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Manual de Procedimientos

Diagnstico y caracterizacin de Escherichia coli O157 productor de toxina Shiga a partir de especimenes clnicos

2007

AUTORES

Marta Rivas Elizabeth Miliwebsky Natalia Deza

Departamento Bacteriologa Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. Dr. Carlos G. Malbrn Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para Amrica del Sur

INDICE CAPITULO I - INTRODUCCION 1.- Antecedentes 1.1.- Marcadores de virulencia 1.2.- Patognesis 1.3.- Evolucin de Escherichia coli O157:H7 1.4.- Manifestaciones clnicas 1.5.- Reservorios y vas de transmisin 1.6.- Tratamiento 1.7.- Epidemiologa 1.8.- Situacin actual del SUH en Argentina 1.9.- Prevencin CAPITULO II - AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE Escherichia coli O157 1.- Especimenes 2.-Procesamiento 2.1.A.-Aislamiento 2.1.B.-Aislamiento con separacin inmunomagntica 2.2.-Mtodos inmunocromatogrficos 2.3.- Serotipificacin 2.3.1- Deteccin del antgeno 0 A) Aglutinacin en lmina con antisuero policlonal a-O157 B) Aglutinacin con partculas de ltex sensibilizadas con anticuerpos a-O157 2.3.2- Deteccin del antgeno flagelar H A) Prueba y estimulacin de la movilidad B) Identificacin del antgeno H: Aglutinacin en tubo C) Identificacin del antgeno H7: Aglutinacin en lmina 2.4- Caracterizacin de cepas hemolticas 2.5- Identificacin Bioqumica 2.5.1- Fundamento y procedimientos para pruebas bioqumicas a) Agar hierro tres azcares (TSI) b) Utilizacin de Citrato c) Sulfuro, indol, movilidad (SIM) d) Movilidad, indol, ornitina (MIO) e) Fermentacin de hidratos de carbono (Medio Rojo Fenol) f) Actividad -glucuronidasa g) Lisina, Hierro, Agar (LIA) h) Produccin de pigmento amarillo 2.6- Biotipificacin de E. coli O157:H7 2.7- Sensibilidad a los antimicrobianos CAPITULO II - APENDICE Algoritmo para el diagnstico y caracterizacin de Escherichia coli O157 con tamizaje por PCR multiplex Algoritmo para el diagnostico y caracterizacion de Escherichia coli O157 FIGURA 1: Esquema de deteccin de Escherichia coli O157:H7/NM FIGURA 2: Aglutinacin con partculas de ltex sensibilizadas con anticuerpos a-O157 FIGURA 3: Prueba y estimulacin de la movilidad bacteriana 3A- Siembra del primer pasaje 3B- Lectura de la movilidad a las 18 24 h 6 6 11 13 14 16 18 18 22 24

26 26 26 29 32 33 33 33 36 38 39 41 42 43 45 46 46 47 48 49 50 50 51 52 52 53

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3C- Siembra de pasajes sucesivos FIGURA 4: Prueba de la Enterohemolisina (EHEC-Hly) FIGURA 5: Pruebas Bioqumicas de E. coli FIGURA 6: Actividad de -glucuronidasa y Biotipificacin de E. coli O157 PROTOCOLO: Caracterizacin de Escherichia coli O157 productor de toxina Shiga TABLA 2A: Interpretacin de resultados de antibiogramas segn NCCLS TABLA 3: Interpretacin de resultados de antibiogramas segn NCCLS CAPITULO III - DETECCION DE FACTORES DE VIRULENCIA 1.- Deteccin genotpica de los factores de virulencia por la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) A) Preparacin de la muestra B) Preparacin de la mezcla de reaccin C) Carga de los templados y amplificacin D) Deteccin del producto de amplificacin 1.1.- PCR multiplex stx1/stx2/rfbO157 1.1.1.-Protocolo PCR multiplex stx1/stx2/rfbO157 1.2.- PCR factor eae 1.2.1-Protocolo PCR factor eae 1.3.- PCR Enterohemolisina (EHEC-hlyA) 1.3.1-Protocolo PCR Enterohemolisina (EHEC-hlyA) 1.4.- PCR antgeno flagelar h7 1.4.1-Protocolo PCR antgeno flagelar h7 CAPITULO III - APENDICE 1.- Buffer PCR 10X 2.- Cl2Mg 25 50 mM 3.- Nucletidos trifosfatos 4.- Primers 5.- Buffer Tris-EDTA (TE) 6.- Buffer Tris-Acetato EDTA (TAE) 7.- Tritn X-100 al 1% en buffer TE 1X. 8.- Buffer de siembra 1 9.- Buffer de siembra 2 10.- BrEt (10mg/ml) CAPITULO IV - TECNICAS DIAGNOSTICAS EN CELULAS VERO 1.- Deteccin de Stx en clulas Vero 1.1.- Obtencin de la muestra A) Extraccin de Stx a partir de aislamientos de Escherichia coli B) Extraccin de Stx de Materia Fecal (StxMF) 1.2-Ensayo de citotoxicidad A) Tamizaje para la deteccin de citotoxicidad por Stx de cepas STEC y por StxMF B) Titulacin de la actividad citotxica por Stx de cepas con tamizaje positivo 1.3. - Ensayo de especificidad para detectar StxMF 2.- Deteccin de Anticuerpos anti-toxina Shiga (a-Stx)

62 63 64 65

66
66 66

67 68 70 72 73 76 77 79 80 82 83 85 86

88 88 88 88 89 89 89 89 89 89

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CAPITULO V - MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Medio de transporte Cary Blair Agar MacConkey sorbitol (SMAC) Medio Cromognico CHROMAgar O157 Medio Cromognico Agar O157:H7 ID (bioMerieux) Caldo Tripticasa de soja (CTS) Caldo Tripticasa de soja con cefixime-telurito (CT-CTS) Caldo GN, Hajna Agar Tripticasa de soja (TSA) Agar para conservacin Solucin salina buferada estril (PBS) Solucin fisiolgica Buffer Tween 20 al 0,05% en buffer PBS 1X estril Solucin fisiolgica formulada 1% V/V Medio de Craigie Agar base triptosa con glbulos rojos lavados (AGRL) y sin lavar (AGRSL) Medio agar hierro tres azcares (TSI) Agar citrato de Simmons Medio para sulfuro, indol, movilidad (SIM) Medio para movilidad indol ornitina (MIO) Solucin al 1% del hidrato de carbono en el medio base Rojo Fenol Caldo Rojo Fenol Solucin del hidrato de carbono (10% P/V) Lisina Hierro Agar (LIA) Agar Mueller Hinton (MH) Caldo Penassay (Antibiotic mdium 3 Difco) 106 106 107 107 107 108 108 108 109 109 110 110 110 110 111 113 114 114 114 115 115 115 115 116 117 118

REFERENCIAS

CAPITULO I INTRODUCCION

1.- Antecedentes

Desde hace ms de dos dcadas, Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es considerado un patgeno emergente transmitido por alimentos asociado a casos espordicos y brotes de diarrea, colitis hemorrgica (CH) y sndrome urmico hemoltico (SUH). Escherichia coli O157:H7 es el prototipo de ms de 150 serotipos que comparten el mismo potencial patognico. Las cepas STEC asociadas a enfermedades severas en el hombre pertenecen a la categora de E. coli enterohemorrgico (EHEC) (Levine, 1987; WHO, 1997). Si bien E. coli O157:H7 fue el primer serotipo reconocido en 1982 como agente causal de brotes (Riley et al., 1983), otros serotipos no-O157 como O18, O26, O111 y O128 fueron descriptos en nios con diarrea y aislados por Konowalchuck en 1977. A partir de esos estudios y durante toda la dcada del 80, otros serotipos fueron asociados a enfermedad humana incluyendo: O4:H-, O45:H2, O111:H- y O145:H- en Estados Unidos (Tzipori et al.,1988), O4:H5 y O111:H2 en Australia (Gunzgurg et al. 1988), O5:H-, O26:H11, O55:H7, O103:H2, O104:H2, O153:H25 y O163:H19 en Inglaterra (Scotland et al.,1988; Dorn et al., 1989). Dentro del grupo STEC, E. coli O157:H7 es el serotipo aislado ms frecuentemente y es al que se le atribuye la ocurrencia de la mayora de los grandes brotes como el de la Costa Oeste de Estados Unidos en 1993 (Barret et al., 1994) y el de Japn en 1996 (Watanabe et al., 1996). Las cepas STEC no-O157 no tienen una caracterstica bioqumica que los distinga del resto de los E. coli, a diferencia de lo que ocurre con O157 que no fermenta el sorbitol y no posee actividad de -glucuronidasa. Por lo tanto, para su aislamiento se requiere la aplicacin de estrategias ms complejas. Si bien la mayora de los estudios estn orientados a la deteccin de E. coli O157, en la actualidad han aumentado los esfuerzos para la deteccin de los diferentes serotipos de STEC.

1.1.- Marcadores de virulencia

Los serotipos de E. coli definidos como EHEC poseen los siguientes marcadores de virulencia (Paton et al., 1998): 1. Potentes citotoxinas, llamadas toxinas Shiga (Stx) (Calderwood et al., 1996), que poseen estructura de subunidades A-B y estn codificadas por bacterifagos insertados en el cromosoma bacteriano. Las cepas STEC de origen humano, animal o de alimentos pueden producir Stx1, Stx2 o variantes de Stx1 o Stx2, solas o en combinacin de dos o ms toxinas (Stx1/Stx2, Stx1/Stx2v, Stx1c/Stx2, Stx1c/Stx2d, Stx2/Stx2v) (Strockbine et al., 1986; Friedrich et al., 2003). Las Stxs se clasifican en dos grandes tipos, Stx1 y Stx2, de acuerdo a la neutralizacin del efecto citotxico

sobre clulas Vero o HeLa con anticuerpos especficos, o por la deteccin de los genes stx por tcnicas de biologa molecular como hibridacin con sondas genticas o por la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Paton et al., 1998). El grupo de las toxinas Stx1 es bastante homogneo. Hasta el momento se ha identificado la variente Stx1c asociada fundamentalmente al reservorio ovino (Zhang et al., 2002). Stx1c tambin se detect en combinacin con Stx2d en aislamientos de origen clnico de casos menos severos de diarrea (Beutin et al., 2004). Para Stx2 se han descrito numerosas variantes, entre ellas: Stx2c (stx2vh-a y stx2vh-b), Stx2e, Stx2d y Stx2f [Tyler et al., 1991; Marques et al., 1987; Pirard et al., 1998; Schmidt et al., 2000]. Stx2c y Stx2d, fueron identificadas en aislamientos humanos, la primera de ellas en cepas O157 y no-O157, y la segunda solo en cepas STEC no-O157. Stx2e o SLT-IIv, primera variante de Stx2 descripta, est asociada a la enfermedad del edema en cerdos, pero raramente a enfermedad humana. Stx2f fue identificada en aislamientos de STEC de heces de paloma y result ser idntica a una variante de Stx2e descrita previamente como SLT-IIva, y asociada a un caso de diarrea humana (Ganon et al., 1990). Si bien los miembros de la familia de Stx muestran similitud en su estructura y funcin, cada uno de los subtipos presenta grandes diferencias en su toxicidad en tejidos celulares y en animales. Stx2 tiene una actividad citotxica 100 veces superior a Stx1. Por otro lado, se ha determinado que Stx1 y Stx2 son ms citotxicas en clulas Vero que las variantes Stx2c y Stx2d no activable. Esto es debido principalmente a la existencia de diferencias en la secuencia nucleotdica de la subunidad B responsable de la unin de la toxina al receptor glicolipdico especfico, globotriaosilceramida (Gb3). (Melton et al., 1998) Recientemente, se han realizado estudios que demuestran que cepas STEC Stx2vh-a son menos virulentas y causan diarrea sanguinolenta menos frecuentemente que cepas Stx2 o Stx2/Stx2vh-a. Otros estudios sugieren que individuos infectados con cepas Stx2 presentan un riesgo mayor de desarrollar SUH (Nishikawa et al., 2000). Por lo tanto, la prevalencia de cepas STEC de determinados genotipos stx, junto a otros factores de riesgo de evolucin a SUH, podran explicar la alta incidencia de enfermedad humana y/o la severidad de los casos clnicos que se presentan en ciertas regiones. 2. Plsmido de 60 MDa (pO157) esta presente en todas las cepas de STEC O157:H7. Contiene diversos genes que codifican para los siguientes factores de virulencia: espP (serina proteasa extracelular), katP (catalasa-peroxidasa), hlyA (enterohemolisina), etp (sistema de secrecin tipo II) y para una fimbria que podra estar involucrada en la colonizacin inicial de los enterocitos. En algunos serotipos de STEC no-O157 se ha identificado, un plsmido con una secuencia similar al pO157. Sin embargo, el rol preciso de los genes codificados en este plsmido an no ha sido totalmente dilucidado.

3. Factores de adherencia intestinal A) Codificados en la regin LEE (del ingls locus of enterocyte effacement) del cromosoma, entre ellos el gen eae que codifica una protena, intimina, responsable de la unin ntima de la bacteria al enterocito y la desorganizacin de las microvellosidades con produccin de la lesin AE (del ingls attaching and effacing). La regin LEE codifica adems un receptor translocado (Tir) para la intimina y el sistema de secrecin tipo III. Ciertos serotipos de STEC-LEE positivos (O157:H7, O26:H11, O111:NM y O145:NM) estn considerados como altamente virulentos y ms comnmente asociados a brotes y casos espordicos de enfermedad severa en humanos (Jenkis et al.,2003 y Paton et al., 1998). Sin embargo la presencia de la regin LEE no sera esencial para la patognesis, dado que un gran nmero de cepas STEC-LEE negativas fueron capaces de causar enfermedad severa y ocasionalmente brotes (Keskimaki et al., 1997; Paton et al., 1999). Por lo tanto en estas cepas, otros factores de adherencia adicionales estaran involucrados en la patognesis. B) Codificados fuera de la regin LEE. Se han descripto un grupo de adhesinas putativas muy relacionadas con la adherencia de las cepas STEC al enterocito. Las adhesinas Iha (adherenceconferring chromosomal gene), (Tarr et al., 2001); Efa1 (EHEC factor for adherence), (Nicholls et al., 2000); LPFO157/OI- 141; LPFO157/OI-154 y LPFO113/OI-154 (long polar fimbria) (Torres et al., 2002; Doughty et al., 2002), estn codificadas en islas genmicas nicas de E. coli EDL 933. Otras tres adhesinas tales como Tox B (protena identificada en pO157) (Tatsuno et al., 2001), Saa (STEC autoaggutinating adhesin) (Paton et al., 2001) y Sfp (sorbitol-fermenting EHEC O157 fimbriaes) (Jenkis et al., 2003) estn codificadas en el megaplsmido de cepas STEC. Si bien los diferentes serotipos difieren en su virulencia, la incidencia y la severidad de las infecciones por STEC no pueden solo atribuirse a los factores de virulencia del patgeno sino que es el resultado de la interaccin de stos con factores del husped y el ambiente. La clasificacin de los serotipos en cinco seropatotipos (A-E) (Karmali et al., 2003) fue propuesta con el fin de esclarecer las diferencias en la virulencia de las cepas STEC. La misma se basa en la incidencia de los serotipos en enfermedad humana y la asociacin con la ocurrencia de brotes y enfermedad severa en el hombre. A pesar de presentar ciertas limitaciones, esta clasificacin permite observar la relacin de los diferentes serotipos con perfiles genticos caractersticos de factores de virulencia. (Tablas 1 y 2)

Tabla 1. Clasificacin de serotipos de STEC en seropatotipos

Seropatotipo

Incidencia relativa

Frecuencia en la ocurrencia de brotes

Asociacin con enfermedades severas Si Si

Serotipos

A B

Alta Moderada

Comn No comn

O157:H7, O157:NM O26:H11, O103:H2, O111:NM, O121:H19, O145:NM

C D E

Baja Baja Nula en humanos

Rara Rara Nula

Si No Nula

O91:H21, O104:H21, O113:H21; otros

Variados Variados

Tabla 2. Seropatotipos y perfiles de factores de virulencia

Seropatotipo

Serotipo

Huesped stx1 stx2 + + + + + -

Factores de virulencia eae + + + + + + + + + + + + hlyA + + + + + + + + + + espP + + + + + + + + KatP + + + + + + +

O157:H7 O157:NM

Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano

+ + + + + + + + +

O26:H11 O103:H2 O103:H2 O103:H2 O111:NM O111:NM O121:H19 O145:NM O145:NM O145:NM

Tabla 2. Seropatotipos y perfiles de factores de virulencia (Continuacin)

Seropatotipo

Serotipo

Huesped stx1 stx2 + + + + + + + + + + + + + + -

Factores de virulencia eae + + + + + hlyA + + + + + + + + + + + espP + + + + + + + + + + KatP -

O91:H21 O91:H21 O104:H21 O113:H21 O113:H21 O113:H21 O121:NM O121:NM O8:H19

Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Humano Bovino Bovino Bovino Bovino

+ + + + + + + + + + + +

O103:H25 O117:H7 O119:H25 O146:H21 O174:H8

O39:H49 O46:H38 O113:NM O136:H12

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1.2.- Patognesis

STEC alcanza el intestino y se adhiere a la clula intestinal sin invadirla. La adherencia bacteriana mediada por fimbrias, causa el alargamiento de las microvellosidades, y la intimina induce la unin ntima de la bacteria al enterocito y la desorganizacin de las microvellosidades con produccin de la lesin AE y acumulacin de filamentos de actina en el citoplasma. Esta reduccin de la superficie absortiva causa una diarrea sin sangre.

Mecanismo de patogenia de Escherichia coli productor de toxina Shiga

STEC STEC STEC

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Mecanismo de patogenia de Escherichia coli productor de toxina Shiga Lesin AE (Nataro and Keper, 1998).

La toxina Shiga liberada se une, mediante el pentmero B, a la clula epitelial del intestino por interaccin con el receptor Gb3 que se encuentra en la membrana apical. La toxina es luego internalizada en una vescula endoctica y transportada al aparato de Golgi, donde la subunidad A es clivada proteolticamente liberando el fragmento A1 el cual acta sobre la subunidad ribosomal 60S, inhibiendo la sntesis proteica y provocando la muerte celular. La toxina puede tambin ser translocada desde la membrana apical a la superficie basolateral, con induccin de interleuquina-8 (IL-8), que contribuye a la acumulacin de leucocitos en la pared intestinal. Se produce un dao en las clulas endoteliales de los vasos sanguneos provocando una colitis hemorrgica. Stx entra a la circulacin sangunea y es transportada, por un mecanismo no dilucidado totalmente, a distintos rganos blanco cuyas clulas endoteliales poseen el receptor Gb3. El LPS bacteriano y las citoquinas del husped aumentan la sensibilidad a las Stxs incrementando la disponibilidad de dichos receptores. Niveles altos de Gb3 se encuentran en el rin, particularmente en la regin cortical, sitio principal de lesin renal en los pacientes con SUH. Las lesiones histopatolgicas principales ocurren por interaccin de la Stx con las clulas endoteliales, las cuales se hinchan y se desprenden a nivel del glomrulo. Simultneamente se produce un depsito de fibrina y plaquetas en la microvasculatura renal, oclusin de los capilares y reduccin del flujo sanguneo lo que provoca la insuficiencia renal y ruptura de los glbulos rojos. Tambin se observan lesiones

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trombticas, particularmente en la microvasculatura del intestino, cerebro y pncreas.

Mecanismo de patogenia de Escherichia coli productor de toxina Shiga

Lumen intestinal Toxina Shiga

Clulas epiteliales

Clulas endoteliales

Plaquetas Toxina Shiga

Microvasculatura Neutrfilos
Acheston et al., 1998.

