintegrit del virione non prodotto nch il genoma non incorporato nel capside rilasciato quando il virus si lega al recettore cellulare - I capsidi sono stabili al calore e ai detergenti. Eccetto i Rhinovirus, sono resistenti anche in ambiente acido. Il genoma dei picornavirus simile RNA messaggero: - singolo lamento di RNA a polarit positiva - Circa 7200-8450 kb con: - sequenza poliA allestremit 3 aumenta linfettivit dellRNA - Proteina VPg legata in 5 importante per lincorporazione del genoma nel capside e per linizio della sintesi di RNA virale. Il genoma codica per: - poliproteina che produce le proteine enzimatiche e strutturali del virus per taglio proteolitico. - Proteine del capside - Vpg - Due proteasi - RNA polimerasi RNA-dipendente. - Proteasi che degrada la proteina legante il cap sui ribosomi eucariotici blocca la trascrizione di molti mRNA cellulari. Struttura dei picornavirus Il capside formato da 60 capsomeri identici Ogni capsomero costituito da 3 polipeptidi VP1, VP2, VP3 che in gruppi di 5 capsomeri costituiscono i 12 vertici. Allinterno del capside associata unaltra proteina, VP4 Replicazione La specicit di interazione per i recettori cellulari determinante del tropismo per il tessuto bersaglio determinante della malattia. Le proteine VP1 ai vertici formano una struttura a canyon, alla quale si lega il recettore: - sito di legame protetto dalla neutralizzazione anticorpale - Il Pleconaril e composti antivirali correlati contengono un gruppo 3- metilisossazolico, che si lega al fondo di questo canyon altera la conformazione impedita spoliazione del virus. I picornavirus possono essere raggruppati a seconda della loro specicit per i recettori della supercie cellulare: - poliovirus, alcuni coxsackievirus e rhinovirus superfamiglia Ig - Almeno l80% dei rhinovirus e diversi sierotipi di coxsackie riconoscono ICAM-1 su broblasti, cellule endoteliali e cellule epiteliali - Diversi coxsackievirus, echovirus e altri enterovirus CD55, il fattore accelerante il decadimento. - Poliovirus molecola che simile al recettore per HSV (detta PVR/ CD155) - Presente in molti tipi di cellule umane, non tutte permissive per la replicazione dei poliovirus. Dopo il legame con il recettore rilasciata VP4 il virione si indebolisce: - il genoma virale introdotto direttamente attraverso un canale di membrana creato ad uno dei vertici del virione - si lega direttamente ai ribosomi, anche senza il cap in 5 - Il ribosoma riconosce un loop di RNA in 10 minuti viene sintetizzata la poliproteina, contenente tutte le sequenze proteiche virali Corso di microbiologia - batteriologia 86 www.bluejayway.it Struttura dei picornavirus Il capside formato da 60 capsomeri identici Ogni capsomero costituito da 3 polipeptidi VP1, VP2, VP3 che in gruppi di 5 capsomeri costituiscono i 12 vertici. Allinterno del capside associata unaltra proteina, VP4 - Tagliata da proteasi virali codicate nella proteina stessa - Successivamente lRNA polimerasi RNA-dipendente virale stampo di RNA a polarit negativa possono essere sintetizzati nuovo mRNA/ genoma - La quantit di mRNA virale prodotto aumenta rapidamente - Si raggiungono circa 40,000 mRNA Model for poliovirus entry into cells Durante linfezione, molti picornavirus inibiscono la sintesi di mRNA cellulare: - proteolisi della proteina ribosomiale legante il cap ad opera di una proteasi virale impedito al mRNA di legare il ribosoma - Inibizione di fattori trascrizionali riduce il livello di mRNA circolanti - Cambiamenti della permeabilit cellulare indotta dai picornavirus riduce la capacit dellmRNA di legarsi ai ribosomi. - Competizione tra mRNA virale e cellulare. Tutte queste attivit contribuiscono alleffetto citopatico. Quando il genoma virale replicato e tradotto, vengono tagliate le proteine strutturali VP0, VP1 e VP3 assemblate in subunit: - 5 subunit associate in pentameri 12 pentameri formano il procapside. - Dopo lacquisizione del genoma, VP0 tagliata in VP2 e VP4 completare il capside. Il virus viene rilasciato per lisi cellulare no a 100,000 virioni. Ciclo di replicazione dei picornavirus LmRNA virale ha alta affinit per lapparato di sintesi proteica. Spiazza rapidamente gli mRNA cellulari dai siti di sintesi proteica, causando una drastica interruzione (shut-off) delle biosintesi cellulari, seguito da un vigoroso effetto citopatico. Il montaggio delle particelle virali ha luogo nel citoplasma. Liberazione delle particelle neoformate per lisi delle cellule. Non tutte le particelle neoformate sono infettive! Spesso presenti particelle difettive interferenti. Corso di microbiologia - batteriologia 87 www.bluejayway.it Patogenesi e immunit A dispetto del loro nome, gli enterovirus non causano enteriti, ma sono trasmessi per via oro-fecale. Le differenze nelle malattie da enterovirus sono causate dalle differenze tra i vari generi inerenti a: - tropismo tissutale - Capacit citolitica Le vie daccesso sono: - parte superiore del tratto respiratorio - Orofaringe - Tratto intestinale I virioni sono resistenti a: - acidi gastrici - Bile - Proteasi La replicazione virale: - inizia nella mucosa e nel tessuto linfoide delle tonsille e della faringe - Successivamente il virus infetta le cellule linfoidi delle placche di Peyer sottostante la mucosa intestinale si sviluppa la viremia primaria infettati i tessuti bersaglio - Milza - Linfonodi - Fegato - Dai tessuti bersagli si sviluppa una viremia secondaria sintomi La maggior parte degli enterovirus citolitica replica rapidamente e causa danni diretti alle cellule bersaglio. Il virus dellepatite A costituisce uneccezione: - Non citolitico - Cinetiche della risposta immunitaria sono correlate alla comparsa dei sintomi immunopatogenesi. Nel caso del poliovirus, il virus accede al cervello infettando il muscolo scheletrico percorre i nervi afferenti al SNC: - citolitico per i motoneuroni delle corna anteriori del midollo spinale paralisi - quali neuroni vengono distrutti localizzazione della paralisi - quanti neuroni distrutti sviluppo di paralisi, possibilit che altri neuroni re- innervino il muscolo. La sindrome post-poliomielitica paralisi che si sviluppa in et avanzata, per effetto combinato della perdita di neuroni dovuta a: - poliomielite - Et La presenza del virus rilevata: - orofaringe prima dei sintomi, per breve periodo - Intestino 30 giorni o pi, anche in presenza di risposta umorale. La risposta anticorpale risposta pi importante contro gli enterovirus: - anticorpi secretori (IgA) prevengono linstaurarsi dellinfezione nellorofaringe e nel tratto GI - anticorpi sierici (IgM e IgG) pervengono la diffusione viremica ai tessuti bersaglio, quindi la viremia. Limmunit cellulo-mediata: - non coinvolta nella protezione Corso di microbiologia - virologia 88 www.bluejayway.it Enterovirus - Eccezione epatite A, in cui i linfociti T sono importanti per la risoluzione della malattia e determinano gran parte della patogenesi Epidemiologia Gli enterovirus sono patogeni esclusivamente per luomo. Diffusione per via orofecale: - coxsackievirus e echovirus possono diffondere anche attraverso goccioline di aerosol infezioni del tratto respiratorio Leliminazione asintomatica pi di un mese con conseguente eliminazione di virus nellambiente - scarse condizioni di igiene e sovraffollamento facilitano la trasmissione del virus - Contaminazione delle risorse idriche con scarichi fognari epidemie da enterovirus - Focolai di malattie da enterovirus osservati in scuole e asili. Le infezioni sono pi comuni destate. Introduzione del vaccino anti-polio eliminata dallemisfero occidentale, ma non dal resto del mondo: - in zone in cui il vaccino non disponibile o non praticata la vaccinazione pu vericarsi la poliomielite paralitica - Ogni anno, numero limitato di casi dovuto al vaccino antipolio risultato della reversione del virus utilizzato come vaccino - Oggi si utilizzano vaccini con virus inattivati. - I poliovirus si diffondono pi spesso durante lestate e lautunno. Linfezione da poliomielite pi grave in et adulta durante linfanzia asintomatica o causa malattia non grave. La malattia da coxsackievirus A in adulti anchessa pi grave che nei bambini. Per la malattia da coxsackievirus B e alcuni echovirus malattia pericolosa nei bambini. infezione da enterovirus materiale fecale umano mani rifiuti solidi fogna fornitura dacqua Sindromi cliniche Le sindromi cliniche causate dagli enterovirus sono determinate da diversi fattori: - sierotipo virale - Dose infettante - Tropismo tissutale - Via dingresso - Et, sesso e stato di salute dellindividuo - Stato di gravidanza. Generalmente il periodo di incubazione varia tra 1 e 35 giorni, a seconda di: - virus - Tessuto - Et del soggetto. Corso di microbiologia - batteriologia 89 www.bluejayway.it Infezioni da poliovirus Dallintroduzione del vaccino anti-polio infezioni da poliovirus selvatico sempre pi rare. Tuttavia possono vericarsi casi di poliomielite in: - popolazioni non vaccinate - Riattivazione di vaccini Nei soggetti non vaccinati, la il virus della poliomielite pu provocare: - malattia asintomatica: se linfezione limitata allorofaringe e allintestino. 90% delle infezioni - Poliomielite abortiva, malattia minore: malattia febbrile aspecica (5% degli infettati). Febbre, cefalea, mal di gola e vomito sono sintomi entro 3-4 giorni dal contagio. - Poliomielite non paralitica o meningite asettica: 1-2% dei contagi. Il virus raggiunge il SNC e le meningi dolori alla schiena, spasmi muscolari e i sintomi della malattia minore - Poliomielite paralitica (malattia maggiore): colpisce lo 0,1-2% degli infettati. 3-4 gg dopo la cessazione della malattia minore (seconda fase di una malattia bifasica) - Il virus si diffonde dal sangue alle cellule delle corna anteriori del midollo spinale e alla corteccia motoria nellencefalo. - Paralisi determinata dallestensione dei neuroni colpiti - Spinale Pu coinvolgere uno o pi arti - Bulbare combinazione di nervi cranici e centri respiratori midollari. Poliomielite paralitica La poliomielite paralitica caratterizzata da una paralisi accida asimmetrica: - nessuna perdita di capacit sensoriali - Il grado della paralisi varia, poich - Pu interessare una gamba - Pu vericarsi la completa paralisi accida delle 4 estremit - La paralisi pu evolvere nei giorni successivi, con diversi esiti - Completa guarigione - Paralisi residua - Morte - La maggior parte del recupero in 6 mesi, ma per la completa remissione possono servire 2 anni Poliomielite bulbare La poliomielite bulbare pu essere pi grave, e interessare anche - faringe - Laringe/corde vocali - Respirazione mortale nel 75% dei pazienti. Sindrome post-poliomielitica La sindrome post-poliomielitica un postumo della polio: - si verica tardi nel corso della vita (30-40 anni dopo) - Nel 20-80% dei malati originari Generalmente, gli individui vanno incontro ad un deterioramento dei muscoli colpiti originariamente. Il poliovirus non presente combinazione di effetti di perdita di neuroni causata sia dalla polio pregressa che dallet. giorni modificazioni patologiche del tratto respiratorio induzione da interferone risposta immunitaria cellulo- mediata virus nelle secrezioni respiratorie aumento degli anticorpi virus-specifici malattia sintomatica simil- influenzale infezione batterica secondaria incubazione convalescenz a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 2 2 4 2 5 4 2 5 4 8 5 4 3 8 6 5 3 8 6 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 6 4 3 8 7 4 3 8 7 4 3 8 7 4 3 8 7 4 3 8 7 4 3 giorni 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 Giorni anticorpi paralisi malattia maggiore malattia minore invasione SNC virus nelle feci prodromo virus nelorofaringe Infezioni da coxsackievirus e echovirus Alcune sindromi cliniche gravi possono essere associate sia ad un coxsackievirus che ad un echovirus, ma alcune malattie sono speciche dei coxsackievirus: - coxsackievirus A: malattie con lesioni vescicolari - Coxsackievirus B: miocardite e pleurodinia Tali virus possono causare anche una forma di malattia paralitica simile alla polio. Le conseguenze comuni di infezione da coxsackie e echovirus sono tuttavia: Corso di microbiologia - batteriologia 90 www.bluejayway.it - mancanza di sintomi - Affezione leggera del tratto respiratorio superiore - Malattia simil-inuenzale Erpangina Lerpangina causata da Coxsackie A: - sintomi tipici della malattia sono - Febbre - Mal di gola - Dolore nella deglutizione - Anoressia - Vomito - Segni tipici lesioni ulcerate vescicolari attorno al palato molle e allugola - Meno spesso lesioni al palato duro. Il virus pu essere ritrovato in feci o lesioni Normalmente la malattia autolimitante solo trattamenti sintomatici. Malattia di mani-piedi-bocca La malattia di mani-piedi-bocca unesantema vescicolare, causato da coxsackievirus A16: - le caratteristiche sono vescicole situate su mani, piedi, bocca e lingua - Il paziente accusa un lieve stato febbrile La malattia regredisce in alcuni giorni. Pleurodinia (malattia di Bornholm) Agente eziologico coxsackievirus B. La pleurodinia, conosciuta anche come stretta del diavolo una malattia acuta: - attacco febbrile improvviso - Dolore laterale al basso torace (es pleurite) - Possibile dolore addominale e vomito Persiste in media 4 giorni, ma si possono vericare anche ricadute, dopo che le condizioni sono rimaste asintomatiche. Miocarditi e pericarditi Infezioni miocardiche e pericardiche causate da Coxsackievirus B: - sporadiche in adulti e adolescenti - Pericolose nei neonati. I neonati infetti accusano - stati febbrili - Collassi cardiaci improvvisi e inspiegabili - Cianosi - Tachicardia - Cardiomegalia - Epatomegalia La mortalit alta e lautopsia generalmente rivela il coinvolgimento di altri sistemi, tra cui: - cervello - Fegato - Pancreas. I giovani adulti (anche gli anziani) riscontrano pericarditi acute benigne: - sintomi simili allinfarto - compare per la febbre Meningite virale (asettica) La meningite asettica una malattia febbrile acuta, accompagnata da: - cefalea - Segni di irritazione delle meningi (es rigidit nucale) In pazienti con meningite da enterovirus possono vericarsi: - petecchie - Rash cutanei Solitamente la guarigione spontanea, salvo che la malattia non sia associata a: - Encefalite - Sviluppata in bambini inferiori ad 1 anno. Solitamente, si vericano meningiti da picornavirus (echovirus 11) nella stagione estiva. Febbre, rash e comuni sintomi da raffreddamento. In pazienti con infezioni da echovirus o coxsackievirus possono vericarsi: - febbre - Rash - Normalmente maculopapulari - Occasionalmente vescicolari o petecchiali - Sintomi da raffreddamento Leruzione petecchiale deve essere distinta da quella tipica della meningococcemia sintomi meno gravi in caso di enterovirus. Corso di microbiologia - batteriologia 91 www.bluejayway.it Coxsackievirus A21, A24 e echovirus 11 e 20 possono causare sintomi da raffreddamento, simili a quelli da rhinovirus. Altre malattie da enterovirus Lenterovirus 70 e una varante del Coxsackievirus A21 sono associati a congiuntivite emorragica acuta: - malattia oculare estremamente contagiosa - Infezione emorragie subcongiuntivali e congiuntiviti. - Periodo di incubazione 24 ore - Si risolve in 1-2 settimane. Alcuni virus coxsackievirus B e echovirus possono essere trasmessi al feto per via transplacentare possono causare grave malattia diffusa. Infezione da coxsackie B al pancreas causa del diabete insulino-dipendente distrugge le cellule di Langerhans. Diagnosi di laboratorio Esami chimico-clinici Si esamina il liquido cerebrospinale (CSF) di meningiti asettiche da poliovirus o enterovirus, rilevando: - prevalenza linfocitaria (25-500 cellule/ml) - Livelli di glucosio normali o leggermente ridotti (nelle meningiti batteriche sono alti) - Livelli di proteine normali o leggermente aumentati - Manca di neutroli Raramente si isola il virus dal liquor Esame colturale I poliovirus possono venire isolati da: - faringe: nei primi giorni - Feci: anche per 30 giorni Il virus cresce bene in colture cellulari di rene di scimmia: - solitamente i coxsackie e gli echovirus possono essere isolati dalla gola e dalle feci durante linfezione in pazienti con meningite. - Il virus raramente isolato in pazienti con miocardite Molti ceppi di coxsackievirus A non crescono in colture cellulari inoculati nei topi neonati. Esami genomici e sierologici Il tipo specico di enterovirus pu essere determinato utilizzando: - test con anticorpi e antigeni specici neutralizzazione, immunouorescenza, ELISA - RT-PCR metodo veloce e ruoteranno per confermare la diagnosi di meningite da echovirus 11 in neonati o di altre malattie da altri picornavirus La conferma sierologica di uninfezione da enterovirus effettuata attraverso: - rivelazione di IgM speciche - riscontro di un aumento d 4 volte del titolo anticorpale tra la malattia acuta o quello della convalescenza. I numerosi sierotipi di echovirus e virus coxsackie rendono difcile tale approccio. Terapia, prolassi e controllo Il pleconaril nuovo farmaco antivirale a disponibilit limitata: - inibisce la penetrazione dei picornavirus nella cellula - Deve essere somministrato precocemente durante uninfezione. La prevenzione della poliomielite paralitica uno dei trion della medicina moderna dagli USA sono sparite dal 1979 le infezioni da poliovirus selvaggio: - tuttavia, nei paesi sottosviluppati (Africa, Asia, Sud-America) non sempre disponibile e ben visto il vaccino antipolio. Esistono 2 tipi di vaccino contro poliovirus: - vaccino antipolio inattivato (IPV): efcace, ma no a poco tempo fa stato utilizzato il vaccino orale, per la sua maggiore facilit di distribuzione e capacit di produrre immunit duratura - Vaccino vivo attenuato (OPV): lattenuazione ha prodotto un virus che pu replicarsi nellorofaringe e nel tratto GI, ma non pu infettare i neuroni - eliminato con le feci per settimane permette nuove immunizzazioni o reimmunizazione favorisce limmunizzazione di massa - Svantaggio - Pu infettare un individuo immunocompromessi - Pu revertere alla forma virulenta causa di malattia paralitica. Le nuove direttive raccomandano: - IPV per immunizzazione iniziale dei bambini in zone in cui assente il poliovirus selvatico a 2, 4, 15 mesi e a 4/6 anni di et - IPV somministrato al posto dellOPV in diversi paesi europei Non esistono vaccini per coxsackievirus o echovirus: - possono essere controllati migliorando gli standard igienico-sanitari Corso di microbiologia - batteriologia 92 www.bluejayway.it Enterovirus Morfologia e replicazione Capside icosaedrico Genoma RNA+ ss, legato con proteina VPg al 5 e con sequenza poliA al 3 Il genoma nudo sufciente per infettare la cellula Il virus replica nel citoplasma LRNA virale tradotto in una poliproteina, che viene poi tagliata in proteine enzimatiche e strutturali Legano proteine della superfamiglia Ig per entrare nella cellula bersaglio (es. ICAM-1, CD55, PVR/CD155) Stabili a pH tra 3 e 9 Patogenesi e immunit Gli enterovirus entrano attraverso lorofaringe, la mucosa intestinale o il tratto respiratorio superiore infettano il tessuto linfatico sottostante viremia primaria diffusione alle cellule dei tessuti bersaglio seconda viremia Il tessuto bersaglio infettato determina la natura della malattia. La patologia virale responsabile maggiormente di quella immunitaria nel determinare i sintomi Risposta anticorpale secretoria transitoria, ma pu prevenire linizio dellinfezione Risposta anticorpale sierica blocca la diffusione viremica nei tessuti bersaglio Lenterovirus eliminato con le feci per 30 o pi giorni Linfezione generalmente asintomatica, o malattia lieve del tratto respiratorio superiore Epidemiologia Natura della malattia correlata allo specico tipo di enterovirus e et della persona Infezione asintomatica, con disseminazione del virus Il virione resistente a molte condizioni ambientali (acido, temperature, detergenti) Trasmissione oro-fecale scarsa igiene, pannolini sporchi. Ingestione di cibi e acqua contaminata, contatto con mani e materiali infetti, inalazione di aerosol infettivi A rischio: - bambini poliomielite (asintomatica o forma lieve) - Adulti rischio di poliomielite (asintomatica o in forma paralizzante) - Neonati rischio pi alto per gravi malattie da enterovirus e coxsackievirus I virus hanno distribuzione mondiale, salvo il poliovirus, (eradicato nei paesi industrializzati). La malattia pi comune in estate. Modalit di controllo Poliomielite vaccini vivi per via orale (OPV trivalente) o vaccini trivalenti inattivati (IPV) contro i tipi 1, 2 3 di poliovirus Altri non c un vaccino. Condizioni igieniche adeguate prevengono le infezioni. Malattie Poliovirus poliomielite paralizzante Echovirus e coxsackievirus A eritema, erpangina, malattia piedi-mani-bocca Echovirus e coxsackie B miocardite, pericardite, pleurodinia Echovirus e coxsackie, poliovirus