18 a 22 de maio de 2009 guas de Lindia/SP FZEA/USP-ABZ

ATIVIDADE DA GLUTATIONA-S-TRANSFERASE E CATALE DE PACUS ALIMENTADOS 1 COM NIVEIS CRESCENTES DE SELENIO E EXPOSTOS AO METL PARATION Leonardo Susumu Takahashi , Rodrigo Yukihiro Gimbo , Jaqueline Dalbello Biller , Marcos 4 2 2 Vinicius Saita , Daniel Nicodemo , Everlon Cid Rigobelo
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Parte do projeto de Ps-doutorado do primeiro autor, financiado pelo CNPq. Docente da Faculdade de Zootecnia da UNESP-Dracena, Dracena-SP. *e-mail: takahashi@dracena.unesp.br 3 Ps-graduao em Produo Animal, FCAV/UNESP-Jaboticabal, Jaboticabal-SP. 4 Ps-graduao em Aquicultura, CAUNESP, Jaboticabal-SP.

Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementao de selnio dietrio na atividade heptica das enzimas glutationa-S-transferase e catalase de juvenis de pacu expostos ao metil paration. Juvenis de pacu foram alimentados durante 65 dias, com dietas suplementadas com 0; 0,3; 0,6; 0,9 e 1,8 mg Se orgnico/kg. Aps o perodo de alimentao, 6 peixes/tratamento foram amostrados e o restante foi transferido para caixas de 100 L, nas quais foi adicionado o -1 metil paration (2,0 mg L ). Os peixes (6 peixes/tratamento) aps exposio ao metil paration por 24 horas, foram amostrados. A partir do macerado do fgado, foram determinadas as atividades das enzimas CAT e GST. Os resultados obtidos foram submetidos a ANOVA e comparao de mdias pelo Teste de Duncan (5%). A exposio ao metil paration causou aumento da atividade das enzimas e a suplementao com selnio orgnico melhorou as respostas hepticas ao estresse oxidativo. Entretanto, maiores estudos devem ser realizados para se definir o nvel ideal de suplementao de selnio, para evitar as conseqncias negativas do selnio. Palavraschave: estresse oxidativo, minerais, organofosforado, Piaractus mesopotamicus. Glutathione-S-transferase and catalase activity of pacu fed increasing levels of selenium and exposed to methyl parathion Abstract: The purpose of this work was to evaluate the effect of dietary selenium supplementation on hepatic activities of glutathione-S-transferase and catalase of pacu juveniles exposed to methyl parathion. Pacu juveniles were fed for 65 days, with diets supplemented with 0; 0,3; 0,6; 0,9 e 1,8 mg organic Se/kg. After feeding period, 6 fish/treatment were sampled and remained were -1 transferred to 100-L boxes, in which were added methyl parathion (2,0 mg L ). Fish (6 fish/treatment) after 24 h of methyl parathion exposition, were sampled. From liver macerate, CAT and GST activities were determined. Results were submitted to ANOVA and means were compared by Duncan`s test (5%). Methyl parathion exposition caused increase of enzymes activities and organic selenium supplementation improvement of hepatic answers against oxidative stress. However, other studies must be realized to determine ideal levels of selenium supplementation avoiding negative consequences. Keywords: minerals, organophosphate, oxidative stress, Piaractus mesopotamicus. Introduo Com a intensificao da piscicultura, as parasitoses que atacam os peixes causam grande reduo da produtividade, alm de provocar atraso no crescimento e alta mortalidade. Para evitar queda na produtividade, alguns pesticidas e inseticidas so indicados para o controle de pragas em tanques de aquicultura. Entretanto, o uso indiscriminado destes produtos, como o metil paration, podem resultar em poluio ambiental, contaminao dos peixes e outros organismos envolvidos na cadeia alimentar aqutica, alm do alto risco de intoxicao nos peixes (RANZANIPAIVA et al., 1997). Por se tratar de um antioxidante, o selnio, micromineral que apresenta estreita faixa de concentrao entre essencialidade e toxicidade, fornecido na dieta em concentraes adequadas pode resultar em bom desempenho produtivo e contribuir com os mecanismos enzimticos de defesa ao estresse oxidativo (LIN e SHIAU, 2005; MONTEIRO et al., 2009). 1

