DEFINICION DE DOS LINAJES PRINCIPALES DE Trypanosoma rangeli EN LATINOAMERICA POR MARCADORES kDNA

Los parmetros biolgicos, bioqumicos y moleculares han demostrado polimorfismos entre cepas aisladas de Trypanosoma rangeli aisladas de diferentes vectores de triatominos (Triatominae) y huspedes vertebrados en distintas regiones geogrficas. (DAlessandro, 1976; Macedo et al., 1993; Steindel et al., 1994; Grisard et al., 1999). Minicirculos de ADN Trypanosomatido del cinetoplasto (kADN) presentan el mismo nmero de regiones conservadas en diferentes cepas de las mismas especies de parsitos. Como una excepcin a la organizacin de kDNA, T. rangeli presenta una variacin de tamao inesperado en los minicirculos con 1,6 y 1,8 kb (Vallejo et al., 1994). Adems, varios secuencias de minicirculos de T. rangeli secuencias clonados mostraron molculas con una regin conservada (KP1), dos regiones conservadas situadas en 180 (KP2) y cuatro regiones conservadas, que se encuentran a 90 (KP3) (Recinos et al, 1994;. Vallejo et al., 1994). Los primers S35 (5 -AAA TAA TGT ACG GGT GGA GAT GCA TGA-3) y S36 (5 -GGG TTC GAT TGG GGT TGG TGT-3) se disearon de las regiones conservadas del minicirculo de kDADN de T. cruzi descrito por sturm et al. (1989). Sin embargo, dado el alto grado de homologa entre las secuencias conservadas de T. cruzi y T. rangeli, estos primers tambin se hebraizaron con minicirculos de kADN de T.rangeli permitiendo la amplificacin de un fragmento de 760 pares de bases derivado de minicirculos de1600 pares de bases que tienen dos regiones conservadas y un grupo heterogneo de fragmentos que van desde hasta pares de bases con cuatro regiones conservadas (vallejo et al., 1999). El primer KP1L (5-ATA CAA CAC TCT CTA TAT CAG G-3) fue diseado para los minicirculos kADN de T. Rangel denominado minicirculo KP1(vallejo et al., 1999). Con el objetivo de obtener un producto de amplificacin del minicirculo KP1, el primer KP1L fue combinado con el primer s36 y un producto de 165 pares de bases obtenido solo de las cepas de T. rangeli aisladas de un husped de la casa R. prolixus o en cepas aisladas de reas donde R. proxilus es el vector de T. rangeli. De otra parte, la amplificacin de este producto no fue observado en cepas aisladas de R.colombiensis y en la cepa LMCI2 de panam y en cadenas aisladas de P.megistus. Una reaccin de cadena doble de polimerasa (PCR) fue diseado para el uso de los 3 primers (s35/s26/KP1L). Las amplificaciones se realizaron en un volumen final de 10 uL, que contiene 1uL de buffer de reaccin Taq polimerasa 10 (GIBCO-BRL), Una mezcla de 200 uM de dNTPs, 3.5 mM de MgCl2, 25 mM KCl, 25 uM de cada primer y 0.5 U de Taq ADN polimerasa (Gibco-BRL). La PCR se corri en un DNA Thermal Minicycler MJ Research PTC-150-16 y se someti a 35 ciclos de amplificacin. El perfil de temperatura para la desnaturalizacin, hibridacin y extensin del primer fue de 95 C durante 1 min (con un mayor tiempo inicial de 5 min), 60 C durante 1 min y 72 C por 1 min, respectivamente, y una extensin final de 5 min. Los productos de reaccin se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida al 6% y se tieron con el mtodo de nitrato de plata.

Los resultados se muestran en las Figs. 1 y 2. Las cepas aisladas de R. prolixus presente K1, KP2 KP3 y productos de amplificacin de los minicirculos. Por otro lado, las cepas aisladas de R. colombiensis o P. megistus presentan productos de amplificacin derivados de minicirculos KP2 y KP3, pero no de KP1. La caracterizacin de 37 cepas de kADN de T. rangeli KP1 con la sonda marcada con biotina y la amplificacin de minicirculos kADN por PCR es resumida en la Tabla 1. La primera indicacin de la presencia de KP1 en minicirculos en las cepas de T. rangeli aisladas de ciclos de transmicion domestica fue sealado por Macedo et al. (1993), Vallejo et al. (1994), usando tcnicas de hibridacin. Los autores observaron que la seal de minicirculos KP1 estaba presente en varias cepas de Colombia, Venezuela y Honduras, pero ausente en la cepa SC58, aislado de un roedor silvestre (Echimys dasythrix) del Estado de Santa Catarina, en el sur de Brasil. Utilizando la misma estrategia de hibridacin, el minicirculo KP1 estuvo ausente en las cepas de T. rangeli aisladas en Colombia de las glndulas salivares de R. colombiensis y cepas aisladas en Brasil a partir del intestino de P. megistus (Vallejo et al., Datos no publicados). Los datos obtenidos confirman que las cepas de T. rangeli KP1 (+) cepas se extienden por toda Colombia, Venezuela y los pases centroamericanos donde domstico R. prolixus est presente. Un mapa preciso de la distribucin de la cepa de T. rangeli KP1 (-) an no se ha establecido en america, este grupo se ha detectado en Brasil en el intestino del selvtico P. megistus y en sangre de Echimys dasythrix en el estado de Santa Catarina (Steindel et al ., 1991). La presencia de las cepas de T. rangeli KP1 (-) en el intestino de P. megistus sin invasin de la hemolinfa y de las glndulas salivales es un hecho comnmente observado en otros triatominos como se ha demostrado por D'Alessandro (1976), quien afirm que es posible encontrar T. rangeli en el intestino de varios vectores sin invasin de la hemolinfa y las glndulas salivales.