meningite Terapia, prevenzione e controllo Pleconaril somministrato prontamente inibisce la penetrazione de picornavirus nella cellula. Vaccini antipolio (IPV e OPV) Buone condizioni igieniche riducono la trasmissione di enterovirus. Corso di microbiologia - batteriologia 93 www.bluejayway.it I rhinovirus costituiscono la causa principale del raffreddore comune e altre infezioni delle vie respiratorie: - tutte infezioni non gravi e autolimitante - Identicati almeno 100 sierotipi di Rhinovirus - Almeno l80% lega ICAM-1 sulle cellule epiteliali, broblasti e cellule B linfoblastoidi Patogenesi e immunit Diversamente dagli enterovirus, i rhinovirus non possono replicare nel tratto gastrointestinale: - labili a pH acido - Crescono meglio a 33C (ambiente freddo della mucosa nasale) - Una singola particella virale infettante pu causare linfezione - malattia al suo apice circa 500-1000 virioni/ml nelle secrezioni nasali - Vie daccesso: naso, bocca, occhi infetta poi il tratto respiratorio superiore. - Esordio e gravit dei sintomi correlati al periodo di eliminazione dei virus e al titolo di virus eliminato. - Le cellule infettate secernono istamina e bradichinina naso che cola Linterferone prodotto in risposta allinfezione pu limitare il progredire dellinfezione e contribuire ai sintomi. Rilascio di citochine nel corso dellinammazione aumento di ICAM-1 espresse facilita la diffusione del virus. Limmunit ai rhinovirus transitoria e la prevenzione di infezioni successive improbabile troppi sierotipi: - infezione primaria sia IgA mucosali che IgG sieriche entro 1 settimana. - La risposta di IgA secretorie cala rapidamente e limmunit decade dopo circa 18 mesi dallinfezione - Limmunit cellulare ha ruolo irrilevante Epidemiologia I rhinovirus causano almeno met di tutte le infezioni del tratto respiratorio superiore. Altri agenti eziologici del raffreddore possono essere: - enterovirus - Coronavirus - Adenovirus - Virus parainuenzali I rhinovirus possono essere trasmessi con: Corso di microbiologia - virologia 94 www.bluejayway.it Rhinovirus Picornavirus a RNA RNA lineare ss Capside nudo Recettore ICAM-1 Causa del comune raffreddore Rhinovirus - aerosol - Oggetti contaminati - Le mani sono il principale vettore, diffuso per contatto diretto persona- persona. Questi virus sono estremamente stabili resistono sugli oggetti per molte ore. I rhinovirus producono malattia clinica solo nel 50% degli individui infetti; - anche gli asintomatici possono diffondere il virus I raffreddori da rhinovirus si vericano pi frequentemente allinizio dellautunno o a ne primavera: - picchi conseguenza di motivi sociali I tassi di infezione sono pi alti nei bambini, soprattutto in tenera et. In una comunit, durante una specica stagione fredda, si possono trovare molti sierotipi di rhinovirus differenti: - solitamente i ceppi predominanti sono quelli recentemente identicati deriva antigenica (mutazioni) simile ai virus inuenzali. Sindromi cliniche I sintomi del raffreddore comune causati da Rhinovirus non possono essere distinti da quelli di altri patogeni virali (es coronavirus, paramyxovirus, enterovirus, ecc): - inizia con starnuti - Rinorrea (naso che cola) - Aumento della rinorrea e sintomi di ostruzione nasale - Possono presentarsi anche - Lieve mal di gola - Cefalea e malessere La malattia raggiunge lapice in 3-4 giorni, ma tosse e sintomi nasali possono persistere per 7-10 giorni. Linfezione da rhinovirus accompagnata da febbre e brividi. Diagnosi di laboratorio La sindrome clinica di raffreddore caratteristica non necessaria diagnosi di laboratorio. Il virus pu essere ottenuto da lavaggi nasali. Cresce in broblasti diploidi umani coltivati a 33C: - identicato per - comparsa di CPE caratteristico - Labilit agli acidi - Sierotipizzazione necessaria solo in pochi casi, ma pu essere eseguita attraverso lutilizzo di sieri neutralizzanti specici. Terapia, prolassi e controllo Esistono molti farmaci da banco per il raffreddore comune, ma nessuna terapia specica: - vasocostrittori nasali sollievo, ma pu essere seguito da una congestione di reazione e peggioramento dei sintomi - Pleconaril inibisce la replicazione dei rhinovirus dimostrato inutile dal punto di vista terapeutico. - Envrirotossina inibisce la RNA polimerasi virale - Analogo polipeptidico basato sulla struttura di ICAM-1 pu essere una soluzione - Somministrazione intravasale di interferone pu bloccare linfezione per breve tempo, dopo sicura esposizione limpiego a lungo termine causa tuttavia sintomi gravi. I vaccini contro rhinovirus sono inutili deriva genica continua continua mutazione degli antigeni virali. Il lavaggio delle mani e la disinfezione di oggetti contaminati sono i mezzi migliori per prevenire la diffusione del virus. Fazzoletti di carta con antivirali chimici limitano la diffusione del virus. Corso di microbiologia - batteriologia 95 www.bluejayway.it La famiglia delle Paramyxoviridae comprende i seguenti generi: - morbillivirus patogeno per luomo, causa il morbillo. - Paramyxovirus i patogeni per luomo sono - Virus parainuenzali - Virus della parotite - Pneumovirus patogeno per luomo il virus respiratorio sinciziale (RSV) Tali virioni hanno in comune: - morfologia e composizione proteica simile - Inducono fusione intracellulare (formazione di sincizi e cellule giganti multinucleate) Le principali malattie causate da questi virioni sono ben note: - virus del morbillo: causa infezione generalizzata, potenzialmente grave, causata da rash maculopapulare (rubeola) - Virus parainuenzali: causano, principalmente nei bambini, infezioni del tratto respiratorio superiore ed inferiore, quali - Faringite - Laringotracheobronchite - Bronchite - Bronchiolite - Polmonite - Virus della parotite: infezione sistemica, la cui principale manifestazione la parotite - RSV: causa negli adulti e nei bambini delle modeste infezioni delle vie respiratorie superiori. I virus del morbillo e della parotite hanno un solo sierotipo sviluppato un solo vaccino efcace a virus vivo: - in USA e altri paesi industrializzati hanno programmi di vaccinazione con vaccini di virus vivo attenuato parotite e morbillo sono diventate malattie rare - Virtuale eliminazione delle gravi complicazioni date dal morbillo. GENERE PATOGENI UMANI PROTEINA DI ATTACCO Morbillivirus Virus del morbillo Emoagglutinina (H) Paramyxovirus Virus parainfluenzale da 1 a 4 Virus della parotite Emoagglutinina- neuraminidasi (HN) Pneumovirus Virus respiratorio sinciziale (RSV) Metapneumovirus Proteina G Struttura e replicazione I paramyxovirus sono costituiti da: - RNA ss a polarit negativa - Capside elicoidale, con envelope pleomorfo di 156-300 nm - Simili agli orthomyxovirus, ma pi grandi e il genoma non segmentato - Lordine delle regioni codicanti del RNA virale, differiscono per ogni genere Il nucleocapside costituito da: - RNA ss a polarit negativa, associato a - NP, nucleoproteina facilita il mantenimento della struttura del genoma - P, fosfoproteina polimerasi coopera alla sintesi del RNA Corso di microbiologia - virologia 96 www.bluejayway.it Paramyxovirus Grande virione con envelope contenente una proteina di attacco virale e una proteina di fusione RNA ss in un nucleocapside elicoidale Replica nel citoplasma Codica RNA- polimerasi Paramyxovirus Enrico Colombo - L, proteina grande la RNA polimerasi virale. - Associato alla proteina di matrice (M) base dellenvelope lipidico Lenvelope contiene due glicoproteine: - proteina di fusione (F): promuove la fusione tra le membrane del virus e della cellula ospite - Per essere attivata deve subire taglio proteolitico derivano due glicopeptidi F1 e F2 - Proteina di attacco: emoagglutinina-neuraminidasi (HN), emoagglutinina (H) o proteina G Schematic representation of the life cycle of a Paramyxovirus. Il ciclo replicativo: - inizia con il legame di NH, proteina G o H ai residui di acido sialico sui glicolipidi della supercie cellulare - Un recettore maggiore per il virus del morbillo il CD46 presente sulla maggior parte dei tipi cellulari, protegge la cellula dal complemento 21 - La proteina F promuove la fusione tra lenvelope e la membrana citoplasmatica - Possono anche indurre la fusione intracellulare sincizi - Replicazione del genoma simile a quelle di altri virus a RNA negativo - La RNA polimerasi gi presente nel nucleocapside - Trascrizione e sintesi proteica nel citoplasma della cellula ospite - Il genoma trascritto - in singoli mRNA - in uno stampo di RNA a polarit positiva di intera lunghezza trascritto in lamento a polarit negativa (nuovi genomi) - I genomi neoformati si associano con le proteine N, L e NP formazione dei nucleocapsidi si associano alle proteine M inserite nella membrana citoplasmatica codicate dalle glicoproteine virali - Le glicoproteine sono sintetizzate e processate come glicoproteine cellulari glicosilazione nel Golgi trasportate in membrana - I virioni maturi gemmano attraverso la membrana plasmatica ed escono dalla cellula. Corso di microbiologia - batteriologia 97 www.bluejayway.it 21 anche il recettore per HSV-6 e per alcuni adenovirus PRODOTTI GENICI LOCALIZZAZIONE NEL VIRIONE FUNZIONE Nucleoproteina (NP) Principale proteina interna Protezione del RNA virale Fosfoproteina polimerasi (P) In associazione con NP Parte del complesso di trascrizione del RNA Matrice (M) Nellenvelope Assemblaggio dei virioni Fattore di fusione (F) Glicoproteina dellenvelope Fattore attivo nella fusione di cellule, nellemolisi e nella penetrazione del virus Emoagglutinina- neuraminidasi (NH), emoagglutinina (H) o proteina G glicoproteina dellenvelope Proteina di attacco Proteina grande (L) In associazione con NP RNA polimerasi Paramyxoviridae Grande virione costituito da RNA- ss in un nucleocapside elicoidale, avvolto da un envelope contenente una proteina di attacco virale (NH/H/G) e una proteina di fusione I tre generi possono essere distinti sulla base dellattivit della proteina dattacco: - NH virus parainuenzali e virus della parotite - H virus del morbillo - G RSV Il virus replica nel citoplasma Penetrazione per fusione dellenvelope con la membrana plasmatica (legame di RNA e proteine con proteina M associata alle glicoproteine F e HN/G/H in membrana) Uscita per gemmazione dalla membrana plasmatica Inducono la fusione intracellulare formazione di cellule giganti multinucleate I paramyxoviridae sono trasmessi attraverso aerosol iniziano linfezione nelle vie respiratorie Limmunit cellulo-mediata causa la maggior parte dei sintomi, ma essenziale per il controllo dellinfezione. Corso di microbiologia - batteriologia 98 www.bluejayway.it Linfezione da virus del morbillo uno dei 5 esantemi tipici dellinfanzia 22 : - in passato era una delle infezioni virali pi fastidiose, con possibili complicazioni - Rash, febbre elevata, tosse, congiuntivite e coriza, prima del 1960, colpivano la maggior parte della popolazione under 20 Dal 1993, anno in cui stato utilizzato in vaccino vivo, sono stati riportati negli USA meno di 1000 casi. Nel mondo ancora causa di morbilit e mortalit, in persone non vaccinate. infezione nelle vie respiratorie replicazione locale nel tratto respiratorio via linfatica (macrofagi e cellule mononucleate) cellule endoteliali infettate + cellule T attivate viremia primaria congiuntiva, vie respiratorie, vie urinarie, piccoli vasi sanguigni, sistema linfatico, SNC emorragia dei piccoli vasi del derma rash (macchie di Koplik) guarigione e immunit duratura encefalite post-infettiva panencefalite sclerosante subacuta (infezione difettiva del SNC) nessuna guarigione dellinfezione acuta dovuta a deficit di linfociti T Patogenesi e immunit Il virus del morbillo in grado di indurre fusione cellulare formazione di cellule giganti sfugge al controllo anticorpale. Nel citoplasma, si formano inclusioni, date da particelle virali incomplete. Generalmente il virus causa lisi cellulare: - in alcuni tipi cellulari pu causare infezioni persistenti, senza lisi (es cellule del SNC) Il virus del morbillo altamente contagioso: - Diffonde attraverso aerosol - Replicazione nelle vie respiratorie invasione del sistema linfatico viremia infezione di - Congiuntiva - Vie respiratorie - Vie urinarie - Capillari sanguigni - Sistema linfatico - Sistema nervoso centrale Nel periodo di incubazione causa: - diminuzione di eosinoli e linfociti - Minore capacit di attivazione nella risposta immunitaria Il rash maculopapulare dovuto alle cellule T che agiscono contro lendotelio infetto dei piccoli vasi. Dopo il rash, nella maggior parte dei casi seguono: - guarigione - Immunit che persiste per tutta la vita Il virus del morbillo pu causare encefalite in tre modi: - infezione diretta dei neuroni - Encefalite post-infettiva immunomediata - Panencefalite sclerosante subacuta (SSPE): dovuta ad una variante difettiva del virus del morbillo che si genera durante la fase acuta - Il virus SSPE agisce come un virus lento - Causa un effetto citopatico dei neuroni sintomi che insorgono molti anni dopo la malattia. Limmunit cellulo-mediata responsabile della maggior parte dei sintomi, ma essenziale per linfezione: - per tutta la durata dellinfezione del morbillo (alcune settimane) il virus causa la repressione del sistema immunitario Corso di microbiologia - virologia 99 www.bluejayway.it 22 assieme a rosolia, roseola, quinta malattia e varicella Virus del morbillo Grande virione con envelope contenente una proteina di attacco virale e una proteina di fusione RNA ss in un nucleocapside elicoidale Replica nel citoplasma Codica RNA- polimerasi Virus del morbillo - infetta monociti e linfociti - Induce le cellule T a produrre citochine TH2 (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) riducono la capacit dellospite di sviluppare risposte protettive cellulo- mediate e DTH - Nonostante ci, una volta sviluppata, la protezione dura per tutta la vita. Epidemiologia Negli USA, un efcace programma di vaccinazione ha trasformato il morbillo in una malattia rara: - in paesi senza programma di vaccinazione epidemia a cicli di 1-3 anni - Molti casi si vericano in ragazzi in et prescolare che vivono in zone urbane di grande estensione - Lincidenza stagionale picchi in inverno e primavera - Ancora una malattia comune in persone nei PVS - La causa di morte pi signicativa di bambini in et tra 1 e 5 anni in molti paesi - Immunocompromessi e denutriti infezione potenzialmente mortale Il virus del morbillo pu diffondere attraverso le secrezioni respiratorie, prima e dopo la comparsa dei sintomi: - una delle malattie pi contagiose che si conoscono - Circa l85% delle persone suscettibili esposte si infetta nel 95% dei casi di persone infette si sviluppa malattia. Il virus del morbillo: - ha un unico sierotipo: - Infetta solo luomo - Causa infezione generalmente sintomatica Lintroduzione della vaccinazione ha signicativamente ridotto lincidenza (del 99%) del morbillo rispetto al periodo prima dellintroduzione della vaccinazione. Scarsa adesione ai programmi di vaccinazione e popolazione non ancora vaccinata (sotto i 2 anni) sono individui suscettibili allinfezione: - il virus pu emergere dalla popolazione stessa o essere importato con limmigrazione da aree in cui assente il programma di vaccinazione Sindromi cliniche Il morbillo una malattia febbrile grave: - incubazione: 7-13 giorni - Prodromi: durante la fase pi infettiva si manifestano con le tre C e P - Febbre elevata - Tosse (C) - Coriza (C) - Congiuntivite (C) - Fotofobia (P) - Dopo 2 giorni di malattia compaiono le tipiche lesioni delle membrane mucose (macchie di Koplik) - Principalmente sulla mucosa buccale, attorno ai molari, ma possono anche comparire in altre mucose (es congiuntiva e vagina) - Lesioni che permangono per 24-48 ore, generalmente piccole, come grani di sale circondati da un alone rosso - La comparsa nella bocca diagnosi certa di morbillo - Dopo 12-24 ore dalla comparsa delle macchie do Koplik esantema diffuso in tutto il corpo rash maculopapulare molto esteso, - Le lesioni diventano conuenti - In 1-2 giorni ricopre tutto il corpo - In tale periodo, la febbre tocca i livelli pi elevati Complicazioni La polmonite una seria complicazione del morbillo: - 60% delle cause di morte associata a morbillo - La mortalit aumenta in caso di malnutrizione ed inversamente proporzionale allet. - I pazienti con polmonite da virus del morbillo possono andare incontro a superinfezione batterica. Una delle complicazioni pi temute del morbillo lencefalite post-infettiva acuta: - fatale nel 15% dei casi in cui si manifesta - Pu manifestarsi nello 0,5% delle persone infettate - Generalmente inizia 7-10 gg dopo la comparsa della malattia - Associata alla demielinizzazione dei neuroni - Pi frequente in giovani e adulti. La panencefalite subacuta sclerosante (SSPE) una complicazione neurologica del morbillo estremamente grave: - colpisce 7/1000000 di pazienti - Grazie alla vaccinazione lincidenza scesa. Corso di microbiologia - batteriologia 100 www.bluejayway.it Schematic diagram of measles virus and the genome and gene order - Si verica quando un virus difettivo persiste nel cervello si comporta come un virus lento - Pu replicarsi e diffondere direttamente da cellula a cellula - Non viene rilasciato - Ha prevalenza in ragazzi inizialmente infetti prima dei 2 anni e si verica approssimativamente 7 anni dopo il morbillo clinico. - Il paziente manifesta - Cambiamento della personalit - Spasticit - Cecit - Perdita di memoria - Spasmi - Spesso sono osservabili alti livelli anticorpali nel sangue e nel liquor di tali pazienti I ragazzi immunocompromessi sono a pi alto rischio di una forma grave di morbillo. In ragazzi carenti di immunit delle cellule T polmonite a cellule giganti senza rash. Superinfezione batteriche e polmoniti gravi si vericano in bambini malnutriti, con anche 25% di mortalit. Time after infection of the three neurologic complications of measles infections: - Acute disseminated encephalomyelitis (ADEM) - Measles inclusion body encephalitis (MIBE) - Subacute sclerosing panencephalitis (SSPE) ADEM, acute, disseminate, encephalomyelitis, MIBE, measles inclusion body encephalytis, SSPE, subacute sclerosino panencephalytis Pathogenesis of measles. Corso di microbiologia - batteriologia 101 www.bluejayway.it Diagnosi di laboratorio La diagnosi di morbillo solitamente clinica manifestazioni molto caratteristiche raramente necessario un test di diagnosi. Il virus del morbillo difcile da isolare e coltivare, ma cresce in colture di cellule umane o scimmia, se pu replicare. La raccolta dei campioni deve essere fatta durante la fase prodromica e no al secondo giorno dopo la comparsa del rash, su: - liquor - Sangue - Urine - Tessuto cerebrale - Secrezioni respiratorie. Il virus pu essere rivelato attraverso: - immunouorescenza localizza lantigene virale in cellule faringee o nel sedimento urinario - RT-PCR in campioni clinici individua il genoma. Nelle cellule prelevate, con colorazione di Giemsa, sono osservabili i caratteristici effetti citopatici: - cellule giganti multinucleate con corpi inclusi citoplasmatici Si possono trovare gli anticorpi, specialmente IgM, quando presente il rash: - linfezione del morbillo confermata osservando - Sieroconversione - Aumento di 4 volte del titolo anticorpale specico per il virus tra siero prelevato durante la fase acuta e durante la fase di convalescenza 1 Measles virus-induced syncytia. Terapia, prolassi e controllo Dal 1993 in uso un vaccino a virus vivo attenuato: - ha permesso di diminuire nei paesi industrializzati lincidenza El virus. - Tale vaccino somministrato a tutti i bambini di 2 anni, in combinazione con i vaccini per la parotite e la rosolia vaccino MMR e per la varicella. - Limmunizzazione efcace nel 95% e pi dei casi - Richiesto tuttavia un richiamo prima dellinizio della scuola. - difcile distribuire il vaccino in regioni prive delle necessarie struttura per la refrigerazione e la distribuzione. Gli ospedali situati nelle zone in cui il morbillo endemico dovrebbero vaccinare i propri dipendenti o controllarne limmunizzazione impedire trasmissione nosocomiale. Agli immunocompromessi somministrazione di globuline sieriche per limitare il rischio e la gravit della malattia clinica. Non sono disponibili trattamenti antivirali specici per il morbillo. Reported measles cases and deaths in the United States from 1960 to 1998. Insert shows data from 1960 to 1979 Corso di microbiologia - batteriologia 102 www.bluejayway.it Virus del morbillo Struttura e replicazione Grande virione costituito da RNA- ss in un nucleocapside elicoidale, avvolto da un envelope contenente una proteina di attacco virale emoagglutinina (H) e una proteina di fusione Il virus replica nel citoplasma Penetrazione per fusione dellenvelope con la membrana plasmatica Uscita per lisi nelle cellule permissive Inducono la fusione intracellulare