LEUCOGRAMA

CONTAGEM DE LEUC LEUCCITOS

EXAME MORFOL MORFOLGICO

Contagem diferencial (frmula leucocit leucocitria) ria)
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LEUCOGRAMA
white blood cells (WBC) Diluente
Soluo de Trk

Contagem de leuc leuccitos

cido actico glacial.. 3 ml Sol. aquosa de violeta de genciana a 1% .... 1 ml gua destilada100 ml
Filtrar antes de usar. O violeta de genciana cora o ncleo dos leuccitos facilitandoa sua identificao e actua como conservante.

Tcnica
Pipetar para tubo de hemlise 0,38 ml de reagente de Trk Pipetar com micropipeta 20 ml de sangue acabado de homogeneizar Limpar a parede externa da ponta da pipeta com papel absorvente Inserir o volume de sangue medido no sol. de Trk Lavar a parede interna da ponta da micropipeta com o diluente de forma a que todos os glbulos medidos fiquem em suspenso Homogeneizar a suspenso com movimentos suaves e repetidos Encher a cmara de Newbauer Contar os leucocitos nos 4 quadrados secundrios da cmara assinalados com WBC

rea total de contagem = 4 mm2 Vol. total de contagem = 0,4 mm3 factor de diluio = 20 0,4 mm3 ___ N (leuccitos) 1 mm3 ___ X X = N /0,4 N leuccitos/mm3 de sangue = (N/0,4)x20 = Nx50 N leuccitos/L de sangue = Nx50x106 Valor normal (adulto) = (4-11)x109/l

Contagem de leuccitos
Correc Correco do valor obtido para a contagem de leuc leuccitos
Deve ser feita quando ocorrem eritroblastos no sangue perifrico

- O soluto de Trk no destri os eritroblastos. Por serem nucleadas estas clulas so contadas, quer pelos mtodos manuais quer pelos automticos, como se fossem leuccitos e por isso o seu valor est includo no resultado obtido para a contagem de leuccitos. Ex: Contagem de leuccitos (contador automtico ou cmara): 20x109/l Eritroblastos contados (nos mesmos campos do esfregao onde se contaram 100 leuccitos)= 30 130 clulas nucleadas 20x109/l clulas nucleadas _____ _____ 100 leuccitos X

X= (100x 20x109/l)/130 = 15,38x109/l Contagem de leuccitos corrigida: 15,38x109/l

2) Frmula leucocitria
CONTAGEM DIFERENCIAL VALORES DE REFERNCIA

Neutrfilos

Linfcitos

Moncitos

Eosinfilos

Basfilos

x109/L

1,7-7,0

1,0-4,0

0,2-0,6

<0,5

<0,09
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Tcnica de execuo de um esfregao de sangue

Depositar uma gota de sangue perto das extremidades de uma lmina de vidro. Colocar a lmina de forma a que a gota fique mais prxima da mo direita e perto do dedo indicador. Segurando uma lamela (ou lmina) com a mo direita deve-se encostar a mesma lmina, esquerda da gota, de forma a que ambas faam um ngulo de 45. Deslocar a lamela (sempre encostada lmina) at gota de sangue deixando que esta difunda ao longo da lamela. Com um movimento uniforme deslizar a lamela no sentido da extremidade livre da lmina at que o sangue se esgote. Depois de seco identificar a amostra marcando a cabea do esfregao com lpis de carvo

Tcnica de execuo de um esfregao de sangue

Esfregao de Sangue
Franja Corpo Cabea

Esfregao Ideal

Linf Linfcitos Polimorfonucleares

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Colorao de esfregaos
Permite a identificao dos leuccitos, graas s suas caractersticas prprias, que so postas em evidncia por corantes apropriados, e tambm a observao da morfologia dos eritrcitos e das plaquetas.

Causas de coloraes deficientes

No filtrao dos corantes pH do tampo incorrecto cido - esfregao vermelho bsico - esfregao azul Tempo de colorao inapropriado Reagentes deteriorados Diluies dos corantes incorrectas
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Colorao de May-Grnwald-Giemsa
Fundamento
Fixao pelo metanol presente na sol de MGG. Dissociao do MGG em presena do tampo de fosfatos
(eosinato de azul de metileno = eosina + azul de metileno)

Aco dos corantes

Eosina (cido) cido) - cora os componentes citoplasmticos bsicos da clula (eosinfilos ou acidfilos) de laranja. Azul de metileno (bsico) sico) - cora o ncleo e elementos citoplsmicos cidos (basfilos) de azul ou roxo. Azur de metileno - cora granulaes (azurfilas) de vermelho. Eosina + azul de metileno - Coram as granulaes primrias de rosa.