1.3.- Evolucin de Escherichia O157:H7

Escherichia, Salmonella y Shigella, los microorganismos facultativos del tracto intestinal mejor conocidos, son agentes causales de enfermedad humana. Estudios filogenticos basados en la secuenciacin de las subunidades 16S y 5S del rRNA indican que Escherichia spp. y Salmonella spp. se diferenciaron a partir de un ancestro comn, hace aproximadamente 120-160 millones de aos, coincidiendo con la aparicin de los mamferos, mientras que Shigella sp se diferenci de E. coli hace 80 millones de aos, coincidiendo con la evolucin de los primates. Las cepas comensales de E. coli colonizan el colon, mientras que las cepas patgenas ocupan fundamentalmente nichos extra-colon. Salmonella spp. parasita reptiles, pjaros y mamferos, y Shigella spp solo primates. El ancestro de las bacterias entricas fue probablemente una cepa de E. coli que tuvo que competir con mas de 500 especies normales del intestino. La insercin de la isla de patogenicidad LEE en el cromosoma de la bacteria comensal dio lugar a la aparicin del clon de E. coli enteropatgeno (EPEC), fermentador del sorbitol (SOR+) y con actividad de -glucuronidasa (GUD+). El modelo evolutivo de Whittman (1998) hipotetiza sobre la aparicin de E. coli O157:H7 a partir del ancestro EPEC por adquisicin del gen para la toxina Shiga 2 (Stx2) por transduccin, posterior insercin del gen rfbO157 y adquisicin del plsmido EHEC que codifica las hemolisinas, y mas recientemente el gen stx1, con prdida de la capacidad de fermentacin del sorbitol (SOR-) y la actividad de -

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glucuronidasa (GUD-).

Ancestro comn
Escherichia (1)

Emergencia de Escherichia coli O157:H7 Modelo Evolutivo Propuesto


Salmonella Shigella (2)
(1)

Ancestro EPEC con locus LEE -glu+ SOR+


unidA -10 AT fago Stx2 regin rfb fago Stx1

O55:H7
-glu+ SOR+

O55:H7
-glu + SOR+
Stx2+ unidA +92 TG

-glu+ SOR+
Stx2+

O157:H7

O157:H7
-glu+ SORStx2+ Stx1+

E. coli comensal Perdida motilidad

Prdida Fermentacin SOR

O157:H7
-glu- SORStx2+ Stx1+

O157:H120 ~ 160 millones de aos (2) 80 millones de aos


(1)

-glu+ SOR+
Stx2+

Whittan et al., 1998.

1.4.- Manifestaciones clnicas

La infeccin por STEC puede causar casos espordicos o brotes de diarrea, colitis hemorrgica (CH) o sndrome urmico hemoltico (SUH) (Remuzzi et al., 1995). Adems, puede mimetizar desrdenes no infecciosos como intususcepcin, apendicitis, diverticulosis, colitis isqumica y ulcerativa, como as tambin colitis infecciosas causadas por Salmonella, Shigella, Campylobacter, Clostridium difficile, Yersinia enterocoltica o Entamoeba histolytica (Tarr, 1995). El cuadro clnico de la infeccin por STEC incluye un perodo de 1 a 2 das de vmitos, fiebre baja o ausente, dolores abdominales severos, diarrea sin sangre y evidencia de edema de la mucosa colnica como sntomas iniciales, seguidos por diarrea sanguinolenta o colitis hemorrgica durante 4 a 6 das. Aunque en la mayora de los casos la diarrea por STEC es autolimitada, aproximadamente 5 al 10 % de los nios infectados evolucionan a SUH, para el cual no existe un tratamiento especfico, sino de sostn. Los nios constituyen el grupo ms vulnerable, con una mayor incidencia de infecciones sintomticas por STEC y riesgo alto de evolucin a SUH (Mead et al., 1998). El SUH, descripto por primera vez en 1955 por Gasser et al., es una enfermedad de comienzo agudo con anemia hemoltica microangioptica, plaquetopenia y dao renal, que habitualmente puede seguir o no a un episodio de diarrea con o sin sangre, en un nio previamente sano. Las manifestaciones comunes son: palidez, petequias, hematomas, oliguria, edema, hipertensin arterial, y cambios neurolgicos como letargia o convulsiones (Comit de Nefrologa, 1995).

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Los criterios de laboratorio para el diagnstico de SUH son: 1) Anemia de comienzo agudo, con hemoglobina menor de 10 mg/dl o hematocrito menor de 30% o cada de al menos 5 puntos, con cambios microangiopticos en el frotis de sangre perifrica (esquistocitos, clulas en casco o fragmentados). 2) Injuria renal aguda evidenciada por hematuria, proteinuria, uremia mayor de 50 mg/dl en ausencia de deshidratacin o creatinina mayor de dos desviaciones estandar respecto a la edad y sexo (Swartz, 1976) o aumento del 50% de los valores al inicio de la enfermedad. 3) Recuento de plaquetas menor a 150.000/mm3. Esta enfermedad sindrmica puede presentar dos formas, una tpica de etiologa infecciosa, precedida por un perodo prodrmico con diarrea, generalmente sanguinolenta y de caractersticas endemoepidmicas (llamada D+), y otra forma atpica (D-) desencadenada por varios factores, como drogas, transplantes de rganos, post parto, etc. Se ha reconocido a STEC como agente causal de la forma infecciosa de SUH (Kaplan, 1990). En los ltimos aos, el diagnstico precoz de la enfermedad y el mejor manejo de la insuficiencia renal aguda y de la anemia disminuy la letalidad durante el perodo agudo, siendo en la actualidad del 3 al 5%. Sin embargo, un 5 % de nios con SUH desarrolla insuficiencia renal crnica, requiriendo en pocos aos procedimientos dialticos o transplante renal. Otro 20% contina con microhematuria y grados variables de proteinuria, pudiendo desarrollar insuficiencia renal crnica terminal en lapsos variables que pueden llegar a dcadas (Spizzirri et al., 1997). Esta patologa implica grandes costos econmicos para los sistemas de salud, lo cual tiene un impacto importante en los pases en desarrollo.

Historia Natural del Sndrome Urmico Hemoltico Post-Entrico


Sndrome Urmico Hemoltico

3 - 5% Muerte 5% Insuficiencia Renal Crnica Secuelas Importantes

60% Resolucin 30% Proteinuria Secuelas Menores

Complicaciones Posteriores

Mead et al., 1998.

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1.5.- Reservorios y vas de transmisin

Los rumiantes en general, y el ganado vacuno en particular, han sido sealados como los principales reservorios de STEC. Estudios de prevalencia realizados en distintos pases, incluyendo Argentina (rskov et al., 1987; Beutin et al., 1993; Chapman et al., 1993; Wells et al., 1991; Parma et al., 2000; Cobbold, et al., 2001, confirmaron el rol del ganado vacuno como reservorio. Los serotipos O5:H-, O26:H11, O103:H2, O111:H8, O111:H11, O111:H- y O118:H16 entre otros (Butler et al.,1994) son los ms comunmemente aislados en el ganado bovino. El ganado ovino es tambin un excretor de estos microorganismos (Ramachandran et al., 2001). Los serotipos ms frecuentes son: O5:H-, O91:H-, O128:H2, O77:H4 y OX3:H8. En cambio cerdos, aves, perros y gatos no son reservorios importantes (Beutin et al., 1993). Los animales excretan estas bacterias en sus heces, es por ello que la contaminacin fecal del agua y la diseminacin de las bacterias contaminantes durante la faena se han sealado como fuentes importantes de infeccin. El ganado vacuno no es un husped especfico de STEC. En heces de animales sanos se pueden aislar distintos serotipos de STEC O157 y no-O157 y un mismo animal puede portar ms de un serotipo. Escherichia. coli O157:H7 es endmico tanto en ganado de carne como lechero. La prevalencia es variable, de menos del 0,5 a ms del 2,0% en campo y a nivel de playa de faena. La bacteria no es patgena para el ganado, la colonizacin es de menos de 2 meses de duracin, y la portacin fecal, que no es prolongada, es mas frecuente en el ganado joven (2 a 24 meses) que en el ganado adulto. La prevalencia en el ganado joven es similar a la encontrada en el ganado alimentado a grano (feedlot), y est relacionada con una mayor susceptibilidad de estos animales a ser colonizados por cepas transientes de E. coli, con dosis menores a 250 unidades formadoras de colonias (UFC). Los animales con una alimentacin reciente en feedlot tienen una prevalencia tres veces superior a la de los animales alimentados por meses en feedlot. Esta mayor susceptibilidad posiblemente est relacionada con alteraciones de la flora normal, el pH y la concentracin de cidos grasos. La alimentacin juega un papel importante por las grandes cantidades de alimento ingeridas diariamente por los animales y por la habilidad de E. coli de multiplicarse en el alimento sobre todo cuando tienen una humedad aumentada. El agua, especialmente con sedimentos, puede constituir un hbitat crtico para la sobreviva y multiplicacin de E. coli O157:H7, sobre todo durante los meses de invierno. La capacidad de colonizacin de E. coli O157:H7 en el ganado es funcin de la dosis infectiva y la susceptibilidad. Se ha descripto para STEC no-O157 que la excrecin en ganado bovino adulto es de un 21% y de un 50% en terneros. La excrecin de ciertos serotipos se produce en forma intermitente lo cual dificulta su aislamiento (WHO, 1998).

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Otras formas de transmisin son: la contaminacin cruzada durante la preparacin de los alimentos, el contacto directo del hombre con los animales, y persona a persona, por la ruta fecal-oral, debido a las bajas dosis infectivas que posee este grupo bacteriano, ya que menos de 100 bacterias por gramo de alimento puede causar enfermedad. Distintos alimentos como carne molida y productos crnicos crudos o insuficientemente cocidos, hamburguesas, embutidos fermentados, leche no pasteurizada, yogur, quesos, mayonesa, papas, lechuga, brotes de soja y alfalfa, jugos de manzana no pasteurizados, entre otros, han sido sealados como fuente de contaminacin en casos espordicos o brotes asociados a STEC. La bacteria es resistente a los cidos y puede sobrevivir en alimentos fermentados y vegetales frescos. Se ha determinado que la temperatura de pasteurizacin de la leche (72C, 16,2s) es un tratamiento efectivo para eliminar 104 clulas de E. coli O157:H7 por mililitro. En los alimentos de origen animal una temperatura interna de 63C, constituye un punto de control crtico para asegurar la inactivacin de E. coli O157:H7. Sin embargo, la Food and Drug Administration de EE.UU. recomend incrementar la temperatura de coccin de las hamburguesas a 68,3C despus del brote que ocurri en cinco Estados de la costa oeste del pas, con mas de 700 afectados (Griffin et al. 1994).

Vas de transmisin de STEC


Medio ambiente Contaminacin Fecal Animales Otros alimentos Humano Persona a persona Humano
Amstrong et al., 1996

Agua

Carne

Leche

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1.6.- Tratamiento

Hasta el presente no existe una terapia especfica para el tratamiento de las infecciones por STEC. A pesar que E. coli O157 es susceptible a los agentes antimicrobianos usados comnmente, los estudios clnicos realizados no han demostrado que la aplicacin de una terapia antimicrobiana en el tratamiento de estas infecciones aporte algn beneficio para el paciente. Por otra parte, algunos autores han postulado que dicho tratamiento puede precipitar la evolucin a SUH. Se ha demostrado que la trimetoprima-sulfametoxazol estimula in vitro la liberacin de Stx. Es por ello que se debe realizar una cuidadosa utilizacin de los antimicrobianos hasta que estudios caso-control demuestren la eficacia de los mismos. Tampoco se deben usar agentes antidiarreicos, que disminuyen la motilidad intestinal, pues estudios retrospectivos sealan un riesgo aumentado de evolucin a SUH. En el perodo agudo del SUH, el tratamiento est basado en el control de las alteraciones fisiopatolgicas como ser: la restriccin de agua y sal, las transfusiones de sedimento globular, la dilisis peritoneal y el adecuado aporte calrico-proteico. Se hallan en etapa de desarrollo la produccin de vacunas para prevenir la infeccin por EHEC. Existen distintas vacunas candidatas basadas en: a) utilizacin del lipopolisacrido bacteriano como inmungeno; b) toxoides de Stx; c) utilizacin de cepas mutantes atxicas; d) insercin de la subunidad B de Stx en una cepa de Vibrio cholerae como vector. Tambin se encuentran avanzados los estudios de Fase II de anticuerpos murinos anti-Stx humanisados para ser utilizados en la inmunoprofilaxis. Teniendo en cuenta que Stx es el factor de virulencia principal, se han desarrollado algunos productos destinados a unirse a la toxina en la luz intestinal, previniendo as su absorcin. Synsorb es el mejor estudiado de estos productos. Es un compuesto formado por glicsidos unidos covalentemente a tierra de diatomeas. En un estudio Fase II con 347 pacientes con infeccin probable o confirmada por STEC, el tratamiento con Synsorb no mostr efectos beneficiosos en general. Slo en aquellos pacientes que recibieron en forma temprana el tratamiento hubo un 40% de disminucin de evolucin a SUH.

1.7.- Epidemiologa

La notificacin de las infecciones por E. coli O157:H7 experimentaron un aumento exponencial a partir de su primera descripcin en 1982. Este comportamiento de patgeno emergente refleja, tanto un aumento real en el nmero de infecciones, como as tambin una mejora en los

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sistemas de vigilancia de las enfermedades asociadas y de los mtodos de deteccin. Su emergencia ha generado gran preocupacin a nivel mundial por el nmero de personas afectadas y por los distintos vehculos de transmisin identificados (carnes, vegetales, alimentos cidos, aguas de consumo y recreacin, etc.), lo que ha llevado a la Organizacin Mundial de la Salud a promover estrategias de prevencin y control. En Europa continental las infecciones por cepas STEC no-O157 son mas frecuentes, mientras que en Gran Bretaa STEC O157 aparece asociado a casos espordicos y brotes, fundamentalmente por productos crnicos. En Alemania, cepas de E. coli O157:NM, Sorbitol+, -glucuronidasa+, son causa frecuente de casos espordicos y brotes de diarrea y SUH. En Asia hay pocos reportes de infecciones por STEC O157, salvo en Japn a partir del brote masivo con mas de 10.000 afectados en 1996, posiblemente por falta de sistemas de vigilancia. En Australia las infecciones por STEC no-O157, fundamentalmente O111:NM, son mas frecuentes que las de O157. Respecto a Latinoamrica, en Colombia un reporte prelimar comunic que E. coli O157:H7 fue el agente causal del 7,2% de los casos de diarrea y 6,5% del ganado era portador de este patgeno. En Chile, STEC O157 y no-O157 est asociado a casos de diarrea y SUH, y el 34,5% del ganado faenado es portador de STEC (Ros et al., 1999). En Argentina, estudios realizados en ganado bovino demuestran que la frecuencia de deteccin es de 35% para STEC no-0157 (Meitchtri, et al., 2004) y 0,5% para STEC O157:H7, (Meitchtri, et al., 2004; Chinen et al., 2003). En relacin a alimentos muestreados a nivel de boca de expendio STEC no-O157 se detect en 8,4% de hamburguesas congeladas y 0,9% de quesos de pasta blanda (Gmez et al.; 2002); mientras O157 en 3,9% de productos crnicos. En Canad, la incidencia de las infecciones por E. coli O157:H7 es de 5,3 casos/100.000 habitantes, siendo la exposicin a carne molida mal cocida, contacto directo con el ganado, agua de consumo contaminada y un medio ambiente rural contaminado son los factores de riesgo mas importantes. En EE.UU. las infecciones por E. coli O157:H7 continan siendo un problema importante de salud a pesar de la implementacin de sistemas de vigilancia de los patgenos asociados a las ETA (FoodNet) y un estricto control de la produccin de alimentos a partir del brote multiestado ocurrido en 1993. A pesar de la identificacin de nuevos vehculos de transmisin como vegetales, jugos de manzana no pasteurizados, aguas de consumo y recreacionales, los productos a base de carne molida como las hamburguesas siguen siendo la principal fuente de infeccin. La incidencia de las infecciones por E. coli O157:H7 es de 2,1 casos/100.000 habitantes, y representa la segunda causa de las hospitalizaciones (29%) por ETA despus de Listeria. En cuanto al SUH, esta patologa est ampliamente distribuida en el mundo (Griffin et al., 1991). En Amrica del Sur el problema se concentra en pases del Cono Sur, principalmente Argentina, Chile y Uruguay. Esto podra responder a diferencias en la distribucin geogrfica como

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consecuencia directa de la magnitud de los reservorios del agente causal y/o la influencia de mecanismos de transmisin especficos presentes en esta rea.

Sndrome Urmico Hemoltico Distribucin Geogrfica

Voyer, 1996

En estos pases las tasas son similares a las comunicadas para pases industrializados.

Sindrome Urmico Hemoltico: Comparacin de tasas de incidencia


Tasa de incidencia / 100.000 nios < 5 aos 10 8 6 4 2 0

Canada

USA

Chile

Uruguay

Argentina

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La asociacin entre SUH e infeccin por STEC, particularmente cepas del serogrupo O157, fue demostrada primero en Canad en 1983-1985 y posteriormente confirmada por numerosos estudios realizados en distintos pases, incluida Argentina. A partir de la dcada del 80 se han producido brotes asociados a la infeccin por STEC en distintas partes del mundo, afectando a numerosas personas. La ocurrencia de brotes en distintas partes permite tener un panorama de la distribucin mundial de E. coli O157:H7.