formazione di cellule giganti multinucleate I paramyxoviridae sono trasmessi attraverso aerosol iniziano linfezione nelle vie respiratorie Limmunit cellulo-mediata causa la maggior parte dei sintomi, ma essenziale per il controllo dellinfezione. Patogenesi In virus infetta le cellule epiteliali respiratorie diffusione sistemica nei linfociti e mediante viremia replica nelle cellule delle congiuntive, respiratorie, sistema linfatico, vasi sanguigni e SNC. Il rash dovuto alla risposta delle cellule T alle cellule endoteliali infettate dei piccoli capillari. Le conseguenze a livello del SNC possono derivare dallimmunopatogenesi (encefalite post- infettiva da morbillo) o dallo sviluppo di mutanti (SSPE) Epidemiologia Virus caratterizzato da virioni di grosse dimensioni, facilmente inattivabili Il periodo contagioso precede i sintomi Infetta solo luomo Esiste un unico sierotipo Causa immunit per tutta la vita Trasmissione inalazione di grosse gocce di aerosol A rischio: - non vaccinati - Immunocompromessi forme pi gravi di morbillo Virus ubiquitario Endemico dallautunno alla primavera Disponibile un vaccino costituito da virus vivo attenuato. Dopo esposizione prolassi con Ig sieriche. Malattie Morbillo: rash maculopapulare caratteristico, tosse, congiuntivite, coriza, fotofobia, macchie di Koplik. Complicazioni otite media, laringotracheobronchite, broncopolmonite, encefalite Morbillo atipico: rash atipico, possibili vescicole, petecchie, porpora o orticaria Panencefalite subacuta sclerosante (SSPE): manifestazioni a livello del SNC (cambiamento di personalit, comportamento e memoria, spasmi, spasticit, cecit) Diagnosi Diagnosticato il morbillo in maniera clinica Coltura difcile, ma i virus che replicano colture primarie di uomo o scimmia Possono essere eseguiti: - immunouorescenza contro antigene virale - RT-PCR per individuare il genoma Diagnosi sierologica attraverso: - sieroconversione - Aumento di 4 volte del titolo tra fase acuta e convalescente Terapia Non esistono farmaci specici Il vaccino MMR, somministrato a 2 anni, garantisce immunizzazione in pi del 95% dei casi richiamo prima dellinizio della scuola Somministrazione di Ig sieriche nei pazienti immunocompromessi a rischio di infezione. Corso di microbiologia - batteriologia 103 www.bluejayway.it I virus parainuenzali, scoperti alla ne degli anni 50, sono virus respiratori, che: - solitamente causano lievi sintomi, simili al raffreddore - Possono causare gravi malattie delle vie respiratorie Il genere parainuenzale comprende 4 sierotipi patogeni per luomo: - tipi 1, 2, 3: infezioni gravi del tratto respiratorio inferiore in neonati e bambini. Principalmente laringotracheobronchite (croup) - Tipo 4: lieve infezione delle vie respiratorie superiori in adulti e bambini Patogenesi e immunit I virus parainuenzali infettano le cellule epiteliali delle vie respiratorie superiori: - replica pi rapidamente rispetto al morbillo e alla parotite - Pu indurre la formazione di cellule giganti e la lisi cellulare. - I virus parainuenzali raramente causano viremia - Si limitano nelle vie respiratorie superiori, causando sintomi simili al raffreddore - Nel 25% delle infezioni diffondono anche alle vie respiratorie inferiori - Nel 2-3% la malattia pu diventare una forma di laringotracheobronchite. La risposta immunitaria cellulo-mediata, oltre a fornire protezione, causa danno cellulare: - lazione delle IgA protettiva, ma dura poco - Linfezione con virus parainuenzali altera la risposta cellulo-mediata limita lo sviluppo della memoria immunologica - Diversi sierotipi + breve durata dellimmunit reinfezione comune, ma con malattia pi lieve. Epidemiologia I virus parainuenzali sono ubiquitari e linfezione comune: - Trasmissione: contatto interpersonale o aerosol - Linfezione primaria solitamente nei neonati e nei bambini con meno di 5 anni - Le reinfezioni si ripetono per tutta la vita. Le infezioni da. - virus parainuenzali 1 e 2 principali cause di laringotracheobronchite, prevalgono in autunno - Virus parainuenzali 3 durante tutto lanno. Tali virus sono diffusi rapidamente allinterno degli ospedali epidemie nei nidi e nei reparti pediatrici. Sindromi cliniche I virus parainuenzali 1, 2, 3 possono causare sindromi delle vie respiratorie, da formi lievi a pi gravi: - lieve raffreddamento coriza, faringite, lieve bronchite e febbre - Bronchiolite - Polmonite I bambini pi grandi e gli adulti, generalmente manifestano forme pi lievi rispetto ai bambini pi piccoli, anche se negli anziani si pu manifestare la polmonite. Linfezione dei neonati pu essere particolarmente grave e sfociare in: - polmonite - Bronchiolite - Laringotracheobronchite evolve nellingrossamento della parte inferiore della glottide possibile ostruzione delle vie respiratorie. - 2-6 gg di incubazione - Sintomi iniziali : tosse, raucedine, tachipnea, tachicardia, retrazione soprasternale - La maggior parte dei bambini guarisce entro 48 ore. La principale diagnosi differenziale associata lepiglottidite da Haemophilus inuenzae. Corso di microbiologia - virologia 104 www.bluejayway.it Virus parainuenzali Grande virione con envelope contenente una proteina di attacco virale e una proteina di fusione RNA ss in un nucleocapside elicoidale Replica nel citoplasma Codica RNA- polimerasi Virus parainuenzali Diagnosi di laboratorio Il virus parainuenzale isolato da lavaggi nasali o secrezioni respiratorie: - cresce bene in colture primarie di cellule di rene di scimmia - Come per gli altri paramyxovirus sensibile al trasporto. La presenza di cellule infette nei broncoaspirati o in coltura testimoniata dallosservazione dei sincizi: - il virus viene identicato per immunouorescenza. La diagnosi pu avvenire anche per: - anticorpi che inibiscono lemoadsorbimento o lemoagglutinazione (in quanto i parainuenzali producono agglutinazione) - RT-PCR sta diventando la metodica preferenziale Terapia, prolassi e controllo La terapia della laringotracheobronchite prevede: - somministrazione di nebulizzazioni fredde o calde - Attento controllo delle alte vie respiratorie - Pu essere necessaria lintubazione. Non sono disponibili farmaci antivirali specici. Vaccinazione con vaccini a virus ucciso inefcace, poich i virus parainuenzali non inducono secrezione locale di anticorpi e risposte cellulo-mediate appropriate. Virus parainuenzali Struttura e replicazione Grande virione costituito da RNA- ss in un nucleocapside elicoidale, avvolto da un envelope contenente una proteina di attacco virale emoagglutinina-neuraminidasi (HN) e una proteina di fusione Il virus replica nel citoplasma Penetrazione per fusione dellenvelope con la membrana plasmatica Uscita per gemmazione dalla membrana plasmatica o per lisi cellulare Inducono la fusione intracellulare formazione di cellule giganti multinucleate trasmessi attraverso aerosol iniziano linfezione nelle vie respiratorie Limmunit cellulo-mediata causa la maggior parte dei sintomi, ma essenziale per il controllo dellinfezione. Patogenesi Esistono 4 sierotipi di virus Infezione limitata alle vie respiratorie, pi comunemente alle vie superiori, ma linfezione alle vie inferiori pu causare malattie rilevanti I virus parainuenzali non sono sistemici e non causano viremia Le malattie comprendono: - sintomi simili al raffreddore - Bronchite - Laringotracheobronchite Linfezione induce immunit protettiva, ma con breve durata Epidemiologia Il virus caratterizzato da virioni grandi, stabili, facilmente inattivabili Il periodo contagioso precede i sintomi e si pu vericare anche in sua assenza Spettro dospite umano Possibili reinfezioni Trasmissione inalazione di aerosol A rischio - bambini per malattie lievi e tracheobronchite - Adulti reinfezione con sintomi pi lievi Il virus ubiquitario e diffuso in tutto il mondo Lincidenza stagionale Non esistono modalit di controllo Malattie Da forme lievi di raffreddamento delle alte vie respiratorie A bronchiolite o bronchite Laringotracheobronchite nei neonati, pericolosa. Diagnosi di laboratorio Isolamento in coltura da lavaggi nasali o secrezioni respiratorie Coltura su cellule di rene di scimmia, ma difcile il trasporto Identicazione con immunouorescenza Possibile test con anticorpi che inibiscono lemoagglutinazione e lemoadsorbimento RT-PCR Terapia, prolassi e controllo Terapia sintomatica Non esiste terapia antivirale specica Vaccinazione inutile. Corso di microbiologia - batteriologia 105 www.bluejayway.it Il virus della parotite causa una parotite acuta benigna (ingrossamento doloroso delle ghiandole salivari): - raro nei paesi in cui si utilizza il vaccino a virus vivo (vaccinazione MMR) - Strettamente correlato al virus parainuenzale tipo 2, ma non ha immunit crociata. Pathogenesis of mumps (orecchioni) Patogenesi e immunit Il virus della parotite, un solo sierotipo, causa infezione litica delle cellule: - infetta inizialmente le cellule epiteliali delle vie respiratorie superiori - Attraversa il dotto di Stensen o entra in circolo (viremia) infetta la parotide. - Per viremia pu giungere ad altri organi - Testicolo - Ovaie - Pancreas - Tiroide In circa il 55% dei casi si verica infezione sintomatica nel SNC, specialmente a livello delle meningi dovuta a risposta inammatoria. Lincontro con il virus della parotite causa immunit persistente per tutta la vita. replicazione nel tratto respiratorio ingresso nelle vie respiratorie viremia primaria parotidi il virus si replica nelle cellule epiteliali. lingrossamento doloroso dovuto alla reazione infiammatoria locale Sistema nervoso centrale pancreas testicoli ovaie nervi periferici occhi orecchio interno sintomi meningei pu essere associato a diabete giovanile 55% 10% Epidemiologia La parotite una malattia altamente contagiosa: Corso di microbiologia - virologia 106 www.bluejayway.it Virus della parotite Grande virione con envelope contenente una proteina di attacco virale e una proteina di fusione RNA ss in un nucleocapside elicoidale Replica nel citoplasma Codica RNA- polimerasi Virus della parotite - trasmissione: contatto interumano diretto o aerosol respiratorio - In assenza di programmi di vaccinazione colpisce il 90% della popolazione entro i 15 anni. - Il virus presente nelle secrezioni respiratorie circa 7 giorni prima della comparsa dei sintomi - Spesso la malattia asintomatica impossibile controllare la diffusione La disseminazione del virus promossa dalle persone che lavorano in ambienti chiusi. Lincidenza stagionale maggiore in inverno. CLINICAL ASPECTS OF MUMPS Site of replication of virus Symptoms Notes Salivary glands Inflammation, parotitis, in a child with mumps. Virus is shed in saliva from 3 days before to 6 days after symptoms Salivary gland symptoms are often absent or may be unilateral Sindromi cliniche Spesso le infezioni sono asintomatiche. La parotite si manifesta inizialmente bilaterale e accompagnata da febbre: - Lesame della bocca arrossamento e gonore dellostium del dotto di Stenson - Qualche giorno dopo lesordio dellinfezione virale (o anche senza parotite) possono manifestarsi ingrossamenti ad altre ghiandole - Epididimo-orchite - ooforite - mastite - Pancreatite - Tiroidite Linammazione risultante dallorchite virale pu essere causa di sterilit. Nel 50% dei pazienti il virus interessa il SNC, e lo manifestano sintomatologicamente. giorni modificazioni patologiche del tratto respiratorio induzione da interferone risposta immunitaria cellulo- mediata virus nelle secrezioni respiratorie aumento degli anticorpi virus-specifici malattia sintomatica simil- influenzale infezione batterica secondaria incubazione convalescenz a 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 3 3 3 3 3 3 8 3 8 7 4 3 8 7 4 3 8 7 4 8 7 4 8 7 4 8 7 6 4 8 6 4 8 6 4 8 6 5 4 6 5 6 5 6 6 6 6 6 giorni 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 Giorni orchite parotite anticorpi virus-specifici isolamento dal liquor incubazione eliminazione del virus da bocca e urine Diagnosi di laboratorio Il virus pu essere isolato da: - Saliva (per circa 5 giorni dopo la manifestazione dei sintomi) - Urine (per 2 settimane dai sintomi) - Faringe - Secrezioni del dotto di Stensen - Liquor Il virus cresce bene in cellule di rene di scimmia forma sincizi In cellule infettate si osserva anche lemoadsorbimento degli eritrociti di cavia, dovuto allemoagglutinina. La diagnosi clinica pu essere confermata attraverso indagine sierologica: - aumento di 4 volte del titolo anticorpale virus-specico - Riscontro di IgM speciche per il virus della parotide Per ricercare virus, antigene e anticorpi ELISA e immunouorescenza. Corso di microbiologia - batteriologia 107 www.bluejayway.it Terapia, prolassi e controllo I vaccini sono lunica efcace misura preventiva si somministra assieme ai vaccini per morbillo e rosolia (MMR) Non sono disponibili farmaci antivirali. Virus parainuenzali Struttura e replicazione Grande virione costituito da RNA- ss in un nucleocapside elicoidale, avvolto da un envelope contenente una proteina di attacco virale emoagglutinina-neuraminidasi (NH) e una proteina di fusione (F) Il virus replica nel citoplasma Penetrazione per fusione dellenvelope con la membrana plasmatica Uscita per gemmazione dalla membrana plasmatica o per lisi cellulare Patogenesi Infetta le cellule epiteliali delle vie respiratorie Diffonde sistematicamente per viremia Infetta parotide, testicoli e SNC La risposta inammatoria causa lingrossamento della parotide Il virus diffonde cellula-cellula anticorpi hanno un ruolo marginale Limmunit cellulo-mediata essenziale per il controllo dellinfezione ed responsabile di parte dei sintomi Linfezione induce immunit protettiva per tutta la vita Epidemiologia Il virus caratterizzato da virioni grandi, facilmente inattivabili Il periodo contagioso precede i sintomi e si pu vericare anche in sua assenza Spettro dospite umano Un solo sierotipo Trasmissione inalazione di aerosol A rischio non vaccinati e immunocompromessi forme pi gravi Il virus ubiquitario e diffuso in tutto il mondo Lincidenza stagionale: inverno e inizio della primavera Il vaccino a virus vivo attenuato, parte della MMR, permette il controllo. Malattie Parotite bilaterale accompagnata da febbre. Meningoencefalite o orchite, pancreatite, tiroidite e epididimite, altre complicazioni Diagnosi di laboratorio Isolamento in coltura da urine, saliva, secrezioni del dotto di Stenson, dal liquor Coltura su cellule di rene di scimmia, ma difcile il trasporto Identicazione con immunouorescenza Possibile test con anticorpi che inibiscono lemoagglutinazione Saggio di emoadsorbimento enzimatico (ELISA) Sierologia: aumento di 4 volte del livello di Ig o sieroconversione Terapia, prolassi e controllo Terapia specica impossibile Unico metodo di controllo il vaccino Corso di microbiologia - batteriologia 108 www.bluejayway.it Il virus respiratorio sinciziale (RSV) membro del genere Pneumovirus: - non codica alcuna proteina con attivit emoagglutinante e neuroaminidasica - Principale causa di infezioni fatali acute delle vie respiratorie nei neonati e nei bambini - Potenzialmente, infetta tutta la popolazione nei primi 2 anni di et e le reinfezioni si ripetono per tutta la vita. Patogenesi e immunit RSV instaura uninfezione localizzata delle vie respiratorie: - induce formazione di sincizi. - Invasione diretta dellepitelio danno cellulare causato dalla risposta immunitaria effetto citopatico (necrosi cellulare) - necrosi di bronchi e bronchioli nei neonati formazione di placche di muco, brina e materiale necrotico nelle vie aeree minori rapida ostruzione delle vie respiratorie nei neonati. Limmunit naturale non previene la reinfezione. La vaccinazione a virus ucciso pare aggravare la malattia invece di prevenirla. Epidemiologia RSV altamente prevalente e infetta quasi tutti i bambini entro i 2 anni di et: - tassi annui globali di infezione di 64 milioni di casi - 25-33% dei casi coinvolgimento delle vie respiratorie inferiori - 1% dei casi necessario il ricovero in ospedale. Le infezioni da RSV si vericano quasi sempre durante linverno, vericandosi epidemie ogni anno. Il virus altamente contagioso: - incubazione 4-5 giorni - Ingresso del virus in reparto neonatale pu essere devastante. - Linfezione associata a stati patologici gravi, talvolta a morte. - Trasmissione attraverso - Mani - Oggetti contaminati - Respiratoria Il virus viene eliminato con le secrezioni respiratorie per molti giorni. Sindromi cliniche RSV pu causare svariati tipi di malattie delle vie respiratorie, dal raffreddore alla polmonite: - infezione del tratto respiratorio superiore rinorrea (naso che cola) - Pi frequente negli adolescenti e negli adulti - Bambini molto piccoli infezioni pi gravi delle vie respiratorie inferiori (bronchiolite) diminuisce la ventilazione, con - sintomi quali - Lieve febbre - Tachipnea - Tachicardia - Sibili espiratori polmonari - Generalmente la malattia autolimitante, ma pu diventare preoccupante se colpisce un neonato - Pu essere fatale per - Neonati prematuri - Individui con malattie polmonari - Immunocompromessi. Diagnosi di laboratorio Difcoltoso lisolamento del virus in colture cellulari. Cellule infettate e lavaggi nasali: - RT-PCR: dimostrazione del genoma - Immunouorescenza e test immunoenzimatici: ricerca dellantigene virale nelle cellule infette Corso di microbiologia - virologia 109 www.bluejayway.it Virus respiratorio sinciziale Grande virione con envelope contenente una proteina di attacco virale e una proteina di fusione RNA ss in un nucleocapside elicoidale Replica nel citoplasma Codica RNA- polimerasi Virus respiratorio sinciziale - Sierologia: aumento di 4 volte del titolo anticorpale o sieroconversione utile per confermare la diagnosi (soprattutto a scopi epidemiologici) Terapia, prolassi e controllo Bambini sani terapia di supporto: - ossigeno - Liquidi per via endovenosa - Vapore freddo nebulizzato Pazienti predisposti a decorso grave (immunocompromessi, nati prematuri e neonati) somministrazione per inalazione di ribavarina, un analogo della guanosina: - Per i neonati prematuri disponibile anche immunizzazione passiva con Ig anti-RSV I bambini infetti devono essere isolati. Il personale ospedaliero che si prende cura dei bambini infetti deve usare precauzioni: - pulizia delle mani - guanti - mascherina - Occhiali Virus respiratorio sinciziale (RSV) Struttura e replicazione Grande virione costituito da RNA- ss in un nucleocapside elicoidale, avvolto da un envelope contenente una proteina G di attacco virale e una proteina di fusione Il virus replica nel citoplasma Penetrazione per fusione dellenvelope con la membrana plasmatica Uscita per gemmazione dalla membrana plasmatica o per lisi cellulare (immuno-mediata) Formazione di sincizi Trasmesso attraverso aerosol, mani, contatto con oggetti contaminati Leffetto citopatico dovuto alla risposta immunitaria cellulare. Patogenesi Infezioni localizzate delle vie respiratorie Non viremia o diffusione sistemica Bronchiolite probabilmente associata alla risposta immunitaria Le strette vie aeree dei neonati vengon rapidamente ostruiti da placche di muco, brina e materiale necrotico. Linfezione non previene la reinfezione. Epidemiologia Virione grande, facilmente inattivabile Periodo di contagio precede i sintomi e pu essere asintomatico Lo spettro dospite soltanto luomo Trasmissione gocce di aerosol inalate A rischio: - neonati infezioni delle vie respiratorie inferiori - Bambini da forme lievi a polmonite - Adulti reinfezione con sintomi pi lievi Virus a diffusione mondiale, ubiquitario. Prevalenza invernale Disponibili x il controllo e la prolassi delle immunoglobuline per i neonati ad alto rischio Malattie Bronchiolite, polmonite o entrambe: febbre, tosse, dispnea e cianosi in bambini con meno di 1 anno Rinite febbrile, faringite: comuni nei bambini Raffreddore: comune negli adulti e negli adolescenti Diagnosi Difcile isolamento. Per ricerca del virus - RT-PCR - Test immunoenzimatici e immunouorescenza Sierologia utile per confermare la diagnosi a scopi epidemiologici. Terapia, prolassi e controllo. Bambini sani terapia di supporto (ossigeno, liquidi per via endovenosa, vapore nebulizzato) Bambini a rischio ribavirina per inalazione e Ig Anti-RSV Necessario isolare i bambini infetti Il personale medico che entra a contato deve utilizzare precauzioni Non disponibile un vaccino efcace. Corso di microbiologia - batteriologia 110 www.bluejayway.it Gli orthomyxovirus comprendono soltanto i virus dellinuenza A, B e C: - solo i virus A e B sono causa di malattie rilevanti nelluomo - Dotati di envelope - Possiedono genoma costituito da RNA segmentato a polarit negativa - Facilita lo sviluppo di nuovi ceppi attraverso mutazione e riarrangiamento di segmenti genici tra diversi ceppi patogeni per luomo e per gli animali. - Linstabilit genetica responsabile di: - Epidemie annuali (mutazione: drift) - Pandemie periodiche (riassortimento: shift) Linuenza una delle principali e pi diffuse infezioni virali: - descrizioni di epidemie inuenzali in qualsiasi epoca - La pi famosa pandemia linuenza spagnola, vericatasi nel 1918 20-40 milioni di morti - Lultima pandemia registrata nel 1977 - Oggi sono disponibili vaccini e farmaci antivirali per la prolassi di persone a rischio I virus dellinuenza sono generalmente virus respiratori, che oltre a sintomi respiratori, causano sintomi tipici dellinuenza: - febbre - Mal di testa - Malessere - Mialgia Il termine inuenza, tuttavia, utilizzato erroneamente anche per descrivere altre patologie virali e altre infezioni respiratorie (es. Inuenza intestinale) Struttura I virioni dellinuenza sono: - pleomor, - Forma sferica o tubulare - Con diametro di 80-120 nm Lenvelope - contiene due glicoproteine: - Emoagglutinina (HA) - Neuraminidasi (NA) - delimitato internamente dalle proteine - della matrice (M1) - E della membrana (M2) Il genoma dei virus dellinuenza A e B consiste di otto segmenti nucleocapsidici elicoidali: - Ogni segmento contiene un RNA a polarit negativa associato con - nucleoproteina (NP) - Trascrittasi (componenti della RNA polimerasi: PB1, PB2, PA) - Il virus dellinuenza C ha solo 7 segmenti capsidici Tutte le proteine sono codicate da segmenti separati, eccetto: - proteine non strutturali (NS1 e NS2) - Proteine M1 e M2 EMOAGGLUTININA La HA (emoagglutinina) un trimero a fora di spicola: - ogni unit attivata da una proteasi tagliata in due subunit che restano unite da un legame disolfuro - La HA possiede numerose funzioni - Proteina di attacco del virus lega lacido sialico sui recettori di supercie delle cellule epiteliali. - Promuove la fusione tra envelope e membrana cellulare - Agglutina lega e aggrega gli eritrociti - Stimola la produzione di anticorpi neutralizzanti - cambiamenti dovuti a mutazioni nellemoagglutinina responsabili della variabilit minore e maggiore (Shift e drift) - I cambiamenti antigenici maggiori si vericano solo per il virus inuenzale A - Le diverse emoagglutinina sono denite H1, H2, ecc Corso di microbiologia - virologia 111 www.bluejayway.it Orthomyxovirus Virus a RNA- segmentato Instabilit genetica: - mutazioni - Riarrangiamento Capside e envelope con HA e NA Codica una RNA polimerasi Pleomor (forma sferica o tubulare) Orthomyxovirus Enrico Colombo NEURAMINIDASI La glicoproteina NA (neuraminidasi) forma un tetrametro con attivit enzimatica: - taglia lacido sialico delle glicoproteine, compreso il recettore cellulare - Leliminazione dellacido sialico dalle proteine virioniche - previene lagglutinazione dei virioni - facilita la liberazione del virus dalle cellule infette - due farmaci antivirali (zanamivir e oseltamivir) hanno come bersaglio NA - Anche la neuraminidasi dellinuenza A subisce cambiamenti antigenici - Le diverse forme sono denominate N1, N2, ecc ALTRE PROTEINE Le proteine M1, M2 e NP sono tipo-speciche utilizzate per differenziare i virus inuenzali A, B e C: - proteine M1: rivestono la supercie interna del virione e ne promuovono lassemblaggio - Proteina M2: forma un canale protonico nella membrana favorisce la scapsidazione e il rilascio del virus. - La proteina M2 del virus inuenzale A bersaglio dei farmaci antivirali amantadina e rimantadina SEGMENTO DI RNA PROTEINA FUNZIONE 1 PB1 Componente della polimerasi 2 PB2 Componente della polimerasi 3 PA Componente della polimerasi 4 HA Emoagglutinina, proteina di attacco virale, proteina di fusione, bersaglio di anticorpi neutralizzanti 5 NP Nucleocapside 6 NA Neuraminidasi (taglia i residui di acido sialico e promuove il rilascio del virus 7 M1 Proteina della matrice: proteina strutturale virale che interagisce con nucleocapside e con lenvelope, promuove lassemblaggio M2 Proteina di membrana: forma canali di membrana, favorisce la spoliazione e la produzione di HA bersaglio dellamantadina e della rimantadina 8 NS1 Proteina non strutturale (inibisce la traduzione dellmRNA cellulare) NS2 Proteina non strutturale (funzione importante ma ignota) Replicazione Lentrata nel citoplasma vede susseguirsi i seguenti passaggi: - legame di HA a residui di acido sialico sulle glicoproteine della supercie cellulare - Internalizzazione in vescicole rivestite e trasferito in un endosomi - Acidicazione dellendosoma modicazioni conformazionali di HA esposizione di regioni idrofobiche della molecola promozione della fusione della membrana virale con quella endosomiale fusione - La proteina M2 promuove lacidicazione del contenuto dellenvelope interrompe linterazione tra proteina M1 e NP scapsidazione rilascio del nucleocapside. - Il nucleocapside si porta nel nucleo trascritto in mRNA La fase di trascrizione e sintesi proteica vede: - La trascrittasi del virus inuenzale (PA, PB1, PB2) utilizza mRNA della cellula ospite come primer per la sintesi dellRNA messaggero virale - Sottrae la regione in 5 metilata (cap) dellRNA sottrae ai ribosomi lRNA cellulare Corso di microbiologia - batteriologia 112 www.bluejayway.it - Tutti i trascritti sono dotati di cap in 5 e poliA in 3 - I mRNA+ trascritti sono messaggeri per le singole proteine - Fanno eccezione quelli per le proteine M e NS processati per splicing da enzimi cellulari - Gli mRNA sono tradotti nel citoplasma. - Le glicoproteina HA e NA processate nel reticolo di Golgi trasportate sulla supercie cellulare. - M2 si inserisce nelle membrane cellulari il canale protonico previene lacidicazione del Golgi e delle altre vescicole impedisce il cambiamento conformazionale e linattivazione pH indotta della proteina HA quando nel reticolo di Golgi. Successivamente, vengon prodotte: - catene di RNA a polarit positiva complementari a ciascun segmento - RNA genomico a polarit negativa replicato nel nucleo. I segmenti genomici sono trasferiti nel citoplasma si associano alla polimerasi e alla proteina NP nucleocapsidi: - interagiscono con M1, che delimita le regioni della membrana citoplasmatica che contiene M1, HA, NA - Tali regioni avvolgono i segmenti genomici forniscono lenvelope - Processo casuale incorporati in media 11 segmenti per virione. - Si forma un piccolo numero di virioni dotati di genoma completo (8 segmenti) e numerose particelle difettive - Le particelle difettive sono antigeniche possono causare interferenza alla progressione dellinfezione. - Il virus gemma dalla supercie apicale della cellula grazie allinserzione selettiva di HA in membrana Il virus generalmente rilasciato 8 ore dopo linfezione. Patogenesi e immunit Il virus inuenzale inizialmente provoca uninfezione del tratto respiratorio superiore: - infetta e uccide le cellule mucipare, le cellule ciliate e altre cellule epiteliali perdita del primario meccanismo di difesa - Proteina NA facilita linfezione taglia i residui di acido sialico del muco permette laccesso ai tessuti. - rilascio preferenziale del virus sulla supercie apicale facilita la diffusione cellula-cellula e la trasmissione ad altri ospiti. Replicazione del virus dellinuenza A. Dopo il legame ai recettori contenenti acido sialico, il virus internalizzato per endocitosi in una vescicola rivestita. Successivamente, grazie ad HA, si fonde con la vescicola ed entra nel citoplasma. M2 acidica il contenuto dellenvelope, permettendo la scapsidazione. Trascrizione e replicazione del genoma avvengono nel nucleo. Sono sintetizzate le proteine virali, si formano i segmenti nucleocapsidici elicoidali (polimerasi e NP), i quali si associano a M1 e M2, le quali sono associate a porzioni di membrana citoplasmatica contenenti glicoproteine HA e NA, provenienti dal reticolo di Golgi. Il virus rilasciato per gemmazione. Se il virus diffonde nel tratto respiratorio inferiore gravi desquamazioni dellepitelio bronchiale e alveolare, raggiungendo le cellule dello strato basale e della membrana basale Linfezione inuenzale, inoltre, compromettendo le difese naturali del tratto respiratorio, facilita ladesione di batteri alle cellule epiteliali: - patogenesi virale o uninfezione batterica secondaria polmonite - Viremia temporanea raramente pu coinvolgere altri organi oltre al polmone Dal punto di vista istologico: - infezione risposta inammatoria cellulare a livello delle mucose monociti, linfociti e neutroli edema submucosale - Il tessuto polmonare pu presentare Corso di microbiologia - batteriologia 113 www.bluejayway.it - alterazioni della membrana ialina, - ensema alveolare - Necrosi della parete alveolare. NORMAL TRACHEAL MUCOSA 3 DAYS POST-INFECTION 7 DAYS POST-INFECTION La guarigione associata a: - produzione di interferone - Risposta immunitaria cellulo-mediata Tali risposte si vericano in concomitanza della fase febbrile. Lintervento delle cellule T guarigione e immunopatogenesi: - solitamente, linfezione inuenzale deprime la risposta dei macrofagi e delle cellule T ostacolo alla risoluzione da parte del sistema immunitario - Spesso la guarigione precede la rivelazione di anticorpi nel siero o nelle secrezioni. La protezione nei confronti di una seconda infezione dovuta principalmente agli anticorpi contro HA e NA: - la risposta anticorpale specica per ciascun ceppo di virus - La risposta cellulo-mediata pi generica agisce nei confronti di ceppi differenti appartenenti allo stesso tipo (virus A o virus B) - Diretta contro gli antigeni del nucleocapside (PB2 e NP), M1 e HA - Gli antigeni PB2 e M1 sono identici per tutti i ceppi dello stesso tipo cellule T memoria possono proteggere verso inuenza sostenuta da ceppi diversi dello stesso tipo (inuenza A o inuenza B) I sintomi e la durata della malattia dipendono da: - azione dellinterferone - Risposta cellulo-mediata - Entit del danno tissutale Linuenza generalmente una malattia autolimitante: - non coinvolge generalmente altri organi oltre al polmone - Molti dei classici sintomi inuenzali sono dovuti allinterferone - Febbre - Malessere - Mal di testa - Mialgia - La riparazione del tessuto danneggiato inizia dopo 3-5 giorni dalla comparsa dei sintomi - Pu richiedere mesi, soprattutto in pazienti anziani. Corso di microbiologia - batteriologia 114 www.bluejayway.it inoculazione del virus con aerosol replicazione nel tratto respiratorio sindrome influenzale desquamazione delle cellule ciliate e mucipare anticorpi risposta cellulo-mediata interferone protezione futura infezione batterica secondaria polmonite virale primaria coinvolgimento di muscoli e SNC polmonite Corso di microbiologia - batteriologia 115 www.bluejayway.it Epidemiologia I ceppi del virus dellinuenza A sono classicati in base a 4 caratteristiche - tipo (A, B, C) - Luogo del primo isolamento - Data del primo isolamento - Antigene (HA e NA) Un ceppo di virus inuenzale dunque indicato come A/Bangkok/1/79(H3N2). Un virus dellinuenza B, dato che gli antigeni sono identici per tutti i ceppi del tipo, classicato in base a: - tipo - Luogo del primo isolamento - Data del primo isolamento Un esempio pu essere B/Singapore/3/64. Nuovi ceppi inuenzali di tipo A si generano per: - Mutazioni antigenic drift - Riassortimento antigenic shift I virus inuenzali A infettano sia uomo che animali e possiedono un genoma segmentato: - coinfezione di due virus di inuenza A riassortimento casuale dei segmenti genomici virus ibridi. - Scambio delle glicoproteine HA possibile generare un nuovo virus che pu infettare una popolazione umana immunologicamente suscettibile - Esempio: un virus H5N1 delle anatre e un virus umano H3N2 hanno infettato simultaneamente dei maiali isolato un virus riassortito in grado di infettare luomo Probabilmente, tale tipo di riassortimento la fonte di ceppi patogeni per luomo: - Cina alta densit di popolazione e promiscuit tra uomini, maiali, polli e anatre terreno fertile per nuovi virus riassortiti e fonte di altri ceppi pandemici da inuenza - Nel 1997 ceppo aviario H5N1 fu isolato da almeno 18 persone e caus 6 morti - Virus H5N1 era insolito non era un riassortante, molto virulento e potenzialmente trasmesso dai volatili alluomo. ANTI GENI C SHI F T Corso di microbiologia - batteriologia 116 www.bluejayway.it I cambiamenti antigenici minori, dovuti a mutazioni dei geni per HA e NA, sono detti antigenic drift: - ogni 2/3 anni - Causano epidemie locali di inuenza - Coinvolgono entrambi i tipi A e B I cambiamenti antigenici maggiori, antigenic shift, derivano dal riassortimento tra genomi di ceppi diversi: - riguardano solo il tipo inuenzale A - Il riassortimento antigenico si verica di rado, ma pu essere devastante pandemie A differenza del virus inuenzale A, il virus B prevalentemente umano. Variabilit antigenica dei virus inuenzali presenza sicura di individui immunologicamente nave nella popolazione suscettibili allinfezione: - soprattutto i bambini - Unepidemia inuenzale pu essere riconosciuta immediatamente dallaumento di assenze nelle scuole e dai posti di lavoro. - Ogni anno, nelle regioni temperate, si vericano epidemie inuenzali - Generalmente, un virus, permane in una comunit per un tempo breve 4-6 settimane. Linfezione diffonde tramite aerosol espulso quando una persona parla o tossisce: - il virus resiste nellambiente per circa 24 ore. Le persone pi suscettibili sono i bambini principali veicoli di diffusione. - La fase contagiosa precede i sintomi ed piuttosto prolungata A rischio di complicazioni (prevalentemente polmoniti) sono: - bambini - Immunodepressi (comprese le donne incinta) - Anziani (90% della mortalit in >65) - Persone con problemi cardiaci o polmonari Le epidemie di inuenza A e B sono attentamente sorvegliate, allo scopo di identicare nuovi ceppi contro cui allestire nuovi vaccini: - il ceppo prevalente inuenzale A o B cambia ogni anno - La sorveglianza estesa anche alle popolazioni animali (possibile riassortimento del virus A) Corso di microbiologia - batteriologia 117 www.bluejayway.it Sindromi cliniche Linfezione pu essere da asintomatica a grave, a seconda del grado di immunit nei confronti del ceppo infettante e di altri fattori: - forme gravi frequenti in - Immunodepressi - Fumatori Il decorso tipico di uninuenza : - incubazione 1-4 giorni - Periodo prodromico per qualche ora si manifestano senso di malessere e mal di testa - Iniziano improvvisamente i vari sintomi inuenzali - Febbre (3-8 giorni) - Brividi - Mialgia - Perdita di appetito - Tosse non produttiva - La risoluzione della malattia, in genere, si ottiene in 7-10 giorni. Linuenza nei bambini molto piccoli pu ricordare altre infezioni del tratto respiratorio, in quanto causa anche: - bronchiolite - Croup - Otite media - Vomito - Dolore addominale Le complicazioni comprendono: - polmonite batterica - Miosite - Sindrome di Reye Linuenza pu causare direttamente polmonite, ma generalmente si verica una infezione batterica secondaria polmonite o bronchiolite: - il danno tissutale pu essere esteso possibile ipossia e polmonite bilaterale - Nellinfezione batterica possono essere solitamente coinvolti - Streptococcus pneumoniae - Haemophilus inuenzae - Staphylococcus aureus. - In caso di infezione batterica espettorato produttivo e purulento Generalmente linfezione limitata al polmone. Tuttavia, determinati ceppi possono diffondere, in alcune persone, in altri siti: - bambini miosite - Encefalopatia rara, pu essere associata a inuenza acuta e potenzialmente fatale - Encefalite postinuenzale manifesta 2/3 settimane dopo la guarigione associata ad unevidente inammazione. La sindrome di Reye unencefalite acuta: - colpisce i bambini - Pu vericarsi dopo svariate infezioni virali acute e febbrili (es varicella, inuenza A o B) - Il rischio di questa malattia aumenta nei trattati con aspirina - Presenta anche disfunzione epatica - Mortalit no al 40% MALATTIA SINTOMI Influenza acuta in adulti Repentini attacchi febbrili, malessere, mialgia, mal di gola, tosse non produttiva influenza acuta in bambini Malattia acuta simile a quella degli adulti, ma con febbre pi alta, sintomi gastrointestinali (dolori addominali e vomito), otite media, miosite e croup Complicazioni nellinfezione da virus influenzale Polmonite virale primaria Polmonite batterica secondaria Miosite Coinvolgimento cardiaco Sindromi neurologiche (Guillain-Barr, encefalopatia, encefalite, sindrome di Reye) Corso di microbiologia - batteriologia 118 www.bluejayway.it ricerca di laboratorio patogenesi patogenesi giorni modificazioni patologiche del tratto respiratorio induzione da interferone risposta immunitaria cellulo- mediata virus nelle secrezioni respiratorie aumento degli anticorpi virus-specifici malattia sintomatica simil- influenzale infezione batterica secondaria incubazione convalescenz a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 3 7 3 9 7 5 3 9 7 5 9 7 5 9 8 7 5 9 8 7 10 9 8 7 4 10 8 7 6 4 5 10 8 7 6 4 5 10 8 6 4 5 10 8 6 4 5 10 8 6 4 5 10 8 6 4 5 10 8 6 5 10 8 6 5 10 8 6 5 10 8 6 5 10 8 6 5 10 8 6 5 10 8 6 5 10 8 6 5 10 8 6 5 10 8 6 5 10 8 6 5 10 8 6 10 8 6 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 influenza Giorni modificazioni patologiche del tratto respiratorio induzione da interferone risposta immunitaria cellulo-mediata virus nelle secrezioni respiratorie aumento degli anticorpi virus-specifici malattia sintomatica simil-influenzale infezione batterica secondaria incubazione convalescenza Diagnosi di laboratorio Se una persona manifesta i tipici sintomi inuenzali, mentre nella comunit in corso unepidemia, pu essere effettuata la diagnosi di inuenza. In laboratorio si possono distinguere il tipo e il ceppo virale dellinuenza. Campioni clinici secrezione respiratoria Coltura cellulare: - terreni cellule di rene di scimmia o nella linea cellulare di rene canino Madin-Darby - Effetti citopatici limitati, osservati dopo 2-4 giorni - Laggiunta di eritrociti di cavia prima dei CPE evidenzia lemoadsorbimento (adesione di eritrociti alle cellule infette che esprimono HA) - Aggiunta ad eritrociti di terreno contenente virus inuenzale emoagglutinazione (formazione di un aggregato gelatinoso) Emoadsorbimento e emoagglutinazione non sono specici per virus inuenzali (anche virus parainuenzali e altri mostrano tali propriet). Sono disponibili anche tecniche pi rapide per rivelare e identicare il genoma o altri antigeni: - saggi antigenici rapidi differenza tra A e B - RT-PCR con primers generici per linuenza, o specici distinzione di nuovi ceppi. - Saggi immunoenzimatici o immunouorescenza identicazione di antigeni inuenzali nelle cellule esfoliate, nelle secrezioni, nelle colture cellulari. - Inibizione dellemoagglutinazione e dellemoadsorbimento con anticorpi specici - La sierologia utilizzata prevalentemente a scopo epidemiologico DIAGNOSI ISOLAMENTO SECREZIONI NASALI, ESCREATO COLTURE CELLULARI COLTURE IN UOVA SIEROLOGIA ANTICORPI FISSANTI IL COMPLEMENTO ANTICORPI INIBENTI L`EMOAGGLUTINAZIONE TEST RAPIDI (QuikVue influenza test) ELISA IMMUNOFLUORESCENZA PCR Corso di microbiologia - batteriologia 119 www.bluejayway.it TEST RILIEVI Coltura in cellule primarie di rene di scimmia o rene canino di Madin-Darby Presenza del virus, limitati effetti citopatici Emoadsorbimento su cellule infettate Presenza di HA sulla superficie cellulare Emoagglutinazione Presenza di virus nelle secrezioni Inibizione dellemoagglutinazione Tipo e ceppo di virus dellinfluenza o specificit anticorpale Immunofluorescenza e ELISA Antigeni virali nelle secrezioni respiratorie o nelle colture tissutali Sierologia: inibizione dellemoagglutinazione, inibizione dellemoadsorbimento, ELISA, immunofluorescenza, fissazione del complemento Epidemiologia sierologica Test molecolari: RT-PCR Identificazione del tipo e del ceppo virale Terapia, prolassi e controllo Molti farmaci alleviano i sintomi dellinuenza (es acetaminophen o anti-istaminici) I farmaci antivirali: - amantadina e rimantadina inibiscono la scapsidazione del virus A (non virus B e C) - Zanamivir e oseltamivir: attivi contro il virus A e virus B inibiscono la neuraminidasi - Senza la neuraminidasi HA lega lacido sialico su altre particelle virali per formare aggregati prevenzione del rilascio del virus - Zanamivir via inalatoria - Oseltavir per via orale - Efcaci per la prolassi dopo 24-48 ore dallesordio, ma inutili per prevenire i sintomi immunopatogenici. Limitare la diffusione aerea del virus inuenzale impossibile. Il modo migliore per controllare il virus limmunizzazione: - immunizzazione naturale conseguente allesposizione al virus, protettiva per lunghi periodi - Vaccino con virus ucciso che rappresenta i ceppi dellannata - Prolassi con farmaco antivirale Ogni anno disponibile un vaccino anti-inuenzale a virus ucciso (inattivato con formalina): - i vaccini a virus intero vengono preparati con il virus cresciuto in uova embrionale e inattivato chimicamente - Disponibili preparazioni di - virus trattati con detergente - Estratti virali contenenti le proteine HA e NA - Il vaccino ideale contiene