1

Curs 4
Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC)
Acestea sunt cele mai mult folosite dintre toate metodele de separare (fig. 1).
Fig.1 Faze in cromatografia lichida de inalta performanta HPLC
Fig. 2. Schema Bloc a HPLC
Pompe pentru HPLC
Pompa este considerat una dintre cele mai importante componente ale HPLC deoarece permite realizarea unui
debit constant al eluentului prin ntreg sistemul: injector, coloan, detector mrind deosebit de mult viteza separrii. ntr-
un cromatograf de lichide pot exista una sau mai multe pompe, fiecare furniznd o presiune care poate atinge 20mii kPa
(cca. 200atm). Presiunea deosebit este necesar deoarece coloana are o umplutur de finee mare i, n lipsa presiunii,
debitul ar fi nepractic de mic.
Exist n uz dou tipuri principale de pompe, clasificate astfel n funcie de debit: pompe cu presiune constant (i
debit variabil) i pompe cu debit constant.
Pompele cu presiune constant sunt mai simple i nu prezint pulsaii n funcionare (care nu ar permite obinerea
unei linii de baz netede). Acestea, prezint dezavantajul c debitul trebuie frecvent modificat pentru a se menine ct mai
constant, ceea ce la separri de durat pune probleme, deoarece prin obturarea coloanelor debitul se modific continuu. Se
nelege c orice modificare de debit (datorit viscozitii sau temperaturii eluentului i a structurii umpluturii) afecteaz
timpul de retenie i totodat semnalul detectorilor, n majoritate sensibili la concentraie.
Pompele cu debit constant nu mai prezint dezavantajele de mai sus. De-a lungul timpului s-au selecionat dou
variante: pompele cu piston (alternative) i pompele de tip sering (cu deplasare pozitiv). La primele, cele mai utilizate,
micarea du-te-vino a pistoanelor i a supapelor cu bil permit o funcionare indefinit dar presupun existena unor
atenuatoare de pulsaii - dispozitive care s elimine micile variaii de debit. Acestea constau dintr-o alternan de mai
multe rezistene, de exemplu tuburi subiri i capaciti - care pot fi incinte cu perei elastici, fie chiar manometre.
Pompele cu presiune constant, asemntoare cu o sering dar avnd o capacitate mai mare, pompeaz continuu pe toat
durata separrii, pistonul deplasndu-se cu o vitez liniar constant dar dup fiecare curs este necesar oprirea debitului
i reumplerea cu solvent a corpului pompei.
Dei solvenii utilizai se degazeaz pentru a se reduce efectele corozive ale oxigenului, datorit presiunilor
ridicate la care se lucreaz, coroziunea este totui deosebit.
Prepararea probei
Injectarea in coloana
Eluarea cu faza mobila
Detectarea componentilor
din proba
Identificare si masurare
2
De aceea aceste pompe (corpul, cilindrii, garniturile i supapele) se execut din materiale rezistente la coroziune: safir,
agat, teflon sau aliaje speciale.
Sisteme de introducere a probei
n cazul HPLC injecia probei trebuie fcut ntr-un timp ct mai scurt, pentru a nu deranja regimul dinamic al
eluentului prin coloan i detector. Dificultatea provine de la presiunea ridicat la care lucreaz coloana (20mii kPa).
Sistemul cel mai utilizat n cromatografele de lichide este ventilul cu 6 ci, numit i ventil de introducere a probei,
prevzut cu bucle interschimbabile (fig. 3).
Fig. 3. Ventilul pentru introducerea probei (cu 6 ci); lucreaz n dou etape: A - alimentarea buclei cu proba;
B - dup o rotire cu 60 n sensul acelor de ceasornic, antrenarea probei din bucl n coloan
Deoarece eluentul ader la perei, pentru completa ndeprtare a sa n momentul alimentrii buclei cu prob, este
necesar injectarea prin bucl a unui volum de cel puin de trei ori volumul acesteia, nainte de comutarea pe analiz.
Bucla lucreaz n dou etape. Etapa A (fig. 3-A) n care bucla este umplut cu prob cu ajutorul unei seringi sau n alt
mod. Apoi are loc comutarea pe analiz (fig. 3-B) cnd prin rotire cu 60, n direcia acelor de ceasornic, manual sau