La infeccin por STEC muestra una variacin estacional, con aumento de casos en primavera y verano, pocas que coinciden con el perodo en que se aslan mayor cantidad de STEC en el ganado bovino. Algunos de los brotes ms importantes aparecen resumidos en la siguiente Tabla: Brotes asociados a Escherichia coli O157:H7 LUGAR Oregon/EE.UU. Michigan/EE.UU. Nebraska/EE.UU. Ontario/Canad Ontario/Canad Utah/EE.UU Missouri/EE.UU. Washington, Idaho, California, Nevada/EE.UU. Washington/EE.UU. Suecia FECHA 2/82 5/82 9/84 9/85 4/86 6/87 12/89 11/92 a 2/93 11/94 95/96 N DE CASOS 26 21 34 73 30 51 243 559 N SUH (%) 0 0 1 (2,9) 12 (16,4) 3 (10) 2 (0,8) 41 (7,3) MORTALIDAD 0 0 4 (11,8) 19 (26) 0 4 (1,6) 4 (0,7) TIPO DE BROTE Comunidad Comunidad Geritrico Geritrico Escuela Crcel Comunidad Comunidad/ Multiestado Comunidad Comunidad FUENTE Hamburguesas Hamburguesas Hamburguesas Sndwiches Leche cruda Carne molida Agua Hamburguesas

20 99

1 (5,0) 24 (24,2)

0 0

Embutido seco Carne

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Washington, California, Colorado, Columbia Britnica/EE.UU., Canad Escocia Japn

10/96

45

12 (26,7)

Comunidad/ Multiestado

Jugo de manzana no pasteurizado

96 96

496 9451

0 101 (1,1)

19 (3,8) 12 (0,1)

Comunidad Escolares

Espaa Argentina

2000 2004

158 4

6 (3,8) 1

0 0

Escolares J. Infantes

Carne Vegetales, carne y pescado Salchichas Agua de recreacin

Brotes asociados a infeccin por Escherichia coli no-O157 productor de toxina Shiga

AO 1984 1986

PAIS Japn Japn

N DE CASOS 100 22

SEROTIPOS O145:NM O111:NM

SUH 0 1

1988

Checoslovaquia

O26:H11/NM O1:H? O157:H7

1991 1991 1992 1994 1995 1995 1996 1999 1999 2000

Japn Japn Italia EEUU Australia Espaa Japn EEUU EEUU Alemania

234 89 9 7 200 13 3 55 11 11

O111:NM O?:H19 O111:NM O104:H21 O111:NM O111:NM O103:H2 O111:H8 O121:H19 O26:H11

0 0 9 0 22 13 0 2 3 0

1.8.- Situacin actual del SUH en Argentina

En Argentina el SUH es endmico, y constituye la primera causa peditrica de insuficiencia renal aguda y la segunda de insuficiencia renal crnica, es adems responsable del 20% de los transplantes renales en nios y adolescentes. Se producen alrededor de 300 casos nuevos por ao con

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un importante subregistro, acumulndose ms 7.000 casos desde 1965 hasta el presente (Comit de Nefrologa, 1995). Los nios afectados son menores de 5 aos, fundamentalmente entre 6 y 36 meses, de ambos sexos. En la mayora de estos nios la diarrea que caracteriza al perodo prodrmico es el primer episodio de sus vidas. La enfermedad est distribuida en todo el pas, pero la frecuencia es mayor en las provincias del centro y sur durante los meses clidos, aunque se registran casos durante todo el ao. La letalidad ha disminuido en los ltimos aos, debido al diagnstico precoz de la enfermedad, la instauracin temprana de la dilisis en los casos con oliguria severa o anuria y al manejo de la anemia hemoltica. En un estudio reciente para establecer la etiologa del SUH en nios argentinos (Lpez et al., 1989; Miliwebsky et al., 1999), se encontraron evidencias acumulativas de infeccin por STEC en el 60% de los casos, siendo O157:H7 el serotipo ms frecuente. Shigella dysenteriae tipo 1, que tambin fue asociado a casos de SUH en otros pases, es aislado excepcionalmente en nuestro pas asociado a esta enfermedad. Teniendo en cuenta el nmero de casos que se producen anualmente y la severidad de la enfermedad, en Abril de 2000 (Resolucin N 346/00), el Ministerio de Salud estableci la notificacin obligatoria al Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiolgica, con modalidad individualizada e inmediata. Complementariamente, a fin de reforzar el Sistema de Vigilancia vigente, se implement una estrategia de vigilancia adicional, basada en Unidades Centinela (UC). La vigilancia epidemiolgica a travs de UC permite determinar tendencias, focalizar actividades de vigilancia y sugerir intervenciones preventivas. Aunque no tiene representatividad poblacional, esta estrategia tiene el mrito de llamar la atencin en forma especial sobre situaciones de riesgo, y es por ello que cumplen una funcin clave en la toma de decisiones. Las UC en lugar de seleccionar un rea geogrfica con una poblacin definida, seleccionan una unidad de atencin de salud sin poblacin definida. Por esta razn esta estrategia presenta la limitacin de no permitir comparar la magnitud del problema estudiado con otras subpoblaciones o reas donde la informacin no se recolecta mediante esta estrategia. Este sistema de vigilancia est integrado por tres componentes: epidemiolgico, clnico y de laboratorio, que cumplen funciones especficas con relacin a la recoleccin, el anlisis y a la difusin de la informacin. La Red de Unidades Centinela es un Subsistema del Sistema Nacional de Vigilancia. Como todo subsistema, debe responder a las prioridades identificadas como problemas relevantes y debe cumplir con los atributos generales del sistema de vigilancia. Hasta el presente se han incorporado 24 UC en 14 jurisdicciones del pas. La tasa de hospitalizacin para el ao 2006 fue de 13,9 casos por cada 100.000 nios menores de 5 aos. Se notificaron 464 casos de los cuales el 51,5% correspondi al sexo femenino y una edad promedio de 26,5 26,8 [1-167] meses. La mayora de los casos ocurrieron durante los meses clidos, en los periodos de enero a abril y de noviembre a diciembre. La letalidad en la fase aguda fue del

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3.2%. El Laboratorio Nacional de Referencia recibi muestras de 361 (78%) casos de SUH remitidas de diferentes jurisdicciones del pas. Se registr un 50% de positividad utilizando tres criterios diagnsticos de la infeccin por STEC: aislamiento de STEC, determinacin de toxina libre en materia fecal y deteccin de anticuerpos anti-Stx. Adems del sistema de vigilancia de SUH mediante las UC, Argentina trabaja en conjunto con el Centro de Enfermedades Infecciosas (CDC) de Atlanta, EE.UU., en la implementacin de la Red PulseNet Latinoamrica. Esta Red de Laboratorios realiza la caracterizacin molecular de bacterias asociadas a ETA por electroforesis en campo pulsado (PFGE, del ingls pulse field gel electrophoresis). El objetivo es comparar los patrones de PFGE obtenidos de aislamientos humanos y de alimentos con los existentes en una base de datos Nacional del INEI - ANLIS Dr. Carlos G. Malbran y de EE.UU. del CDC. Esto permite: 1) identificar casos de ETA que ocurren al mismo tiempo en reas geogrficas separadas, producidas por el mismo agente etiolgico. 2) identificar el vehculo de transmisin y as establecer las medidas de intervencin correspondientes y, 3) diferenciar un brote de un "pseudos-brote" o de casos espordicos.

1.9.- Prevencin

Las medidas preventivas para controlar la transmisin de la infeccin son:


a) Asegurar prcticas de higiene durante el faenamiento del ganado. b) Aplicar controles en los puntos crticos de la elaboracin de alimentos. c) d) Asegurar una correcta y homognea coccin de la carne. La bacteria se destruye a los 70C. Tener especial cuidado con la coccin de la carne picada, ya que generalmente se cocina bien la parte superficial, pero no en el interior, permaneciendo la bacteria viable. e) f) Utilizar distintos utensilios de cocina para cortar la carne cruda y para trozarla antes de ser ingerida. Evitar el contacto de las carnes crudas con otros alimentos.

g) Controlar el uso de leche y derivados lcteos correctamente pasteurizados y conservar la cadena de fro. h) No consumir jugos de frutas no pasteurizados. i) j) Lavar cuidadosamente las frutas y verduras. Asegurar la correcta higiene de las manos. Deben lavarse siempre con agua y jabn antes de preparar los alimentos y despus de manipular carne cruda. k) Lavar las manos con agua y jabn luego de ir al bao. l) Evitar el hacinamiento en comunidades cerradas (jardines maternales, jardines de infantes, escuelas, crceles, etc.). m) No asistir a comunidades cerradas aquellas personas con diagnstico bacteriolgico positivo de STEC hasta no tener 2 coprocultivos negativos en un lapso de 72 hs. n) Evitar el uso de antimicrobianos y antidiarreicos, considerados factores de riesgo en la evolucin de

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diarrea a SUH; o) Educar a mdicos, microbilogos, personal de plantas elaboradoras de alimentos y restaurantes, de jardines maternales, de infantes y geritricos y la comunidad en general sobre los riesgos que implica la infeccin por EHEC. p) Consumir agua potable. Ante cualquier duda hervirla. q) Utilizar aguas recreacionales habilitadas

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CAPITULO II - AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE Escherichia coli O157

1.- Especimenes

Materia fecal: a) Evacuacin espontnea: Recolectar 2 g de materia fecal con una esptula y colocarla en un recipiente estril. La muestra debe permanecer refrigerada a 4C hasta su procesamiento. Si la muestra no es procesada dentro de las 2 horas de recolectada, deber ser colocada utilizando un hisopo estril en un medio de transporte (Cary-Blair, Stuart, Amies o solucin salina tamponada con glicerol). Si el procesamiento se efecta dentro de los 2-3 das, el medio de transporte deber ser conservado refrigerado a 4C. Si el espcimen no es analizado en ese lapso de tiempo deber mantenerse congelado a -70C.

b) Hisopado rectal: Tomar la muestra con hisopo, conservarlo en un medio de transporte y mantenerlo refrigerado hasta su procesamiento. Si el nio usa paal, tomar la muestra que queda en el mismo con hisopo o con esptula.

Recomendaciones: Recolectar la materia fecal lo antes posible despus del establecimiento de la diarrea. La mayora de los pacientes excretan STEC, fundamentalmente E. coli O157, por perodos menores a 7 das. El paciente no debe estar con tratamiento antibitico. Recolectar la muestra despus de suspender la antibioticoterapia por no menos de 48 horas.

2.-Procesamiento

2.1. A.- Aislamiento

Medios Agar MacConkey sorbitol (SMAC) Caldo tripticasa de soja (CTS) CTS con cefixima 0,05 mg/l (medio) y telurito de potasio 2,5 mg/l (medio) [CT-CTS]

Materiales y equipamiento Estufa de cultivo a 37C Ansas de rulo

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Procedimiento 1. Realizar la siembra de la materia fecal en SMAC, en forma directa y luego del enriquecimiento en CTS (a 37C por 6 h) y en CT-CTS (a 37C por 6 h).

Comentarios El agregado de cefixima y telurito de potasio al medio de enriquecimiento proporciona mayor sensibilidad y especificidad en la recuperacin de STEC O157. Se pueden aplicar para la mtodos deteccin

inmunocromatogrficos

rpida de STEC O157 a partir del medio de enriquecimiento. (Ver Procedimiento Mtodos inmunocromatogrficos). 2. Incubar las placas de SMAC (a 37C por 18 h). 3. Observar morfologa y caractersticas fenotpicas de las colonias aisladas en las placas de SMAC. La mayora de las cepas STEC O157 no fermentan el sorbitol en 24 horas. En la placa de SMAC desarrollan colonias pequeas, incoloras y translcidas. En cambio,

microorganismos fermentadores de sorbitol, desarrollan colonias pequeas y rosadas. Realizar el diagnstico presuntivo de E. coli O157 de las colonias no fermentadoras de sorbitol por aglutinacin en lmina con antisuero anti-O157 o reactivo de ltex (Ver Procedimiento de Serotipificacin). Es importante comunicar inmediatamente al mdico (a las 24 horas de realizado el coprocultivo) la presencia presuntiva de E. coli O157 asociado a un caso de diarrea con o sin sangre, o colitis hemorrgica, para vigilar la probable evolucin a SUH mediante parmetros bioqumico-clnicos, y el control del grupo familiar. Se debe tener en cuenta que el suero anti-O157 da reaccin cruzada con cepas de Escherichia hermanii. Cuando se observan colonias no fermentadoras de sorbitol con

seroagrupamiento positivo con el antisuero anti-O157 se debe realizar la diferenciacin bioqumica entre E. coli y E. hermanii. (Ver Procedimiento de Identificacin Bioqumica).

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4. Tomar una muestra de la zona de crecimiento confluente de las placas SMAC y de las colonias presuntivas para extraccin de ADN y posterior realizacin de la tcnica PCR multiplex stx1/stx2/rfbO157 (Ver Preparacin de la muestra para PCR) 5. Realizar la confirmacin bioqumica de las colonias presuntivas con seal positiva para stx1 y/o stx2 y/o rfbO157 por PCR multiplex. (Ver Procedimiento de Identificacin Bioqumica)

PCR multiplex se utiliza como tcnica de tamizaje para detectar los genes stx1, stx2 y rfbO157.

Si se obtiene seal positiva por PCR multiplex de la zona confluente se deber identificar la colonia positiva correspondiente. Para tal fin, realizar PCR de colonias aisladas. Si no se observan colonias tpicas, realizar un nuevo aislamiento de la zona de cultivo confluente de la cual se obtuvo seal positiva.

6. Determinar el fenotipo enterohemoltico de las colonias presuntivas y/o de los aislamientos stx positivos. (Ver

Dado que existe relacin entre la produccin de Stx y de enterohemolisina (EHEC-Hly), se considera que la deteccin de EHEC-Hly puede ser un marcador til para seleccionar rpidamente probables cepas STEC.

Caracterizacin de cepas hemolticas)

7. Confirmar la fermentacin de sorbitol en tubo y determinar la actividad de la enzima -glucuronidasa (-glu) de los aislamientos. (Ver Procedimiento de Identificacin Bioqumica) 8. Realizar la biotipificacin de las cepas E. coli O157 por la fermentacin de los azcares rafinosa, dulcitol y ramnosa. (Ver Procedimiento de Biotipificacin)

La determinacin de la actividad de la enzima -glucuronidasa es utilizada como marcador bioqumico para diferenciar las cepas de E. coli O157, que no presentan actividad -glu, de otras cepas de E. coli.

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9. Determinar la movilidad de la cepa aislada utilizando el medio de Craigie. Si la cepa es mvil, se deber determinar el antgeno flagelar H. (Ver

La deteccin del antgeno H requiere de una estimulacin previa de la movilidad de la cepa mediante varios pasajes en el medio de Craigie.

Procedimiento de Serotipificacin).

El

antgeno

H7

puede

detectarse

por

aglutinacin en lmina y/o por PCR utilizando oligonucletidos especficos que amplifican un fragmento del gen fliCh7. La tcnica de amplificacin no requiere de la estimulacin previa de la movilidad. (Ver Procedimiento PCR h7) 10. Determinar la sensibilidad de las cepas STEC a los antimicrobianos. (Ver Pruebas de Sensibilidad) 11. Detectar los marcadores de virulencia accesorios de cepas STEC, eae y EHEChlyA por PCR. (Ver Deteccin de Factores de Virulencia) 12. Detectar la produccin de Stx por ensayos de citotoxicidad especfica en clulas Vero. Para la realizacin de estos ensayos se debe disponer de la lnea celular y estufa de CO2.

2.1.B.- Aislamiento con separacin innunomagntica La sensibilidad del procedimiento de aislamiento de E. coli O157:H7/NM puede aumentarse aplicando la tcnica de separacin inmunomagntica. (SIM)

Fundamento Anticuerpos anti-E.coli O157 purificados, adsorbidos y unidos covalentemente a la superficie de partculas esfricas paramagnticas de poliestireno, reaccionan con el antgeno somtico O157. Se recupera el microorganismo cuando las partculas unidas al O157, son atradas magnticamente y sembradas en placas de aislamiento.

Medios Caldo GN, Hajna Tween 20 al 0,05% en buffer PBS 1X estril

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Agar Mac Conkey sorbitol suplementado con cefixima - telurito de potasio (CT-SMAC) Medios cromognicos. (CHROMAgar O157, Agar ID O157: H7)

Materiales y equipamiento Partculas inmunomagnticas anti-E. coli O157 Tubos Eppendorf de 1,5 ml Pipetas estriles de 10 ml Micropipeta rango: 5-40 l Micropipeta rango: 40-200 l Micropipeta rango: 200-1000 l Tips para micropipetas Ansas de rulo Agitador rotatorio Gradilla imantada Estufa de cultivo a 37C

Procedimiento 1. Realizar la siembra de la materia fecal en 5 ml de caldo GN, Hajna. 2. Incubar en forma esttica a 37C por 5h. 3. Mezclar 1 ml del cultivo con 20 l de las partculas inmunomagnticas anti- E. coli O157, en un tubo Eppendorf estril de 1,5 ml de capacidad.

Comentarios

Las partculas inmunomagnticas se deben conservar refrigeradas entre 2 y 8C. Antes de su uso homogenizar suavemente, con vortex o con micropipeta automtica, la solucin madre de las partculas.

4. Colocar el tubo en el agitador rotatorio a 18 rpm durante 10 minutos.

Es

importante

respetar

el

tiempo,

las

revoluciones por minuto y el sistema de rotacin dado que en esta etapa se produce la unin antgeno-anticuerpo.

5. Introducir el imn en la gradilla 6. Colocar el tubo en la gradilla imantada y dejar inmvil durante 3 minutos. Verificar que en la pared del tubo que contacta con el imn se visualice una suave lnea coloreada correspondiente a las partculas atradas magnticamente.

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7. Invertir suavemente la gradilla 5 veces. 8. Extraer el sobrenadante, sin retirar el tubo de la gradilla imantada. Se debe realizar con precaucin para no desprender las partculas de la pared que contacta con el imn.

9. Agregar 1 ml de buffer lavado ( Tween 20 al 0,05% en buffer PBS 1X estril)

El buffer de lavado debe preparase en el momento previo a su uso. (Ver medios de cultivo y reactivos)

10. Retirar el imn e invertir la gradilla 5 veces 11. Colocar el imn en la gradilla y dejar inmvil durante 3 minutos. 12. Repetir 2 veces los pasos 7 al 11. 13. Retirar el sobrenadante. 14. Extraer el imn y colocar 100 l de buffer de lavado (Tween 20 al 0,05% en buffer PBS 1X estril) 15. Dispensar 50 l en una placa de CTSMAC y 50 l en una placa de medios cromognicos para E. coli O157. Se utilizan placas de CT-SMAC y con medios cromognicos para aumentar la selectividad del mtodo de aislamiento. Es necesario visualizar despus del cultivo de las placas, colonias con morfologa y fenotipo caracterstico de E. coli O157. Para tal fin se recomienda la siembra de las partculas en placa completa, utilizando ansa de rulo, de manera de obtener colonias aisladas. 16. Incubar las placas a 37C por 18 a 24h. Homogenizar con micropipeta las partculas al agregar los 100 l de buffer de lavado.

31

17. Observar morfologa y caractersticas fenotpicas de las colonias aisladas en las placas de CT-SMAC y de medios cromognicos.

Las cepas STEC 0157 desarrollan en placas de CT-SMAC colonias pequeas, incoloras, con centro negro. En placas de medio

cromognico se observan colonias de un color caracterstico utilizado. En dependiendo CHROMAgar del medio se

O157

observan de color malva y en Agar ID O157:H7 de color turquesa verdoso, segn lo descripto por el fabricante respectivamente. Se recomienda no extender la lectura de las placas por ms de 24 h de incubacin. En caso de no obtener colonias aisladas se recomienda repetir la SIM tratando de mejorar la forma de aislamiento. 18. Continuar con el punto 4 del

procedimiento 2.1. Aislamiento en el caso de detectar colonias presuntivas de E. coli O157.

2.2.-Mtodos Inmunocromatogrficos

Fundamento La muestra sembrada migra en una membrana cromatogrfica. En la primera porcin se enfrenta con una zona que contiene anticuerpos especficos anti-LPS O157 conjugados con partculas de oro coloidal. En caso de estar presente el LPS O157, se forma un complejo antgeno-anticuerpo. La muestra con el complejo inmune contina migrando hasta una segunda porcin (zona de ensayo) donde un segundo anticuerpo reacciona contra un epitope del LPS O157. Este anticuerpo captura al complejo inmune, y lo fija a la membrana. El remanente de la muestra contina migrando hasta la zona control donde se encuentran anticuerpos anti-especie, que capturan el resto de anticuerpos conjugados con partculas de oro que no reaccionaron en la zona de ensayo.

Materiales requeridos Micropipeta de 200 l Tips para micropipetas Caldo de enriquecimiento Equipo de inmunocromatografa para la deteccin de E. coli O157:H7/NM:

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Reveal20 Single Step for E. coli O157:H7 Neogen Corporation, Lansing, Michigan. EE.UU. ImmunoCard STAT. E. coli O157:H7 Meridian Diagnostic, Inc. Cincinnati, Ohio, EE.UU. Singlepath E. coli O157 Merck KGaA, Alemania. RapidChek E. coli O157 Test Kit. Strategic Diagnostics Inc. Newark, DE, EE.UU

Procedimiento 1. Colocar una alcuota del caldo enriquecido de la materia fecal, en la regin de siembra de la placa inmunocromatogrfica.

Comentarios La alcuota del cultivo enriquecido puede tomarse del caldo CTS o Hagna, encubados a 37C por 6 h y respectivamente. (Ver a 37 por 5 hs. procedimiento de

Aislamiento 2.1.A. y 2.1.B). El volumen de la alcuota depende de lo recomendado por la presentacin comercial. 2. Esperar 10 a 20 minutos. El ensayo funciona correctamente si al cabo de 10 a 20 minutos aparece una lnea de color rojo en la zona de control. 3. Realizar la lectura de la placa cromatogrfica El ensayo es positivo cuando aparece una lnea de color rojo en la zona de ensayo y en la de control. El ensayo es negativo si solo se observa una lnea roja en la zona control. Ver FIGURA 1.

2.3.- Serotipificacin 2.3.1- Deteccin del antgeno somtico O Para la deteccin del serogrupo se puede efectuar la aglutinacin en lmina con antisuero policlonal anti-O157 o reactivo de ltex anti-O157.

A) Aglutinacin en lmina con antisuero policlonal anti-O157

Fundamento Los anticuerpos del antisuero especfico aglutinan con la bacteria cuando el antgeno O157 est presente en el lipopolisacrido (LPS) bacteriano.