gli antigeni de ceppi di virus inuenzale A e B che prevarranno nella comunit nella stagione invernale che sta per iniziare. La vaccinazione raccomandata ad: - anziani - Personale sanitario - Persone con malattie polmonari o cardiache croniche. - Persone allergiche alle uova non dovrebbero ricevere il vaccino. disponibile anche un vaccino con virus vivo attenuato somministrabile attraverso spray nasale: - vaccino trivalente di riassortanti per geni di HA e NA di diversi virus inuenzali - Dovrebbe stimolare una protezione pi naturale, comprendente - Immunit cellulo-mediata - Produzione di IgA - Raccomandato agli individui compresi tra 3 e 50 anni. Orthomyxovirus Struttura e replicazione Il virione, dotato di pericapside (envelope), possiede un genoma costituito da 8 segmenti di RNA a polarit negativa. Glicoproteina emoagglutinina, nellenvelope, la proteina di attacco e fusione, oltre ad indurre la risposta protettiva e neutralizzante degli anticorpi Il virus dellinuenza trascrive e si replica nel nucleo della cellula bersaglio, ma si assembla e gemma dalla membrana plasmatica. I farmaci antivirali amantadina e rimantadina inibiscono la fase di spoliazione agendo sulla proteina M2 (membrana) per la sola inuenza A. I farmaci antivirali zanamivir e oseltamivir inibiscono la proteina NA dei virus inuenzali A e B La segmentazione del genomica favorisce la diversit genetica mutazioni e riassortimento dei segmenti durante infezione contemporanea con due diversi ceppi virali. Linuenza A infetta gli uomini, mammiferi e uccelli (zoonosi) Linuenza B infetta solo gli umani. Patogenesi e immunit Il virus pu instaurare infezione delle vie respiratorie superiori e inferiori. Corso di microbiologia - batteriologia 120 www.bluejayway.it I sintomi sistemici sono dovuti allinterferone e alle linfochine prodotte in risposta al virus. I sintomi locali sono dovute al danneggiamento delle cellule epiteliali, comprese le cellule ciliate e quelle mucipare. La produzione di IFN e la risposta immunitaria cellulo-mediata (NK e T) sono importanti sia per la risoluzione che per limmunopatogenesi Le persone infette sono predisposte alla superinfezione batterica, a causa della perdita delle barriere naturali. Gli anticorpi sono importanti per la successiva protezione contro linfezione specici per determinati epitopi su HA e NA Le proteine HA e NA del virus dellinuenza A possono andare incontro a variazioni antigeniche maggiori (shift, riassortimento) o minori (drift, mutazioni) che assicurano la presenza di persone immunologicamente nave Il virus dellinuenza B subisce solo cambiamenti antigenici minori Epidemiologia I virus dellinuenza sono dotati di envelope e vengono inattivati facilmente da detergenti, essiccamento e ambiente acido. Il genoma segmentato facilita i cambiamenti antigenici maggiori, soprattutto per quanto riguarda HA e NA Il virus dellinuenza A infetta diverse specie di vertebrati, comprese varie specie di mammiferi e uccelli. La coinfezione con ceppi di virus inuenzali animali e umani pu generare, per riassortimento genetico, ceppi molto differenti dagli originali. Spesso, la trasmissione del virus, precede la comparsa dei sintomi. Trasmissione tramite piccole gocce di aerosol, che vengono espulse parlando, respirando e tossendo. Predilige linverno (clima fresco, poco umido) Largamente diffuso dai bambini in et scolare. A rischio - adulti sindrome inuenzale classica - Bambini infezione delle vie respiratorie, da asintomatica a grave - Alto rischio per immunocompromessi, pazienti con problemi cardiaci e respiratori. Virus ubiquitari (epidemie locali, pandemie mondiali) Malattie MALATTIA SINTOMI Influenza acuta in adulti Repentini attacchi febbrili, malessere, mialgia, mal di gola, tosse non produttiva influenza acuta in bambini Malattia acuta simile a quella degli adulti, ma con febbre pi alta, sintomi gastrointestinali (dolori addominali e vomito), otite media, miosite e croup Complicazioni nellinfezione da virus influenzale Polmonite virale primaria Polmonite batterica secondaria Miosite Coinvolgimento cardiaco Sindromi neurologiche (Guillain-Barr, encefalopatia, encefalite, sindrome di Reye) diagnosi TEST RILIEVI Coltura in cellule primarie di rene di scimmia o rene canino di Madin-Darby Presenza del virus, limitati effetti citopatici Emoadsorbimento su cellule infettate Presenza di HA sulla superficie cellulare Emoagglutinazione Presenza di virus nelle secrezioni Inibizione dellemoagglutinazione Tipo e ceppo di virus dellinfluenza o specificit anticorpale Immunofluorescenza e ELISA Antigeni virali nelle secrezioni respiratorie o nelle colture tissutali Sierologia: inibizione dellemoagglutinazione, inibizione dellemoadsorbimento, ELISA, immunofluorescenza, fissazione del complemento Epidemiologia sierologica Test molecolari: RT-PCR Identificazione del tipo e del ceppo virale terapia, prolassi e controllo Amantadina, rimantadina, zanamivir e oseltamivir sono approvati per prolassi e trattamento precoce Il vaccino a virus ucciso contiene i ceppi di virus dellinuenza A e B che si ritiene prevarranno durante linferno successivo. Corso di microbiologia - batteriologia 121 www.bluejayway.it I retrovirus sono il gruppo pi studiato in biologia molecolare: - possiedono un envelope - Genoma a RNA polarit positiva - Morfologia e modalit di replicazione peculiare - Codicano una DNA polimerasi RNA-dipendente (trascrittasi inversa) - Replicano attraverso unintermedio di DNA si integra nel genoma della cellula ospite, diventando un gene cellulare. Molti retrovirus sono oncogeni oncornavirus: - codicano proteine che sono in grado di controllare la crescita cellulare (oncogeni) Tra la ne degli anni 70 e i primi anni 80 si notato che un numero insolito di giovani omosessuali, tossicodipendenti, haitiani e emoliaci (il gruppo delle 4 H) moriva di infezioni opportunistiche normalmente benigne: - i loro sintomi caratterizzavano la sindrome dellimmunodecienza acquisita (AIDS) - LAIDS non limitata a questi gruppi, ma pu insorgere in chiunque sia esposto al virus. - 40 milioni di persone al mondo che vivono con il virus che causa lAIDS - Si sono isolati 2 ceppi HIV-1 e HIV-2 - Nonostante lAIDS sia una malattia devastante, oggi stato sviluppato un cocktail di farmaci antivirali (HAART, terapia antiretrovirale altamente attiva) permette a molti sieropositivi di riprendere una vita normale. Le tre sottofamiglie dei retrovirus umani sono: - oncovirinae o oncovirus: HTLV-1, HTLV-2, HTLV-5 - Lentivirinae: HIV-1 e HIV-2 - Spumavirinae. Nonostante il primo retrovirus isolato forre uno spumavirinae, nessuno di questi virus associato a malattie nelluomo Retrovirus endogeni integrati nel DNA, trasmessi verticalmente e possono occupare no all1% del genoma - Non possono produrre virioni - Tuttavia sono state rilevate molte sequenze geniche in specie animali e umane. Classicazione La classicazione dei retrovirus attuata in base a: - malattia causata - Tropismo tissutale - Spettro dospite - Morfologia dei virioni - Complessit genetica Gli oncovirus includono i retrovirus che possono immortalizzare o trasformare le cellule target: - suddivisi in tipi A, B, C e D in base alle caratteristiche del core e del capside. I lentivirus sono virus lenti associati a malattie neurologiche e immunosoppressive. Struttura I retrovirus sono virus a RNA+: - grossolanamente sferici - Con envelope di 80-120 nm - Lenvelope circonda il capside, che contiene - 2 copie identiche di RNA genomico a polarit positiva nel core - 10-50 copie di trascrittasi inversa - Gli enzimi integrasi - Due tRNA che fungono da primer per la trascrittasi inversa (appaiati ai 2 lamenti di RNA) La morfologia del core differisce nei diversi virus (usata per classicazione): - il core del virione di HIV assomiglia ad un cono troncato. Il genoma dei retrovirus possiede: - cap in 5 - poliA in 3 Nonostante assomiglia ad un mRNA non infettante, poich non codica una polimerasi che possa direttamente generare pi mRNA. Corso di microbiologia - virologia 122 www.bluejayway.it Retrovirus Virus a RNA a polarit positiva Alcuni virus sono oncogeni Envelope che racchiude il capside Hanno gi nel capside enzimi (trascrittasi inversa, integrasi e tRNA) Geni gag, pol, env Sequenze LTR terminali Retrovirus Enrico Colombo Il genoma dei retrovirus semplici consiste di 3 principali geni, che codicano poliproteine: - gag: antigeni gruppo specici (capside, matrice e proteine legate allacido nucleico) - Pol: polimerasi, proteasi e integrasi - Env: envelope, le glicoproteine del pericapside. In ciascuna estremit del genoma sono presenti delle sequenze long terminal repeat (LTR): - contengono promotori e enhancer - Contengono altre sequenze geniche utilizzate per il legame con differenti fattori di trascrizione cellulari. - I virus oncogeni possono contenere anche un oncogene per la regolazione della crescita I retrovirus complessi (HTLV e lentivirus) codicano anche diverse proteine regolatorie: - richiedono processi trascrizionali pi complessi (splicing) rispetto ai retrovirus semplici. Le glicoproteine virali sono prodotte mediante tagli proteolitici delle proteine codicate dal gene env: - la grandezza delle glicoproteine differisce per ciascun gruppo di virus - Gp62 di HTLV-1 tagliata in gp46 e gp21 - Gp 160 di HIV tagliata in gp41 e gp120 - Tali glicoproteine, assemblate in trimeri, formano le spicole visibili sulla supercie del virione - La pi grande delle glicoproteine (es gp120) lega i recettori presenti sulla supercie cellulare - determina il tropismo tissutale del virus - riconosciuta da anticorpi neutralizzanti - La pi piccola (gp41 in HIV) forma lo stelo del lollipop favorisce la fusione tra cellule. - La gp120 di HIV altamente glicosilata la sua antigienicit pu cambiare 23 durante il corso di uninfezione cronica da HIV impedisce leliminazione del virus da parte del sistema immunitario. Replicazione La replicazione dei retrovirus umani inizia con il legame tra le spicole glicoproteiche (trimeri di gp120 e gp41) e la proteina recettoriale di supercie CD4: - la gp120 di HIV si lega a CD4 su cellule della linea macrofagica 24 (M- tropico) - Si lega anche a CCR5, un recettore per chemochine a 7 domini transmembrana accoppiato a proteina G sui macrofagi e cellule T attivate - Nel corso della malattia, il virus cambia gp120 si lega a - CD4 - CXCR4 recettore per chemochine presente su cellule T nave e altre cellule T-helper (T-tropico) - Il legame con il recettore per le chemochine envelope virale e membrana plasmatica cellulare a contatto gp41 interagisce con le due membrane fusione. - Persone geneticamente decitarie di CXCR4 sono resistenti allinfezione da HIV - gp41 bersaglio di un farmaco antivirale. Corso di microbiologia - batteriologia 123 www.bluejayway.it 23 antigenic drift 24 macrofagi, cellule dendritiche, cellule della microglia, cellule di Kupffer, ecc Una volta rilasciato nel citoplasma, inizia la fase di replicazione: - la trascrittasi inversa utilizza come primer il tRNA presente nel virione sintetizza una catena di DNA complementare, a polarit negativa - Agisce anche come ribonucleasi H degrada lRNA genomico successivamente sintetizza la catena di DNA a polarit positiva (cDNA) - bersaglio principale dei farmaci antivirali - Durante la sintesi del DNA virionico (provirus) le sequenze di ciascuna terminazione del genoma (U3 e U5) sono duplicate permettono lattacco delle LTR a ciascuna estremit - Crea sequenze necessarie per lintegrazione - Sequenze con ruolo di enhancer e promoter nelle LTR regolazione della trascrizione - La copia del DNA del genoma dunque pi grande del RNA originale. La trascrittasi inversa commette errori frequenti nella trascrizione: - la velocit di errore per ogni trascrittasi inversa circa 1/2000 (5 errori per genoma) - Instabilit genetica di HIV nuovi ceppi di virus durante il decorso della malattia pu alterare la patogenicit del virus e favorire levasione dal sistema immunitario. Il cDNA a doppia catena dunque trasportato al nucleo e inserito nel cromosoma della cellula ospite, grazie agli enzimi integrasi: - enzima codicato dal virus presente nel virione maturo Corso di microbiologia - batteriologia 124 www.bluejayway.it - Lintegrazione richiede la replicazione cellulare - Tuttavia, il cDNA di HIV e altri lentivirus pu restare nel nucleo e nel citoplasma in una forma di DNA circolare, nch la cellula non attivata. Una volta integrato, inizia la fase tardiva: - DNA virale trascritto come un gene cellulare dallRNA polimerasi II dellospite mRNA a lunghezza piena - Nei retrovirus semplici processato per produrre diversi mRNA che contengono sequenze geniche env, gag, gag-pol. - Pu essere utilizzato per assemblare nuovi virioni. Il virus integrato agisce come un gene cellulare la replicazione dipende da: - estensione della metilazione del DNA virale - Velocit di crescita cellulare - Capacit della cellula di riconoscere enhancer e promoter codicate nelle LTR Altre infezioni o citochine o mitogeni attivazione della cellula fattori di trascrizione in grado di legare le LTR attivata la trascrizione del virus: - se il virus codica oncogeni possono promuovere la crescita cellulare, stimolare la trascrizione e la replicazione virale. - La capacit di una cellula di trascrivere il genoma retrovirale secondo determinante per il tropismo tissutale e per lo spettro dospite del virus HIV e HTLV sono retrovirus complessi: HTLV codica 2 proteine, tax e rex regolano la replicazione virale - mRNA per tax e rex richiedono pi fasi di splicing - Gene Rex codica per 2 proteine che si legano sullmRNA virale previene ulteriori splicing trasporto di mRNA nel citoplasma sintesi di proteine strutturali - LmRNA di tax/rex ottenuto con doppio evento di splicing espresso precocemente ([Rex] bassa), mentre le proteine strutturali sono espresse tardivamente ([Rex] alta) - In fase tardiva - rex aumenta lespressione dei geni strutturali a singolo evento di splicing - Tax un attivatore trascrizionale aumenta la trascrizione del genoma virale dalla sequenza genica promoter nella LTR 5. - Tax attiva anche altri geni (IL-2, IL-3, GM-CSF e IL-2R) promuove la crescita delle cellule T infette. GENE VIRUS FUNZIONE Gag Tutti Antigene gruppo-specifico: proteine del core e del capside Int Tutti Integrasi Pol Tutti Polimerasi: polimerasi inversa, proteine, integrasi Pro Tutti Proteasi Env Tutti Glicoproteine dellenvelope Tax HTLV Transattivazione di geni cellulari e virali Tat HIV-1 Transattivazione di geni cellulari e virali Rex HTLV Regolazione dello splicing di RNA e promozione dellesportazione nel citoplasma Rev HIV-1 Regolazione dello splicing di RNA e promozione dellesportazione nel citoplasma Nef HIV-1 Alterazione dei segnali di attivazione cellulare, progressione verso AIDS (riduzione espressione CD4 e MHC-I) Vif HIV-1 Infettivit del virus, promozione dellassemblaggio, blocca una proteina cellulare antivirale Vpu HIV-1 Facilita lassemblaggio del virione e il rilascio, diminuisce il CD4 sulla superficie cellulare Vpr HIV-1 Trasporto di cDNA al nucleo, arresto della crescita cellulare LTR Tutti Elementi promoter e enhancer La replicazione di HIV regolata da sei prodotti genici accessori: - tat: come tax, un attivatore della trascrizione dei geni virali e cellulari (IL-2, IL-3, GM-CSF, ecc) - Rev: agisce come rex, per regolare e promuovere il trasporto degli mRNA virali nel citoplasma - Nef: ha numerose funzioni, probabilmente essenziali per la progressione dellinfezione verso AIDS - riduce lespressione sulla supercie cellulare dei CD4 e delle molecole MHC di classe I - Altera le vie di signaling intracellulare delle cellule T - Regola la tossicit del virus - Necessaria per mantenere la tossicit virale - Vif: favorisce lassemblaggio e la maturazione. Si lega a una proteina cellulare antivirale e aiuta la replicazione in cellule mieloidi e altre cellule. - Vpu: riduce lrepressione del CD4, aumenta il rilascio dei virioni - Vpr: importante per il trasporto del cDNA nel nucleo e per la replicazione di HIV. Corso di microbiologia - batteriologia 125 www.bluejayway.it - Arresta la cellula nella fase G2 ottimale per la replicazione di HIV Anche la cellula controlla la replicazione di HIV lattivazione delle cellule T da parte di un mitogeno o un antigene promuove la replicazione virale. Le proteine tradotte dagli mRNA di gag, gag-pol e env sono sintetizzate come poliproteine e successivamente tagliate. Le glicoproteine sintetizzate, glicosilate e processate a livello di RER e apparato di Golgi tagliate in: - subunit transmembranarie - Subunit extracellulari adibite alladsorbimento. Queste subunit si associano a formare trimeri e migrano verso la membrana plasmatica. Le proteine gag e gag-pol acilazione si legano alla porzione di membrana contenente le glicoproteine dellenvelope: - associazione di due copie del genoma e molecole di tRNA gemmazione del virione - Dopo lacquisizione dellenvelope, la proteasi virale taglia le poliproteine gag e gag-pol per rilasciare la trascrittasi inversa e formare il core del virione assicurato linserimento di tali enzimi. - Lazione della proteasi indispensabile per produrre virioni infettanti, ed un target per i farmaci antivirali. Lacquisizione dellenvelope e rilascio avviene sulla supercie cellulare: - replicazione e gemmazione dei retrovirus non necessariamente uccidono la cellula - HIV pu anche attuare diffusione cellula-cellula formazione di sincizi. - I sincizi sono fragili la formazione di tali cellule giganti aumenta lattivit citolitica del virus. !"#$% &'()$!'*+,-. !"# !"# !"# !"# !!$% !!$% $%&'()*+& &'()*(+ !!$% ',$-(.%,/& GAG POL ENV Gli ultimi stadi del ciclo replicativo dei retrovirus Corso di microbiologia - batteriologia 126 www.bluejayway.it Patogenesi e immunit La caratteristica principale della patogenesi e della malattia causata da HIV il tropismo virale per le cellule T e macrofagi che esprimono CD4: - induce immunosoppressione riduzione del numero di cellule T CD4 ridotte funzioni helper e di ipersensibilit ritardata (DTH) Durante i rapporti sessuali, sia vaginali che anali: - HIV-1 infetta e rimane sulle cellule di Langerhans e cellule dendritiche 25