Em peixes, o estudo dos mecanismos de defesa antioxidante na proteo celular tem aumentado bastante e as alteraes nestes mecanismos de defesa podem ser usadas como biomarcadores de estresse oxidante de diferentes produtos nos organismos aquticos. O equilbrio entre as enzimas antioxidantes (SOD, CAT, GPx e GST) fundamental para a manuteno da integridade celular. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da suplementao de selnio dietrio na atividade heptica das enzimas catalase e glutationa-Stransferase em pacus expostos ao metil paration. Material e Mtodos O experimento foi conduzido no Laboratrio de Tilapicultura do Centro de Aquicultura da UNESP-Campus de Jaboticabal (CAUNESP). Foram utilizadas 20 caixas de polietileno, com capacidade para 100 L, dispostas num sistema de circulao fechado com fluxo contnuo de gua, composto por filtro biolgico e aerao forada por meio de compressores de ar radiais e pedras porosas. Os juvenis de pacu, obtidos da Seo de Hidrobiologia e Aquicultura de Jupi da Companhia Energtica de So Paulo (CESP-Castilho), aps aclimatao s condies laboratoriais por 12 dias, foram capturados, pesados, medidos e distribudos em 20 caixas de polietileno de 100 L, correspondentes aos cinco tratamentos com quatro repeties (caixas) por tratamento, na densidade de 13 peixes/caixa. Os peixes foram alimentados com as dietas experimentais durante 65 dias, em duas refeies dirias (09h00min e 17h00min), at a saciedade aparente. As dietas testadas foram isoproticas (27,3% PB), isoenergticas (4.080 kcal/kg), com suplementao vitamnica e mineral completa, isenta apenas da fonte de selnio, e com cinco nveis crescentes de suplementao de selnio na dieta (0; 0,3; 0,6; 0,9 e 1,8 mg Se/kg) na forma de selnio orgnico. Ao final do perodo de alimentao foram amostrados 4 peixes/caixa. Os peixes restantes foram transferidos para outras caixas de polietileno de 100 L com o fluxo de gua interrompido e a oxigenao mantida apenas por aeradores. Os peixes foram -1 expostos ao metil paration (MP), por 24 horas, na concentrao de 2,0 mg L (~1/3 da CL50). Aps a exposio foram amostrados 6 peixes/tratamento. Os animais amostrados foram laparotomizados para retirada e pesagem do fgado, que foi o armazenado a -70 C at a realizao das anlises da atividade da glutationa S-transferase e atividade da catalase. A atividade da GST foi determinada pelo produto formado pela complexao da glutationa reduzida (GSH) com o 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB), conforme metodologia de Keen e William (1976). A atividade da CAT foi quantificada atravs da metodologia descrita por Beutler (1975), que consiste em mensurar a atividade da CAT atravs do consumo de perxido de hidrognio (H2O2) exgeno, gerando oxignio e gua, atravs de espectofotometria ( = 240 nm). A concentrao de protena total no sobrenadante do homogeneizado dos tecidos foi determinada pela metodologia do biureto (Kit Labtest). O experimento foi conduzido num delineamento inteiramente casualizado com dez tratamentos em esquema fatorial 5x2 (cinco nveis de incluso de selnio e 2 amostragens) com quatro repeties cada. Os resultados obtidos foram submetidos a anlise de varincia sendo as mdias comparadas pelo teste de Duncan (5%). Resultados e Discusso Durante todo o experimento no foi observada mortalidade dos peixes. As variveis fsicoqumicas permaneceram dentro de faixas consideradas adequadas para a produo de peixes tropicais (concentrao de oxignio dissolvido = 6,2 0,1 mg/L, temperatura = 27,5 0,2 oC; concentrao de amnia total = 0,48 0,24 mg/L). A atividade da enzima glutationa-S-transferase (GST) dos juvenis de pacu est apresentada na Tabela 1. A suplementao de selnio orgnico na dieta nos nveis 0,3 e 0,6 mg/kg resultou no aumento da atividade heptica da GST, sendo superior a atividade observada nos peixes sem suplementao. Aps a exposio ao metil paration (MP), apenas os peixes que apresentavam atividade mais baixa antes da exposio (alimentados com as dietas suplementadas com 0,0 e 1,8 mg de selnio orgnico/kg) apresentaram aumento significativa na atividade da enzima.