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Medios Antisueros anti-O157 Solucin fisiolgica estril (SF) Cepa de referencia patrn positivo del antgeno O157 Cepa de referencia patrn negativo del antgeno O157 Tubos testigos de la escala de McFarland

Materiales y equipamiento Micropipeta rango 5-40 l Tips para micropipeta Lmpara para observar aglutinacin Lmina de vidrio para aglutinacin Ansa de rulo

A1) Aglutinacin en lmina con inactivacin previa por calor

Procedimiento 1. Determinar si el aislamiento a ensayar debe ser previamente inactivado por calor, de acuerdo a la naturaleza del antisuero a utilizar.

Comentarios El aislamiento a ensayar deber ser inactivado por calor cuando el antisuero a utilizar haya sido producido con un inculo cuyo antgeno capsular ha sido previamente eliminado. Mediante el calentamiento a 100C se elimina el antgeno capsular de la bacteria quedando expuesto el antgeno O del LPS.

2. Realizar una suspensin en SF (1ml) con una ansada de la cepa en estudio.

La

turbidez

de

la

suspensin

debe

corresponder al testigo 7 de la escala de McFarland (Cl2Ba 0,7 %).

3. Hervir la suspensin durante 1 h. 4. Colocar, en forma separada, dos gotas de 20 l de la suspensin en una lmina de vidrio.

34

5. Observar

las

dos

suspensiones

No se debe continuar con el ensayo si la muestra aglutina por si misma. Una muestra autoaglutinada corresponde a una cepa

iluminando la lmina con luz de una lmpara.

rugosa, la cual puede revertir al estado liso realizando sucesivos pasajes en agar sangre o agar Mueller Hinton. 6. Agregar 15 l del antisuero a ensayar a una de las dos suspensiones y mezclar. 7. Mover la lmina mediante rotacin suave durante un minuto. 8. Observar las suspensiones con luz de una lmpara. El ensayo es positivo si solo se observa aglutinacin o formacin de pequeos grumos en la mezcla de la suspensin bacteriana con el antisuero. El ensayo es negativo si ambas suspensiones aglutinacin. El antisuero O157 puede dar falsos resultados positivos con Salmonella Urbana O:30; Yersinia enterocolitica O:IB O:9; Yersinia Citrobacter son homogneas sin La suspensin sin el agregado de antisuero se utiliza como control negativo.

pseudotuberculosis

freundii; E. hermanii; Haffnia spp. y Brucella abortus por reacciones cruzadas. En cada ensayo se debe realizar control de los reactivos utilizando cepas patrones positivas y negativas.

A2) Aglutinacin en lmina sin inactivacin por calor

Procedimiento 1. Colocar separadamente dos gotas de 20 l de SF en una lmina de vidrio. 2. Mezclar una ansada del cultivo con las gotas de SF.

Comentarios

35

3. Observar

las

dos

suspensiones

Si la muestra aglutina por si misma no se debe continuar con el ensayo. Una muestra autoaglutinada corresponde a una cepa rugosa, la cual puede revertir al estado liso realizando sucesivos pasajes en agar sangre o agar Mueller Hinton.

iluminando la lmina con luz de una lmpara.

4. Agregar 15 l del antisuero a ensayar a una de las dos suspensiones y mezclar. 5. Mover la lmina mediante rotacin suave durante un minuto. 6. Observar la apariencia de las

La suspensin sin el agregado de antisuero se utiliza como control negativo

El ensayo es positivo si solo, en la mezcla de la suspensin con el antisuero, se observa aglutinacin o formacin de pequeos

suspensiones con luz de una lmpara.

grumos. El ensayo es negativo si ambas suspensiones aglutinacin. El antisuero O157 puede dar falsos resultados positivos con Salmonella Urbana O:30; Yersinia enterocolitica O:IB O:9; Yersinia Citrobacter son homogneas sin

pseudotuberculosis freundii;

E. hermanii; Haffnia spp. y

Brucella abortus por reacciones cruzadas. En cada ensayo se debe realizar control de los reactivos utilizando cepas patrones positivas y negativas.

B) Aglutinacin con partculas de ltex sensibilizadas con anticuerpos anti-O157

Fundamento Los anticuerpos anti-O157 adsorbidos a partculas de ltex, aglutinan con la bacteria, cuando el antgeno O est presente en el lipopolisacrido bacteriano.

Medios Reactivo de ltex anti-O157 Control del reactivo de ltex

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Cepa de referencia patrn positivo del antgeno O157 Cepa de referencia patrn negativo del antgeno O157

Materiales y equipamiento Pipetas Pasteur estriles Lmina para aglutinacin Ansa de rulo

Procedimiento 1. Colocar los reactivos de ltex a

Comentarios

temperatura ambiente antes de usarlos. 2. Mezclar los reactivos de ltex hasta homogenizar las suspensiones. 3. Dispensar con pipeta Pasteur estril una gota del reactivo de ltex y otra del control del reactivo de ltex en la lmina para aglutinacin. 4. Mezclar una ansada del aislamiento a ensayar con la gota del control del reactivo de ltex. 5. Mezclar otra ansada del aislamiento a ensayar con la gota del reactivo de ltex. La mezcla de reaccin con el reactivo y control de ltex debe ocupar un rea de 25 mm. 6. Mover la lmina mediante rotacin suave durante un minuto.

37

Observar si hay aglutinacin de la cepa con el reactivo de ltex. Ver FIGURA 2.

El ensayo es positivo si solo en la mezcla de la cepa con el reactivo de ltex, se observa aglutinacin grumos. o formacin de pequeos

El resultado no podr ser vlido si se observa aglutinacin de la cepa con el reactivo de ltex y con el reactivo control.

En cada ensayo se debe realizar control de los reactivos utilizando cepas patrones positivas y negativas.

Este ensayo puede dar falsos positivos por reaccin cruzada con E. hermanii. Es necesario realizar la diferenciacin

bioqumica entre E. coli O157 y E. hermanii.

2.3.2.- Deteccin del antgeno flagelar H Se realiza la tcnica convencional de aglutinacin en tubo, utilizando antisuero anti-H. Para la deteccin especifica del antgeno H7 puede realizarse adems, la tcnica de aglutinacin en lmina utilizando antisuero anti-H7.

Fundamento Los anticuerpos del antisuero especfico aglutinan con el antgeno flagelar correspondiente.

Medios Medio de Craigie fraccionado en tubo de ensayo con varilla de vidrio central Agar tripticasa de soja fraccionado en forma de pico de flauta en tubo de ensayo. (TSA) Antisueros anti-H Solucin fisiolgica estril (SF) Solucin fisiolgica (SF) formolada 1% (v/v) Cepa de referencia patrn positivo del antgeno H Cepa de referencia patrn negativo del antgeno H

Materiales y equipamiento Estufa de cultivo 37C Bao termo-estatizado 50C

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Tubos de hemlisis Micropipeta rango 5-40 l Tips para micropipeta Lmpara para observar aglutinacin Lmina de vidrio para aglutinacin Ansa de rulo Ansa de aguja

A) Prueba y estimulacin de la movilidad

Procedimiento 1 Da 1. Picar con ansa de aguja la colonia en estudio. 2. Introducir el ansa de aguja en la varilla central del tubo con medio de Craigie.

Comentarios

Sembrar en el interior de la varilla de vidrio, en el tercio superior del medio de cultivo. Ver FIGURA 3

3. Incubar el tubo a 37C por 18 h.

Anotar en el tubo la fecha de la primera siembra

2 Da 1. Observar el desarrollo de la bacteria y registrar si corresponde al lugar de siembra o alcanz la superficie del medio de cultivo externo a la varilla. La bacteria se considera no mvil cuando su desarrollo corresponde al lugar de siembra despus de siete das de

incubacin a 37C. La bacteria se considera mvil cuando su desarrollo alcanza la superficie del medio de cultivo, externo a la varilla. Para identificar el antgeno flagelar H se requiere la previa estimulacin de la movilidad de la bacteria. Para tal fin, se realizan siete pasajes en el medio de Craigie. Se considera que se ha producido un pasaje, cuando la bacteria desarrolla y alcanza el medio exterior de la varilla en 18 h de incubacin a 37C.

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2. Anotar el N del pasaje en la pared del tubo. (Por ejemplo: Pasaje N 1) 3. Picar con el ansa de aguja, la superficie del medio de cultivo desarrollado, en la parte externa a la varilla. 4. Sembrar con el ansa cargada el interior de la varilla (tercio superior del medio de cultivo) de un tubo con medio de Craigie. 5. Anotar el N de pasaje en la pared del tubo. 6. Incubar el tubo en estufa a 37C por 18 h. 3 al 7 Da 1. Registrar el desarrollo de la bacteria. Repetir los pasos correspondientes al 2 da hasta completar siete pasajes. 2. Tomar una ansada del tubo Se debe tomar la ansada de la superficie del medio de cultivo desarrollado externo a la varilla. La bacteria alcanz su mxima movilidad en la superficie del medio de cultivo.

correspondiente al 7 pasaje y sembrar en estra de TSA. 3. Incubar el TSA en estufa a 37C por 18 h. 8 Da 1. Conservar el cultivo en TSA a 4C hasta el procesamiento de identificacin del antgeno H.

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B) Identificacin del antgeno H: Aglutinacin en tubo

Procedimiento 1. Sembrar una ansada de cultivo de la estra de TSA en caldo CTS.

Comentarios En un mismo ensayo se puede enfrentar el cultivo bacteriano con diferentes antisueros anti-H. En estos casos, se debe calcular el volumen de CTS necesario para realizar el ensayo con N antisueros:
Vol. CTS para N antisueros
=

250 l CTS

N antisueros a ensayar

250 l CTS (control negativo)

2. Incubar en estufa a 37C con agitacin por 8 h. 3. Mezclar el volumen de cultivo-CTS, con igual volumen de SFformolada al 1% (v/v). 4. Colocar 500 l de la mezcla (CultivoCTS/SFformolada)

Se agrega SFformolada al 1% (v/v) con el fin de inactivar el cultivo desarrollado en CTS.

Se debe disponer de un nmero de tubos de prueba igual a la cantidad de antisueros a ensayar. En cada tubo de prueba se agrega el antisuero correspondiente.

en un tubo de hemlisis.

(Tubo de prueba) 5. Agregar 50 l de antisuero anti-H en el tubo de prueba. 6. Colocar 500 l de la mezcla (CultivoCTS/SFformolada)

en un tubo de hemlisis.

(Tubo control) 7. Colocar 50 l de solucin fisiolgica en en el tubo control. La suspensin sin el agregado de antisuero se utiliza como control negativo. No se debe continuar con el ensayo si la muestra aglutina por si misma. Una muestra autoaglutinada corresponde a una cepa rugosa, la cual puede revertir al estado liso realizando sucesivos pasajes en agar sangre o agar Mueller Hinton. 8. Mezclar e incubar los tubos en bao de agua a 50C por 1 h.

41

9. Observar

las

dos

suspensiones

Para realizar la lectura se recomienda inclinar suavemente los tubos. El ensayo es positivo si solo se observa aglutinacin (botn de aglutinacin en el fondo del tubo) o formacin de pequeos grumos en la mezcla de la suspensin bacteriana con el antisuero (Tubo de prueba). El ensayo es negativo si las suspensiones del tubo de prueba y del tubo control son homogneas sin aglutinacin.

iluminando los tubos con luz de una lmpara.

En cada ensayo se debe realizar el control de los reactivos utilizando cepas patrones

positivas y negativas.

C) Identificacin del antgeno H7: Aglutinacin en lmina

Procedimiento 1. Colocar separadamente dos gotas de 20 l de SF en una lmina de vidrio. 2. Mezclar una ansada del cultivo con las gotas de SF. 3. Observar las dos suspensiones

Comentarios

iluminando la lmina con luz de una lmpara. 4. Agregar 15 l del antisuero anti-H7 a una de las dos suspensiones. 5. Mover la lmina mediante rotacin suave durante un minuto. La suspensin sin el agregado de antisuero se utiliza como control negativo

42

6. Observar

la

apariencia

de

las

El ensayo es positivo si solo, en la mezcla de la suspensin con el antisuero, se observa aglutinacin o formacin de pequeos

suspensiones a la luz de una lmpara.

grumos. El ensayo es negativo si ambas suspensiones aglutinacin. En cada ensayo se debe realizar control de los reactivos utilizando cepas patrones positivas y negativas. son homogneas sin

2.4.- Caracterizacin de cepas hemolticas Fundamento La composicin del agar base triptosa suplementado con Cl2Ca y glbulos rojos lavados de sangre desfibrinada de cabra u oveja, permite la visualizacin de la hemlisis debida a la enterohemolisina de EHEC (EHEC-Hly) despus de una incubacin a 37C por 18 h.

Medios Agar tripticasa de soja fraccionado en forma de pico de flauta en tubo de ensayo (TSA) Agar base triptosa con glbulos rojos lavados (AGRL) Agar base triptosa con glbulos rojos sin lavar (AGRSL)

Materiales y Equipamiento Estufa de cultivo a 37C Ansa de rulo Cepa control positivo: E. coli 32511 O157:HCepa control negativo: E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia

Procedimiento 1 Da 1. Sembrar colonias presuntivas y cepas controles en TSA

Comentarios

43

2. Incubar los tubos en estufa de cultivo a 37C por 18 h. 3. Preparar placas AGRL y AGRSL Ver preparacin de las placas de AGRL y AGRSL. 2 Da 1. A partir del cultivo en TSA, sembrar con ansa de rulo las placas de AGRL (placa de ensayo) y AGRSL (placa control). En cada placa se pueden probar varias cepas presuntivas. Siempre se deben sembrar las cepas controles positivo y negativo. Se sugiere dividir las placas dibujando una grilla con espacios no menores de 2 cm2. 2. Incubar ambas placas a 37 C por 3 h. 3. Realizar una primera lectura de ambas placas a las 3 h de incubacin, observando si hay fina hemlisis El aislamiento se considera no productor de EHEC-Hly si despus de 3 h de incubacin se observa hemlisis por -hemolisina (Hly) en placa control (AGRSL) y o en placa de ensayo (AGRL). Si no se observa hemlisis continuar con la incubacin. 4. Continuar la incubacin de las placas a 37 C hasta cumplimentar las 18 h. 3 Da Realizar una segunda lectura de las placas. Ver FIGURA 4 La cepa es productora de EHEC-Hly si despus de 18 h de incubacin aparece una fina hemlisis alrededor de la zona de siembra solo en la placa de ensayo (AGRL). Si despus de 18 h de incubacin tambin se observa hemlisis en ambas placas (AGRL y AGRSL), la cepa es productora de -Hly y no de EHEC-Hly. Se puede visualizar mejor la hemlisis dejando la placa a 4C por 2 h o bien levantando suavemente el desarrollo

alrededor del desarrollo bacteriano.

bacteriano con un ansa.

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2.5.- Identificacin Bioqumica Los aislamientos presuntivos son sometidos a las siguientes pruebas bioqumicas: Ver FIGURA 5 Pruebas Bioqumicas E. coli noO157 Fermentacin de glucosa Fermentacin de lactosa Fermentacin de sacarosa Formacin de Ac. Sulfdrico Produccin de gas Utilizacin del Citrato Produccin de indol + + +
Sulfuro, indol, movilidad (SIM)

Bacteria E. coli O157:H7 + + E. hermanii

Medio de cultivo

Agar triple azcar y hierro (TSI)

TSI

TSI

TSI

+ -

+ -

+ -

TSI Citrato de Simmons

Movilidad

Mvil / no mvil

Mvil

Mvil

SIM

Fermentacin de sorbitol

Fermentacin de hidratos de carbono

Actividad -glucuronidasa

Disco con glucurnido

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Actividad lisina decarboxilasa Actividad ornitina decarboxilasa Fermentacin de Celobiosa

+ (90) *

+ (100)

- (6% )

Lisina Hierro Agar (LIA)

+ (95)

+ (100)

+ (100)

Movilidad, indol, ornitina. (MIO)

- (2%)

- (2%)

+ (97%)

Fermentacin de hidratos de carbono

Produccin de pigmento amarillo

- (0%)

- (0%)

+ (98%)

Tripticasa de soja

* El dato entre parntesis indica % de cepas positivas (+): positivo; (-): negativo Segn Manual of Clinical Microbiology (7 ed). 1999, pg. 459. Estas pruebas bioqumicas son de utilidad para diferenciar E. coli O157 y E. hermanii.

2.5.1- Fundamento y procedimientos para pruebas bioqumicas a) Agar hierro tres azcares (TSI)
Fundamento: - Determina la capacidad de un microorganismo de fermentar los hidratos de carbono presentes en el medio de crecimiento bsico con produccin o no de gas. La fermentacin provoca acidificacin del medio con viraje del indicador (rojo de fenol) al amarillo. - Permite detectar la produccin del sulfuro de hidrgeno por ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro ferroso.

Tcnica: - Inocular la superficie del pico de flauta con estra y el fondo por puncin. - Incubar a 37C. - Efectuar la lectura luego de 18-24 h de incubacin.

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Interpretacin: Fermentacin de azcares: Las reacciones que pueden observarse son: Pico alcalino (rojo) / fondo alcalino (rojo). No hay fermentacin de azcares. Pico alcalino (rojo) / fondo cido (amarillo). Glucosa fermentada. Lactosa y sacarosa no fermentadas. Pico cido (amarillo) / fondo cido (amarillo). Glucosa fermentada. Lactosa y/o sacarosa fermentadas. Produccin de gas: Se evidencia por la aparicin de burbujas o fragmentacin del medio.

Sulfuro de hidrgeno: Se evidencia por el ennegrecimiento del medio.

b) Utilizacin de Citrato

Fundamento: - Determina si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono para el metabolismo, produciendo alcalinidad. El medio Citrato de Simmons contiene tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo que es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono, utiliza tambin las sales de amonio como su nica fuente de nitrgeno. Las sales de amonio se desdoblan en amonaco con la consiguiente alcalinidad. El indicador de pH usado es el azul de bromotimol, el cual en medio alcalino toma un color azul intenso, indicando una prueba positiva. El medio no inoculado tiene color verde.

Tcnica: - Inocular la superficie del pico de flauta con estra y el fondo por puncin. - Incubar a 37C durante 48 h (a veces se requiere incubacin ms prolongada).

Interpretacin: Prueba positiva: desarrollo de color azul Prueba negativa: el medio conserva el color verde original y hay ausencia de desarrollo bacteriano.

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c) Sulfuro, indol, movilidad (SIM)


Fundamento: - Permite detectar la produccin del sulfuro de hidrgeno por ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro ferroso. - Permite detectar la produccin de indol, producto de la degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. El indol desdoblado de la molcula de triptofano puede ser detectado cuando reacciona con el grupo aldehdo del para-dimetilamino benzaldehdo del reactivo revelador (reactivo de Kovacs), formndose un complejo de color rojo. - Determina si el microorganismo es mvil por migracin a partir del lugar de siembra y se disemina en el medio provocando turbidez.

Tcnica: - Sembrar por puncin nica en la regin central del tubo, utilizando una aguja recta hasta una profundidad de 2/3 del medio. - Incubar a 37C durante 18-24 h. - Agregar 2 3 gotas del reactivo de Kovacs para deteccin del indol.

Interpretacin: Sulfuro de hidrgeno: Indol: Movilidad: Prueba positiva: Se visualiza turbidez parcial o total del medio. Prueba negativa: Hay crecimiento bacteriano solamente en la lnea de siembra. Prueba positiva: color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el medio. Prueba negativa: no hay modificacin del color en la interfase del reactivo y el medio. Prueba positiva: Se observa ennegrecimiento del medio.