dellepitelio - Tali cellule si portano ai linfonodi infezione delle cellule T CD4 Il sesso anale pu comportare rischio anche maggiore rispetto alle altre modalit di trasmissione: - cellule T speciali, dotate di pi corecettori CD4, sono separate dal colon solo da un sottile strato di cellule epiteliali The chemokine receptors CXCR4 and CCR5 are members oI the G protein-coupled receptor superIamily and have been identiIied as the principal co-receptors Ior HIV-1. Co-receptor Is Required for Viral Entry 352 C L A D T F F H L L S P L A F N Y I V L W L L F I G F G F L I L I L I L F I T F Y G T S S T V L I F T I T V G S F V V V W P A I A G C M V L L I Y I V G L V L S L I L P I V T I L F Y V W L M F Y I P L F I I V N A L L M V I F Y P V G L G L S L F N V F I L L I L I N I N F C T V M A P Y C V T L M T I A I G E G Q H E I D L K R M T K S Y T M C Q N F G R Y L A V V A F A K A R T V T F V G H V L S Q K E G L H Y T C S Y S Q Y Q F W K N F Q H P F S K T L L V H R K K E N R C R N T F Q E F F G L N N C S S S N R D Q L C K K F F R N Y L L V H I A K R F F Q K A C C S I F Q Q S V Y T R S T G E P E R A S E Q E A A A Q A A I Q K V N I K Q C P E S T Y Y N I D Y I P S S V Q Y D M - NH2 - COOH R 31- -57 67- -89 102- -125 146- -168 -197 219- -235 -258 303- T L R A I S V G L R P L D K R 277- Acidic Basic CCR5 = CXCR4 CCR5 D W CCR5 Q L S D T F F L R A P I A L H Y V L V W L F I L S T V L A L I V I V V Y A S L Y N H S Y V P I F L A G V I D T F L V V W P L I A I C I I V G H Y I L G L I I C I S L P M V I L T F Y G W I I V F I P S C L T A Y L I A G V I T Y P I I G L G L T S F F N V I V I I L L M G Y L N F C A I F W P Y C L T L I F I A L G G A S H A K D L K K M T R S D F L C K N Y F G D R Y L A I V N S R P R K L L A K E H T Q V S E A D D R Y I C D N D L W V V V F Q F Q F P Y R S K L S K L A K R K Q H G K S H D S F I L L E I I K Q G C E F E N T H K V L K K L F K T S A Q H V S R G S S A T S G I L S K G K R T E S E S S S F G H S S V S H S S V A A N W K N F N A N E E R F C P E K M S D Y D G S G M E E T Y N D S T Y I S I G E M - NH2 Ser/Thr rich * * * N Cytoplasmic 39- -65 75- -97 110- -133 154- -176 -202 224- -239 -262 -282 308- -352 F CXCR-4 A = Predicted G-protein binding domains CXCR4 Iniettato nel sangue infetta le cellule dendritiche e le altre cellule della linea monocito-macrofagica: - esprimono come recettori per chemochine sia CCR5 che CXCR4 infettabili sia da HIV M-tropico che da HIV T-tropico - I macrofagi son infettati persistentemente da HIV e sono probabilmente il principale reservoir e mezzo di diffusione di HIV - mutazioni del gene env cambiamento di tropismo da M-tropico a T- tropico infezione delle cellule T CD4 - Nei linfonodi avviene continua replicazione del virus liberato nel sangue assieme alle cellule T infettate. - La diminuzione delle cellule T CD4 potrebbe essere indotta da - Citolisi dovuta a HIV - Citolisi dovuta a cellule T citotossiche immuni - Attivazione cronica di cellule T indotta da antigeni di HIV rapido differenziamento e morte apoptotica Laumento di virus nel sangue e la diminuzione delle cellule CD4 correlano direttamente con lo sviluppo dei sintomi di AIDS. HIV induce differenti effetti citopatici che possono uccidere la cellula T infettata: - accumulo di copie del genoma a DNA circolare - Aumentata permeabilit della membrana plasmatica - Formazione dei sincizi - Induzione di apoptosi. La capacit di HIV di uccidere la cellula bersaglio correla con la quantit di CD4 espresso dalla cellula: - i macrofagi esprimono poco CD4 resistono allazione citolitica Le proteine accessorie di HIV sono importanti per la replicazione e la virulenza: - nef: essenziale nel promuovere la progressione HIV AIDS La risposta immune verso HIV limita linfezione virale, ma contribuisce alla patogenesi: - anticorpi anti gp120 partecipano alla risposta citotossica mediata da anticorpi. - Un virus HIV opsonizzato comunque infettante fagocitato dai macrofagi - Cellule CTL CD8 ruolo critico nel controllo della malattia da HIV - Possono uccidere le cellule infettate attraverso unazione citotossica diretta - Producono fattori di soppressione limitano la replicazione virale - Richiedono lattivazione da parte di cellule T CD4 il numero delle cellule T CD8 attive diminuisce con il numero delle cellule CD4 AIDS. Corso di microbiologia - virologia 127 www.bluejayway.it 25 il virus HIV rimane legato alle cellule dendritiche attraverso una lectina, DC-SIGN. Utilizza le cellule dendritiche per il trasporto e per favorire linfezione delle cellule T CD4 Virus HIV !"# Agente eziologico della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) 1981- Descrizione della sindrome in uomini omosessuali caratterizzata da inIezioni opportunistiche Sarcoma di Kaposi LinIomi e altri tumori 1983- Isolamento dell`HIV-1 1985- Sequenziamento del genoma 1987- Isolamento dell` HIV-2 STRATEGIA EVASIVA FUNZIONE Infezione di linfociti T e macrofagi Inattivazione degli elementi chiave della difesa immune Inattivazione delle cellule T helper CD4 Perdita dellattivazione del sistema immunitario e della DTH Antigenic drift di gp120 Evasione del rilevamento anticorpale Pesante glicosilazione della gp120 Evasione del rilevamento anticorpale HIV utilizza vari metodi per evadere alla risposta immunitaria: - capacit di subire mutazione altera lantigienicit sfugge alla risposta anticorpale - Cellule T CD4 come bersaglio ridotta secrezione di citochine e attivazione di altre cellule immunitarie - Infezione persistente in macrofagi e cellule T CD4 si mantiene in tipi cellulari e tessuti immunologicamente privilegiati. IL DECORSO DELLA MALATTIA DA HIV SEGUE IN PARALLELO LA RIDUZIONE DEL NUMERO DI CELLULE T CD4 E LA QUANTIT DI VIRUS NEL SANGUE: - inizialmente (fase acuta) consistente produzione virale e viremia - Proliferazione delle cellule T e risposte contro le cellule linfoidi e mieloidi infettate sindrome simil-mononucleosi. - Latenza clinica diminuiscono i livelli di virus nel sangue, ma questo si replica nei linfonodi. Il virus resta latente nei macrofagi e nelle cellule T resting - Fasi tardive i livelli di virus nel sangue aumentano, i livelli di linfociti T CD4 diminuiscono in maniera signicativa, perdita della struttura linfonodale immunocompromesso. Le cellule T helper CD4 hanno un ruolo centrale nellinizio di una risposta immunitaria e DTH: - diminuzione del numero di linfociti T CD4 impossibile risposta immunitaria antigene-specica e mancato controllo della risposta umorale - La perdita delle cellule T CD4, responsabili delle DTH molte infezioni intracellulari opportunistiche. Oltre allimmunodepressione, HIV pu causare disfunzioni neurologiche: - i tipi cellulari coinvolti sono costituiti da microglia e macrofagi, ma anche i neuroni possono essere bersaglio - Microgliociti e monociti infetti rilascio di sostanze neurotossiche o chemiotattici inammazione nel cervello - Possibili anche CPE diretti sui neuroni. Epidemiologia LAIDS stata evidenziata per la prima volta negli USA tra i maschi omosessuali, ma si diffusa nella popolazione con proporzioni epidemiche: - nel 2003 stato stimato che ogni anno avvengono 5 milioni di nuove infezioni e 3 milioni di morti allanno. - Si pensa che HIV sia derivato dal virus dellimmunodecienza della scimmia (HIV-2 simile) - Infezione iniziale nelluomo anni 30, ma rimase in zone rurali inosservata - Dagli anni 60, la migrazione delle persone verso la citt ha portato il virus nei centri abitati - Laccettazione culturale della prostituzione ha favorito la diffusione Corso di microbiologia - batteriologia 128 www.bluejayway.it Sottotipi e distribuzione geograca Le infezioni da HIV-1 sono diffuse in tutto il mondo: - picco in Africa - Casi crescenti in Asia, USA e resto del mondo. HIV-2 presente prevalentemente in Africa, rispetto agli USA e alle altre parti del mondo. La trasmissione eterosessuale di HIV-1 e HIV-2 la principale fonte di contagio in Africa, con uomini e donne ugualmente infettati: - HIV-2 causa una malattia simile, ma meno severa dellAIDS - possibile suddividere, in base ai geni env e gag, HIV-1 e HIV-2 in sottotipi o clades - HIV-1: 9 sottotipi (A H, M, O) - HIV-2: 5 sottotipi (A E) La gp120 e le proteine del capside differiscono nelle varie clades virali principali antigeni per anticorpi e cellule T. Trasmissione La presenza di HIV nel sangue, nel liquido seminale e nelle secrezioni vaginali in persone infette e nel periodo asintomatico dellinfezione favorito la diffusione attraverso: - contatti sessuali - Esposizione a sangue e a derivati contaminati. Il virus HIV pu anche essere trasmesso per via perinatale ai neonati. Non trasmesso attraverso: - contatti casuali - Baci - Abbracci - Tosse e starnuti - Punture di insetti - Acqua, cibo, - Utensili - Toilette e piscine Popolazioni ad alto rischio Le persone ad alto rischio sono: - persone sessualmente attive (rapporti non protetti) - Tossicodipendenti da droghe iniettabili (e partner sessuali) - Neonati da madri HIV-positive LAIDS stata inizialmente descritta in giovani uomini omosessuali promiscui e prevale ancora nella comunit gay: - rapporti anali efciente trasmissione del virus - La trasmissione eterosessuale e labuso di droghe iniettabili sono diventate tuttavia le principali modalit attraverso cui HIV viene trasmesso. Prima del 1985, categorie ad alto rischio di infezione da HIV erano: - persone trasfuse o riceventi trapianti dorgano - Emoliaci trattati con fattori della coagulazione ottenuti da sangue. In molti paesi, lutilizzo improprio di siringhe condivise o non sterilizzate ad opera del personale sanitario fu un mezzo di diffusione. Oggi, il controllo sul sangue trasfuso, ha eliminato il risico di trasmettere HIV in tale modalit. Il personale sanitario a rischio di infezione con HIV per punture dago e per tagli accidentali, o attraverso lesposizione di abrasioni cutanee e mucose a sangue contaminato. Aghi per tatuaggi e inchiostro contaminato sono altri potenziali sistemi attraverso cui HIV pu essere trasmesso. Sindromi cliniche LAIDS una delle pi devastanti epidemie mai registrate: - la maggior parte delle persone infettate da HIV diventano sintomatiche - La gran parte delle persone sintomatiche, senza trattamento, soccombe alla malattia. La malattia da HiV inizia come infezione asintomatica progredisce verso una profonda immunosoppressione, detta AIDS conclamata: - patologia correlata caratterizzata soprattutto da - Infezioni opportunistiche - Sviluppo di tumori - Effetti diretti di HIV sul sistema nevoso - Rari i casi di sopravvivenza a lungo termine. Buona parte per persone infettate con virus che difettano di nef. - Resistenti al virus persone che non hanno i corecettori per chemochine. La fase acuta (2-4 settimane dopo linfezione) pu assomigliare a inuenza o mononucleosi, con in pi - meningite asettica - Rash che insorge no a 3 mesi dopo linfezione Corso di microbiologia - batteriologia 129 www.bluejayway.it I sintomi, come per la mononucleosi, derivano dalle risposte immuni, innescate da unestesa infezione delle cellule linfoidi: - passano spontaneamente in 2-3 settimane Successivamente si ha un periodo di infezione asintomatica o linfoadenopatia persistente generalizzata, che pu durare parecchi anni. - Durante questo periodo, il virus continua a replicare nei linfonodi. Il deterioramento della risposta immunitaria indicato da un aumento della suscettibilit verso patogeni opportunistici, specialmente quelli controllati da: - cellule T CD4 - Cellule T CD8 - Macrofagi - Risposte DTH (funghi, herpesvirus o batteri intracellulari) Linsorgenza dei sintomi correlata a: - un valore inferiore a 450 cellule T CD4/l - aumento dei livelli di virus nel sangue - Aumento dei livelli della proteina p24 LAIDS conclamata si ha quando la conta delle cellule T CD4 scende sotto 200 cellule/l: - sviluppo di malattie pi gravi (es sindrome da deperimento) - Comparsa id malattie indicatori (es il sarcoma di Kaposi) - Comparsa di malattie opportunistiche (polmonite da Pneumocisti, infezioni da Mycobacterium avium-intracellulare e infezioni da cytomegalovirus) LAIDS pu manifestarsi in modi differenti, inclusi: - linfoadenopatia e febbre - Infezioni opportunistiche - Tumori - Demenza AIDS-correlata Linfoadenopatia e febbre Possono insorgere linfoadenopatia e febbre: - insieme di sintomi clinici denito come complesso AIDS-correlato (ARC). - Si sviluppa in maniera insidiosa - Pu essere accompagnato da perdita di peso e malessere - I sintomi possono persistere indenitamente o progredire. Possono vericarsi: - infezioni opportunistiche - Diarrea - Sudorazioni notturne - Affaticamento In Africa comune la sindrome da deperimento (slim disease). Infezioni opportunistiche Normalmente, le infezioni benigne causate da Candida albicans e altri funghi, virus a DNA capaci di malattie ricorrenti, parassiti e batteri intracellulari in pazienti con HIV malattie importanti. Il principale segno di AIDS polmonite pneumocistica (PCP) indotta da Pneumocystis jiroveci. Altre malattie possono essere - candidosi orale - Toxoplasmosi cerebrale - Meningite criptococicica - Infezioni da herpesvirus - HSV - VZV - EBV leucoplachia capelluta della bocca, linfomi - CMV retiniti, polmoniti, malattia intestinale Corso di microbiologia - batteriologia 130 www.bluejayway.it - Paopvavirus il virus JC causa leucoencefalopatia multifocale spongiforme (PML) - Tubercolosi e altre malattie da micobatteri - Diarrea causata da comuni patogeni (Salmonella, Shigella, Campylobacter) INFEZIONI MALATTIA Infezioni opportunistiche da protozoi Toxoplasmosi del cervello Criptosporidiosi con diarrea Isosporiasi con diarrea Infezioni opportunistiche da funghi Candidosi dellesofago, trachea e polmoni Polmoniti da Pneumocystis jiroveci. Criptococcosi Istoplasmosi Coccidiomicosi Infezioni virali Malattia da CMV Infezioni da virus Herpes Simplex (disseminata o persistente) Leucoencefalopatia multifocale progressiva Leucoplachia capelluta causata da EBV Infezioni opportunistiche da batteri Complesso intracellulare di Mycobacterium Avium Qualsiasi malattia atipica da micobatteri Tubercolosi extrapolmonare Setticemia da salmonella Infezioni batteriche piogene Neoplasia opportunistica Sarcoma di Kaposi Linfoma primario del cervello Altri linfomi non Hodgkin Altri Sindrome da deperimento da HIV Encefalopatia da HIV Polmonite interstiziale linfoide Tumori Il tumore pi diffuso in pazienti con AIDS il sarcoma di Kaposi associato a HSV-8: - raro cancro della pelle, solitamente benigno - In pazienti immunocompromessi dissemina e coinvolge organi viscerali Presenti anche: - linfomi non-Hodgkin - Linfoma EBV-correlato Demenza correlata allAIDS La demenza correlata allAIDS pu derivare da: - infezioni opportunistiche delle cellule microgliali e dei neuroni del cervello - Infezioni da HIV in cellule microgliali Pazienti con tale condizioni possono presentare: - lento deterioramento delle capacit intellettuali - Altri segni legati a disordine neurologico. Anche una delle molte infezioni opportunistiche pu esserne la causa. macrofagi HIV cellule dendritiche CCR5 CCR5 Sangue Sperma Secrezioni vaginali linfociti T CD4 CXCR4 risposta immunitaria verso cellule infette fase acuta: sindrome simil-mononucleosica variazione gp120 replicazione nei linfonodi fase latente deplezione cellule T CD4 helper (<200 cellule/l) AIDS conclamata infezioni opportunistiche tumori associati demenza Corso di microbiologia - batteriologia 131 www.bluejayway.it Diagnosi di laboratorio I test per diagnosticare uninfezione da HIV sono eseguiti per: - identicare le persone con linfezione terapia antivirale - Identicare i portatori che possono trasmettere ad altri linfezione (donatori di sangue, organi, donne in gravidanza e partner sessuali) - Seguire i decorso della malattia e confermare la diagnosi. Linfezione da HIV cronica permesso lutilizzo di test sierologici per documentare linfezione di HIV: - sono completati dalla rilevazione e quantizzazione del genoma virale, mediante tecniche correlate alla PCR - I test sierologici non possono identicare persone con infezione recente. Non possibile identicare HIV in coltura. Infezione recente o fasi tardive della malattia sono identicate: - dallantigene virale p24 (trascrittasi inversa) - Da grandi quantit di RNA virale in campioni di sangue, rivelato attraverso - RT-PCR - Real-time PCR I livelli di RNA virale sono utilizzati anche per monitorare il successo della terapia. Genomica Per seguire il corso di uninfezione da HIV e lefcacia della terapia sono diventati cruciali indagini su quantizzazione e rilevazione del genoma di HIV: - il cDNA, dopo la conversione dellRNA virale identicato mediante PCR e quantizzato attraverso - real-time PCR. - Amplicazione del segnale attraverso DNA ramicato - Altri metodi - Determinare la carica virale permette di monitorare il decorso e lefcacia terapeutica Sierologia Per lo screening di routine sono utilizzati - saggi immunoenzimatici (ELISA) - Procedure di agglutinazione I test ELISA possono dare falsi-positivi e non rivelare uninfezione recente necessaria la conferma con procedure pi speciche: - western-blot confermano la sieropositivit individuata con ELISA Il saggio di Western Blot permette di rivelare la presenza di anticorpi diretti verso: - p24 - p31 - gp41 - gp120/160 Gli anticorpi HIV, tuttavia, impiegano 4-8 settimane a comparire, e per alcuni pazienti no a 6 mesi. Studi immunologici Lo stato di uninfezione con HIV pu essere denito dallanalisi del sottoinsieme di cellule T: - numero assoluto dei linfociti T CD4 enormemente basso - Rapporto CD4/CD8 La particolare concentrazione dei linfociti T CD4 indica lo stato di AIDS. TEST SCOPO Sierologia Test immunoenzimatici (ELISA) Agglutinazione con particelle di lattice Test rapido anticorpale orale Analisi Western blot immunofluorescenza Screening iniziale Screening iniziale Screening iniziale Test di conferma Test di conferma RNA virionico con RT-PCR Ricerca del virus nel sangue Real time RT-PCR Quantizzazione del virus nel sangue DNA a catena ramificata Quantizzazione del virus nel sangue Antigene p24 Marker precoce dinfezione Isolamento del virus Test non disponibile Rapporto cellule T CD4/CD8 Correla la malattia del virus HIV Terapia, prevenzione e controllo Nel mondo vi un grande impegno per sviluppare vaccini e farmaci efcaci contro HIV. I farmaci approvati dalla FDA possono essere classicati come: - inibitori della fusione-penetrazione: - Analoghi nucleosidici inibitori della trascrittasi inversa: - Inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa: - Inibitori della proteasi: Corso di microbiologia - batteriologia 132 www.bluejayway.it Un peptide (T20:enfuvirtide) blocca lazione della molecola gp41 inibisce la fusione tra envelope virale e membrana cellulare prevenzione dellinfezione della cellula. Inibizione della trascrittasi inversa previene linizio della replicazione virale blocca la sintesi di cDNA: - azidotimidina (AZT), dideossinosina (ddI) e la dideossicitidina (ddC) e altri analoghi nucleosidici fosforilati da enzimi cellulari incorporati nel cDNA dalla trascrittasi inversa terminazione della catena nascente - Nevirapina Inibitore non nucleosidico della trascrittasi inversa inibiscono con altri meccanismi Gli inibitori della proteasi bloccano la morfogenesi del virione inibiscono il taglio delle poliproteine gag e gag-pol virione inattivo. Altri farmaci anti-HIV in via di sviluppo includono: - analoghi nucleotidici - Inibitori della trascrittasi inversa - Antagonisti dei recettori (analoghi di CD4 e gp120) - Inibitori della funzione tat - Inibitori della glicosilazione delle proteine - Interferoni e induttori di interferoni - DNA antisenso specico per sequenze essenziali Normalmente, lazidotimidina (AZT) raccomandato per il trattamento di: - persone sintomatiche o mediamente sintomatiche con conta linfocitaria sotto 500 cellule/l - Donne in gravidanza infettate per ridurre la probabilit di trasmissione del virus al feto. Gli effetto tossici collaterali di AZT ad alte dosi si minimizzano somministrando AZT nella fase precoce in piccole dosi ripetute. Tuttavia, la velocit di mutazione di HIV favorisce lo sviluppo di resistenza a tali farmaci: - un cocktail detto trattamento antiretrovirale altamente attivo (HAART) diventato una terapia raccomandata - Costituito da differenti farmaci caratterizzati da diversi meccanismi dazione meno sensibile alla resistenza - La terapia multifarmacologica pu ridurre i livelli di virus nel sangue no a 0 e ridurre la morbilit e mortalit in molti pazienti con AIDS avanzata. - HAART un difcile e costoso regime terapeutico, ma molti ritornano a condizioni di salute quasi normali. Educazione Il modo principale attraverso cui linfezione da HIV pu essere controllata leducazione della popolazione su: - metodi di trasmissione - Misure che possono ridurre la diffusione virale. Ad esempio la possibilit di esposizione pu essere ridotta con: - relazioni monogame - Sesso sicuro - Preservativo Aghi contaminati sono la principale sorgente di infezione di HIV nei tossicodipendenti da droghe iniettabili, si deve insegnare a non condividere gli aghi: - il riutilizzo di aghi contaminati in clinica era la sorgente di epidemie di AIDS in URSS e in altri paesi - In alcuni paesi sono state avviate iniziative per fornire attrezzature sterili ai tossicodipendenti Una campagna di educazione anti-HIV di successo in Uganda stata pi efcace dei farmaci antivirali nel salvare vite. Screening di sangue, emoderivati, organi Potenziali donatori di sangue e di organi sono controllati prima che possano donare sangue: - persone positive per HIV non devono donare sangue - Persone che prevedono una futura necessit di sangue dovrebbero donare il proprio sangue in anticipo - Per limitare le epidemie nel mondo, si dovrebbe iniziare anche lo screening di sangue nelle nazioni in via di sviluppo. Controllo delle infezioni. Le procedure di controllo per e infezioni da HIV sono le medesime per quelle previste per il virus dellepatite B: - precauzioni universali per lutilizzo di sangue e uidi corporei (basate sullassunzione che tutti i pazienti sono potenzialmente infetti) - Indumenti protettivi - Altre barriere per prevenire lesposizione a prodotti del sangue - Siringhe e strumenti chirurgici non devono essere mai riutilizzati, salvo che non siano attentamente disinfettati - Superci contaminate dovrebbero essere disinfettate Corso di microbiologia - batteriologia 133 www.bluejayway.it - Il bucato in acqua calda con lutilizzo di detergenti sufciente a inattivare HIV Sviluppo di vaccini Non ancora disponibile un vaccino contro HIV, nonostante parecchi esperimenti. Un vaccino di successo dovrebbe: - prevenire lacquisizione di HIV - Impedire la trasmissione da madri a bambini - Dovrebbe bloccare la progressione della malattia La maggior parte dei vaccini studiati utilizzano la gp120 o il suo precursore gp160: - il gene di tale proteina stato clonato e espresso in differenti sistemi cellulari eucariotici sviluppato un vaccino a subunit - Il gene env stato incorporato nel virus vaccinico vaccini ibridi - Sono in corso di studio possibili vaccini peptidici, epitopi specici e antigeni per le cellule T, provenienti dal gene gag. - Si stanno studiando vaccini a DNA, costituiti da vettori di espressione eucariotici (plasmidi) contenenti il gene per la gp160 o altri geni HIV. Lo sviluppo di un vaccino efcace contro HIV comporta comunque vari problemi: - la protezione iniziale dovrebbe richiedere la formazione di anticorpi secretori per prevenire la trasmissione sessuale e lacquisizione del virus - Gli anticorpi e dellimmunit cellulo-mediata sono entrambi necessari a proteggere uninfezione da HIV - Nonostante un vaccino vivo attenuato potrebbe essere ideale, questi virus mostrano ancora virulenza in test su primati. - Lantigienicit della gp120 varia nei differenti clades e cambia a causa delle mutazioni - Il virus pu diffondere per mezzo di sincizi e rimanere latente si nasconde allanticorpo. - HIV infetta e inattiva le cellule necessarie ad iniziare una risposta immunitaria. La possibilit di saggiare i vaccini, inoltre, un serio problema: - HIV da malattia nelluomo e per monitorare lefcacia del vaccino richiesto di seguirlo per lunga durata. Ciclo di replicazione di HIV e target Iarmacologici ! Nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC, ABC, TDF,FTC 9 Protease inhibitors (PIs) SQV, IDV, RTV, NFV, fAPV, LPV, ATV, TPV, DRV " Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) EFV, NVP, DLV, ETR 1. Binding & fusion 2. Entry 3. Uncoating 4. Reverse transcription 5. Integration 6. Transcription 7. Translation 8. Assembly & budding 9. Maturation 1 Fusion inhibitor (FIs) T20 # Integrase inhibitors (INIs) RAL, !"