1.

Extraccin y cuantificacin de pigmentos: Se seleccion la mezcla de solventes etanol (polar) /hexano (apolar), ya que permite obtener la mayor eficiencia de extraccin de clorofilas y ficobiliprotenas y una alta eficiencia de extraccin de lpidos. Condiciones ptimas para la extraccin de pigmentos y lpidos: Temperatura (C): 45 C. Tiempo (h): 4 h. Relacin biomasa/solvente (g/ml): 10 g/ml. Pasos para la extraccin y cuantificacin de pigmentos: Para cada experimento: 3 g de biomasa seca. Seguidamente se agreg el solvente polar en una relacin de 1:10 g/ml. Luego la mezcla de biomasa-solvente fue sometida a agitacin magntica a 350 rpm y temperatura ambiente durante 24 horas. Seguidamente se realiz filtracin al vaco a la mezcla donde se cuantificaron los pigmentos en la fase lquida. La cuantificacin de pigmentos: Se realiz midiendo el espectro de absorcin (absorbancia A) de los extractos de la fase hidroalcohlica despus de la filtracin al vaco en un espectrofotmetro UV-visible (SpectroquantPharo 300 Merck) a 665, 650 y 620 nanmetros (nm). Posteriormente se aplicaron las ecuaciones 1-4 para calcular las concentraciones de los diferentes pigmentos en microalgas; donde Chl-a es la concentracin de clorofila a, Chl-b es la concentracin de clorofila b, PC es la concentracin de ficocianina y APC es la concentracin de aloficocianina en mg/L. Estas ecuaciones utilizadas fueron desarrolladas especficamente para el clculo de los pigmentos fotosintticos de microalgas. Los datos obtenidos de clorofilas y ficobiliprotenas fueron normalizados con el fin de descartar resultados errneos por dilucin de los componentes en un mayor volumen de solvente. ( ) ( ) ( )

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2. Para la extraccin de protenas: 10 ml de muestra (cultivo). Centrifugar 3400 rpm de 15 a 20 minutos. Descartar sobrenadante. Preparar NaOH 1 Molar (solubiliza protena). Agrego 1 ml de NaOH. Centrifugo 3400 rpm de 15 a 20 minutos. Caliento 5 minutos. Tomo sobrenadante le agrego reactivo (5 ml) por 30 minutos. Mido absorbancia a 540 nm.

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Preparacin del reactivo: (mtodo Biuret). a) Preparacin solucinNaOH 6M: - Disuelve 60 g de NaOH en agua destilada y se diluye a 250 ml. - Almacenar en un frasco de polietileno bien cerrado a temperatura ambiente. b) Preparacin reactivo Biuret: - Disolver 1,50 g de sulfato cobre (II) (CuSO4) en 250 ml de agua destilada. - Aadir 4,5 g de tartrato de sodio y potasio y 2,5 g yoduro potasio. - Despus que los slidos se ha disuelto, aadir 50 ml de NaOH 6 M a un volumen final de 500 ml con agua destilada. Almacenar en una botella cerrada a temperatura ambiente. Reactivo estable por 6 meses. c) Preparacin blanco del reactivo Biuret: - Preparar exactamente como b) omitiendo sulfato cobre (II). d) Solucin azida de sodio (NaN3): - Solucin acida de sodio 1,5 mM. Aadir 0,05 g de azida de sodio en 250 ml agua destilada. Diluir a un volumen final de 500 ml. e) Protena estndar: - Disolver 1 g en 7 ml de solucin azida de sodio. Diluir a 10 ml volumen final con solucin NaN3. f) Solucin estndar: - Diluir la protena estndar a 20, 40, 60, 50 y 100 g/L. mediante la adicin de cantidad de agua adecuada. El volumen de cada uno debe ser de 100 ml.

3. Hidrolisis cida para extraccin de azucares: 4. Para la separacin de los lpidos: - Se agreg a la fase lquida un volumen de 6 mL de solvente apolar y 4 mL de agua destilada con el fin de obtener una separacin de fases. Las cuales se llevaron a un embudo de decantacin y se extrajo la fase lipoflica, este proceso se repiti cuatro veces ms con el fin de asegurar una efectiva separacin del aceite de microalgas. Una vez terminada la separacin, se realiz un secado por volatilizacin con el fin de obtener el extracto lipdico. Teniendo ya seleccionado el solvente apolar para la extraccin de lpidos, sta se realiza por medio del mtodo Soxhlet. Se utiliza la biomasa proveniente de la etapa de extraccin de clorofilas y ficobiliprotenas. La biomasa es llevada al tubo Soxhlet, el cual se ubica sobre un baln aforado al que se le agrega el solvente apolar seleccionado y por calentamiento se extraen los lpidos de la biomasa, este procedimiento tarda 18 horas, quedando el extracto lipdico en el baln aforado junto con parte del solvente apolar, el cual es recuperado por destilacin simple, y el extracto lipdico se obtiene por volatilizacin del solventerestante en el baln.

Solvente Recuperado Biomasa, Residuo De filtracin. Extraccin Soxhlet Extracto + Solvente Remanente Recuperacin solvente (destilacin simple)

Solvente Remanente

Solvente + Extracto

Evaporacin y cuantificacin

Biomasa Residual

Extracto Lipdico