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d) Movilidad, indol, ornitina (MIO)


Fundamento: - Determina si el microorganismo es mvil por migracin a partir del lugar de siembra y se disemina en el medio provocando turbidez. - Permite detectar la produccin de indol, producto de la degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. El indol desdoblado de la molcula de triptofano puede ser detectado cuando reacciona con el grupo aldehdo del para-dimetilamino

benzaldehdo del reactivo revelador (reactivo de Kovacs), formndose un complejo de color rojo. - Detecta la capacidad de un microorganismo de decarboxilar la ornitna. Las decarboxilasas son un grupo de enzimas capaces de actuar sobre los grupos carboxilo de los aminocidos produciendo aminas, de reaccin alcalina. Cada una de las decarboxilasas es especfica para un aminocido. La ornitina puede ser decarboxilada transformndose en putrescina. Esto produce un viraje al violeta del indicador prpura de bromocresol. Como la decarboxilacin slo tiene lugar en medio cido (pH inferior a 6), es necesario que se produzca previamente la acidificacin del medio de cultivo, por fermentacin de la glucosa. Por este motivo este medio de cultivo slo debe utilizarse para la diferenciacin de cultivos que fermentan la glucosa. Los microorganismos que no producen ornitina decarboxilasa pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje del medio al amarillo. La incubacin por 24 h produce una alcalinizacin en la superficie del medio de cultivo y consecuentemente un viraje del pico del medio al color violeta.

Tcnica: - Sembrar por puncin en el centro del medio de cultivo hasta el fondo del tubo. - Incubar a 37C durante 18-24 h. - Agregar 2 3 gotas del reactivo de Kovacs para la lectura del indol.

Interpretacin: Movilidad: Indol: Prueba positiva: color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo. Prueba negativa: no hay modificacin del color en la interfase del reactivo y el caldo. Prueba positiva: Se visualiza turbidez parcial o total del medio. Prueba negativa: Hay crecimiento bacteriano solamente en la lnea de siembra.

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Ornitina: Prueba positiva: Pico violeta / fondo violeta Prueba negativa: Pico violeta / fondo amarillo

e) Fermentacin de hidratos de carbono ( Medio Rojo Fenol)


Fundamento: - Se produce el viraje del color del indicador si el microorganismo tiene la capacidad de fermentar el hidrato de carbono presente en el medio.

Tcnica: - Sembrar una ansada del aislamiento en 1ml de medio rojo fenol con hidrato de carbono especfico al 1%. - Incubar a 37C durante 18-24 h. - Para todos los azcares se deben realizar lecturas diarias durante 7 das, con la excepcin del sorbitol que se debe efectuar a las 24 h.

Interpretacin: Prueba positiva: Se observa viraje del indicador al amarillo.

f)

Actividad -glucuronidasa

Fundamento: - Se evidencia la formacin de un producto cromognico amarillo por la actividad de la enzima glucuronidasa sobre el glucurnido.

Tcnica: - Se realiza una suspensin bacteriana con 0,2 ml de agua destilada estril (pH 7) y una ansada del aislamiento a identificar.

- Se incorpora un disco impregnado con el glucurnido. - Se incuba a 37C durante 4 h.

50

Interpretacin: Prueba positiva: Se observa coloracin amarilla por la formacin del producto cromognico.

Aquellas suspensiones en las cuales no se observa viraje durante las primeras 4 horas se deben incubar durante 2 horas adicionales.

g) Lisina, Hierro, Agar (LIA)


Fumdamento: - Detecta la capacidad de un microorganismo de decarboxilar la lisina. Las decarboxilasas son un grupo de enzimas capaces de actuar sobre los grupos carboxilo de los aminocidos produciendo aminas, de reaccin alcalina. Cada una de las decarboxilasas es especfica para un aminocido. La lisina puede ser decarboxilada transformndose en cadaverina. Esto produce un viraje del indicador prpura de bromocresol al violeta. Como la decarboxilacin slo tiene lugar en medio cido (pH inferior a 6), es necesario que se produzca previamente la acidificacin del medio de cultivo, por fermentacin de la glucosa. Por este motivo este medio de cultivo slo debe utilizarse para la diferenciacin de cultivos que fermentan la glucosa. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje del medio al amarillo. La incubacin de 24 h ocasiona una alcalinizacin en la superficie del medio de cultivo y consecuentemente un viraje del pico al color violeta. Las cepas Proteus y Providencia, con excepcin de algunas cepas de Morganella morganii, desaminan la lisina y producen cido alfa-ceto-carbnico. Este ltimo, con la sal de hierro y por la influencia de oxgeno forma combinaciones pardo-rojizas en la regin superficial del medio de cultivo. - Permite detectar la produccin del sulfuro de hidrgeno por ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro ferroso.

Tcnica: - Inocular la superficie del pico de flauta con estra y el fondo por puncin. - Incubar a 37C durante 18-24 h.

Interpretacin: Decarboxilacin de la lisina: Prueba positiva: pico violeta / fondo violeta Prueba negativa: pico violeta / fondo amarillo

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Desaminacin de la lisina: Prueba positiva: pico pardo rojizo / fondo amarillo

Sulfuro de hidrgeno: Prueba positiva: Se observa ennegrecimiento del medio.

h) Produccin de pigmento amarillo


Fundamento: - Las cepas de E. hermannii producen con su desarrollo un pigmento amarillo.

Tcnica: - Cultivar los aislamientos en agar tripticasa de soja a 37 C por 18 a 24 h. - Observar la aparicin del pigmento amarillo. - En ausencia del pigmento dejar incubando a 37C y observar el cultivo diariamente por siete das.

2.6.- Biotipificacin de E. coli O157:H7 Las cepas de E. coli O157:H7 se clasifican en los biotipos A, B, C, D, segn la capacidad de fermentar los azcares rafinosa, dulcitol y ramnosa. Ver FIGURA 6
Fundamento: - Si el microorganismo fermenta el hidrato de carbono presente en el medio, se produce viraje en el color del indicador.

Medios Medio para fermentacin de azcares (Medio Rojo Fenol) con rafinosa Medio para fermentacin de azcares (Medio Rojo Fenol ) con dulcitol Medio para fermentacin de azcares (Medio Rojo Fenol) con ramnosa

Materiales y equipamiento Ansa de rulo Estufa de cultivo a 37C

52

Tcnica: - Seguir procedimiento 2.5.e), Fermentacin de hidratos de carbono.(Medio Rojo Fenol), para probar la capacidad de fermentar rafinosa, dulcitol y ramnosa. - Incubar a 37C durante 18-24 h. - Realizar lecturas diarias durante 7 das. - Determinar el biotipo del aislamiento segn los resultados de la fermentacin.

Interpretacin: Fermentacin positiva: Se observa viraje del indicador al amarillo.

El biotipo se establece segn la siguiente tabla:

Prueba

Biotipo E. coli O157:H7 A B + + C + + + D + +

Rafinosa Dulcitol Ramnosa

+ -

2.7.- Sensibilidad a los antimicrobianos

Se utiliza el mtodo de difusin en agar por discos (antibiograma) segn la tcnica de Kirby Bauer. Todo el proceso debe responder a las normas establecidas por la NCCLS, en lo referente a la siembra en las placas, condiciones de los discos, aplicacin de los mismos, incubacin, lectura por medicin de la zona de inhibicin, significado de las colonias que pudieran aparecer dentro de los halos y utilizacin de cepas patrones.

53

Medios
Placas de agar Mueller Hinton (MH) pH 7,2-7,4. Discos con antibiticos para amicacina ampicilina, ciprofloxacina colistin, cloranfenicol, gentamicina, cido nalidxico, norfloxacina, estreptomicina, tetraciclina y trimetoprimasulfametoxazol Solucin fisiolgica estril (SF) Cepas patrones ATCC 25922 Tubos testigos de la Escala de McFarland

Equipamiento
Hisopo estril Ansa de aguja Pinza para discos con antibitico Estufa de cultivo a 37C Frezzer -20C Heladera 4C Calibre para medir halos de inhibicin

Procedimiento 1 Da 1. Secar las placas de MH a 37C durante 30-60 minutos. 2. Colocar los discos con antibiticos a temperatura usarlos. ambiente antes de

Comentario

Para realizar el antibiograma se debe eliminar la humedad superficial de las placas.

Se utilizan discos para los siguientes antibiticos: ciprofloxacina, gentamicina, amicacina, colistin, cido ampicilina, cloranfenicol, nalidxico,

nitrofurantoina, estreptomicina, tetraciclina y trimetoprima-sulfametoxazol Los discos deben conservarse en heladera a 4C o en frezzer a -20C.

54

3. Preparar la suspensin bacteriana que se utiliza como inculo en el antibiograma. Tomar con ansa de aguja colonias aisladas del cultivo a ensayar y resuspender en 2 ml de SF hasta obtener una turbidez

Siempre se deben probar cepas patrones paralelamente estudio. con los aislamientos en

correspondiente al testigo 5 (Cl2Ba 0,5 %) de la escala de McFarland. 4. Con hisopo estril previamente

embebido con el inculo y escurrido en las paredes del tubo, estriar las placas de MH en tres direcciones. 5. Dejar estabilizar las placas hisopadas a temperatura ambiente por 5

minutos. 6. Tomar con pinza y colocar sobre la placa hisopada los discos con
Colocar 6 discos por placa como mximo.

antibitico. 7. Incubar en estufa de cultivo a 37C por 18-24 h. 2 Da 1. Efectuar la lectura de los halos de inhibicin, correspondientes a cada disco, con calibre.
Para la interpretacin, los resultados deben cotejarse con las tablas publicadas por NCCLS (M100-S13, Enero 2005).

55

Algoritmo para el diagnstico y caracterizacin de Escherichia coli O157 con tamizaje por PCR multiplex
Separacin Inmunomagntica Materia fecal (suspensin)

Ensayo inmunocromatogrfico

CTS 37C x 6 h

CT-CTS 37C x 6 h SMAC

Agar MacConkey Sorbitol (SMAC) 37C x 18 h

SMAC

37C x 18 h Seroagrupamiento presuntivo O157

37C x 18 h

Tamizaje PCR Multiplex stx1/stx2/rfbO157 zona de confluencia, colonias sorbitol (-) y sorbitol (+)

PCR (-)

PCR (+)

Descartar

Aislamiento Identificacin bioqumica Fenotipo enterohemoltico Sorbitol en tubo -glucuronidasa Biotipificacin STEC O157 Serotipificacin Sensibilidad a ATB

Caracterizacin por PCR eae, EHEC-hlyA, fliCH7 Centro Nacional de Referencia Citotoxicidad especifica clulas Vero Subtipificacin de STEC Genotipo de variantes stx Fagotipificacin STEC O157 PFGE

56

Algoritmo para el diagnstico y caracterizacin de Escherichia coli O157


Materia fecal (suspensin)

CTS 37C x 6 h Agar MacConkey Sorbitol (SMAC) 37C x 18 h

CT-CTS 37C x 6 h

SMAC 37C x 18 h

SMAC 37C x 18 h

Seroagrupamiento presuntivo O157

Seroagrupamiento (-)

Seroagrupamiento (+)

Deteccin de Stx por alguna metodologa

Aislamiento Identificacin bioqumica Fenotipo enterohemoltico Sorbitol en tubo -glucuronidasa Biotipificacin STEC O157 Serotipificacin Sensibilidad a ATB

Centro Nacional de Referencia Caracterizacin por PCR stx1, stx2, rfbO157, eae, EHEC-hlyA , fliCh7 Citotoxicidad especifica clulas Vero Subtipificacin de STEC Genotipo de variantes stx Fagotipificacin STEC O157 PFGE

57

FIGURA 1

Esquema de deteccin de E. coli O157:H7/NM por inmunocromatografa

Ac anti-especie Zona control Ac anti-LPSO157+ oro coloidal

Sentido de la migracin

Ac anti-LPSO157+ oro coloidal Zona de ensayo Antgeno LPSO157 Ac anti-LPSO157

1 Zona de reaccin

Ac anti-LPSO157+ oro coloidal Antgeno LPSO157

Zona de siembra

58

FIGURA 2 Aglutinacin con partculas de ltex sensibilizadas con anticuerpos anti-O

Reactivo de latex

Reactivo control de latex

Cepa control negativo

Cepa control positivo

Cepa problema autoaglutinada

Cepa problema positiva

59

FIGURA 3

Prueba y estimulacin de la movilidad bacteriana

3A- Siembra del primer pasaje

1- Medio de Craigie con varilla de vidrio central. 2- Siembra del medio de Craigie con ansa de aguja en el interior de la varilla de vidrio, correspondiente al tercio superior del medio de cultivo.

60

3B- Lectura de la movilidad a las 18 24 h

1- Cepa STEC mvil 2- Cepa STEC no mvil

61

3C- Siembra de pasajes sucesivos

1- Picar con el ansa de aguja, la superficie del medio de cultivo desarrollado, en la parte externa a la varilla. 2- Sembrar con el ansa cargada el interior de la varilla (tercio superior del medio de cultivo) de un tubo con medio de Craigie.

62

FIGURA 4 Prueba de la Enterohemolisina (EHEC-Hly)

1- Aislamiento de E. coli O157:H7 EHEC-Hly positivo 2- Cepa de Referencia E. coli 32511 EHEC-Hly positiva 3- Cepa de Referencia E. coli 25922 EHEC-Hly Negativa

63

FIGURA 5 Pruebas Bioqumicas de Escherichia coli productor de toxina Shiga

1- TSI: Pico cido/fondo cido con produccin de gas, SH2 negativo 2- Utilizacin del Citrato: negativo 3- SIM: SH2 negativo, Indol: positivo, movilidad: positiva 4- LIA: decarboxilacin de la lisina positiva, SH2: negativa 5- Fermentacin de celobiosa: negativa

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FIGURA 6 Actividad de -glucuronidasa y Biotipificacin de E. coli O157

1- Actividad -glucuronidasa: negativa 2- Fermentacin del sorbitol: negativa 3- Fermentacin de rafinosa: positiva 4- Fermentacin de dulcitol: positiva 5- Fermentacin de ramnosa: positiva

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CARACTERIZACION DE Escherichia coli O157 productor de toxina Shiga Fecha: .............................. N de Muestra: .................

Prueba
Morfologa de las colonias SeroAgrupamiento

Aislamiento presuntivo

E. coli EDL933 O157:H7

E. coli 32511 O157:H-

E. hermanii

E. coli ATCC 25922

SMAC Antisuero anti-O Ltex anti-O TSI Citrato de Simmons SIM MIO

Bioqumica

Sorbitol Actividad -glucuronidasa LIA Celobiosa Pigmento amarillo EHEC-Hly Rafinosa

Hemlisis Biotipificacin STEC O157 Serotipificacin

Dulcitol Ramnosa Antisuero anti-H Acido Nalidxico Amikacina Ampicilina Ciprofloxacina Cloranfenicol Colistin Estreptomicina Gentamicina Nitrofurantona Tetraciclina Trimetoprima sulfametoxazol

Sensibilidad a los antimicrobianos

66

CAPITULO III - DETECCION DE FACTORES DE VIRULENCIA

1.- Deteccin genotpica de los factores de virulencia por la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Fundamento de la Tcnica de PCR La replicacin enzimtica de una molcula blanco o templado de ADN, mediante ciclos repetitivos de amplificacin, permite obtener un producto fcilmente detectable.

Equipamiento Termociclador para PCR Micropipeta para reactivos de PCR rango: 0,5 - 10 l Micropipeta para reactivos de PCR rango: 5 - 40 l Micropipeta para reactivos de PCR rango: 40 - 200 l Micropipeta para el templado de ADN rango: 0,5 - 10 l Micropipeta para amplicones: 5- 40 l Bao de agua para hervir Microcentrifuga para tubos Eppendorf Cuba y fuente de poder para electroforesis Transiluminador UV Freezer -20C Heladera 4C

Materiales Ansa de aguja Tubos Eppendorf 1,5 ml Microtubos pared delgada PCR 0,2 ml Tips con filtro para aerosoles Recipiente con hielo

Reactivos Buffer Tritn X-100 al 1% en buffer TE 1X Buffer PCR10X

67

Mezcla de dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, y dTTP: 2,5 mM Cl2Mg 25 50 Mm Par de primers especficos: 0,1 nmol/l Taq polimerasa: 5U/l Agua tridestilada estril (H2O ddd) Aceite mineral Agarosa Buffer TAE 1X Bromuro de Etidio (BrEt): 10 mg/ml Buffer de siembra 1: Xilene cyanol 0,25%, glicerol en agua 30% Buffer de siembra 2: Azul de Bromofenol 0,25%, glicerol en agua 30% Marcador de tamao molecular: 100 pb Marcador de tamao molecular: 1 kb

a) Preparacin de la muestra Procedimiento 1. Tomar una ansada de cultivo Comentarios La tcnica de PCR es de muy alta sensibilidad. Se recomienda establecer

correspondiente a la zona de crecimiento confluente de las placas de SMAC.

diferentes reas de trabajo para evitar la obtencin de falsos resultados positivos por contaminaciones cruzadas: 1. rea de procesamiento de la muestra y obtencin del ADN. 2. rea de preparacin de la mezcla de reaccin. 3. rea para el agregado del templado y amplificacin. 4. rea de deteccin de los productos de amplificacin.

68

2. Resuspender la muestra en 150 l de buffer Tritn X-100 al 1% en buffer TE 1X.

Fraccionar

el

buffer

Tritn

en

tubos

Eppendorf de 1,5 ml de capacidad, en el rea de preparacin de la mezcla de reaccin. Utilizar micropipeta para uso exclusivo de reactivos, y tips con filtro para aerosoles. Luego trasladar los tubos al rea de procesamiento de la muestra para preparar el extracto de ADN. Frotar el ansa cargada de muestra contra las paredes del tubo con buffer Tritn.

3. Adems,

seleccionar

colonias

presuntivas con igual morfologa, de las placas de SMAC. 4. Picar las colonias con ansa de aguja y resuspenderlas en 150 l de Buffer Tritn X-100 al 1% en buffer TE 1X. 5. Preparar el extracto de ADN de las cepas de referencia que sern utilizadas como controles (positivo y negativo) en la reaccin. Seguir los pasos 3, 4, y 6. 6. Hervir en bao de agua a 100C durante 15 minutos El efecto conjunto del detergente Tritn y el calentamiento produce la lisis bacteriana y la liberacin del ADN. Tomar la precaucin de cerrar bien los tubos Eppendorf antes de hervir. 7. Centrifugar a 10.000 rpm durante 5 minutos. Luego de la centrifugacin, se obtiene un pellet correspondiente al debris bacteriano y un sobrenadante donde se encuentra el ADN. Verificar las cepas de referencia que se utilizan en cada protocolo de PCR. Frotar el ansa contra las paredes del tubo.

69

8. Conservar el extracto de ADN a 4C para ser utilizado como templado en la reaccin de PCR.

El extracto de ADN puede conservarse en freezer a -20C para ser utilizado en otra PCR. Conservarlos en un rea libre de reactivos.

Si el extracto es descongelado, es necesario realizar una centrifugacin a 10.000 rpm por 5 minutos antes de utilizarlo.

b) Preparacin de la mezcla de reaccin Procedimiento 1. Retirar los reactivos para la PCR del freezer de -20C. Esperar que los mismos se descongelen y colocarlos en un recipiente con hielo. 2. Establecer determinaciones el y nmero completar de el Realizar el siguiente clculo para determinar el nmero de determinaciones:
N de determ inaciones

Comentarios Los reactivos para PCR deben conservarse en freezer a -20C en un rea especfica para tal fin.

protocolo de la PCR a realizar (Ver Protocolo especfico)

N dem uestras presuntivas

C ontrol Positivo

+ Negativo + Reactivos + 1

C ontrol

C ontrol

Se suma 1 para calcular, en exceso, el volumen total de la mezcla de reaccin. Se contempla de esta manera los probables errores de pipeteo que pueda cometer el operador.

3. Para

cada

reactivo,

calcular

los

Las concentraciones de los reactivos de trabajo, de los reactivos en la mezcla y los volmenes de los reactivos para una

volmenes necesarios en la mezcla de reaccin, de acuerdo al nmero de determinaciones

determinacin, se indican en el protocolo especfico de cada PCR. Realizar el siguiente clculo para determinar el volumen de cada reactivo en la mezcla:
Vol. del Rvo. en la mezcla para n determinaciones

Vol. del Rvo. en la mezcla para una determinacin

N de determinaciones

70

4. Enumerar los microtubos de 0,2 l de acuerdo al N de muestras. 5. Preparar la mezcla en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. agregando los reactivos en el siguiente orden: a. H2O ddd b. Buffer PCR c. dNTPs d. Cl2Mg e. Primers f. Taq polimerasa

Marcar la pared del tubo utilizando una fibra indeleble. Preparar la mezcla en un rea o superficie libre de bacterias, muestras de ADN o productos amplificados.