# # Entry inhibitors Maraviroc "$%&$'$&(% Corso di microbiologia - batteriologia 134 www.bluejayway.it Virus dellimmunodecienza umana (HIV) Caratteristiche peculiari Virione sferico con envelope che racchiude un capside contenente due copie del genoma Retrovirus a RNA a polarit positiva 9kb Nel virione sono presenti gli enzimi trascrittasi inversa e integrasi. Il recettore per il virus determinante per il tropismo tissutale. La replicazione procede attraverso un intermedio a DNA, detto provirus. Il provirus integra in maniera casuale nel genoma della cellula ospite, diventando un gene cellulare. La trascrizione del genoma regolata dallinterazione dei fattori di trascrizione dellospite con promoter e enhancer nelle LTR del genoma virale necessario un linfocita o macrofago attivato Retrovirus complessi oltre ai geni gag, pol, env codicano anche geni accessori (tat, rev, nef, vpu, vif, ecc) I virioni si assemblano e gemmano dalla membrana plasmatica. La morfogenesi nale di HIV richiede il taglio da parte della proteasi dei polipeptidi di gag e gag-pol dopo lacquisizione dellenvelope. Patogenesi HIV inizialmente infetta le cellule T CD4 e le cellule della linea macrofagica Causa infezione litica in cellule T CD4 e infezione persistente produttiva a bassi livelli nella linea macrofagica Il virus causa formazione di sincizi, con cellule che esprimono grande quantit di antigene CD4 (ovvero i linfociti T helper CD4), con successiva lisi. altera le funzioni cellulari di linfociti T e macrofagi Epidemiologia Fattori virali della malattia Il virus con envelope facilmente inattivato deve essere trasmesso nei uidi corporei La malattia ha lungo periodo prodromico Il virus pu essere trasmesso prima dello sviluppo di sintomi identicabili. Trasmissione sangue, sperma e secrezioni vaginali. A rischio: - eroinomani - Persone attive con molti partner - Prostitute - Neonati con madre HIV-positive - Riceventi di sangue e organi non monitorati Geograa e stagione Epidemia in espansione mondiale Non c incidenza stagionale Malattia Incubazione di 2-4 settimane Primi sintomi simil-mononucleosi (linfoadenopatia), sudorazione notturna, febbre oppure asintomatica per parecchi anni Aumento del titolo virale nel sangue correlato alla diminuzione delle cellule CD4 Possibili infezioni secondarie da parassiti intracellulari, batteri intracellulari, micobatteri, funghi, tumori Il virus infetta il cervello, causando, a lungo termine, demenza. Diagnosi Screening con test immunoenzimatici (ELISA) o agglutinazione. Conferma di test positivo con Western blot Ricerca del virus RNA virionico con RT-PCR Quantizzazione nel sangue real-time RT-PCR, DNA catena ramicata Rapporto cellule T CD4/CD8 correla la malattia del virus HIV Terapia, prevenzione e controllo Farmaci antivirali (soprattutto il cocktail HAART) limitano la progressione della malattia Vaccini per la prevenzione e il trattamento sono in fase di sperimentazione Sesso sicuro in monogamia aiuta a limitare la diffusione Uso tassativo di aghi sterili non usati Programmi di screening su larga scala per sangue da trasfusioni, organi per trapianti e fattori di coagulazione per emoliaci. Corso di microbiologia - batteriologia 135 www.bluejayway.it I virus epatitici includono almeno sei virus (A, B, C, D, E, G). Lorgano bersaglio sempre il fegato, i sintomi sono simili, ma tali virus differiscono per: - struttura - Modalit di replicazione - Modo di trasmissione - Durata della malattia - Sequele della malattia che causano. I virus dellepatite classici sono: - virus dellepatite A (HAV) - Virus dellepatite B (HBV) Gli altri virus, detti virus delle epatiti non-A e non-B (NANB), sono: - virus delle epatiti C, G e E - Virus dellepatite D (HDV) o agente delta Ciascuno dei virus epatitici infetta e danneggia il fegato, determinando i sintomi classici di epatite: - itterizia - Rilascio di enzimi epatici Il virus specico che causa malattia pu essere identicato per: - decorso e natura della malattia - Sierologia Tali virus si diffondono velocemente le persone infettate sono contagiose prima della comparsa dei sintomi o in assenza di manifestazioni cliniche. Lepatite A, nota come epatite infettiva: - causata da un picornavirus (virus con genoma a RNA) - Si trasmette per via oro-fecale - Periodo di incubazione 1 mese, dopo il quale i sintomi sono improvvisi - Non causa malattia cronica - Raramente fatale Lepatite B, nota inizialmente come epatite da siero: - causata da un hepadnavirus, con genoma a DNA - Trasmessa per via parenterale attraverso il sangue, con aghi infetti, attraverso il contatto sessuale e per via perinatale - Periodo di incubazione di 3 mesi - I sintomi itterici iniziano in maniera insidiosa - Da epatite cronica nel 5-10% dei pazienti - Associata con il carcinoma epatocellulare primario (PHC). Pi di 1/3 della popolazione mondiale infettata con HBV, con due milioni di morti per anno: - lincidenza sta diminuendo soprattutto nei bambini, grazie allo sviluppo e allutilizzo di un vaccino specico. Il virus dellepatite C estremamente diffuso (170 milioni di portatori): - trasmesso attraverso le stesse vie di HBV - Causa pi facilmente malattia cronica - un avivirus a RNA Il virus dellepatite G un avivirus, causa infezioni croniche HEV un virus enterico, appartenente alla famiglia dei Novavirus, con malattia simile a quella di HAV. Lepatite D o epatite delta, richiede la replicazione attiva di HBV come virus helper: - la malattia si sviluppa solo in pazienti con infezione di HBV attiva - HBV fornisce lenvelope per lRNA di HDV e per i suoi antigeni - Aggrava i sintomi dellepatite B Corso di microbiologia - virologia 136 www.bluejayway.it Virus epatitici Sei virus differenti (A- E, G) danno epatite Differiscono per struttura, replicazione, trasmissione e sequele post-malattia Epatite A infettiva Epatite B da siero Virus dellepatite Enrico Colombo HAV causa epatite infettiva, trasmessa per via oro-fecale: - infezioni spesso dovute allassunzione di - Acqua contaminata - Molluschi - Altri cibi - un picornavirus, classicato nel genere Heparnavirus per il suo unico genoma Struttura Il virus dellepatite A (HAV) ha un capside icosaedrico nudo di 27 nm: - circonda un genoma a RNA a polarit positiva a singola catena (7470 kb) - Il genoma ha - una proteina VPg legata al 5 - PoliA in 3 - Il capside pi stabile degli altri picornavirus agli acidi e altri trattamenti. Replicazione HAV replica come gli altri picornavirus: - interagisce in maniera specica con un recettore espresso sugli epatociti - Non citolitico rilasciato per esocitosi 26 . - Ceppi di laboratorio di HAV sono stati adattati a crescere in cellule primaria e cellule di fegato di scimmia, ma gli isolati clinici crescono a fatica in coltura cellulare. Patogenesi Ingresso per via orale orofaringe o rivestimento epiteliale dellintestino viremia fegato: - infettale cellule di Kupffer e gli epatociti - I virioni sono riversati nella bile feci HAV viene eliminato attraverso le feci circa 10 giorni prima della comparsa dellittero o che gli anticorpi siano rilevati. HAV replica lentamente nel fegato, senza produrre effetti citopatici: - linterferone limita la replicazione virale - Per eliminare le cellule infettate cellule NK e linfociti T CTL - Anticorpi, complemento e citotossicit mediata da anticorpi facilitano leliminazione del virus e linduzione di danno immuno-mediato. - Littero, come conseguenza di danno epatico, si sviluppa quando: - si possono rilevare le risposte immunitarie cellulo-mediate - Sono presenti anticorpi contro il virus. - La protezione anticorpale di lunga durata Dal punto di vista istopatologico epatite non distinguibile da HBV - danno causato da eventi immunopatologici e non da CPE virale - Contrariamente ad HBV, HAV - non pu instaurare infezione cronica - Non associato a cancro epatico. Epidemiologia Circa il 40% dei casi di epatite acuta causato da HAV: - 10-14 giorni prima dei sintomi le persone sono contagiose il virus diffonde rapidamente in una comunit - 90% dei bambini infettati e 25-50% degli adulti infezioni inapparenti, ma produttive. Corso di microbiologia - virologia 137 www.bluejayway.it 26 in questo si differenzia dagli altri picornavirus, i quali sono citolitici HAV Picornavirus Capside icosaedrico nudo (27 nm) Genoma RNA+ ss legato a proteina VPg Non citolitico Rilasciato per esocitosi Ingresso per via orale e espulsione fecale Virus dellepatite A - Eliminato in alte concentrazioni attraverso le feci diffusione via oro- fecale - Acqua e cibo contaminati - Mani sporche - HAV resistente - agli acidi e ai detergenti - A temperature no a 60 - Pu sopravvivere per molti mesi in acqua dolce e in acqua salata - Liquami non trattati possono inquinare i rifornimenti idrici contaminano i molluschi - I molluschi, soprattutto vongole, ostriche e mitili sono importanti sorgenti di virus Le epidemie di HAV sono solitamente originate da una sorgente comune: - la diffusione asintomatica e lincubazione lunga (15-40 gg) difcile identicazione della sorgente - Ambienti scolastici principale sorgente di diffusione del virus tra compagni e genitori Unalta incidenza di HAV strettamente correlata a: - scarse condizioni igieniche - Sovraffollamento La maggior parte delle persone infettate da HAV in paesi in via di sviluppo costituita da bambini che vanno incontro ad una malattia di media gravit sviluppano protezione immunitaria per tutta la vita. In paesi pi sviluppati infezione pi avanzata nella vita. settimane virus nelle feci IgM specifiche per HAV IgG specifiche per HAV 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0 0 0 5 0 0 14 0 0 15 5 0 4 20 5 2 25 20 1 20 25 0 15 25 0 10 25 0 8 25 0 7 25 0 6 25 0 5 25 0 4 25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 virus nelle feci IgM specifiche per HAV IgG specifiche per HAV ingestione prodromo: malessere, nausea, perdita di appetito, dolore addominale Legionella pneumophila 15-40 giorni incubazione ittero nel 70-80% degli adulti e 10% bambini 4-6 giorni guarigione coltura su terreno BCYE, 35C, CO2 al 3-5% legionella pneumophila test dellantigene urinario test sierologico diagnosi positiva molluschi, acqua contaminata, mani infette epatite fulminante colonie piccole di 1-3 mm DFA con microscopia positiva mancata crescita con terreni privi di L-cys 2-5 giorni test immunoenzimatico (EIA) su urine concentrate. Rilevati antigeni fino ad 1 mese dopo per il 50% sieroconversione o aumento di 4 volte del titolo anticorpale tra fase acuta e fase convalescente morte 80% 3/1000 Corso di microbiologia - batteriologia 138 www.bluejayway.it Sindrome clinica I sintomi causati da HAV sono molto simili a quelli causati da HBV danno epatico immuno-mediato: - nei bambini la malattia meno grave, e solitamente asintomatica - I sintomi insorgono rapidamente 15-40 giorni dopo linfezione e si intensicano nei 4-6 giorni prima della fase itterica - Sintomi iniziali - Febbre - Affaticamento - Nausea - Perdita di appetito - Dolore addominale - Litterizia si manifesta nel 80% degli adulti, ma solo nel 10% dei casi di infezione in bambini sotto i 6 anni - I sintomi diminuiscono dopo la fase itterica La diffusione precede di circa 10-14 giorni la comparsa dei sintomi si blocca prima della cessazione dei sintomi. Nel 99% delle volte guarigione completa 1-3/1000 persone sviluppano epatite fulminante nelle infezioni da HAV mortalit 80%. Diagnosi di laboratorio La diagnosi di infezione da HAV generalmente in base: - ai sintomi clinici - Allidenticazione di una sorgente infetta conosciuta - Risultati dei test sierologici. Il modo migliore per dimostrare infezione acuta da HAV ricerca di IgM anti- HAV attraverso ELISA o test radioimmunologico. Non utilizzato lisolamento virale in coltura cellulare. Trattamento, prevenzione e controllo Diffusione di HAV interrotta prevenendo la trasmissione per via orofecale: - evitando acqua o cibo contaminati (soprattutto molluschi non cotti) - Lavaggio appropriato delle mani (soprattutto nei centri per linfanzia e negli ospedali) - Trattamento dellacqua da bere con il cloro La prolassi con Ig sieriche somministrate prima o precocemente durante il periodo di incubazione (prima di 2 settimane dopo lesposizione) previene la malattia nel 80-90% dei casi. Un vaccino ucciso per HAV stato approvato dalla FDA: - disponibile per tutti i bambini e per gli adulti ad alto rischio - Somministrato ai bambini a 2 anni di et - Pu essere somministrato negli adulti assieme al vaccino HBV HAV infetta soltanto luomo e ha un solo sierotipo programma di immunizzazione pu avere largo successo. Corso di microbiologia - batteriologia 139 www.bluejayway.it Virus dellepatite A Struttura e replicazione Capside icosaedrico nudo Genoma a RNA ss polarit positiva Un solo sierotipo Replica interagendo in maniera specica con recettori sugli epatociti HAV non citolitico Rilasciato per esocitosi Stabile allacido, solventi, detergenti Resiste per mesi in acqua sia dolce che salata Resiste a temperature sotto i 60C Patogenesi Bocca orofaringe/intestino viremia fegato bile feci Eliminato attraverso le feci in alte concentrazioni 10 giorni prima della comparsa di ittero Leffetto citopatico immuno-mediato epatite Gli anticorpi, il complemento facilitano leliminazione del virus Lepatite A non istologicamente differente dallepatite da HBV Epidemiologia Virus molto resistente allattivazione Il periodo di contagio da 10 giorni prima della comparsa dei sintomi alla ne dei sintomi Il virus pu causare diffusione asintomatica Trasmesso per via orofecale Ingestione di cibo e acqua contaminati pu causare infezione HAV alberga in molluschi che ltrano acqua contaminata da acque di scolo. Il virus pu essere trasmesso da personale degli asili e dai bambini A rischio - bambini malattia lieve, generalmente asintomatica; le scuole sono la maggior sorgente di diffusione - Adulti epatite ad esordio improvviso - Donne gravide alta mortalit associata ad HEV Virus diffuso in tutti i continenti Non c incidenza stagionale Malattia Epatite: - 15-40 giorni di incubazione - Fase iniziale (4-6 giorni) vomito, febbre, malessere, affaticamento - Fase conclamata ittero e gli altri sintomi Generalmente guarigione (99% dei casi) Diagnosi Diagnosi effettuata in base a: - Sintomi e decorso clinico - Identicazione della fonte di diffusione - Sierologia (ELISA) Terapia, prevenzione e controllo Controllo attraverso: - buon livello igienico - Lavaggio delle mani Protezione passiva per HAV con Ig speciche come prolassi Immunizzazione con vaccino a virus ucciso. Corso di microbiologia - batteriologia 140 www.bluejayway.it LHBV il principale membro degli hepadnavirus: - altri membri della famiglia sono di epatiti animali - Hanno tropismo tessutale e spettro dospite limitati HBV infetta il fegato e in maniera meno importante reni e pancreas: - ospiti: uomo e scimpanz - Progressi nella biologia molecolare hanno permesso lo studio di HBV, nonostante la mancanza di un sistema di colture cellulari che potesse coltivare il virus. Struttura LHBV un piccolo virus a DNA, dotato di envelope, con diverse propriet peculiari: - genoma a DNA circolare, parzialmente bicentenario - Codica per una trascrittasi inversa replica attraverso un intermedio a RNA. - Il virione, detto particella di Dane, ha diametro 42 nm - pur essendo dotato di envelope, i virioni sono stabili - Resistenti a - Trattamento con etere - Basso pH - Congelamento - Moderato riscaldamento - Resistenza trasmissione persona-persona facile Il virione di HBV include: - proteina chinasi: - Polimerasi: attivit di trascrittasi inversa e ribonucleici H - Proteina P attaccata al genoma Tutte le proteine e il genoma sono inserite in un capside costituito dallantigene del core dellepatite (HBcAg). Il virione rivestito da un envelope contenente la glicoproteina di supercie dellepatite B (HBsAg). La proteina e dellepatite B (HBeAg) un componente minore del virione: - condivide parzialmente la sequenza con lantigene del core (HBcAg) - Tuttavia - processato in maniera differente - Secreto per primo nel siero - Non si autoassembla - Esprime determinanti antigenici Particelle contenenti HBsAg sono rilasciate nel siero di persone infette in quantit superiore ai virioni completi: - pi piccole rispetto alle particelle di Dane - Possono essere sferiche o lamentose - Sono immunogeniche HBsAg include tre glicoproteine (L, M e S) codicate dallo stesso gene e letto nello stesso frame - tradotte in proteine differenti partendo da differenti codoni dinizio (AUG). Corso di microbiologia - virologia 141 www.bluejayway.it HBV Hepadnavirus con DNA bicentenario incompleto Envelope Codica per una trascrittasi inversa Il virione include una chinasi, la trascrittasi inversa e una proteina P legata al genoma virione stabile HBsAg una glicoproteina di supercie Virus dellepatite B - Glicoproteina S: completamente contenuta nella glicoproteina M - Glicoproteina M: contenuta in tutta la glicoproteina L - Tutte condividono le stesse sequenze C-terminali. - Tutte e tre le forme di HBsAg si trovano nel virione La glicoproteina S il principale componente delle particelle HBsAg: - si autoassembla in particelle sferiche di 22 nm rilasciate nel sangue - Le particelle lamentose di HBsAg ritrovate nel siero contengono soprattutto glicoproteina S, ma anche piccole quantit di glicoproteine M, L e lipidi La glicoproteina L un componente essenziale per lassemblaggio del virione: - favorisce la formazione delle forme lamentose e limita la secrezione di tali strutture Le glicoproteine HBsAg contengono i determinanti di HBV: - gruppo-specici (a) - Tipo-specici (d/y, w/r) Combinazioni di questi antigeni producono 8 sottotipi di HBV, utili marker epidemiologici (es ady, adw, ayr, ecc). Replicazione La replicazione di HBV peculiare per varie ragioni: - tropismo denito per il fegato - Genoma piccolo deve economizzare i processi di sintesi - Replica attraverso un intermedio a RNA - Produce e rilascia particelle antigeniche decoy (HBsAg) Assorbimento di HBV mediato dalle glicoproteine HBsAg (L, S, M): - recettori su epatociti per transferrina, asialoglicoproteina, endonexina - Meccanismo dentrata non noto - HBsAg si lega allalbumina sierica umana interazione che potrebbe facilitare il legame e ladsorbimento del virus nel fegato. IPOTESI DI CICLO REPLICATIVO DI HBV Dopo lentrata nellepatocita e la liberazione del core del nucleocapside, il genoma a DNA parzialmente bicentenario completato ad opera di enzimi presenti nel core, poi rilasciato nel nucleo. La trascrizione del genoma produce quattro classi di mRNA, di cui uno pi lungo del genoma (3500 mRNA e 3200 il genoma). Migra nel citoplasma e viene tradotto in proteina. Le proteine del core si assemblano attorno allmRNA di 3500 b e viene sintetizzato il DNA a polarit negativa, grazie allattivit della retrotrascrittasi presente nel core. LRNA viene degradato (la polimerasi ha anche attivit di ribonucleasi H), mentre viene sintetizzato il lamento di DNA a polarit positiva. Il core viene rivestito dallenvelope prima del completamento del DNA+ e il virione rilasciato attraverso esocitosi Dopo la penetrazione della cellula completamento della catena parziale del DNA genomico conversione in una forma completa di DNA ds: - trasportato nel nucleo trascritto - La trascrizione controllata da elementi cellulari di trascrizione presenti negli epatociti - Il DNA trascritto in diversi mRNA, classicabili in - tre classi maggiori (2100, 2400, 3500 b) - Due classi minori (900 b) LmRNA 3500 pi esteso del genoma codica per - antigeni HBe e HBc proteine correlate tradotte da differenti codoni dinizio differenze nel loro processamento e nella struttura Corso di microbiologia - batteriologia 142 www.bluejayway.it - Liberazione di HBe - Incorporazione di HBc nel virione - Polimerasi - Proteina da innesco per la replicazione del DNA, che agisce come stampo per la replicazione del genoma LmRNA 2100 codica le piccole e medie glicoproteine da differenti codoni dinizio. LmRNA 2400 codica le grandi glicoproteine: - si sovrappone al mRNA a 2100 LmRNA 900 codica per la proteina X promuove la replicazione virale, funzionando come: - transattivatore trascrizionale - Protein chinasi La replicazione del genoma inizia con la produzione degli mRNA 3500 basi: - sono incapsidati nel core nucleocapsidico contenente la trascrittasi inversa - LRNA 3500 basi funziona da stampo su cui viene sintetizzata la catena negativa del DNA, utilizzando la proteina dinnesco come primer - LRNA degradato dallattivit della ribonucleasi H (altra attivit della trascrittasi inversa) - Il DNA a polarit negativa serve da stampo per la sintesi della catena positiva del DNA - La sintesi della catena positiva di DNA interrotta dallavvolgimento del nucleocapside con le membrane del reticolo endoplasmatico contenenti HBsAg - Cattura di genomi costituiti da RNA-DNA circolari con RNA di differenti lunghezze - La continua degradazione della copia di RNA restante nel virione sintesi di DNA genomico parzialmente bicentenario - Il virione rilasciato dagli epatociti per esocitosi e non per lisi cellulare Lintero genoma pu essere integrato nella cromatina della cellula ospite: - nelle cellule in cui presente il DNA di HBV integrato pu essere spesso rivelato HBsAg, - Il signicato dellintegrazione non conosciuto - DNA virale HBV integrato stato trovato nei carcinomi epatocellulari Patogenesi e immunit HBV pu causare una malattia: - acuta o cronica, - sintomatica o asintomatica La condizione patologica pare essere determinata dalla risposta immunitaria allinfezione. La messa in evidenza nel sangue di entrambi i componenti del virione (HBeAg e HBsAg) indica infezione attiva in corso: - particelle di HBs continuano ad essere rilasciate nel sangue anche dopo che il rilascio del virione terminato e no a quando linfezione risolta. La principale sorgente dinfezione il sangue, ma altre sono: - liquido seminale - Saliva - Secrezioni vaginali e mestruali - Fluido amniotico - Latte In virus inizia a replicare nel fegato 3 giorni dopo il contagio sintomi possono non essere osservati per 45 giorni o per pi tempo, a seconda - della dose infettante Corso di microbiologia - batteriologia 143 www.bluejayway.it - Della modalit di infezione - Della persona infettata HBV replica negli epatociti effetto citopatico minimo: - senza causare danno al fegato o sintomi, linfezione procede per parecchio tempo - In tale periodo alcune copie di genoma si integrano nella cromatina restano latenti - Accumulo intracellulare di forme lamentose di HBsAg possono indurre la siopatologia dellepatocita a vetro smerigliato. Limmunit cellulo-mediata e linammazione sono responsabili di: - sintomi - Risoluzione degli effetti dovuti allinfezione a HBV eliminano gli epatociti infettati Epitopi di antigeni HBc sono importanti antigeni per cellule T. Una risposta T insufciente epatite cronica Anticorpi possono prevenire il trasporto di virus al fegato: - nelle fasi successive dellinfezione, la grande quantit di HBsAg nel siero lega e blocca lazione degli anticorpi neutralizzanti limita la capacit degli anticorpi di risolvere uninfezione - Gli immunocomplessi che si formano contribuiscono allo sviluppo di reazioni di ipersensibilit (tipo III) portano a problemi secondari - Vasculite - Rash - Danno renale Neonati e bambini piccoli hanno una risposta immunitaria cellulo-mediata immatura: - sono meno capaci di risolvere linfezione - Risentono meno dei sintomi. - diventano portatori cronici per il 90% replicazione virale persistente Durante la fase acuta dellinfezione, il fegato mostra cambiamenti degenerativi: - rigonamento cellulare - Necrosi La risoluzione permette al parenchima di rigenerarsi. Le infezioni fulminanti, lattivazione delle infezioni croniche o la coinfezione con agente delta danno epatico permanente cirrosi. Epidemiologia In USA 300,000 infezioni allanno, con 4000 morti. Nei PVS il numero di persone contagiate pi alto (15% della popolazione si infetta durante la nascita o durante linfanzia): - elevati tassi di sieropositivit in Italia, Grecia, Africa e Sud-Est asiatico. - Molti portatori cronici asintomatici favoriscono la diffusione del virus Il virus diffuso attraverso via: - sessuale - Parenterale - Perinatale Trasmissione avviene mediante sangue contaminato e derivati di sangue, attraverso: - trasfusione - Condivisione di aghi - Agopuntura Corso di microbiologia - batteriologia 144 www.bluejayway.it - Piercing allorecchio o tatuaggi - Contatti personali molto stretti, che coinvolgono - Liquido seminale - Saliva - Secrezioni vaginali I principali fattori di rischio sono: - abuso di droghe - Promiscuit sessuale. Bimbi nati da madre cronicamente positive per HBV sono ad un rischio pi elevato per linfezione. Nelle banche di sangue screening sierologico rischio ridotto di acquisire il virus attraverso sangue contaminato o suoi derivati. Sesso sicuro e vaccino hanno permesso di diminuire la trasmissione. Una delle principali preoccupazioni lassociazione con il carcinoma epatocellulare primario (PHC): - responsabile di 250000-1 milione di morti allanno nel mondo - In USA circa 5000 morti allanno per PHC Sindromi cliniche Infezione acuta Nei bambini manifestazioni cliniche meno grave negli adulti. Pu essere asintomatica La malattia clinicamente apparente avviene in circa il 25% degli infettati. Linfezione da HBV caratterizzata da: - periodo di incubazione lungo - Manifestazione clinica insidiosa - Prodromi febbre, malessere, anoressia, poi nausea, vomito, disturbi addominali e brividi. - Sintomi classici: ittero (urine scure, feci pallide, itterizia) - Guarigione: indicata dalla diminuzione della febbre e dal ritorno dellappetito. Lepatite fulminante 1% dei pazienti itterici, pu essere fatale: - sintomi pi severi - Segni di grave danno epatico Linfezione da HBV pu favorire reazioni di ipersensibilit, causate da immunocomplessi HBsAg-IgG anti-HBs: - rash - Vasculite acuta necrotizzante - Glomerulonefrite Infezione cronica Lepatite cronica avviene nel 5-10% delle persone con infezione da HBV, - solitamente dopo una malattia iniziale inapparente o di media gravit - Circa 1/3 delle persone con infezione cronica ha unepatite cronica attiva - Continua distruzione del fegato cicatrici nel tessuto epatico, cirrosi, insufcienza epatica o PHC - I 2/3 hanno unepatite cronica passiva rare conseguenze Unepatite cronica pu essere rivelata accidentalmente trovando: - livelli elevati degli enzimi del fegato - Analisi biochimiche di routine del sangue Persone cronicamente infettate sono la principale sorgente di diffusione del virus. Sono a rischio di malattia fulminante se infettate con HDV. Carcinoma epatocellulare primario LOMS ha attribuito l80% dei casi di PHC ad infezioni con HBV: - genoma di HBV integrato nelle cellule del carcinoma epatocellulare tali cellule hanno antigeni HBV - una delle cause pi comuni di morte per cancro in tutto il mondo. HBV pu indurre PHC: - promuovendo il continuo riparo e la crescita cellulare (rigenerazione) - Integrandosi nel cromosoma dellospite stimola direttamente la crescita cellulare. - Potrebbe stimolare il riarrangiamento genetico o la giustapposizione di promoter virali vicino ai geni del controllo della crescita cellulare. Corso di microbiologia - batteriologia 145 www.bluejayway.it - Una proteina codicata dal gene X di HBV pu transattivare la trascrizione delle proteine cellulari stimolata crescita - pu favorire una successiva mutazione carcinoma. Il periodo di latenza varia da 9-35 anni. Diagnosi di laboratorio La diagnosi iniziale di epatite fatta in base a: - sintomi - Ritrovamento di enzimi epatici nel sangue La sierologia dellinfezione da HBV pu descrivere decorso e natura della malattia. Le infezioni acute o croniche possono essere distinte dalla presenza di: - HBsAg e HBeAg nel siero: secreti durante la replicazione virale - presenza di virus infettante La rilevazione di HBeAg - Infezione cronica reperiti HBeAg e HBsAg, ma non anticorpi contro di essi - Fase sintomatica difcile rilevare anticorpi contro HBeAg e HBsAg, poich sono sotto forma di immunocomplessi. - Diagnosi precoce di infezione misura delle IgM anti-HBc - Anticorpi contro antigeni HBV nellindividuo STATO DI MALATTIA STATO DI MALATTIA STATO DI MALATTIA STATO DI MALATTIA STATO DI MALATTIA STATO DI SALUTE STATO DI SALUTE Reattivit sierologica Presintomatico Precoce acuta Acuta Cronica Acuta tardiva Guarigione Vaccinati Anti-HBc - - - + +/- + - Anti-HBe - - - - +/- +/- - anti-HBs - - - - - + + HBeAg - + + + - - - HBsAg + + + + + - - Virus infettivi + + + + + - - Corso di microbiologia - batteriologia 146 www.bluejayway.it Trattamento, prevenzione e controllo Non disponibile alcun trattamento per linfezione acuta: - immunoglobuline speciche per epatite B somministrate entro 1 settimana dallesposizione (anche a bambini nati da madri HBsAg positive) prevenzione e miglioramento della malattia - Infezione cronica trattata con farmaci contro la polimerasi - Lamivudina inibitore della trascrittasi inversa di HIV - Adefovir dipivoxil e famciclovir. - Somministrazione di interferone per 4 mesi pu essere efcace La trasmissione di HBV attraverso il sangue o i suoi derivati stata ridotta dallo screening del sangue per la presenza di HBsAg o HBc. Ulteriore impegno consiste nellevitare il sesso. Contatti domestici e partner sessuali di portatori sono a pi alto rischio. La vaccinazione raccomandata: - in bambini e infanti - Persone appartenenti a gruppi ad alto rischio - Dopo lesposizione al virus, - In neonati di madri positive - Persone accidentalmente esposte a sangue o secrezioni di una persona HBsAg-positiva Limmunizzazione ridurr anche lincidenza di PHC I vaccini sono vaccini a subunit: - inizialmente da particelle di HBsAg 22nm presenti nel plasma umano di pazienti cronicamente infetti - Oggi stato geneticamente ingegnerizzato trascritto del gene S in un lievito Il vaccino dovrebbe essere somministrato in 3 iniezioni: - Prima iniezione - 1 mese dopo - 6 mesi dopo Pi del 95% degli individui vaccinati sviluppa immunit. Per limitare lesposizione ad HBV precauzioni universali durante la manipolazione di sangue e uidi corporei: - assunzione che tutti sono potenzialmente infettati - Guanti per maneggiare sangue e uidi - Occhiali o vestiti protettivi - Attenzione ad aghi e strumenti taglienti. Materiali contaminati con HBV possono essere decontaminati con varechina al 10%. Virus dellepatite B (HBV) Struttura Hepadnavirus I virioni possiedono envelope Genoma circolare a DNA, parzialmente bicentenario Replicazione avviene attraverso un intermedio a RNA Il virus codica una retrotrascrittasi, che viene posta nel virione Il virus codica una serie di proteine (HBsAg [L, M, S], HBc, HBe) che condividono le sequenze geniche, ma con differenti codoni di inizio. HBV ha uno stretto tropismo tissutale per il fegato. Le cellule infettate da HBV producono e rilasciano una gran quantit di particelle di HBsAg prive di DNA Il genoma di HBV pu integrarsi nel cromosoma dellospite. Patogenesi Malattia acuta o cronica e sintomatica o asintomatica, in base al tipo di risposta immunitaria Hbs e HBe presenti contemporaneamente indicano infezione attiva in corso. La principale sorgente di infezione il sangue, ma altri mezzi possono essere secrezioni vaginali, latte, uido amniotico, liquido seminale, saliva. Dopo 3 giorni il virus inizia a replicare, I sintomi prodromici si manifestano 45 o pi giorni dopo. Danno citopatico diretto minimo, Il danno tissutale dato dai CTL e linfociti NK (risposta immunitaria e inammatoria) e dalla citolisi mediata da anticorpi/complemento. Possono vericarsi ipersensibilit da immunocomplessi (III tipo) Durante la fase acuta necrosi e rigonamento cellulare negli epatociti. Epidemiologia Diffusa in tutto il mondo, senza incidenza stagionale. Molti portatori cronici asintomatici favorita la diffusione del virus Diffusione per via sessuale, parenterale e perinatale. Trasmissione attraverso: - sangue o aghi contaminati o derivati dal sangue mediante trasfusione - Contatti personali stretti, che coinvolgono saliva, secrezioni vaginali, sperma Corso di microbiologia - batteriologia 147 www.bluejayway.it Screening sierologico del sangue e vaccinazione stanno aiutando a diminuire lincidenza di HBV. Sindromi cliniche Infezione acuta: lungo periodo di incubazione, poi manifestazioni cliniche pre-itteriche (febbre, malessere, disturbi addominali, nausea, vomito, anoressia), in seguito comparsa di ittero, con danno epatico. Generalmente si ha guarigione, ma possono svilupparsi epatite fulminante o epatite cronica Epatite cronica: in circa il 5-10% degli infettati da HBV. Circa 1/3 dei malati ha epatite cronica attiva, sviluppando cirrosi, insufcienza epatica o PHC. Gli altri hanno epatite cronica passiva, con minori conseguenze. Carcinoma epatocellulare primario: HBV associato all80% dei carcinomi epatocellulari. Il genoma di HBV integrato nel genoma della cellula ospite. Diagnosi di laboratorio Diagnosi iniziale sulla base di sintomi clinici e presenza di enzimi epatici nel sangue. La sierologia dellinfezione da HBV descrive il decorso e la natura della malattia. HBsAg e HBeAg sono secreti nel sangue durante la replicazione virale. Gli antigeni HBs, HBc, HBe e gli anticorpi che li riconoscono possono descrivere linfezione nei diversi stadi. Le IgM anti HBc sono un modo per diagnosticare una recente infezione Trattamento, prevenzione e controllo. Nessun trattamento disponibile per linfezione acuta Possono essere somministrate Ig speciche per lepatite B entro una settimana dallesposizione per prevenire linsorgenza di malattia in bambini nati da madri positive. Farmaci antivirali possono essere utili per trattare linfezione cronica (lamivudina, adefovir dipivoxil e famciclovir). Linterferone pu essere efcace per un trattamento di 4 mesi. Screening dei donatori di sangue per evitare infezioni da trasfusioni Stile di vita idoneo (sesso sicuro e igiene) Vaccinazione per infanti e bambini. Immunizzare le madri gravide pu ridurre il numero di portatori cronici per HBV. Corso di microbiologia - batteriologia 148 www.bluejayway.it Il virus dellepatite C fu identicato nel 1989 dopo lisolamento di RNA virale in uno scimpanz infettato dal sangue di una persona con epatite NANB: - RNA era convertito a DNA mediante trascrittasi inversa - Venivano espresse le sue proteine, riconosciute da anticorpi di pazienti con epatite NANB - Sviluppati diversi test ELISA, genomici e altri test per rilevare il virus che non pu ancora essere cresciuto. HCV la causa predominante delle epatiti virali NANB ed stato la causa principale di epatiti post-trasfusionali prima che fosse effettuato lo screening: - 170 milioni di portatori di HCV al mondo - Trasmesso con modalit simili a HBV (sesso, sangue, secrezioni corporee) - Ha pi facilit di dare epatiti persistenti e croniche. - Spesso portano a cirrosi o potenzialmente a carcinoma epatocellulare. Struttura e replicazione HCV il solo membro del genere Hepacivirus, della famiglia dei aviviridae: - diametro 30-60 nm - Genoma RNA a polarit positiva - Provvisto di envelope Il genoma di HCV codica 10 proteine, incluse: - glicoproteine E1 e E2 subiscono variazioni a durante una stessa infezione, a causa di regioni di ipervariabilit nei loro geni Esistono circa 6 principali gruppi di varianti (clades) differenti per distribuzione mondiale. HCV infetta solamente uomini e scimpanz. Il virus si copre con lipoproteine a bassa densit (LDL), e usa il loro recettore per essere internalizzato dagli epatociti. Il legame ai recettori di supercie CD81 espressi sui linfociti e su altre cellule permette al virus di restare fuori dagli epatociti. HCV replica come gli altri avivirus: - il virione gemma - Resta nel reticolo endoplasmatico, restando associato alle cellule Le proteine di HCV inibiscono - lapoptosi - Lazione dellIFN- mediante il legame al recettore per TNF e alla proteina chinasi R Tali azioni prevengono la morte della cellula ospite infezione persistente. Patogenesi Capacit di HCV di restare associato alle cellule e di prevenire la morte cellulare favorisce infezione persistente: - la malattia epatica tuttavia prodotta pi avanti nella vita - Il principale responsabile del danno tissutale il sistema immunitario reazione cellulo-mediata. Corso di microbiologia - virologia 149 www.bluejayway.it HCV Flavivirus Envelope riveste un nucleocapside. Genoma a RNA a polarit positiva Si copre con le LDL e entra con esse nel fegato Pu sopravvivere fuori dal fegato legando il CD81 sui linfociti Predilige infezioni croniche. Inibisce lapoptosi e lazione di IFN- Virus dellepatite C (HVC) Una biopsia al fegato pu rilevare dei parametri per seguire lavanzamento della malattia: - inltrato linfocitario - Inammazione - Fibrosi portale e periportale - Necrosi globulare. Riparazione continua del fegato + induzione della crescita cellulare durante linfezione cronica suscettibilit a carcinoma epatocellulare primario (PHC). Gli anticorpi anti-HCV non sono protettivi, e limmunit non duratura. Epidemiologia HCV trasmesso soprattutto attraverso: - sangue infetto - Via sessuale Popolazione a rischio: - trasfusi - Tossicodipendenti - Emoliaci riceventi fattori VIII e IX Quasi tutte le persone infettate da HIV che erano o sono utilizzatori di droghe sono infettati con HCV (~90%). La malattia prevalente in: - Sud Italia, - Spagna - Europa centrale - Giappone - Medio Oriente. Lelevata incidenza di infezioni croniche asintomatiche favorita la diffusione. Sindromi cliniche HCV causa tre tipi di malattie: - 15% epatite acuta, con risoluzione e guarigione dellinfezione - 70% infezione cronica persistente, con possibile progressione verso la malattia pi avanti nelle persone infettate - 15% rapida progressione verso la cirrosi Dopo 1-3 settimane dalla trasfusione di sangue contaminato pu essere rilevata una viremia: - dura 4-6 mesi in persone con infezione acuta - Dura pi di 10 anni in persone con infezione persistente Nellepatite acuta sintomi simili a HBV 27 , ma meno gravi La infezione cronica persistente solitamente asintomatica allinizio: - il sintomo predominante laffaticamento cronico - La malattia progredisce a epatite cronica attiva entro 10-15 anni e verso la cirrosi (20% dei cronici), poi linsufcienza epatica (20% dei cirrotici) dopo 20 anni Il danno epatico da HCV pu essere aggravato: - dal consumo di alcool Corso di microbiologia - batteriologia 150 www.bluejayway.it 27 prodromo con malessere, affaticamento, nausea, vomito e dolori addominali. Successivamente sviluppo di ittero, urine scure e feci pallide. - Da alcuni trattamenti medici - Da altri virus epatitici che portano a cirrosi. In alcuni pazienti cronicamente infettati carcinoma epatocellulare Diagnosi di laboratorio La diagnosi e la rilevazione dellinfezione da HCV si basano su: - riconoscimento degli anticorpi mediante saggio ELISA - Rilevazione del RNA genomico Il saggio ELISA utilizzato per lo screening dei normali donatori di sangue: - i risultati positivi possono essere confermati mediante procedure di Western blot. - In viremici, immunocompromessi e immunodializzati non sempre possibile evidenziare la presenza di anticorpi - Si possono utilizzare le tecniche genomiche per rivelare lRNA virale (RT-PCR, Branched-chain DNA, ecc...) Trattamento, prevenzione e controllo IFN- ricombinante o interferon peghilato (trattato con PEG, glicol polietilenico) da solo o con ribavarina sono gli unici trattamenti conosciuti per HCV: - possono portare a guarigione no al 50% Virus dellepatite G Il virus dellepatite G simile sotto molti aspetti a HCV: - avivirus - Trasmesso attraverso il sangue - Predilige lepatite cronica Il rilevamento avviene attraverso RT-PCR o altri metodi di rilevazione di RNA virale. Virus dellepatite E HEV (epatite E-NANB), dove la E sta per enterico o epidemico: - diffuso per via orofecale, soprattutto con acqua contaminata - Genere separato tra i Norovirus, per grandezza e struttura - Diffuso in tutto il mondo, ma problematico maggiormente nei PVS I sintomi e il decorso della malattia da HEV sono simili a quelli della malattia HAV: - possono insorgere pi tardi rispetto a malattia da HAV - Il tasso di mortalit circa 1-2% - Linfezione con HEV grave soprattutto nelle donne in gravidanza (mortalit 20%). Corso di microbiologia - batteriologia 151 www.bluejayway.it
CoronaVirus CoViD-19 SARS-CoV2 e Attivita Fisica Adattata: Considerazioni osservazioni curiosità scienza durante il periodo di quarantena di contenimento sociale della pandemia