automat, bucla este parcurs de eluentul de la pomp i coninutul acesteia este antrenat n coloan. Volumul probelor
pentru coloane obinuite (25cmx4.6mm) este de 10- 50l.
Aceste ventile sunt confecionate din materiale rezistente la coroziune i la solveni (oel inoxidabil, tantal, teflon etc).
Coloanele n LC
Locul n care se petrece separarea propriu-zis i - n funcie de calitatea acesteia se mrete sau micoreaz raportul
semnal/zgomot, este coloana cromatografic.
Corpul coloanei i mecanisme de separare
Materialul din care se confecioneaz corpul coloanei n LC trebuie s asigure acesteia rezistena mecanic
adecvat presiunilor nalte (20mii kPa) precum i rezistena la coroziune fa de faza mobil. n majoritatea cazurilor a fost
preferat oelul inoxidabil 316 lucios. Acesta rezist la majoritatea solvenilor, excepie fcnd doar srurile halogenilor, n
special n soluie puternic acid. Alte alternative o constituie coloanele compozite: sticl sau plastic n interior - oel
inoxidabil sau material plastic n exterior.
Fig. 4. Aspectul coloanelor din LC: coloan analitic (stnga), semipreparativ (dreapta)
Din punctul de vedere al geometriei (fig. 4), aceste coloane sunt cilindrice, iar dimensiunile depind, n primul
rnd, de dimensiunea granulelor i porozitatea umpluturii. Astfel diametrul coloanelor variaz ntre 0.3-5cm iar lungimea
poate fi ntre 3-25cm. Pentru scopuri preparative, n cazul unor componente necunoscute, se utilizeaz chiar diametre mai
mari.
Cu ct umplutura este mai fin, cu att coloana este mai scurt. Pentru a se reine eventualele impuriti sau
componeni care nu pot prsi coloana (fiind reinui practic ireversibil) se folosesc adesea precoloane care, fiind de
dimensiuni mai mici (acelai diametru i lungimi de 0.4-1cm), pot fi nlocuite mai des, evitndu-se astfel scoaterea
prematur din funcie a coloanei principale. Pentru a nu fi antrenat faza staionar n afara coloanei, aceasta este blocat la
capete de dou discuri metalice, poroase, avnd diametrul porilor ntre 0.5- 10m. De asemenea pentru a nu se lrgi prea
mult prin coloan zona cromatografic (cu diluarea ce are loc simultan), tot volumul mort ale acesteia (goluri n coloan,
tubul de aduciune de la injector, tubul de evacuare spre detector) trebuie redus la minim.
Se cunosc pn n prezent mai multe mecanisme de separare prin coloane, care depind mult de fazele mobil i
staionar. Mai exact, depind de natura fenomenului fizico-chimic pe care se bazeaz retenia difereniat i separarea.
Metodele LC (HPLC) se pot clasifica, dup mecanismele principale amintite, astfel:
cromatografie de adsorbie, cromatografie de repartiie, cromatografie ionic, cromatografie de excluziune steric.
Fiecare dintre aceste variante este preferat n cazul unor grupuri de substane, asemntoare structural (vezi fig. 7),
neexistnd din pcate un mecanism universal.
Se disting dou moduri de realizare a cromatografiei de repartiie:
Cromatografie de repartiie direct (sau cu faze normale - clasic);
Cromatografia de repartiie cu faze inversate - metoda preferat n zilele noastre - pe care
se realizeaz cele mai numeroase separri.
n primul caz faza staionar este format dintr-un lichid polar iar faza mobil dintrun solvent organic nepolar iar
n al doilea, situaia se inverseaz: lichidul imobil este nepolar iar faza mobil este un amestec de solveni polari. De
3
exemplu, una dintre cele mai rspndite faze inversate este cea staionar - silicagel, iar cea mobil - un amestec ap,
metanol, acrilonitril (sau tetrahidrofuran).
Faza staionar
Silicagelul (SiO2) este considerat materialul cel mai important utilizat ca faz staionar. Acesta a devenit, n
ultimii 20 de ani, doar suportul adevratelor faze fazele chimic legate - ceea ce nu schimb importana sa. Silicagelul s-a
obinut la nceput n form granular, neregulat, apoi n form sferic (fig. 5).