Utilizar

micropipetas

exclusivas

para

reactivos de PCR y tips con filtro para aerosoles. Homogenizar los reactivos antes de usarlos. La enzima debe permanecer siempre a -20C para evitar que baje su actividad. En el momento que deba ser utilizada, retirarla del freezer y colocarla rpidamente en un bloque fro.

6. Resuspender la mezcla con micropipeta y fraccionar 48 l en cada microtubo de PCR.

Descartar el resto de volumen que queda en el tubo de 1,5 ml. Este sobrante, corresponde al volumen de muestra para una determinacin calculado previamente en exceso.

7. Cerrar y trasladar los microtubos de PCR al rea de carga de los templados y donde se encuentra el termociclador.

71

c) Carga de los templados y amplificacin Procedimiento 1. Agregar a cada microtubo, 2 l del templado correspondiente. Al microtubo de control de reactivos se agrega 2 l de H2O ddd. Comentarios Para cargar los templados se debe utilizar una micropipeta exclusiva para manipulear ADN y tips con filtro para aerosoles. El volumen del templado se toma del sobrenadante del tubo donde se prepara el extracto de ADN. 2. Agregar una gota de aceite mineral a cada microtubo. Se agrega aceite mineral para evitar que la mezcla de reaccin se evapore cuando es sometida a las diferentes temperaturas del programa de amplificacin. No es necesario el agregado de aceite mineral cuando se dispone de un termociclador con tapa aseguradora de tubos. 3. Colocar los microtubos en el Tomar la precaucin de cerrar correctamente los microtubos.

termociclador y activar el programa de amplificacin especfico para cada PCR. (Ver Protocolo PCR)

72

d) Deteccin del producto de amplificacin Procedimiento 1. Preparar un gel de agarosa en buffer TAE 1X. (Ver en el protocolo de cada PCR que porcentaje de agarosa se utiliza para preparar el gel) Comentarios Se deber preparar un gel de una consistencia tal, que permita separar y visualizar

correctamente las bandas despus de realizar la corrida electrofortica. La concentracin de agarosa a utilizar depende del tamao de la banda del producto amplificado. Armar la bandeja o el molde para el gel de agarosa. Colocar el peine o molde para hoyos. Disolver la agarosa en buffer TAE 1X en microondas en bao de agua caliente. Dispensar BrEt hasta una concentracin final de 0,5 g/ml. Agregar antes que gelifique el gel y mezclar para homogenizar. El BrEt es agregado al gel para poder visualizar el ADN. Esta droga es

potencialmente txica por sus propiedades mutagnicas. Se recomienda utilizar guantes para su manipulacin. Dejar gelificar y retirar el peine del gel. Colocar el molde con el gel en la cuba electrofortica. La molcula de ADN tiene carga negativa y en la corrida electrofortica migra hacia el polo positivo de la cuba. Por lo tanto orientar el gel de manera que la zona de siembra quede conectada al borne negativo. Cubrir con buffer TAE 1X. El buffer debe penetrar en los hoyos y sobrepasar la superficie del gel en 0,5 cm.

73

2. Retirar los microtubos del termociclador y llevar al rea de deteccin del producto de amplificacin. 3. Diluir los amplificados en buffer de siembra 1. El buffer de siembra 1 esta compuesto por Xilene cyanol (0,25%) y glicerol en agua (30%). El glicerol arrastra al ADN hacia el fondo del hoyo y el colorante Xilene marca el fondo de corrida. Se debe diluir una parte del buffer de siembra 1 (6X) en 5 partes del amplificado. 4. Sembrar los amplificados en el gel. Utilizar una micropipeta de uso exclusivo para la siembra de geles. 5. Sembrar paralelamente un marcador de tamao molecular diluido en buffer de siembra 2. (Ver el marcador de tamao molecular que es sugerido en cada protocolo de PCR ) La eleccin del marcador del de tamao del

molecular fragmento

depender a

tamao El

amplificar.

marcador

adecuado es aquel que permite establecer si la banda obtenida para cada producto

amplificado, es del tamao esperado. El buffer de siembra 2 esta compuesto por Azul de Bromofenol 0,25% y glicerol en agua 30%. El colorante Azul de Bromofenol marca el frente de corrida. Se debe diluir una parte del buffer de siembra 2 (6X) en 5 partes del marcador. 6. Conectar la cuba a la fuente de poder. 7. Realizar la corrida electrofortica a 80 Volts por 30-40 minutos.

74

8. Colocar el gel en el UV-transiluminador

Una exposicin inadecuada a luz ultravioleta puede daar la piel y los ojos. Se recomienda usar anteojos protectores de UV.

Observar en la calle del control positivo, la presencia de bandas especficas cuyo tamao corresponde al fragmento amplificado. No se deben visualizar bandas en las calles del control negativo y del control de reactivos.

Observar y registrar en el protocolo, la presencia de bandas especficas en las calles correspondientes a las muestras presuntivas.

Descartar el gel de agarosa con BrEt siguiendo las normas para la eliminacin de residuos txicos.

75

1.1.- PCR multiplex stx1/stx2/rfbO157 Se utilizan los oligonucletidos o primers iniciadores de Pollard et al., que amplifican un fragmento de 130 pb de la regin del gen correspondiente a la subunidad B para Stx1 y un fragmento de 346 pb de la regin del gen correspondiente a la subunidad A para Stx2 y los oligonucletidos iniciadores de Paton et al, que amplifican un fragmento de 259 pb del gen rfb correspondiente al LPS O157.

Tamao Primer Secuencia del primer (5-3) del fragmento de amplificacin (pb) stx1a stx1b stx2a stx2b O157F O157R GAAGAGTCCGTGGGATTACG AGCGATGCAGCTATTAATAA TTAACCACACCCCACCGGGCAGT GCTCTGGATGCATCTCTGGT CGGACATCCATGTGATATGG TTGCCTATGTACAGCTAATCC 259 346 130

Productos de amplificacin por PCR para la deteccin de los genes stx1, stx2 y rfbO157 en cepas de referencia y en cepas STEC de distinto origen. Lneas 1 y 13: control positivo E. coli EDL933 stx1/stx2/rfbO157+. Lneas 2 y 4: E. coli O157:H7 stx2/rfbO157+, aislados de casos de SUH. Lneas 3 y 8: E. coli O157 rfbO157+, aislados de alimentos. Lneas 5, 6, 7 y 10: E. coli stx2+, aislados de casos de diarrea. Lineas 9 y 11: E. coli stx1+, aislados de casos de diarrea. Lnea 12: control negativo E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia. Linea 14: control de reactivos (mezcla sin templado). Lnea 15: marcador de tamao molecular Cien Marker.

76

Referencias Pollard DR, Johnson WM, Lior H, Tyler SD, Rozee KR. Rapid and specific detection of verotoxin genes in Escherichia coli by the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 1990; 28:540-5 Paton A, Paton J. Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using Multiplex PCR assays for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and rfbO157. J. Clin. Microbiol. 1998; 36:598-602.

1.1.1.-Protocolo PCR multiplex stx1/stx2/rfbO157 Cepas de referencia E. coli EDL933, O157:H7 Stx1/Stx2 E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia Control Positivo Negativo

Programa de amplificacin Paso N 1 2 3 Etapa Desnaturalizacin Desnaturalizacin Pegado de primers Annealing Extensin Extensin Pausa Temperatura C 94 94 58 Tiempo 5 min 30 seg 30 seg Va al paso N N veces

4 5 6

72 72 4

30 seg 2 min

29

Caractersticas del gel Agarosa al 2% en buffer TAE 1X

Marcador de peso molecular 100 pb

Tamao de los fragmentos Primers stx1a / stx1b stx2a / stx2b O157F / O157R Tamao del Fragmento (pb) 130 346 259

77

Protocolo PCR multiplex stx1/stx2/rfbO157

Fecha:

Reactivo

Concentracin de trabajo del reactivo 10X 2,5 mM 25 mM* 0,1 nmol/l 0,1 nmol/l 0,1 nmol/l 0,1 nmol/l 0,1 nmol/l 0,1 nmol/l 5 U/l

Concentracin del reactivo en la mezcla 1X 0,1 1,5 mM mM

Buffer Mezcla dNTP Cl2Mg Primer stx1a Primer stx1b Primer stx2a Primer stx2b Primer O157F Primer O157R Taq polimerasa Templado H2O ddd Vol. Final

Volumen del reactivo en la mezcla para una determinacin (l) 5 2 3 1 1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 2 35 50

Volumen del reactivo en la mezcla para N determinaciones (l)

2 pmol/l 2 pmol/l 0,4 pmol/l 0,4 pmol/l 0,4 pmol/l 0,4 pmol/l 0,02 U/l

* La concentracin del Cl2Mg puede variar segn la marca comercial del equipo de la Taq polimerasa. En general se comercializa el Cl2Mg a 25 50 mM. Si se dispone la concentracin de 50 mM, se utiliza 1,5 l de Cl2Mg y 36,5 l de H2O ddd por determinacin. Microtubo N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N Identificacin de la muestra #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 Control positivo EDL933 Control negativo ATCC 25922 Control reactivos Colonia N Resultado

78

1.2.- PCR factor eae Se utilizan los primers iniciadores de Karch et al., que amplifican un fragmento de 864 pb de la regin conservada del gen eae para EPEC y de EHEC.

Primer SK1 SK2

Secuencia del primer (5-3) CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG

Tamao del fragmento de amplificacin (pb) 864

864 pb

Productos de amplificacin por PCR para la deteccin del gen eae en cepas de referencia y en una cepa de STEC de origen clnico. Lnea 1: E. coli O145:NM Stx2 / eae+, aislado de un caso de SUH. Lnea 2: control negativo E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia. Lneas 3 y 4: controles positivos E. coli 2348/68 eae+ (EPEC) y E. coli E32511 eae+ (STEC). Lnea 5: control de reactivos (mezcla sin templado). Lnea 6: marcador de tamao molecular Cien Marker.

Referencia Karch H, Bohm H, Schmidt H, Gunzer F, Aleksic S, Heesemann J. Clonal structure and pathogenicity of Shiga-like toxin-producing, sorbitol-fermenting Escherichia coli O157:H-. J. Clin. Microbiol.1993; 31: 1200-5.

79

1.2.1-Protocolo PCR factor eae

Cepas de referencia E. coli 2348/69 (EPEC) E. coli E32511 (STEC) E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia

Control Positivo Positivo Negativo

Programa de amplificacin Paso N 1 2 3 Etapa Desnaturalizacin Desnaturalizacin Pegado de primers annealing Extensin Extensin Pausa Temperatura C 94 94 54 Tiempo 5 min 30 seg 1 min Va al paso N N veces

4 5 6

72 72 4

2 min 2 min

29

Caractersticas del gel Agarosa al 1% en buffer TAE 1X

Marcador de peso molecular 100 pb

Tamao del fragmento Primers SK1 / SK2 Tamao del Fragmento (pb) 864

80

Protocolo PCR factor eae

Fecha:

Reactivo

Concentracin de trabajo del reactivo 10X 2,5 mM 25 mM* 0,1 nmol/ul 0,1 nmol/ul 5 U/ul

Concentracin del reactivo en la mezcla 1X 0,1 1 Mm mM

Buffer Mezcla dNTP Cl2Mg Primer SK1 Primer SK2 Taq polimerasa Templado H2O ddd Vol. Final

Volumen del reactivo en la mezcla para una determinacin (l) 5 2 2 0,2 0,2 0,2 2 38,4 50

Volumen del reactivo en la mezcla para N determinaciones (l)

0,4 pmol/ul 0,4 pmol/ul 0,02 U/ul

*La concentracin del Cl2Mg puede variar segn la marca comercial del equipo de la Taq polimerasa. En general se comercializa el Cl2Mg a 25 50 mM. Si se dispone la concentracin de 50 mM, se utiliza 1 l de Cl2Mg y 39,4 l de H2O ddd por determinacin.

Microtubo N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N

Identificacin de la muestra #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 Control positivo 2348/69 Control positivo E32511 Control negativo ATCC 25922 Control reactivos

Colonia N

Resultado

81

1.3.- PCR Enterohemolisina (EHEC-hlyA) Se utilizan los primers iniciadores de Schmidt et al., que amplifican un fragmento de 1551pb de la regin 5 del gen EHEC-hlyA. Tamao del fragmento de amplificacin (pb) 1551

Primer hlyA1 hlyA4

Secuencia del primer (5-3) GGTGCAGCAGAAAAAGTTGTAG TCTCGCCTGATAGTGTTTGGTA

1551 pb

Productos de amplificacin por PCR para la deteccin del gen EHEC-hlyA en cepas de referencia y en cepas STEC de origen clnico. Lnea 1: marcador de tamao molecular 1kb. Lnea 2: control negativo E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia. Lnea 3: control positivo E. coli E32511 EHEC-hlyA+. Lneas 4: E. coli O157:H7 stx2/EHEC-hlyA+ aislado de un caso de SUH. Linea 5: E. coli O145:NM stx2/ EHEC-hlyA+ aislado de un caso de diarrea sanguinolenta. Lnea 6 control de reactivos (mezcla sin templado)

Referencia Schmidt H, Beutin L, Karch H. Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of Escherichia coli O157:H7 stain EDL 933. Infect. Immun. 1995; 63:1055-61.

82

1.3.1-Protocolo PCR Enterohemolisina (EHEC-hlyA)

Cepas de referencia E. coli E32511 E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia

Control Positivo Negativo

Programa de amplificacin Paso N 1 2 3 Etapa Desnaturalizacin Desnaturalizacin Pegado de primers annealing Extensin Extensin Pausa Temperatura C 94 94 58 Tiempo 5 min 30 seg 90 seg Va al paso N N veces

4 5 6

72 72 4

90 seg 3min

29

Caractersticas del gel Agarosa al 0,8% en buffer TAE 1X

Marcador de peso molecular 1 kb

Tamao del fragmento Primers hlyA1 hlyA4 Tamao del Fragmento (pb) 1551

83

Protocolo PCR Enterohemolisina (EHEC-hlyA)

Fecha:

Reactivo

Concentracin de trabajo del reactivo 10X 2,5 mM 25 Mm* 0,1 nmol/l 0,1 nmol/l 5 U/l

Concentracin del reactivo en la mezcla 1X 0,1 1,5 mM mM

Volumen del reactivo en la mezcla para una determinacin (l) 5 2 3 0,2 0,2 0,4 2 37,2 50

Volumen del reactivo en la mezcla para N determinaciones (l)

Buffer Mezcla dNTP Cl2Mg Primer hlyA1 Primer hlyA4 Taq polimerasa Templado H2O ddd Vol. Final

0,4 pmol/l 0,4 pmol/l 0,04 U/l

* La concentracin del Cl2Mg puede variar segn la marca comercial del equipo de la Taq polimerasa. En general se comercializa el Cl2Mg a 25 50 mM. Si se dispone la concentracin de 50 mM, se utiliza 1,5 l de Cl2Mg y 38,7 l de H2O ddd por determinacin.

Microtubo N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N

Identificacin de la muestra #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 Control positivo E32511 Control negativo ATCC 25922 Control reactivos

Colonia N

Resultado

84

1.4.- PCR antgeno flagelar h7 Se utilizan los primers iniciadores de Gannon et al., que amplifican un fragmento de 625-pb de la regin 5 del gen fliCh7.

Primer FLICH7-F FLICH7-R

Secuencia del primer (5-3) GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC

Tamao del fragmento de amplificacin (pb) 625

625 bp

Productos de amplificacin por PCR para la deteccin del gen fliCh7 en cepas de referencia y en cepas STEC de origen clnico. Lnea 1: control positivo E. coli EDL933 O157:H7. Lneas 2 y 3: E. coli O157:H7 aislado de un caso de SUH. Lnea 4: control negativo E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia. Lnea 5: control negativo (mezcla sin templado). Lnea 6: marcador de tamao molecular Cien Marker.

Referencia Gannon VP, DSouza S, Graham T, King RK, Rahn K, Read S. Use of the flagellar H7 gene as a target in multiplex PCR assays and improved specificity in identification of enterohemorrhagic Escherichia coli strains. J. Clin. Microbiol.1997; 35: 656-62.

85

1.4.1-Protocolo PCR antgeno flagelar h7

Cepas de referencia E. coli EDL933, O157:H7 E. coli ATCC 25922 sin factores de virulencia

Control Positivo Negativo

Programa de amplificacin Paso N 1 2 3 Etapa Desnaturalizacin Desnaturalizacin Pegado de primers annealing Extensin Extensin Pausa Temperatura C 94 94 60 Tiempo 1 min 15 seg 15 seg Va al paso N N veces

4 5 6

72 72 4

75 seg 5 min

34

Caractersticas del gel Agarosa al 2% en buffer TAE 1X

Marcador de peso molecular 100 pb

Tamao del fragmento Primers FLICH7-F FLICH7-R Tamao del Fragmento (pb) 625

86

Protocolo PCR antgeno flagelar h7

Fecha:

Reactivo

Concentracin de trabajo del reactivo 10X 2,5 mM 25 mM* 0,1 nmol/l 0,1 nmol/l 5 U/l

Concentracin del reactivo en la mezcla 1X 0,15 1,5 mM mM

Volumen del reactivo en la mezcla para una determinacin (l) 5 3 3 0,3 0,3 0,2 2 36,2 50

Volumen del reactivo en la mezcla para N determinaciones (l)

Buffer Mezcla dNTP Cl2Mg Primer FLICH7-F Primer FLICH7-R Taq polimerasa Templado H2O ddd Vol. Final

0,6 pmol/l 0,6 pmol/l 0,02 U/l

* La concentracin del Cl2Mg puede variar segn la marca comercial del equipo de la Taq polimerasa. En general se comercializa el Cl2Mg a 25 50 mM. Si se dispone la concentracin de 50 mM, se utiliza 1,5 l de Cl2Mg y 37,3 l de H2O ddd por determinacin.

Microtubo N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N

Identificacin de la muestra #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 Control positivo EDL933 Control negativo ATCC 25922 Control reactivos

Colonia N

Resultado

87

CAPITULO III APENDICE


Composicin y preparacin de reactivos para PCR Los reactivos utilizados pueden ser adquiridos comercialmente o pueden ser preparados como se describe a continuacin:

1. Buffer PCR 10X KCl 500 Mm Gelatina 0,1% Tris-HCl 100 mM (pH 8,3)

Este buffer forma parte del Kit Taq polimerasa y puede presentar variaciones segn la marca comercial.

2. Cl2Mg 25 50 mM Este reactivo forma parte del equipo de reaccin de la Taq polimerasa

3. Nucletidos trifosfatos Reactivo de stock Set de dATP, dCTP, dGTP y dTTP 100 mM (c/u)

Reactivo de trabajo Mezcla 2,5 mM de los cuatro nuclotidos Para 1000 l dATP dCTP dGTP dTTP H2O ddd 100 mM 100 mM 100 mM 100 mM 25l 25l 25l 25l 900l

4. Primers Se recomienda el uso de oligonuclotidos desalados. Para su reconstitucin seguir las indicaciones del fabricante. Llevar a una concentracin de trabajo de 0,1 nmol/l

88

5. Buffer Tris-EDTA (TE) 1X Tris- HCl 10 mM (pH 8) EDTA 1 mM (pH 8)

6. Buffer Tris-Acetato EDTA (TAE) Solucin concentrada 50X Por litro Tris base 242 g Acido actico glacial 0,5 M EDTA (pH 8) 57,1ml 100 ml

Solucin de trabajo 1X Se realiza una dilucin 1:50 de la solucin concentrada 50X.