Antes da exposio ao metil paration (MP) a alimentao com dietas com diferentes nveis de suplementao de selnio orgnico no resultou em diferenas significativas na atividade da enzima catalase (CAT), como mostra a Tabela 2. Entretanto, aps a exposio ao MP a suplementao de selnio orgnico em nveis superiores a 0,6 mg/kg resultou em aumento da atividade desta enzima. Os resultados observados sugerem que o metil paration induz estresse oxidativo em juvenis de pacu, como observado em matrinx Brycon cephalus, causando aumento na atividade heptica das enzimas CAT e GST (MONTEIRO et al., 2006). A suplementao das dietas com selnio orgnico na concentrao de 0,3 a 0,6 mg selnio/kg promoveram aumento na atividade da GST antes da exposio ao MP preparando o animal para este desafio. Aps a exposio, apenas os peixes alimentados com a dieta com 0,9 mg selnio/kg apresentaram atividade da GST heptica inferior a do grupo sem suplementao de selnio. A atividade da GST juntamente com a da CAT demonstram que a suplementao de Se na dieta em concentraes adequada pode promover efeito protetor ao estresse oxidativo pela manuteno da atividade das GST e aumento da CAT. Tabela 1. Atividade heptica da enzima glutationa-S-transferase (mU/mg de protena) em juvenis de pacu alimentados com as dietas experimentais por 65 dias.

Incluso de Se mg/kg 0,0 0,3 0,6 0,9 1,8

Glutationa-S-transferase Antes da exposio ao MP Aps a exposio ao MP 210,9 54,2 Cb 338,9 46,2 Aa 379,4 39,5 Aa 272,6 102,8 ABa 317,5 63,2 ABa 341,1 43,8 Aa 247,3 29,6 BCa 224,7 38,9 Ba 237,5 39,8 Cb 339,6 32,3 Aa

Valores so mdias DP. Letras diferentes, maisculas na coluna e minsculas na linha, indicam diferenas significativas (p<0,05). Tabela 2. Atividade heptica da enzima catalase (U/mg de protena) em juvenis de pacu alimentados com as dietas experimentais por 65 dias.

Incluso de Se mg/kg 0,0 0,3 0,6 0,9 1,8

Catalase Antes da exposio ao MP 4,1 0,9 Aa 3,5 0,6 Aa 4,1 0,8 Ab 4,8 0,8 Ab 4,5 1,0 Aa

Aps a exposio ao MP 3,9 0,4 Ba 3,9 0,3 Ba 5,6 1,8 ABa 5,9 1,7 Aa 4,9 0,3 ABa

Valores so mdias DP. Letras diferentes, maisculas na coluna e minsculas na linha, indicam diferenas significativas (p<0,05). Concluses Com base nos resultados obtidos, pode-se inferir que a exposio ao metil paration promove estresse oxidativo. A suplementao da dieta com selnio orgnico na concentrao de 0,6 mg/kg pode contribuir com o sistema antioxidante. Agradecimentos Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnolgico CNPq pela Bolsa de Ps-Doutorado concedida ao primeiro autor, Seo de Hidrobiologia e Aquicultura de Jupi da Companhia Energtica de So Paulo (CESP-Castilho) pela doao dos peixes, Alltech pelo fornecimento do Sel-Plex e ao CAUNESP pela infra-estrutura e suporte.

Literatura citada LIN, Y.H.; SHIAU, S.Y. Dietary selenium requirements of juvenile grouper, Epinephelus malabaricus. Aquaculture, v.250, n.1-2, p.356-363, 2005. MONTEIRO, D.A.; ALMEIDA, J.A.; RANTIN, F.T.; KALININ, A.L. Oxidative stress biomarkers in the freshwater characid fish matrinxa, Brycon cephalus, exposed to organophosphorus insecticide Folisuper 600 (methyl parathion). Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology, v.143, p.141-149, 2006. MONTEIRO, D.A.; RANTIN, F.T.; KALININ, A.L. The effects of selenium on oxidative stress biomarkers in the freshwater characid fish matrinxa, Brycon cephalus (Gunther, 1869) exposed to organophosphate insecticide Folisuper 600 BR (R) (methyl parathion). Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology, v.149, n.1, p.40-49, 2009. RANZANI-PAIVA, M.T.; RODRIGUES, E.L.; EIRAS, A.C.; VEIGA, M.L.; PACHECO, F.J. Alteraes Hematolgicas em Curimbat, Prochilodus scrofa STEINDACHNER, 1881, exposto ao Dipterex 500 (Trichlorfon). Boletin do Instituto de Pesca, v.24, p.187-196, 1997.