Fig. 5. Aspectul granulelor de silicagel folosite Fig.6. Aspectul schematic al unei granule sferice
frecvent la umplerea coloanelor din HPLC cu faz staionar chimic legat pe suprafaa suportului
Indiferent de form, granulaia trebuie s fie uniform (se elimin partea fin) pentru c astfel caracteristicile
curgerii eluentului sunt mult mbuntite.
Faza mobil
Faza mobil sau eluentul n LC nu reprezint un mediu inert ca gazul purttor din GC.
De aceea alegerea fazei mobile se face aici n perfect concordan cu faza staionar. Astfel faza mobil difer
destul de mult n funcie de tipul interaciunilor componentelor separate cu faza staionar din coloan. Singurele
caracteristici generale sunt urmtoarele: (1) faza mobil trebuie s aib o viscozitate cobort, (2) aceasta trebuie s
dizolve bine componentele, (3) nu trebuie s afecteze funcionarea coloanei i (4) trebuie s permit funcionarea
detectorului.
Unii elueni provoac migrarea unui anumit component mai repede prin coloan. Se spune c acetia au o trie
relativ mai mare sau, altfel spus, au o putere de eluie mai ridicat. Aceast denumire provine de la faptul c factorul de
capacitate, k, este mai mare i de aceea componentul migreaz mai repede. Dar totul depinde de trio-ul component faz
mobil - faz staionar. Astfel, pe o faz staionar polar, folosind o faz mobil nepolar, se vorbete de cromatografie
de repartiie normal (sau cu faze directe). Din contr, pe o faz staionar nepolar utilizndu-se o faz mobil polar se
vorbete de cromatografie de repartiie cu faze inverse (sau inversate). n acest ultim caz au devenit uzuale fazele mobile
formate din amestecuri metanol - ap care n cromatografia de repartiie sunt considerate printre fazele mobile mai puin
tari.
Tabelul 3. Cteva faze mobile (monocomponente) utilizate n cromatografia de repartiie n ordinea triei lor
relative n LC de repartiie cu faze normale
Pe o faz staionar polar, amestecul metanol-ap face parte dintre cei mai tari elueni cunoscui. n tabelul 3 se prezint
civa dintre cei mai ntlnii solveni i ordinea n care crete tria lor relativ, n cele dou tipuri de cromatografie de
repartiie.
n HPLC, din contr, solventul are o contribuie important n procesul de separare, dar nu trebuie neglijat
importana decisiv a cuplului faz mobil - faz staionar. Dei unii compui sunt reinui slab prin coloan, ieind destul
de repede, cei reinui puternic ies din coloan dup un timpcteodat nepractic de lung, lucru care determin diluarea n
eluent a componentul n urma parcurgerii coloanei, aceasta micorndu-se calitatea analizei. S-a recurs la introducerea
treptat peste primul solvent (eluent), a unui al doilea solvent mai tare sau a celui de-al treilea, ceea ce n limbajul de
specialitate se numete gradient de eluie (sau de concentraie).
S-a recurs n practic const, n general, dintr-un sistem de ventile electromagnetice care permite intrarea
solvenilor n aceeai pomp, prin intermediul unei camere de amestecare aflate la joas presiune. Este posibil i un alt
montaj n care fiecare solvent are pompa proprie, comandat de un dispozitiv de control al debitului. Aceti solveni intr
n camera de amestec i de aici n coloan.
Detectori
Foarte multe detectoare sunt angajate n separrile cromatografice [7]. Detecia absorbanei moleculare UV-VIS
este cea mai comun. Detectorul ideal este necesar s aib: sensibilitate adecvat; bun stabilitate i reproductibilitate;
timp de rspuns scurt; rspuns liniar la diferite ordine de concentraie; stabilitate pe un larg domeniu de temperatur;
4
durat lung de via i uurin n utilizare. Deci detectorii constituie acea parte a instrumentaiei care permite s se
observe modul cum decurge separarea prin coloan fr a se vedea componenii propriu zii ci doar semnalul lor.
ntruct coloanele de separare performante au capaciti de ncrcare mici, sistemul de detecie trebuie s fie unul foarte