7. Tritn X-100 al 1% en buffer TE 1X. Buffer TE 1X Tritn X-100 50 ml (estril) 0,5 ml

Dispensar el Tritn en el buffer TE 1X y mezclar enrgicamente

8. Buffer de siembra 1 Para 100 ml Glicerol 30% 30 ml

Xilene cyanol 0,25% 0,25 g Agua estril 70 ml

9. Buffer de siembra 2 Para 100 ml Glicerol 30% Azul de Bromofenol 0,25% Agua estril 30 ml 0,25 g 70 ml

10. BrEt (10mg/ml) Agregar 1 g de Bromuro de Etidio en 100 ml de agua. Mezclar con agitacin magntica hasta lograr la completa disolucin de la droga. Conservar a 4C en un frasco oscuro.

89

CAPITULO IV TECNICAS DIAGNOSTICAS EN CELULAS VERO

Las clulas Vero poseen una alta sensibilidad a las toxinas Shiga (Stx), y el ensayo de citotoxicidad utilizando esta lnea celular, es considerado la tcnica gold standard. Estas clulas poseen en su membrana plasmtica una alta concentracin de receptores Gb3 y Gb4, lo que permite detectar Stx1, Stx2 y sus variantes. Las tcnicas diagnsticas en clulas Vero se utilizan para determinar la produccin de Stx por los aislamientos bacterianos, para la deteccin de Stx libre en la materia fecal del paciente y para la deteccin de anticuerpos anti-Stx en el suero. Estas tcnicas son laboriosas, lentas y de alto costo, por lo que su uso est restringido a laboratorios de mayor complejidad, fundamentalmente a los laboratorios de referencia.

1.- Deteccin de Stx en clulas Vero 1.1.- Obtencin de la muestra Medios Caldo Penassay (Medio de Antibiticos N 3, Difco) PBS 0,2M (1X) pH 7,2 Sulfato de Polimixina B 8200 U/mg Cepa control de referencia E. coli O157:H7 C984 productor de Stx1 Cepa control de referencia E. coli O157:H7 1271-84 productor de Stx2

Materiales y equipamiento Tubos de vidrio de 30 ml Tubos de vidrio 13/100 con tapa a rosca Tubos de centrifuga de 16 ml Tubos de centrfuga de 50 ml Tubos Ependorff de 1,5 ml Erlenmeyer de 125 ml Probetas de 10 y 25 ml Pipeta descartable estril de 10 ml Unidad filtrante de 0,22 m Baja lengua Micropipeta rango: 200 -1000 l

90

Tips para micropipeta Estufa de cultivo Agitador orbital termoestatizado Centrfuga refrigerada Microcentrfuga

A) Extraccin de Stx a partir de aislamientos de Escherichia coli Procedimiento 1. Sembrar la cepa de E. coli en tubos de ensayo de 30 ml de capacidad, conteniendo 10 ml de caldo Penassay (Medio de Antibiticos N 3). Comentarios

2. Incubar a 37C por 18 h sin agitacin. 3. Transferir 1 ml del cultivo a un Erlenmeyer de 125 ml de capacidad, conteniendo 25 ml de caldo Penassay. Se utilizan Erlenmeyers de 125 ml de capacidad porque permiten establecer un sistema de cultivo (medio lquido/aire) ptimo para el desarrollo de la bacteria y la produccin de toxinas. 4. Incubar a 37C por 18 h, con agitacin a 140 rpm. 5. Centrifugar el cultivo en tubos de 50 ml a 8.000 rpm a 4C, durante 10 minutos. 6. Separar y conservar 5 ml del Las cepas STEC liberan las toxinas al medio de cultivo. La toxina Stx2 es producida y liberada al medio en forma continua durante la fase de crecimiento exponencial, mientras que la toxina Stx1 se acumula en el espacio periplsmico de la bacteria con liberacin al final de la fase exponencial. Por lo tanto, el efecto citotxico del sobrenadante de cultivo es debido principalmente a la Stx2.

sobrenadante en un tubo estril. Esta muestra se identifica como Sbte.

91

7. Desechar el sobrenadante restante y retener el pellet celular en el tubo de centrfuga. 8. Resuspender el pellet en 1 ml de PBS 1X.

9. Pasar la suspensin a un tubo Ependorff y centrifugar a 10.000 rpm a temperatura ambiente, durante 2 minutos. 10. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de PBS 1X. 11. Centrifugar con las condiciones del punto 9 y repetir 2 veces los pasos 10 y 11. 12. Descartar el sobrenadante del tercer lavado y resuspender el pellet en 1 ml de una solucin de Sulfato de Polimixina B en PBS (0,1mg/ml). El antimicrobiano Polimixina B es utilizado para lisar la bacteria y liberar la toxina retenida en el espacio periplsmico de la bacteria. El efecto citotxico del pellet es debido principalmente a Stx1. Se debe preparar para realizar los puntos 12 y 13, un volumen de 3 ml por muestra de la solucin de Sulfato de Polimixina B en PBS (0,1mg/ml). 13. Pasar la suspensin a un tubo de centrifuga de 16 ml de capacidad y agregar 2 ml de la solucin de Sulfato de Polimixina B en PBS (0,1mg/ml). 14. Incubar a 37C por 30 minutos con agitacin. 15. Centrifugar a 10.000 rpm, a 4C durante 2 minutos.

92

16. Conservar 5 ml del sobrenadante en un tubo estril y descartar el pellet. El sobrenadante se identifica como Pellet. 17. Filtrar las muestras de Sbte y Pellet con unidad filtrante de 0,22 m y conservar a -20C hasta la realizacin del ensayo de citotoxicidad.

La denominacin de esta muestra como Pellet se debe a que, proviene del producto de la lisis del pellet bacteriano.

Referencia Karmali MA, Petric M, Lim C, Cheung R, Arbus GS. Sensitive method for detecting low numbers of verotoxin-producing Escherichia coli in mixed cultures by use of colony sweeps and polymyxin extraction of verotoxin. J. Clin. Microbiol. 1985; 22: 614-9.

B) Extraccin de Stx de Materia Fecal (StxMF) Procedimiento 1. Suspender y homogenizar 1 g de materia fecal en 3 ml de PBS 1X. Comentarios Tomar 1 ml de la materia fecal si tiene consistencia lquida y resuspender en 2 ml de PBS. 2. Centrfugar a 8.000 rpm, a 4C durante 15 minutos 3. Filtrar el sobrenadante con unidad filtrante de 0,22 y conservar a -20C hasta la realizacin del ensayo.

1.2-Ensayo de citotoxicidad Se utiliza la tcnica de cultivo de clulas Vero en microplacas.

Medios Microplaca Nunclon de 96 hoyos con 100 l/hoyo de una suspensin de 1,4x105 clulas Vero, en el medio 199 adicionado con 7% de suero fetal bovino (SFB) y gentamicina (50 g/ml). Medio 199 sin el agregado de suero fetal bovino (SFB) Solucin de cristal violeta (0,75%) en 40% de metanol.

93

Cepa control de referencia E. coli O157:H7 C984 productor de Stx1 Cepa control de referencia E. coli O157:H7 1271-84 productor de Stx2 Extracto de materia fecal control positivo para StxMF

Materiales y equipamiento Micropipeta rango: 5 - 40 l Micropipeta rango: 40 - 200 l Micropipeta multicanal de 8 canales rango: 40 - 200 l Tips para micropipetas Microplaca Nunclon de 96 hoyos y estril Microscopio ptico invertido Estufa con 5% de CO2

A) Tamizaje para la deteccin de citotoxicidad por Stx de cepas STEC y por StxMF Procedimiento 1. Observar en el microscopio ptico invertido el estado de la monocapa de clulas Vero. 2. Sembrar por duplicado 25 y 50 l por hoyo del Sbte y Pellet de cada una de las cepas problema y de cepas de referencia. 3. Sembrar 25 y 50 l de los extractos de materia fecal y del extracto control positivo. 4. Incubar la microplaca a 37C en estufa con 5% de CO2. Introducir la placa en su envoltorio original o en un sobre de nylon para evitar En cada ensayo se debe utilizar como control un extracto positivo para StxMF. Comentarios Verificar que la monocapa sea continua uniforme, de morfologa normal y libre de contaminaciones con aumentos de 40x y 100x. Realizar un esquema de la microplaca indicando donde se siembra cada muestra.

contaminaciones. 5. Realizar lecturas diarias observando la microplaca invertido. con el microscopio A las 72 h se determina la actividad citotxica evidenciada por alteraciones de la monocapa (clulas redondeadas y encogidas, muchas flotando libres en el medio de cultivo).

94

6. Descartar el contenido de las placas a las 72 h de incubacin en un recipiente con lavandina. 7. Teir las clulas con solucin de cristal violeta 0,75% en metanol 40% y confirmar que hoyos presentan el efecto citotoxico caracterstico producido por Stx. Para teir las clulas se agregan 50 l por hoyo de la solucin de cristal violeta. Se deja a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se lava con abundante agua. La tincin es una coloracin vital. Las clulas vivas se tien de color violeta mientras que las clulas daadas y muertas por el efecto citotxico no captan el colorante.

95

B) Titulacin de la actividad citotxica por Stx de cepas con tamizaje positivo Procedimiento 1. Realizar diluciones al medio de las muestras positivas en medio 199 sin SFB. Incluir en cada ensayo extractos de cepas de referencia productoras de Stx1 y Stx2 y medio Penassay. Comentarios Seguir el siguiente procedimiento para preparar las diluciones de las muestras positivas y de las cepas de referencia en forma seriada: Realizar dos diluciones 1:10 y 1:100 de las muestras en el medio 199 sin SFB en tubos de vidrio. Colocar con micropipeta multicanal, 100 l de medio 199 sin SFB en toda la microplaca Nunclon de 96 hoyos. Sembrar 100 l de las dilucines 1:100 de cada una de las muestras en la columna 1 (hoyos A-H). Mezclar 10 veces el contenido de la primera columna con micropipeta multicanal de 8 canales y con los mismos tips transferir 100 l a la columna 2. Utilizando los mismos tips repetir el paso 4 para la columnas 2 hasta la 12. Transferir con micropipeta multicanal, 100 l de cada columna a la microplaca Nunclon de 96 hoyos con clulas Vero. Reservar las posiciones A-12 y B-12 para agregar a las clulas Vero 100 l de caldo Penasay como control de clulas. 2. Incubar la microplaca a 37C en estufa con 5% de CO2. Introducir la placa en su envoltorio original o en un sobre de nylon para evitar

contaminaciones.

96

3. Realizar lecturas diarias observando la microplaca invertido. con el microscopio

A las 72 h se determina el ttulo de la actividad citotxica.

El ttulo es igual a la inversa de la dilucin ms alta que presenta destruccin en el 50% de la monocapa. Esta dilucin se considera una unidad citotxica 50% (DC50)

Ejemplo: 51200 = 1 unidad DC50 25600 = 2 unidades DC50 12800 = 4 unidades DC50 4. Descartar el contenido de las placas a las 72 h de incubacin, en un recipiente con lavandina. 5. Teir las clulas con solucin de cristal violeta 0,75% el en ttulo metanol de la 40% y

confirmar citotxica.

actividad

1.3. - Ensayo de especificidad para detectar StxMF Se utiliza la tcnica de neutralizacin en clulas Vero, empleando anticuerpos monoclonales a-Stx1 y a-Stx2

Medios Microplaca Nunclon de 96 hoyos con 100 l/hoyo de una suspensin de 1,4x105 clulas Vero, en el medio 199 adicionado con 7% de suero fetal bovino (SFB) y gentamicina (50 g/ml). Medio 199 sin el agregado de suero fetal bovino (SFB) Solucin de cristal violeta (0,75%) en 40% de metanol. Extractos de materia fecal control positivo para Stx1MF y Stx2MF

97

Anticuerpos monoclonales MAb 13C4 (a-Stx1) MAb C5BB12 (a-Stx2) Los anticuerpos fueron suministrados por la Dra. Nancy Strockbine, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga, USA.

Materiales y equipamiento Micropipeta rango: 5 - 40 l Micropipeta rango: 40 - 200 l Tips para micropipetas Microplaca Nunclon de 96 hoyos Microscopio ptico invertido Estufa de cultivo Estufa con 5% de CO2 Comentarios Para calcular el volumen necesario de Mab que se debe preparar hay que tener en cuenta que se utilizan 50 l de cada MAb por extracto de materia fecal 2. Colocar 50 l del extracto de materia fecal en tres hoyos de la microplaca Nunclon. 3. Colocar 50 l del extracto de materia fecal, control positivo para Stx1MF en tres hoyos de la microplaca Nunclon. 4. Colocar 50 l del extracto de materia fecal, control positivo para Stx2MF en tres hoyos de la microplaca Nunclon. 5. Mezclar 50 l del MAb a-Stx1 en el primer hoyo, 50 l del MAb a-Stx2 en el segundo hoyo y 50 l del medio 199 sin SFB en el tercer hoyo. En cada ensayo se deben utilizar como controles, extractos de materia fecal

Procedimiento 1. Realizar una dilucin 1:250 para a-Stx1 y 1:100 para a-Stx2 en el medio 199 sin SFB

positivos para Stx1 y Stx2.

98

6. Incubar en estufa a 37C durante 2 h.

Durante

la

incubacin,

el

anticuerpo

monoclonal neutraliza especficamente la actividad citotxica. 7. Transferir 90 l del contenido de los hoyos a una microplaca Nunclon con clulas Vero. 8. Incubar la microplaca a 37C en estufa con 5% de CO2. 9. Descartar el contenido de las placas a las 72 h de incubacin, en un recipiente con lavandina. 10. Teir las clulas con solucin de cristal violeta 0,75% en metanol 40%. Introducir la placa en su envoltorio original o en un sobre de nylon para evitar

contaminaciones.

99

11. Se determina el tipo de Stx por neutralizacin de la actividad citotxica por el MAb correspondiente.

Si hay Stx libre en la materia fecal la actividad citotxica se neutraliza con el MAb especfico y las clulas permanecen vitales y coloreadas despus de la tincin.

En la siguiente tabla se indican los posibles resultados: Hoyo 1


MF + a-Stx1

Hoyo 2
MF + a-Stx2

Hoyo 3
MF Resultado

CV CM CV y M* CV CM

CM CV CV y M* CV CM

CM CM CM CV CM

Stx1MF Stx2MF Stx1/2MF Negativo


Inespecfico

CV: Clulas vivas coloreadas CM: Clulas muertas no coloreadas


CV y M: Clulas vivas y muertas

*El

efecto

citotxico

que

se

neutraliza

corresponde a la toxina del MAb especfico agregado. Por lo tanto, en estos hoyos se puede observar un efecto citotxico residual

correspondiente a la toxina no especfica sin neutralizar. Si se obtienen resultados como Stx1/2MF o Inespecfico se los debe confirmar con el siguiente procedimiento.

100

12. Realizar las siguientes diluciones de los MAbs en el medio 199 sin SFB

MAb

Dilucin

Vol. medio 50 l 50 l 50 l

a-Stx1 a-Stx2 a-Stx1/a-Stx2

1:250 1:100 1:250/1:100

13. Colocar 50 l del extracto de materia fecal en cuatro hoyos de la microplaca Nunclon. 14. Mezclar 50 l del MAb a-Stx1 en el primer hoyo, 50 l del MAb a-Stx2 en el segundo hoyo, 50 l de la dilucin de los MAbs a-Stx1/a-Stx2 en el tercer hoyo y 50 l del medio 199 sin SFB en el cuarto hoyo. 15. Incubar en estufa a 37C durante 2 h. Durante la incubacin, el anticuerpo

monoclonal neutraliza especficamente la actividad citotxica. 16. Transferir 90 l del contenido de los tres hoyos a una microplaca Nunclon con clulas Vero. 17. Incubar la microplaca a 37C en estufa con 5% de CO2. 18. Descartar el contenido de las placas a las 72 h de incubacin, en un recipiente con lavandina. 19. Teir las clulas con solucin de cristal violeta 0,75% en metanol 40%. Introducir la placa en su envoltorio original o en un sobre de nylon para evitar

contaminaciones.

101

20. Determinar de acuerdo a las siguientes observaciones, si el efecto sobre las clulas Vero es debido a la actividad de las dos toxinas presentes en la materia fecal o es un efecto citotxico

Si hay Stx1/Stx2 libre en la materia fecal la actividad citotxica de cada una de ellas se neutraliza con el MAb especfico. En los dos primeros hoyos el efecto citotxico que se neutraliza corresponde a la toxina del MAb especfico agregado (CV) y el efecto

inespecfico.

citotxico residual corresponde a la toxina no


Hoyo 1 MF + a-Stx1 Hoyo 2 MF + a-Stx2 Hoyo 3 MF + a-Stx1 + a-Stx2 CV y M CV y M CV CM Stx1/Stx2 MF CM CM CM CM Inespecfico Hoyo 4 MF Rdo.

especfica sin neutralizar (CM). En cambio en el tercer hoyo al agregar conjuntamente el Mab a-Stx1 y a-Stx2 se neutraliza el efecto de ambas toxinas y las clulas permanecen vivas y coloreadas. Si en el tercer hoyo no se observa neutralizacin y las clulas permanecen muertas no coloreadas, el efecto observado no

CV: Clulas vivas coloreadas CM: Clulas muertas no coloreadas CV y M: Clulas vivas y muertas

es debido a la accin de las toxinas sino que es un efecto inespecfico.

2.- Deteccin de Anticuerpos anti-toxina Shiga (a-Stx) Medios Microplaca Nunclon de 96 hoyos con 100 l/hoyo de una suspensin de 1,4x105 clulas Vero, en el medio 199 adicionado con 7% de suero fetal bovino (SFB) y gentamicina (50 g/ml). Medio 199 sin el agregado de suero fetal bovino (SFB) Solucin de cristal violeta (0,75%) en 40% de metanol. Extracto previamente titulado de la cepa control de referencia E. coli O157:H7 C984 productor de Stx1 (Pellet) Extracto previamente titulado de la cepa control de referencia E. coli O157:H7 1271-84 productor de Stx2 (Sbte) Suero control negativo: pool de sueros negativos para a-Stxs

102

Materiales y equipamiento Micropipeta rango: 5 - 40 l Micropipeta multicanal 12 canales rango: 40 - 200 l Tips para micropipetas Microplaca Nunclon de 96 hoyos estril Microscopio ptico invertido Estufa de cultivo Estufa con 5% de CO2

Procedimiento 1. Preparar diluciones correspondientes a 4 DC50 del Sbte de la cepa de referencia para Stx2 y del Pellet de la cepa de referencia para Stx1.

Comentarios Los extractos bacterianos de las cepas de referencia deben ser previamente titulados para determinar la dilucin correspondiente a 4 DC50. control basal,

2. Preparar

un

suero

El suero control basal negativo se prepara mezclando volmenes iguales de sueros negativos para a-Stx. El pool de sueros debe ser fraccionado en alcuotas y conservado a -20C

negativo para a-Stx

103

3. Realizar diluciones seriadas al medio y por duplicado (para la deteccin de aStx1 y a-Stx2) de los sueros de los pacientes y del suero control basal negativo, en una microplaca estril, partiendo de una dilucin 1:4 y llegando a 1:128.

Continuar con el siguiente procedimiento para diluir en forma seriada las muestras de sueros de los pacientes y del suero control basal negativo: 1. Colocar 75 l del medio 199 sin SFB en la Fila A, 50 l en las filas B hasta G, y 100 l en la fila H. 2. Agregar 25 l de la muestra 1 de suero en los hoyos A1 y A7, 25 l de la muestra 2 en A2 y A8, etc. (dilucin 1:4). 3. Mezclar 10 veces el contenido de la fila A con micropipeta multicanal de 12 canales. Transferir 50 l a la fila B. 4. Utilizando los mismos tips repetir el paso 3 para la fila B hasta la F, de la cual se descartan 50 l luego de mezclar bien. 5. La fila G queda con 50 l y la fila H con 100 l de medio 199 sin SFB.