Aco individual dos corantes. Dissociao do Giemsa (azur de

metileno + azul de metileno).

Actuao individual dos seus componentes.

Colorao de May-Grnwald-Giemsa
Reagentes
A) Sol. De MayMay-Gr Grnwald May... ... . . 3 g May-Gr Grnwald em p.. .. Metanol .. . ...1000 ml .. Aquecer o alcool a 50 50C. Adicionar o corante. corante. Deixar repousar 24 h e depois filtrar. filtrar. B) Tampo de fosfatos Dihidrogenofosfato de pot potssio ssio.. .1 1 g Hidrogenofosfato diss .3 dissdico dico. 3 g gua destilada .. .Completar o vol de 1000 ml C) Solu Soluo de Giemsa Diluir extemporneamente a sol. Me (1 gota de giemsa /1ml de tampo fosfatos) fosfatos)

Tcnica

Colocar os esfregaos em suportes apropriados. Mergulhar os suportes contendo as lminas em tinas contendo a sol de MGG (A) durante 3 min. Escorrer. Mudar o suporte com as lminas para uma segunda tina contendo MGG (A) e tampo fosfatos (B) em partes iguais. Deixar 3 min. Escorrer. Mergulhar o suporte numa tina contendo sol de Giemsa diluda (C), durante 15 min. Lavar com gua corrente. Limpar a face da lmina oposta ao esfregao. Deixar secar ao ar.

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Clulas mononucleadas

Granul Granulcitos

Neutrfilo Eosinfilo Basfilo Linfcito Moncito

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LEUCOGRAMA
Leuccitos 4.0-11.0 x 109/L FL (%)

Neutrfilos

45-70%

2.5-7.5 x 109/L

Eosinfilos

1-5%

0.4-0.44 x 109/L

Basfilos

0-1%

0.01 -0.1x-0.109/L

Linfcitos

20-40%

1.5-3.5 x 109/L

Moncitos

3-10%

0.2 -0.8x 109/L

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LEUCOGRAMA 1) Contagem de leuccitos

white blood cells (WBC)

Diluente Soluo de Trk

cido actico glacial .. 3 ml Sol. aquosa de violeta de genciana a 1% .. 1 ml gua destilada 100 ml Filtrar antes de usar. . O violeta de genciana cora o ncleo dos leuccitos facilitandoa sua identificao e actua como conservante.
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Esfregao de sangue perifrico

Execuo
Dever ser executado com sangue fresco, de preferncia imediatamente aps a colheita e sem anticoagulante. Deve ser fino, regular e homogneo. Deve conter bordos bem definidos e franja. Deve ser identificado com lpis de carvo na zona mais espessa, depois de seco. Se forem usadas lminas com etiqueta prpria a marcao deve ser feita na etiqueta.
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HEMOGRAMA
Mtodos automticos
(ADVIA Siemens)

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Tecnologia de Eritrcitos
Esferifica Esferificao IsoIso-volum volumtrica

Citmetro
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Impedncia elctrica
Princpio Coulter
Os glbulos (maus condutores) so suspensos numa sol. electroltica tamponada (boa condutora) Um volume constante de amostra Wallace y Joseph Coulter

os quais existe uma corrente contnua

(por aco de um manmetro de mercrio) passa (atravs de 1 orifcio) entre 2 electrodos entre

Cada clula que passa no orifcio desloca um vol idntico de sol. electroltica, originando um > de resistncia elctrica A diferena de potencial gerada entre os elctrodos traduzida em pulsos ou picos (amplitude

proporcional ao vol da clula que lhe deu origem)

O n de picos (= ao n de clulas) captado por um circuito elctrnico, que os amplifica e transforma em dados numricos
Amplitude: proporcional ao volume da clula Nmero: igual ao nmero de clulas

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Tecnologia de Leuccitos (Perox) Perox)

1 5 2

DISPERSO (volume)