sensibil. Totodat, pentru c n LC volumul de prob este de ordinul microlitrilor (8-10l), volumul detectorilor trebuie s
fie de volum apropiat pentru a se putea sesiza n mod continuu picul cromatografic.
Detectorii monocromatici au fost primii utilizai, fiind mai ieftini deoarece lucreaz doar la o lungime de und. Modelul
cel mai rspndit se compune dintr-o surs luminoas cu deuteriu sau cu vapori de mercur, un monocromator care separ
un domeniu ngust (de ex. linia 254nm a mercurului) i un detector.
Detectorii policromatici mai frecvent utilizai n cromatografele HPLC moderne permit i selectarea lungimii de
und la care se lucreaz, dar chiar pot nregistra electronic absorbana celulei la mai multe lungimi de und simultan. Acest
mod de lucru d o mai mare siguran analizei, n sensul c permite stabilirea puritii, adic dac picul constituie un
semnal dat de o singur substan sau de un amestec (ceea ce se cunoate sub numele de stabilirea puritii picului). Aceti
detectori conin celula amintit montat ntr-un spectrofotometru cu reea de diode.
Lrgimea benzii n cromatografie
O cromatogram:
ilustreaz rspunsul detectorului la un compus de analizat din prob la ieirea acestuia din coloan ca funcie de timp sau
de volum de faz mobil adugat;
este util att pentru determinrile cantitative ct i calitative;
furnizeaz o serie de picuri, unde aria de sub picuri furnizeaz informaia cantitativ despre cantitatea de component iar
poziia picului servete pentru identificarea compusului din prob;
Cteva forme de band pe cromatogram este posibil s depind de concentraia compusului de analizat n fazele
mobil i staionar i de comportamentul fiecrui compus n parte (fig. 10).
a) b) c)
Fig. 10. Forme de picuri - (a) Gaussian; (b) deplasat dreapta; (c) deplasat stnga
Un pic Gaussian este ideal (a). Mai mult, oricum picurile pot avea o cretere progresiv urmat de o cdere
abrupt datorat suprancrcrii coloanei (b) sau o form cu coad care rezult din faptul c unele lcae ale coloanei rein
solutul mai mult dect altele (c). Lrgimea benzii poate fi explicat din punct de vedere cantitativ. O particul individual
suport multe transformri n timpul migrrii, n consecin, timpul de staionare n coloan este extrem de diferit precum
i migrarea particulelor de-a lungul coloanei este neregulat. Odat cu creterea timpului, limea benzii crete n timp ce
se parcurge coloana, timpul de staionare n coloan va fi mai mare, iar viteza de curgere a fazei mobile scade .
Exist patru parametri care caracterizeaz n viteza de migrare: timpul de retenie, coeficientul de partiie,
factorul de capacitate i factorul de separare. Aceti parametri descriu echilibrul de distribuie care exist i,
transferul soluiei n cele dou faze (fig.7).
a) Timpul t
R
la care apare maximul unui pic, msurat din momentul introducerii probei se numete timp
de reinere sau retenie i este o caracteristic calitativ a componentului respectiv. nlimea picului h sau aria lui,
A, sunt caracteristici cantitative, proporionale cu cantitatea componentului din prob. Se noteaz cu t
M
timpul n
care eluentul i componentele care nu interacioneaz cu faza staionar parcurg distana pn la detector.
Viteza componentului din faza staionar (v) i a eluentului (u) se exprima prin urmtoarele ecuaii:
v = L/t
R
(1)
u = L/t
M
(2)
unde L este lungimea coloanei.
Fig. 7. Elementele unei cromatograme [2]
5
b) Coeficientul de partiie K reprezint raportul dintre concentraia molar (c
S
) a substanei n faza
staionar i concentraia n faza mobil (c
M
):
K = c
S
/c
M
. (3)
Fraciunea din timpul de reinere n care o molecul se gsete n faza mobil se noteaz cu R i reprezint
probabilitatea ca molecula s se gseasc n faza mobil, respectiv fraciunea din totalul moleculelor care se afl n
faza mobil. 1 R reprezint restul moleculelor care se gsesc n faza staionar. La echilibru putem scrie:
S S
M m
V c
V c
R 1
R
=