4. Agregar 50 l del extracto (Pellet) de Stx1 en el sector comprendido entre las columnas 1 a 6 y la fila A a la G.

Se

producir

neutralizacin

del

efecto

citotxico de Stx1 si el suero del paciente posee anticuerpos a-Stx1. Este efecto

neutralizante disminuye en las diluciones sucesivas del suero. 5. Agregar 50 l del extracto (Sbte) de Stx2 en el sector comprendido entre las columnas 7 a 12 y la fila A a la G. Se producir neutralizacin del efecto

citotxico de Stx2 si el suero del paciente posee anticuerpos a-Stx2. Este efecto

neutralizante disminuye en las diluciones sucesivas del suero. 6. Incubar en estufa a 37C por 2 h.

104

7. Transferir 90 l de la mezcla contenida en cada uno de los hoyos, a una microplaca con un cultivo en monocapa de clulas Vero.

La fila G es el control del efecto citotxico (Clulas Vero + medio 199 sin

SFB+extractos de toxinas). La fila H es el control de la clulas Vero (Clulas Vero + medio 199 sin SFB)

8. Incubar a 37C en estufa con 5% de CO2 durante 72 h.

Introducir la placa en su envoltorio original o en un sobre de nylon para evitar

contaminaciones. 9. Realizar una primera lectura a las 72 h de incubacin en el microscopio Interpretacin de resultados: se considera que un suero tiene proteccin cuando la monocapa est intacta. El ttulo est dado por la inversa de la dilucin en la que se observa 50% de destruccin de la monocapa. Se comienza con la lectura del ttulo (a-Stx1 y aStx2) para el suero control basal negativo. El ttulo del mismo vara de acuerdo al nivel basal de anticuerpos de la poblacin en estudio y de variaciones propias del ensayo. Se considera que un suero es positivo para aStx1 o/y a-Stx2 cuando los ttulos son mayores a los ttulos ledos para el suero control basal negativo. En la fila G y en la fila H se debe observar destruccin de la monocapa de clulas y clulas intactas, respectivamente. 10. Descartar el contenido de las placas en un recipiente con lavandina. 11. Teir las clulas con solucin de cristal violeta 0,75% en metanol 40%. 12. Realizar una segunda lectura en el microscopio invertido. Referencia
Karmali MA. Infection by verotoxin-producing Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 1989; 2: 15-37.

invertido

Confirmar el ttulo determinado en la primera lectura.

105

CAPITULO V - MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS


Medio de transporte Cary Blair

Composicin: Para 1000 ml Tioglicolato de sodio Fosfato disdico Cloruro de sodio Agar pH final a 25 C

1,5 g 1,1 g 5,0 g 5,0 g 8,0 0,5

Preparacin: 1. Disolver 12,6 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Calentar a ebullicin hasta disolucin completa. 3. Dispensar 3 ml del medio en tubos 13/100 con tapa bacteriolgica. 4. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 5. Conservar a 4C. Agar MacConkey sorbitol (SMAC) Medio selectivo y diferencial empleado para el aislamiento de Escherichia coli O157:H7 Composicin: Para 1000 ml Peptona Sorbitol Sales biliares N3 Cloruro de sodio Rojo neutro Cristal violeta Agar pH final a 25 C

20 g 10 g 1,5 g 5 g 0,03 g 0,001 g 15 g 7,1 0,2

Preparacin: 1. Resuspender 51,5 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 3. Dejar enfriar hasta una temperatura de 50C 4. Mezclar para homogenizar el medio 5. Dispensar aproximadamente 20 ml del medio por cada placa. 6. Conservar a 4C 7. Secar el agar en un rea estril, antes de usar. Recomendacin: No calentar el medio a ebullicin antes de autoclavar. El calentamiento excesivo destruye el sorbitol.

106

Medio Cromognico CHROMAgar O157 Medio con cromgeno especfico para detectar E. coli O157 Preparacin: 1. Disolver el polvo comercial (un envase) en un volumen de agua destilada estril fra. Utilizar el volumen de agua indicado por el fabricante. 2. Calentar a ebullicin hasta disolucin completa. Se debe tener la precaucin de no excederse en el tiempo de calentamiento. 3. Homogenizar el medio. 4. Transferir los frascos a un bao de agua a 50 C. 5. Dispensar aproximadamente 20 ml del medio por cada placa, evitando la formacin de burbujas. 6. Conservar a 4 C, protegidos de la luz, preferentemente envueltos en papel metalizado. 7. Secar el agar en un rea estril antes de usar.

Medio Cromognico Agar O157:H7 ID (bioMerieux) Medio con cromgeno especfico para detectar E. coli O157:H7, basado en la deteccin de la actividad de dos enzimas: - D galactosidasa y - D glucuronidasa.

Preparacin: 1. Abrir suavemente sin destapar el frasco de agar. 2. Fundir el agar a bao mara hirviente hasta disolucin. 3. Homogenizar despus del cierre de la tapa. 4. Transferir los frascos a un bao de agua a 50 C. 5. Dispensar aproximadamente 20 ml del medio por cada placa, evitando la formacin de burbujas. 6. Conservar a 4 C, protegidos de la luz, preferentemente envueltos en papel metalizado. 7. Secar el agar en un rea estril antes de usar. Caldo Tripticasa de soja (CTS) Medio utilizado para fines generales para el cultivo de microorganismos fastidiosos y no fastidiosos. Composicin: Para 1000 ml Triptona Soitona Dextrosa Cloruro de sodio Fosfato dipotsico pH final a 25 C

17 g 3 g 2,5 g 5 g 2,5 g 7,3 0,2

Preparacin: 1. Disolver 30 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Dispensar el medio de acuerdo al uso. 3. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 4. Conservar en la heladera.

107

Caldo Tripticasa de soja con cefixime-telurito (CT-CTS) Medio selectivo y diferencial empleado para el aislamiento de Escherichia coli O157:H7 Composicin: Para 1000 ml CTS estril Cefixima Telurito de potasio

1000 ml 0,05 mg 2,5 mg

Preparacin: 1. Preparar el CTS, esterilizar y dejar enfriar a temperatura ambiente. 2. Agregar cefixima y telurito al medio. 3. Mezclar para homogenizar. 4. Dispensar el medio de acuerdo al uso. 5. Conservar a 4C. Caldo GN, Hajna Medio base empleado para el aislamiento y el cultivo de microorganismos gram negativos Composicin: Para 1000 ml Digerido pancretico de casena Peptona de proteosa N3 Dextrosa D-Manitol Citrato desodio Desoxicolato de sodio Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico Cloruro de sodio pH final:

12 g 8 g 1 g 2 g 5 g 0.5 g 4 g 1,5 g 5 g 7,0 0,2

Preparacin:
1. 2. 3. 4. Disolver 39 g del polvo en un litro de agua destilada. Dispensar el medio de acuerdo al uso. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Conservar en la heladera.

Agar Tripticasa de soja (TSA)

Medio utilizado para fines generales para el cultivo de microorganismos fastidiosos y no fastidiosos. Composicin: Para 1000 ml Triptona Soitona Cloruro de sodio Agar pH final a 25 C

15 g 5 g 5 g 15 g 7,3 0,2

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Preparacin: 1. Disolver 40 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Calentar a ebullicin hasta disolucin completa. 3. Dispensar el medio de acuerdo al uso. 4. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 5. Conservar a 4C.

Agar para conservacin

Medio utilizado para conservar microorganismos no fastidiosos. Composicin: Para 1000 ml CTS 1000 ml Agar 8g Preparacin: 1. Preparar el CTS y agregar el agar. 2. Calentar a ebullicin hasta disolucin completa. 3. Dispensar el medio de acuerdo al uso. 4. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 5. Conservar a 4C. Procedimiento: 1. Sembrar el aislamiento en el vial con agar. 2. Incubar a 37 durante 18C. 3. Conservar el vial sembrado a 4C. 4. Realizar una vez por mes, un repique un nuevo vial para mantener viable al microorganismo. Solucin salina buferada estril (PBS) Composicin: Solucin concentrada 10X Para 1000 ml Cloruro de sodio Cloruro de potasio Fosfato cido disdico anhidro (Na2HPO4 PM 142,1) Fosfato dicido monopotsico (KH2 PO4) pH final a 25 C Solucin de trabajo 1X Se realiza una dilucin 1:10 de la solucin concentrada 10X.

80 g 2 g 11,5 g 2 g 7,3 0,2

Preparacin: 1. Disolver los componentes de la solucin concentrada 10X en 1000 ml de agua destilada. 2. Esterilizar la solucin 10X, en autoclave a 121C, durante 15 minutos. 3. Realizar una dilucin 1:10 de la solucin 10X. 4. Esterilizar la solucin 1X, en autoclave a 121C, durante 15 minutos.

109

Solucin fisiolgica Composicin: Para 1000 ml Cloruro de sodio 8,5 g pH final a 25 C 7 0,2 Preparacin: 1. Disolver el cloruro de sodio en un litro de agua destilada. 2. Dispensar la solucin de acuerdo al uso. 3. Esterilizar en autoclave a 121C, durante 15 minutos. Buffer Tween 20 al 0,05% en buffer PBS 1X estril Buffer de lavado utilizado en la tcnica de separacin inmunomagntica. Composicin: Para 10 ml PBS 1X estril Tween 20

99.5 ml 0.5 ml

Preparacin: 1. Disolver 0.5 ml de Tween 20 en 99,5 ml de PBS 1X estril. Recomendacin: Preparar el buffer inmediatamente antes de su uso. Solucin fisiolgica formolada 1% V/V Se utiliza para inactivar cultivos de bacterias Composicin: Para 100 ml Solucin fisiolgica estril Formol 40% V/V

97,5 ml 2,5 ml

Preparacin: 1. Mezclar 2,5 ml de formol 40% V/V con 97,5 ml de Solucin fisiolgica estril. 2. Conservar a temperatura ambiente. Medio de Craigie Se utiliza para la estimulacin de la movilidad y expresin del antgeno flagelar. Composicin: Para 1000 ml Caldo nutritivo Extracto de levadura Cloruro de sodio Nitrato de potasio Agar

8 2 5 1 3

g g g g g

110

pH final a 25 C 7,6 0,2 Preparacin: 1. Disolver los componentes en un litro de agua destilada. 2. Calentar a ebullicin hasta disolucin completa. 3. Dispensar 5 ml por tubo de ensayo. 4. Colocar varilla de vidrio central. 5. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 6. Conservar a 4C. Recomendacin: Se utiliza varilla de vidrio hueca de 0,6 cm de dimetro por 5 cm de largo aproximadamente. El medio debe cubrir la mitad inferior del largo de la varilla, quedando libre el extremo superior.

Agar base triptosa con glbulos rojos lavados (AGRL) y sin lavar (AGRSL)

Estos medios se utilizan para la deteccin de la enterohemolisina de EHEC. Se emplean placas con agar base triptosa suplementado con 10 mM de cloruro de calcio y 5% de sangre desfibrinada de cabra u oveja, previamente lavada tres veces con solucin salina buferada esteril pH 7,2. (AGRL) y como control se emplean placas de agar con 5% de sangre desfibrinada de oveja, sin lavar y sin el agregado de cloruro de calcio. (AGRSL)

Placa de AGRL Composicin: Para 20 ml de agar (una placa) Agar Base triptosa (TBA) Agar TSA Cloruro de calcio 1M Glbulos rojos lavados (GRL) de sangre desfibrinada de cabra u oveja Recomendacin: Se debe emplear sangre fresca, de no ms de 10 das de extrada. Preparacin de la placa AGRL: 1. Dispensar el medio de TSA en cada placa de Petri y dejar solidificar. 2. Mantener el medio de TBA a 50C. 3. Agregar el Cloruro de calcio al TBA y homogeneizar. 4. Incorporar el volumen necesario de GRL al TBA. 5. Mezclar suavemente con movimientos circulares. 6. Agregar el agar TBA con los GRL en las placas de Petri con TSA. 7. Identificar a las placas como placas de ensayo. 8. Conservar a 4C. 9. Utilizar dentro de los 15 das posteriores a su preparacin.

10 ml 10 ml 0,1 ml 0,5 ml

111

Placa de AGRSL Composicin: Para 15 ml de agar (una placa) Agar Base triptosa (TBA) Glbulos rojos sin lavar (GRSL) de sangre desfibrinada de cabra u oveja Recomendacin: Se debe emplear sangre fresca, de no ms de 10 das de extrada. Preparacin de la placa AGRSL: 1. Mantener el medio de TBA a 50C. 2. Incorporar el volumen necesario de GRSL al TBA. 3. Mezclar suavemente con movimientos circulares. 4. Dispensar el agar TBA con los GRSL en las placas de Petri. 5. Identificar a las placas como placas controles. 6. Conservar a 4C. 7. Utilizar dentro de los 15 das posteriores a su preparacin.

15 ml 0,75 ml

Preparacin de los componentes de las placas de AGRL y AGRSL TBA Composicin: Para 1000 ml Triptosa 10 g Extracto de carne 3 g Cloruro de sodio 5 g Agar 20 g

Preparacin:
1. 2. 3. 4. 5. Disolver los componentes en un litro de agua destilada. Calentar a ebullicin hasta disolucin completa. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Dejar enfriar. Mantener en bao de agua termoestatizado a 50C para la preparacin de las placas de AGRL y AGRSL

Cloruro de calcio 1M Composicin: Para 10 ml

Cloruro de calcio Preparacin:

1,11 g

1. Disolver el cloruro de calcio en 10 ml de agua destilada. 2. Esterilizar con unidad filtrante de 0,22 m. 3. Conservar el cloruro de calcio 1M a temperatura ambiente para la preparacin de la placa de

112

AGRL

Obtencin de GRL de sangre desfibrinada de cabra u oveja. Preparacin:


1. Centrifugar 5 ml de sangre desfibrinada de cabra u oveja a 2500 rpm por 10 minutos. 2. Desechar el plasma 3. Resuspender suavemente con micropipeta, 1 volumen de glbulos rojos en 2 volmenes de solucin salina buferada esteril pH 7.2. Se debe obtener una suspensin homognea sin romper los glbulos rojos. 4. Centrifugar a 2500 rpm por 10 minutos. 5. Repetir 2 veces los pasos 2, 3 y 4. 6. Desechar el sobrenadante. 7. Guardar el paquete globular para la preparacin de la placa AGRL Obtencin de GRSL de sangre desfibrinada de cabra u oveja. Preparacin: 1. Centrifugar 5 ml de sangre desfibrinada de cabra u oveja a 2500 rpm por 10 minutos. 2. Desechar el plasma. 3. Guardar el paquete globular para la preparacin de la placa AGRSL

Medio agar hierro tres azcares (TSI)

Composicin: Para 1000 ml: Peptona Cloruro de sodio Lactosa Sacarosa Glucosa Sulfato amnico ferroso Tiosulfato de sodio Rojo de fenol Agar pH final a 25 C

20 g 5 g 10 g 10 g 1 g 0,2 g 0,2 g 0,025 g 13 g 7,3 0,2

Preparacin: 1. Resuspender 65 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Calentar a ebullicin hasta disolucin completa. 3. Fraccionar 4 o 5 ml del medio en tubos 13/100 con tapa bacteriolgica. 4. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 5. Solidificar en forma de pico de flauta para obtener 2 cmaras de reaccin: fondo de 1 cm (anaerobiosis); pico (aerobiosis).

113

Agar citrato de Simmons

Composicin: Para 1000 ml Fosfato dicido de amonio Fosfato dipotsico


Cloruro de sodio Sulfato de magnesio Agar Azul de bromotimol Citrato de sodio pH final a 25 C

1 1

g g

5 g 0,2 g 15 g 0,08 g 5 g 6,8 0,2

Preparacin: 1. Resuspender 24,2 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Calentar a ebullicin hasta disolucin completa. 3. Fraccionar 4 o 5 ml del medio en tubos 13/100 con tapa bacteriolgica. 4. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 5. Solidificar en forma de pico de flauta permitiendo la formacin de una base profunda

Medio para sulfuro, indol, movilidad (SIM)

Composicin: Para 1000 ml Triptena Peptona Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato sdico Agar pH final a 25 C

20 g 6,1 g 0,2 g 0,2 g 3,5 g 7,3 0,2

Preparacin: 1. Resuspender 30 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Calentar a ebullicin hasta disolucin completa. 3. Fraccionar 4 o 5 ml del medio en tubos 13/100 con tapa bacteriolgica. 4. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 5. Solidificar en posicin vertical.

Medio para movilidad indol ornitina (MIO)

Composicin:
Para 1000 ml Extracto de levadura Peptona Triptona Hidrocloruro de L-ornitina 3 10 10 5 g g g g

114

Dextrosa Agar Prpura de bromocresol pH final a 25 C

1 g 2 g 0,02 g 6,5 0,2

Preparacin: 1. Resuspender 31 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Calentar a ebullicin hasta disolucin completa. 3. Fraccionar 4 o 5 ml del medio en tubos 13/100 con tapa bacteriolgica. 4. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 5. Solidificar en posicin vertical. Solucin al 1% del hidrato de carbono en el medio base Rojo Fenol Solucin para la prueba de fermentacin de azcares. Composicin: Para 10 ml Medio base Caldo Rojo Fenol estril Hidrato de carbono 10% estril

9 ml 1 ml

Preparacin: 1. Disolver 1 ml del hidrato de carbono 10 % en 9 ml de caldo Rojo Fenol estril. 2. Fraccionar 1 ml de la solucin en tubos estriles 13/100 con tapa bacteriolgica. 3. Conservar los tubos a 4C.

Caldo Rojo Fenol Medio base para la fermentacin de azucares


Composicin: Para 1000 ml Digerido pancretico de casena Cloruro de sodio Rojo fenol Ph final:

10 g 5 g 0,018 g 7,0 0,2

Preparacin: 1. Disolver 15 g del polvo en 1 litro de agua destilada. 2. Dispensar el medio de acuerdo al uso. 3. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 4. Conservar en heladera.

Solucin del hidrato de carbono (10% p/v)

Composicin: Para 10 ml Hidrato de carbono Preparacin:

1g

115

1. Disolver el hidrato de carbono en 10 ml de agua destilada estril. 2. Esterilizar con unidad filtrante de 0,22 m. 3. Conservar en heladera. Recomendacin: La solucin de dulcitol al 10% debe ser utilizada inmediatamente antes de su uso, dado que precipita el hidrato de carbono a 4C.

Lisina Hierro Agar (LIA)

Composicin:
Peptona Extracto de levadura Dextrosa Hidrocloruro de lisina-L Citrato amnico frrico Tiosulfato de sodio Prpura de bromocresol Agar pH final a 25 C 5 g 3 g 1 g 10 g 0,5 g 0,04 g 0,02 g 15 g 6,7 0,2

Preparacin: 1. Resuspender 34,5 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Calentar a ebullicin hasta disolucin completa. 3. Fraccionar 4 o 5 ml del medio en tubos 13/100 con tapa bacteriolgica. 4. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 5. Solidificar en forma de pico de flauta permitiendo la formacin de una base profunda.

Agar Mueller Hinton (MH)

Composicin: Para 1000 ml Infusin de carne Casaminocidos Almidn Agar pH final a 25 C Preparacin:
1. 2. 3. 4. 5.

300 g 17,5 g 1,5 g 17 g 7,2 0,2

Resuspender 38 g del polvo en un litro de agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Dejar enfriar hasta una temperatura de 50C Dispensar 25 ml del medio por cada placa para obtener una capa de 4 mm de espesor. Conservar a 4C. Las placas as conservadas pueden utilizarse hasta 4 das despus de su preparacin.

116

Caldo Penassay (Antibiotic mdium 3 Difco)

Composicin: Para 1000 ml Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Dextrosa Cloruro de sodio Fosfato monopotsico Fosfato dipotsico
Ph final a 25C

1,5 1,5 5 1 3,5 1,32 3,68


7,0 0,05

g g g g g g g

Preparacin: 1. Disolver 17,5 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Dispensar el medio de acuerdo al uso. 3. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. 4. Conservar en la heladera.

117

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