3 4

ABSORVNCIA (complexidade)

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HEMOGRAMA

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VELOCIDADE DE SEDIMENTAO GLOBULAR (VSG)

A VSG mede a velocidade de queda dos eritrcitos no plasma diludo Mede a distncia entre a superfice do menisco e o topo da camada de eritrcitos sedimentados quando a amostra colocada em tubo apropriado e deixada TA e em posio vertical durante 1 hora. Depende da diferentes (plasmticos, mecnicos) interrelao de factores globulares e

de grande valor clnico no diagnstico e monitorizao de estados inflamatrios e infecciosos

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VSG - Mtodos
Westergreen - mtodo de referncia
(recomendado pelo CISH)
Tubo de vidro aberto com 30 cm de altura, 2,5 mm de dimetro, graduado de 0-200mm, que depois de cheio com sangue colocado na vertical e em suporte adequado que permite o fecho das extremidades do tubo atravs de borrachas Sistemas fechados descartveis (recomendados) usam tubos de plstico fechados, munidos de Ac, onde colhida a amostra nas propores adequadas. A rolha posterior/ perfurada com um tubo de plstico graduado que permite a leitura directa da VSG.

Westergreen modificado
Usa sangue colhido em EDTA e depois diludo em citrato de Na
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VSG
Depende da diferena de gravidade especfica entre os eritrcitos e o plasma

Aumento da VS:
anemia, infeces, inflamao, necrose tecidular, hemolises, tuberculose, sflis, doenas reumatismais, leucemias, mielomas, diferentes neoplasias gravidez, sexo feminino, idade, periodo menstrual

ETAPAS
1 - AGREGAO (~ 10 minutos) formao de rouleaux 2 - SEDIMENTAO (~ 40 minutos) queda de rouleaux a velocidade constante 3 - SEDIMENTAO FINAL (~10 minutos) empilhamento dos eritrcitos nos fundo do tubo

VN: At 50 anos
homens: at 10 mm/h mulheres: at 13 mm/h > 50 anos homens: at 13 mm/h mulheres: at 20 mm/h

Diminui Diminuio da VS
Poliglobulias, hipofibrinogenemia, esferocitose hereditria...
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Reticulcitos
Reticul Reticulcitos so gl glbulos vermelhos jovens e anucleados mas que ainda contm restos de RNA.
- O n nmero de reticul reticulcitos presentes no sangue perif perifrico um bom indicador da actividade da medula ssea. - A contagem de reticul reticulcitos indicaindicanos tamb tambm se uma anemia regenerativa ou arregenerativa . - Contagem de reticul reticulcitos baixa ou normal (< 100 x 109/l) = Anemia arregenerativa - Contagem de reticul reticulcitos elevada (> 120 x 109/l) = Anemia regenerativa 23

RETICULCITOS
MTODO MANUAL
Fundamento:
Colorao vital (ou supravital)
- Ribossomas reagem com corantes de natureza bsica: azul de cresil brilhante ou azul de metileno novo - Neutralizao e precipitao do RNA citoplasmtico residual sob a forma de grnulos e filamentos (reticulado) de cor azul ou arroxeada - Clulas no reticuladas fracamente coradas de azul esverdeado

Corantes:
Azul de metileno novo reticulado fortemente corado e uniforme, citoplasma claro, maior contraste Azul de cresil brilhante - reticulado preto-azulado (ou azul escuro), citoplasma azul-esverdeado claro

Azul brilhante de cresil 1g citrato de sdio 3% - 20 ml Soro Fisiolgico 80 ml Novo azul de metileno 1g citrato de sdio 3% - 20 ml Soro Fisiolgico 80 ml Filtrar

Percentagem % R.N. CRIANA (1 MS) CRIANA (1-12 ANOS) ADULTOS 2.5 6.5 0.2 1.5 0.3 2.5 0.5 2.5

Reticulcitos x 109/L 120 400 20 60 30 100 50 - 100

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RETICULCITOS
TCNICA
Num tubo de hemlise juntar: 50 L sangue + 50 L corante Homogeneizar Incubar a 37 C durante 15 min Homogeneizar Colocar uma gota numa lmina Executar um esfregao Deixar secar Observar ao microscpio com objectiva de imerso e restringir o campo Contar o n de reticulcitos (N) / 1000 GV