R =
k 1
1
V
V
K 1
1
KV V
V
M
S
S M
M
+
=
+
=
+
(4)
R = v/u = t
M
/t
R
(5)
M
S
V
V
K 1
u
v
+
=
(6)
unde :
V
M
- reprezint volumul fazei mobile
V
S
- reprezint volumul fazei staionare
k = KV
S
/V
M
- reprezint raportul dintre cantitatea total de substan aflat n faz staionar i cantitatea
total de substan aflat n faza mobil i se numete factor de capacitate. Pentru o specie oarecare A
aflat n amestec, factorul de capacitate k
A
va fi:
M
M R
M
S A
A
t
t t
V
V K
k

= = ,
M ) A ( R
M ) B ( R
A
B
A
B
t t
t t
K
K
k
k

= = = o (7)
Factorul de capacitate k este o funcie de parametri de solubilitate, n cazul cromatografiei de separaie
lichid-lichid. Practic, n vederea obinerii unei rezoluii maxime pe unitatea de timp, trebuie ca valoarea lui k s fie
cuprins ntre 2 i 5. Factorul de separare pentru o anumit coloan de separare este un parametru utilizat
pentru descrierea diferenelor ce apar ntre vitezele de migrare a componenilor. Se definete ca fiind raportul
dintre factorii de capacitate k
A
i k
B,
ai componentului B (care trece mai greu prin coloan) i A (componentul care
se elueaz mai repede) aflai n amestec. Una dintre cele mai importante caracteristici ale unui sistem
cromatografic este eficiena sau numrul de talere teoretice. Cu ct o coloan va avea mai multe talere pe unitatea
de lungime cu att eficacitatea ei de separare va fi mai bun. Numrul de talere N poate fi definit din
cromatograma unui singur pic astfel:
N =
2
2 / 1
R
2
R
2
t
R
W
t
54 , 5
W
t
16
t
|
|
.
|

= |
.
|

=
|
|
.
|

o
(8)
unde:
t
R
- timpul de retenie;
2
t
o - dispersia aceleiai benzi n uniti de timp; W - valoarea segmentului pe abscis
rezultat din intersecia celor dou tangente prin punctele de inflexiune ale picului.
N este un numr adimensional. Aceeai valoare a lui N poate fi obinut din volumul de retenie V
R
i dispersia
2
V
o exprimat n uniti de volum. Numrul de talere N este o msur a eficienei ntregului suport al coloanei. O alt
msur a eficienei coloanei, folosit curent n cromatografie este dat de nlimea unui taler H (nlimea echivalent a
unui taler teoretic):
N =
2
2
V
R
L V
|
.
|

o
=
|
|
.
|

o
,
L N
L
H
2
o
= = , H =
2
R
2
t 16
LW
, R =
B A
) A ( R ) B ( R
W W
t 2 t 2
+

(9)
unde:
L este lungimea coloanei cu umplutur.
Pentru caracterizarea separabilitii a doi componeni s-a introdus noiunea de rezoluie, notat R
S
. n expresia
rezoluiei s-a cutat s se lege mrimile care caracterizeaz proprietile termodinamice ale fazelor i componenilor
precum i mrimile care caracterizeaz dinamica proceselor din coloan. Rezoluia este o noiune mai cuprinztoare,
coninnd i mrimile care caracterizeaz eficacitatea coloanei precum i selectivitatea ei.
Rezoluia
Pentru caracterizarea separabilitii a doi componeni s-a introdus noiunea de rezoluie, notat R
S
. n expresia
rezoluiei s-a cutat s se lege mrimile care caracterizeaz proprietile termodinamice ale fazelor i componenilor
precum i mrimile care caracterizeaz dinamica proceselor din coloan. Rezoluia este o noiune mai cuprinztoare,
coninnd i mrimile care caracterizeaz eficacitatea precum i selectivitatea coloanei.
B A
R
B A
A R B R
S
W W
t
W W
t t
R
+
A
=
+

=
2
2 2
) ( ) (
(10)
Dac cele dou picuri sunt apropiate avnd suprafeele egale i simetrice, atunci i W
1
= W
2
= W. Ecuaia (10) se
poate scrie astfel:
6
W
t
R
R
S
A
= (11)
Dac diferena dintre coeficienii de repartiie a componenilor crete, atunci selectivitatea coloanei s-a
mbuntit. Aceasta se realizeaz prin alegerea corespunztoare a fazelor staionar i mobil. Un alt mod de mrire a
rezoluiei este acela de a aciona n sensul reducerii lrgimii zonei, adic de a realiza coloane mai eficace, cu un numr de
talere mai mare pe unitatea de lungime. Rezoluia este influenat att de proprietile termodinamice ale sistemului, prin
intermediul coeficienilor de capacitate, respectiv de repartiie, precum i de eficacitatea de separare a coloanei, prin
intermediul termenilor N i H. Cu ajutorul ecuaiei (9), (11) rezult:
H
L
N R
S
~ ~ (12)