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CONTAGEM DE RETICULCITOS
Escolher rea para contagem onde a colorao est boa As clulas no devem estar sobrepostas O esfregao no deve ser demasiado fino Observar com objectiva de imerso (100x) Restringir o campo disco de papel com perfurao central colocado sobre a ocular Contar os reticulcitos que se observam quando se contam 1000 clulas anucleadas (eritrcitos + reticulcitos)

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RETICULCITOS
COLORA COLORAO VITAL
A

Estados de matura maturao

(classificao de Heilmeyer)
- Grupo I mais imaturos, grandes agregados de reticulina; A e B - Grupo II maturao intermdia; C e D

- Grupo III maturao E intermdia mais pronunciada; E e F - Grupo IV mais maduros, poucos grnulos de reticulina G sob a forma de pequenos pontos ou cadeias pequenas; G H anemia hemoltica

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EXPLORAO DA HEMOSTASE
Contagem de plaquetas em sangue perif perifrico
Determina o n de plaquetas, no sangue, por unidade de volume.

Mtodo Directo
- Sangue colhido em EDTA - Reagentes: Plaxan Soluo de Rees e Ecker Soluo de Oxalato de Amnio 1% - Cmara de Neubauer - Contar o n de plaquetas (N) numa rea de 1mm2

N de Plaquetas/mm3 = Nx1000
Ou

Nx109 (UI)
VN = 150 400 x 109/l 28

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Contagem de plaquetas em sangue perifrico

(M (Mtodo directo) Amostra
Sangue total, colhido obrigatoriamente em EDTA. A diluio do sangue deve ser feita at 2 h aps a colheita. Reagentes Plaxan ou oxalato de amnio a 1%. Medir 2 ml de Plaxan para tubo de plstico pequeno Juntar 20 l de sangue bem homogeneizado. Misturar bem.esta suspenso poder esperar algumas horas at se fazer a contagem. Encher a cmara de Newbauer com a suspenso, aps uma homogeneizao da suspenso durante cerca de 2 minutos. Colocar a cmara de contagem em cmara hmida durante cerca de 20 min. Focar com objectiva de 10. Contar com objectiva de 40. ontar o n de plaquetas (N) numa rea de 1mm2.

Tcnica

Resultado
N de plaquetas/mm3= Nx1000 SI: Nx109/L

VN: 150-400x109/L

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EXPLORAO DA HEMOSTASE
Tempo de Protrombina (TP) ou Tempo de Quick
- Tempo de recalcificao de plasma pobre em plaquetas em presena de excesso de tromboplastina e Ca2+ - Explora a via extrnseca da coagulao (II, V, VII, X) - Utiliza-se para: * monitorizao da teraputica

* triagem geral de distrbios do sistema da coagulao * Prova da funo heptica

- Resultados:

TP do doente e do TP do controlo normal Taxa de protrombina (%) INR (Razo Normalizada Internacional) = (TP do doente/
ISI= ndice de sensibilidade internacional

TP do controlo normal) ISI

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Controlo de qualidade
Laborat Laboratrio de hematologia
Os preparados comerciais do controlo armazenados entre 2 e 8 C so vlidos at ao final do prazo de validade. Estes produtos so tratados do mesmo modo que as amostras dos doentes. So analisados uma vez por dia antes de se realizarem os testes dos doentes, quando se abre um novo kitt, quando se recbe uma nova remessa e quando se inicia um novo lote. No se registam resultados de doentes enquanto os valores do controlo no estiverem dentro do intervalo de referncia.
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Controlo de qualidade
Laborat Laboratrio de hematologia
Exactido (grau de proximidade com o verdadeiro valor de
resultados). Preciso (poder de repetio de resultados de um determinado mtodo para uma mesma amostra). Popula Populao (conjunto de elementos que provem determinada caracterstica). Amostra (parte da populao com maior nmero de elementos que o total). Amplitude (diferena entre o menor e o maior resultado de um determinado procedimento). Mdia (x) somatrio de todos os resultados dividido pelo nmero de resultados. Desvio padro (DP) Raiz quadrada da varincia que, por sua vez, corresponde ao grau de desvio em relao mdia. Coeficiente de varia variao (CV) Razo entre o desvio padro e a mdia. Mede o grau de disperso dos resultados em torno da mdia. 32

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